CN109260464A

CN109260464A - 抗血小板溶栓素的新用途

Info

Publication number: CN109260464A
Application number: CN201811267026.7A
Authority: CN
Inventors: 楚在玹; 李小羿; 戴向荣
Original assignee: ZHAOKE PHARMACEUTICAL (HEFEI) CO Ltd
Current assignee: ZHAOKE PHARMACEUTICAL (HEFEI) CO Ltd
Priority date: 2018-10-29
Filing date: 2018-10-29
Publication date: 2019-01-25
Anticipated expiration: 2038-10-29
Also published as: WO2020087855A1; EP3875108A4; CA3118230A1; JP2022505919A; KR20210113168A; EP3875108A1; JP7260639B2; US20220370550A1; BR112021008304A2; CN109260464B

Abstract

本发明涉及医药领域，公开了抗血小板溶栓素在制备抑制炎症药物中的应用。经实验证实，本发明所述抗血小板溶栓素可抑制αMβ2整合素介导的血小板与白细胞的相互作用，降低中性粒细胞间的聚集，也可减少血小板与中性粒细胞间的结合，从而起到抑制炎症的作用，具有良好的临床应用前景。

Description

抗血小板溶栓素的新用途

技术领域

本发明涉及医药领域，尤其涉及一种抗血小板溶栓素在制备抑制炎症药物中的新用途。

背景技术

炎症(inflammation)是指外源性和内源性损伤因子引起细胞多种损伤性病变，机体的局部和全身发生一系列复杂的反应，以局限和消灭损伤因子，并清除和吸收坏死组织，修复损伤，属于机体的一种防御性反应。

引起机体炎症反应的因素包括外界生物因子、理化因子、自体坏死组织以及变态反应等。血管反应是炎症过程的中心环节，有些致炎因子可直接损伤血管内皮，引起血管通透性升高。但许多致炎因子并不直接作用于局部血管组织，而主要是通过内源性化学因子的作用而导致炎症，这些内源性化学因子即化学介质或炎症介质。当外源性损伤因子如病原微生物侵入机体后，其本身及某些组分可以激活多种细胞如单核细胞、血管内皮细胞等释放多种促炎介质如肿瘤坏死因子(TNF-α)、白介素等,并且通过接触激活因子XII、前激肽释放酶、高分子激肽原及补体系统，产生一系列炎症反应，同时，入侵的病原微生物及其某些组分直接或间接可使单核细胞、巨噬细胞和血管内皮细胞上调组织因子表达，从而启动凝血过程，引起血栓形成。另外，血小板的黏附、激活和聚集是血栓形成的起始和促进因素，但血小板作为一个炎症成分，被激活后会释放出大量细胞因子，进一步增强炎性反应和血小板聚集；凝血过程中的凝血酶亦能通过对白细胞和内皮细胞的效应，在诱导血栓形成的同时促进血管壁非细胞成分的累积及血管内膜合成和释放炎症反应因子，调节血浆白蛋白及血管壁细胞的炎症反应等。

研究表明，血管反应是炎症过程的中心环节。急性炎症过程中组织发生损伤后，很快会发生血流动力学变化，包括血流量和血管口径的改变，如细动脉短暂收缩、血管扩张、血流加速以及血流速度减慢、血流停滞等，其发生的速度取决于损伤的严重程度。在此过程中，在炎症介质的作用下，血管壁通透性升高，血浆蛋白和一些液体在毛细血管静脉端和微静脉渗出，并引起血液浓缩、血液粘滞性增加，导致血流缓慢，形成血栓。同时，毛细血管及微静脉内的流体静水压增高，以致大量血浆渗出，致使组织水肿，随着血流速度减慢，红细胞聚集成团，白细胞逸出，血栓形成，加速炎症反应。

正常血管内皮细胞光滑完整，不利于血小板的黏附。但被激活或受损伤后，天然屏障作用遭到破坏，损伤的内皮细胞可释放出组织因子和血栓调节蛋白激活凝血系统。其产生的大量促凝因子和物质，促血管收缩、纤溶功能下降，另外缓慢的血流易在静脉瓣膜凹陷处停滞和发生涡旋，加重血管壁的损伤，受损血管内皮细胞表面会有大量的黏附分子表达，使单核细胞、中性粒细胞、以及血小板在其表面滚动、黏附和聚集，导致炎症反应。在缺血性血管损伤部位，暴露的纤维状胶原与GPVI结合，诱导血小板活化与GPIIb/IIIa受体的功能性上调，且活化的血小板自身释放多聚磷酸盐。多聚磷酸盐和带负电荷的表面作用并激活凝血因子XII-内源性凝血途径起始酶。除了通过纤维蛋白生产而触发血栓形成，FXII同时促进接触激肽系统的激活：FXIIa裂解血浆前激肽释放酶形成活性丝氨酸蛋白酶血浆激肽释放酶，从而裂解高分子激肽原释放炎症肽肽缓激肽BK，BK与内皮细胞受体结合启动信号级联，诱导内皮细胞损伤导致血管水肿，促炎细胞因子表达，诱导胶质细胞活化、炎症。同时，缺血性损伤活化循环中的白细胞如T细胞和中性粒细胞，导致无菌性炎症反应，包括内皮细胞和免疫细胞的化学诱导物、趋化因子、粘附分子上调。T淋巴细胞通过P-选择素/P-选择素糖蛋白配体-1(PSGL-1)募集并通过细胞间粘附分子(ICAM-1)/淋巴细胞功能相关抗原-1[LFA-1]及血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)/极晚期抗原-4(VLA-4)与血管稳定结合后，通过CD40/CD40L与活化的血小板相互作用，形成稳定的血栓。而中性粒细胞通过巨噬细胞-1抗原[MAC-1]/GPⅠba和P-选择素/PSGL-1与血小板相互作用，通过MAC-1/纤维蛋白相互作用参与纤维蛋白交联，诱导外源性组织因子TF/FⅦa通路触发凝血酶活化，释放炎症反应因子，调节血浆白细胞及血管壁细胞的炎症反应。

通常情况下，炎症反应对机体起到保护作用，但当炎症反应过强时，大量炎症介质产生会引起机体抗炎-促炎平衡失调，TNF-α、IL-1β和IL-6等前炎症介质又能诱发机体内产生大量继发性炎症介质，如PGE₂、PAF以及一些黏附因子等，这些炎症介质均能介导炎症细胞与血管内皮细胞间的作用，降低机体抗炎、造成代谢功能紊乱，引发全身性炎症反应综合症。

发明内容

本专利发明人意外发现，抗血小板溶栓素能够减少血小板-中性粒细胞聚集，抑制炎症反应。

所述抗血小板溶栓素的α链氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，β链氨基酸序列如SEQID NO.2所示，或所述抗血小板溶栓素为其α链氨基酸序列经过取代、缺失、或添加一个或几个氨基酸衍生的与SEQ ID NO.1的氨基酸序列至少有95％的一致性，且其β链氨基酸序列经过取代、缺失、或添加一个或几个氨基酸衍生的与SEQ ID NO.2的氨基酸序列至少有95％的一致性，且具有抑制炎症的活性。

本发明所述抗血小板溶栓素(Antiplatelet thrombolysin，APT，anfibatide)能够抑制活化的αMβ2整合素与血小板结合，提高血流速度，减少血小板-中性粒细胞聚集，在小鼠大脑中动脉闭塞模型(MCAO)及再灌注模型中，抗血小板溶栓素对小鼠脑组织损伤具有显著保护作用，减少梗塞体积及改善神经缺陷。

作为优选，所述炎症包括急性炎症和慢性炎症；更优选地，所述炎症包括变质性炎症、渗出性炎症、增生性炎症和特异性炎症。

作为优选，本发明所述药物为化学药物制剂或生物制剂。

作为优选，所述药物包括抗血小板溶栓素与药学上可接受的辅料。

优选的，本发明所述药物为口服制剂或注射剂。

更优选的，所述口服制剂为片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、滴丸剂、微囊剂或微丸剂。

优选的，本发明所述药物为外用制剂。更优选的，所述外用制剂为酊剂、软膏剂、乳膏剂、洗剂、冲洗剂、搽剂或凝胶剂。

实验证实，本发明所述抗血小板溶栓素可抑制αMβ2整合素介导的血小板与白细胞的相互作用。抗血小板溶栓素可降低中性粒细胞间的聚集作用，也可减少血小板与中性粒细胞间的结合作用，从而起到抑制炎症的作用。

本发明提供的抗血小板溶栓素的新应用，可以补充现有药物治疗炎症的不足。经体内外实验证实，抗血小板溶栓素能够抑制活化的αMβ2整合素与血小板结合，提高血流速度，减少血小板-中性粒细胞聚集，在小鼠大脑中动脉闭塞模型(MCAO)及再灌注模型中，抗血小板溶栓素对小鼠脑组织损伤具有显著保护作用，减少梗塞体积及改善神经缺陷，Bederson和grip test评分显示能够抑制炎症反应，具有良好的临床应用前景。

附图说明

图1示抗血小板溶栓素抑制鼠血小板与αMβ2整合素的结合作用；

图2示抗血小板溶栓素抑制人血小板与αMβ2整合素的结合作用；

图3示抗血小板溶栓素降低TNF-α诱导wt小鼠中性粒细胞细胞间聚集作用；

图4示抗血小板溶栓素减少TNF-α诱导wt小鼠血小板-中性粒细胞间结合作用；

图5示抗血小板溶栓素降低人中性粒细胞间聚集作用；

图6示抗血小板溶栓素减少人血小板-中性粒细胞间结合作用；

图7示不同时间点血小板及中性粒细胞影像图，从左到右依次为BSA组、25ng/ganfibatide组、50g/g anfibatide组，从上到下依次为0s、30s、60s图谱，箭头表示血流方向，绿色为标记血小板，红色为标记中性粒细胞；

图8示给药组血流速度对比图，从左到右依次为BSA组、25ng/g anfibatide组、50g/g anfibatide组；

图9示血小板-中性粒细胞计数图，从左到右依次为对照IgG组、anti PDI组、BSA组、anfibatide组、IgG+BSA组，anti PD-I+anfibatide组；

图10示缺血/再灌注诱导中风小鼠脑组织切片，从左到右依次为假手术组、BSA组、5ng/ganfibatide组、25ng/g anfibatide组；

图11示缺血/再灌注诱导中风小鼠梗死体积实验结果，纵坐标为梗死体积，从左到右依次为假手术组、BSA组、5ng/ganfibatide组、25ng/g anfibatide组；

图12示缺血/再灌注诱导中风小鼠Grip评分，从左到右依次为假手术组、BSA组、5ng/g Anfibatide组、25ng/g Anfibatide组；

图13示缺血/再灌注诱导中风小鼠Bederson评分，从左到右依次为假手术组、BSA组、5ng/g Anfibatide组、25ng/g Anfibatide组。

具体实施方式

本发明公开了抗血小板溶栓素在制备抑制炎症药物中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的试剂皆为普通市售品，皆可于市场购得。

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。

实施例1抗血小板溶栓素抑制αMβ2整合素与血小板的结合作用

取小鼠及人的血小板在37℃条件下分别与对照IgG(10μg/ml)、BD34(抗PD1抗体,10μg/ml)、BSA(牛血清白蛋白，0.2μg/ml)和anfibatide(抗血小板溶栓素0.2μg/ml)预孵30min，再用HEPES-Tyrode缓冲液(20mM HEPES,pH 7.4,136mM NaCl,2.7mM KCl,12mMNaHCO₃,2mM MgCl₂,and 5.5mM glucose)洗涤血小板，将洗涤后血小板与经或不经0.5mMMnCl₂处理的重组人αMβ2整合素(10μg/ml)37℃孵育30min，洗去未结合αMβ2，剩余血小板与5μg/ml IgG-FITC或羊抗人β2抗体孵育，流式细胞仪进行检测。

αMβ2又叫Mac-1或CD11b/CD18，是整合素家族中的一员，是介导细胞和细胞外基质以及细胞间黏附作用的主要因子，可以识别、结合细胞外基质中相应的配体，主要分布于白细胞，是一类重要的而白细胞黏附因子，参与白细胞与内皮细胞等之间的黏附，介导白细胞功能，从而在炎症反应、免疫反应等方面其关键作用。

如图1-2所示，图1示鼠血小板与αMβ2整合素的结合作用，图2示人血小板与αMβ2整合素的结合作用。其中纵坐标为荧光强度，横坐标对应实验组依次为：对照IgG组、BSA组、anti PDI组、IgG+BSA组，anti PDI+anfibatide组，其中anti-PDI为蛋白质二硫键异构酶抑制剂，左边柱状图为未经MnCl₂处理αMβ2检测结果，右边柱状图为经MnCl₂处理αMβ2检测结果，实验数据经统计分析，n＝3，*P<0.05,**P<0.01,or***P<0.001。

结果显示，抗血小板溶栓素可抑制αMβ2整合素介导的血小板与白细胞的相互作用。

实施例2抗血小板溶栓素减少TNF-α诱导wt小鼠模型血小板-中性粒细胞聚集作用

中性粒细胞是第一个到达感染部位的免疫细胞，有骨髓中分化变成成熟的携带颗粒物质的细胞之后释放到血液中，在机体没有感染的情况下，中性粒细胞保持静息状态存在于外周血中，但一旦细菌入侵，机体会快速的将中性粒细胞招募到感染部位，中性粒细胞通过吞噬作用联合产生多种杀菌物质、从颗粒中释放蛋白酶以及中性粒细胞外诱捕网络，同时中性粒细胞还分分泌趋化因子以招募其他免疫细胞进入感染部位，共同消灭感染原。

但是，过度活化的中性粒细胞会被募集到一些重要器官，在这些器官部位，活化中性粒细胞携带的杀菌物质在局部会大量释放，通过各自的破坏作用，导致组织损伤，进一步导致器官障碍，且中性粒细胞侵入一个器官之后，会诱导其他的重要器官中中性粒细胞的聚集，从而导致多器官功能衰竭。通过针对不同中性粒细胞物质的抑制剂，可以缓解急性炎症中的组织损伤。同时，血小板凝血酶活化后，血小板选择受体会迅速表达到细胞表面，并介导活化血小板与中性粒细胞的结合与黏附，中性粒细胞聚集，溶酶体酶释放，血小板衍生产物亦能促进中性粒细胞趋化性、酶的释放和吞噬作用并抑制氧化爆发。另一方面，血小板与中性粒细胞黏附，促进血小板聚集，介导血管闭塞，加重炎症反应。

试验方法：

取WT小鼠和PDI CKO小鼠(PDI^flox/flox小鼠与PF4-Cre小鼠杂交获得PDI CK0小鼠)的血小板(2x10⁷个/ml)和中性粒细胞(1x10⁶个/ml)分别用DyLight488-抗CD42C和AlexaFluor647-抗Ly-6G抗体标记，人中性粒细胞和血小板分别用Alexa Fluor 488-抗CD41和FITC-抗L选择素抗体标记，中性粒细胞用20ng/ml TNF-α诱导5min，血小板分别与对照IgG(10μg/ml)、anti PDI抗体(10μg/ml)、BSA(0.2μg/ml)、抗血小板溶栓素(0.2μg/ml)及抗血小板溶栓素+antiPDI室温预孵30min，后与0.025U/ml凝血酶于37℃孵育5min，再与50uMPPACK孵育，1000rpm搅拌混合血小板及中性粒细胞，5min后固定并通过流式细胞仪进行分析。

实验结果如图3-6所示，抗血小板溶栓素减少TNF-α诱导wt小鼠模型血小板-中性粒细胞聚集作用，其中纵坐标为相对于对照组，细胞与细胞间/血小板与中性粒细胞间作用，横坐标为实验组，实验组从左至右依次为：对照IgG组、anti PDI组、BSA组、anfibatide组、IgG+BSA组，anti PD-I+anfibatide组。n＝4，实验数据经统计分析，*P<0.05,**P<0.01,or***P<0.001。

试验结果显示，抗血小板溶栓素可降低中性粒细胞间的聚集作用，也可减少血小板与中性粒细胞间的结合作用，从而起到抑制炎症的作用。

实施例3抗血小板溶栓素对TNF-α诱导炎症的抑制作用

TNF-α是一种重要的促炎症细胞因子，具有参与免疫、抗肿瘤、抗病毒、调节特定基因表达等生理功能，在机体免疫-炎症协调的信号网络调解中起之至关重要的作用。若TNFα过度表达，则引起炎症反应性疾病及自然免疫性疾病。

取WT小鼠，麻醉后阴囊注射TNF-α，3h后分别给药BSA 50ng/gBW，Anfibatide(25、50ng/gBW)，活体实时显微镜观察记录。将WT小鼠血小板用钙黄绿素AM标记，分别与IgG(10μg/ml)、anti-PDI(10μg/ml)、BSA(0.2μg/ml)、anfibatide(0.2μg/ml)、anfibatide+anti-PDI预孵后，按血小板数量2x10⁹个/ml每只TNF-α小鼠注射100μl。

实验数据经ANOVA和Tukey’s检验统计分析，*P<0.05,**P<0.01,or***P<0.001。试验结果显示，经TNF-α处理后给予Anfibatide 25-50ng/g对中性粒细胞在内皮细胞中的滚动和黏附基本无影响(见图7)。与BSA对照相比，Anfibatide呈剂量依赖性地增加了血液流速(见图8)。同时在活体显微镜中采用了血小板转移模型进行实验。使用0.2μg/mlAnfibatide处理抑制了50-55％的血小板-中性粒细胞的粘附(图9)，进一步说明抗血小板溶栓素减少TNF-α诱导wt小鼠模型血小板-中性粒细胞聚集作用。

实施例4抗血小板溶栓素对缺血/再灌注中风小鼠脑组织损伤作用实验

将雌性和雄性C57BL/6小鼠、WT小鼠(22-25g，7-10周龄)用2％戊巴比妥麻醉，通过腹腔注射丁丙诺啡(30ng/g BW)，手术过程中使用加热毯维持体温37℃。暴露左颈总动脉，解剖颈外动脉并分离颈内动脉，用纤丝(直径0.15mm，尖端直径0.22-0.25mm)封闭左脑中动脉1h，使用激光多普勒灌注监控系统(PF5010,Perimed AB，Ardmore，PA)局部脑血流降至20％基线水平表示栓塞成功。随后去除纤丝并将血流恢复至基线。栓塞1h后给药BSA或抗血小板溶栓素(5、25ng/g BW，100μl生理盐水)，再次ip注射丁丙诺啡(25ng/gBW)，再灌注23h，使用Bederson和grisp进行动物行为评分。评分后处死小鼠并取2mm脑组织切片，用2％2，3,5-三苯基四氮唑氯化物溶液37℃染色10min，4％多聚甲醛固定，扫面切片并使用ImageJ分析梗塞体积。

缺血/再灌注脑组织损伤模型是一种成熟的炎症模型，其炎症与血栓形成有关。实验数据经ANOVA和Tukey’s检验统计分析，n＝6-7/组，采用ANOVA和Tukey检验，***P<0.001，****P<0.0001为显著性差异。

结果显示，抗血小板溶栓素对缺血/再灌注诱导中风小鼠脑组织损伤具有保护作用。在MCAO诱导的局部缺血后1小时给予Anfibatide治疗，5ng/g BW的Anfibatide能够将梗塞体积减少至BSA对照组的40％，相比于BSA对照Anfibatide呈剂量依赖性地减少了梗塞体积，改善神经功能，提高平衡能力和运动能力(图10-13)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 兆科药业（合肥）有限公司

<120> 抗血小板溶栓素的新用途

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 130

<212> PRT

<213> Artifial

<400> 1

Asp Val Asp Cys Leu Pro Gly Trp Ser Ala Tyr Asp Gln Ser Cys Tyr

1 5 10 15

Arg Val Phe Lys Leu Leu Lys Thr Trp Asp Asp Ala Glu Lys Phe Cys

20 25 30

Thr Glu Arg Pro Lys Gly Gly His Leu Val Ser Ile Glu Ser Ala Gly

35 40 45

Glu Arg Asp Phe Val Ala Gln Leu Val Ser Glu Asn Lys Gln Thr Asp

50 55 60

Asn Val Trp Leu Gly Leu Lys Ile Gln Ser Lys Gly Gln Gln Cys Ser

65 70 75 80

Thr Glu Trp Thr Asp Gly Ser Ser Val Ser Tyr Glu Asn Phe Ser Glu

85 90 95

Tyr Gln Ser Lys Lys Cys Phe Val Glu Lys Asn Thr Gly Phe Arg Thr

100 105 110

Trp Leu Asn Leu Asn Cys Gly Ser Glu Tyr Ala Phe Val Cys Lys Ser

115 120 125

Pro Pro

130

<210> 2

<211> 125

<212> PRT

<213> Artifial

<400> 2

Gly Phe Cys Cys Pro Leu Arg Trp Ser Ser Tyr Glu Gly His Cys Tyr

1 5 10 15

Leu Val Val Lys Glu Lys Lys Thr Trp Asp Asp Ala Glu Lys Phe Cys

20 25 30

Thr Glu Gln Arg Lys Gly Gly His Leu Val Ser Val His Ser Arg Glu

35 40 45

Glu Ala Asp Phe Leu Val His Leu Ala Tyr Pro Ile Leu Asp Leu Ser

50 55 60

Leu Ile Trp Met Gly Leu Ser Asn Met Trp Asn Asp Cys Lys Arg Glu

65 70 75 80

Trp Ser Asp Gly Thr Lys Leu Asp Phe Lys Ala Trp Ala Lys Thr Ser

85 90 95

Asp Cys Leu Ile Gly Lys Thr Asp Asp Asn Gln Trp Leu Asn Met Asp

100 105 110

Cys Ser Lys Lys His Tyr Phe Val Cys Lys Phe Lys Leu

115 120 125

Claims

1.抗血小板溶栓素在制备抑制炎症药物中的应用，所述抗血小板溶栓素由α链、β链两条肽链组成，其α链氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，β链氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；或所述抗血小板溶栓素为其α链氨基酸序列经过取代、缺失、或添加一个或几个氨基酸衍生的与SEQ ID NO.1的氨基酸序列至少有95％的一致性，且其β链氨基酸序列经过取代、缺失、或添加一个或几个氨基酸衍生的与SEQ ID NO.2的氨基酸序列至少有95％的一致性，且具有抑制炎症的活性。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述炎症包括急性炎症和慢性炎症。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述炎症包括变质性炎症、渗出性炎症、增生性炎症和特异性炎症。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物为化学药物制剂或生物制剂。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物为口服制剂或注射剂。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述口服制剂为片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、滴丸剂、微囊剂或微丸剂。

7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物为外用制剂。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述外用制剂为酊剂、软膏剂、乳膏剂、洗剂、冲洗剂、搽剂或凝胶剂。