CN109254068A - 一种快速检测有机杂环类除草剂残留的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种快速检测有机杂环类除草剂残留的方法，具体的操作步骤实验结果如下：毛细管电泳检测条件进行筛选优化，并选出了一种最佳的毛细管电泳分离条件。即以10 mmol/L硼砂做为运行缓冲液，PH为9.5，30 mmol/L十二烷基硫酸钠，7.5%甲醇溶液为最佳分离介质。其它条件的设置为：进样压力为0.5 psi,进样时间为5s,分离电压为15 KV，毛细管柱温为：25℃，检测波长为221 nm。通过本方案最终建立了一套高效、可靠的快速检测有机杂环类除草剂残留的方法的技术体系，为后续的进一步推广应用奠定了基础。

Description

一种快速检测有机杂环类除草剂残留的方法

技术领域

本发明主要涉及绿色植物保护技术研究领域，具体地说，涉及一种通过毛细管电泳方法检测五种有机杂环类除草剂(西草净、扑草净、西玛津、氰草津和莠去津)残留的方法，从而为后续检测各种介质中有机杂环类除草剂提供参考。

背景技术

农药最初作为消除有害生物的手段发展农业，但随着农药的大量应用也造成了农业及人类生活的各个方面的不利影响。目前，世界各地近3000种农用品中使用了超过800种活性成分。由于人口及其相关需求的增加，农药使用范围不断扩大;随着使用的迅速增加，农药残留在农产品中的量也在增加。这些化合物不仅具有毒性，而且具有生物活性和生物累积性。此外，农药还影响各种物理，化学和生物过程。农药残留物通过各种方法进入生物体内会对其产生危害，并通过生物链的作用一步步进入人体内对人类健康造成危害。因此，必须不断监测农药及其代谢物在农产品中的浓度水平。联合国粮食及农业组织和世界卫生组织已建立了农药残留限量（MRL）的最大值。近年来，一些MRL限制已经从ppm降低到亚ppm水平，以满足人类对食品安全需求。因此，为了保护人类免受农药造成的危害，需要研究出一些可靠可行的分析检测农药残留的方法。

目前，农药残留检测主要使用气相色谱(Gas Chromatography, GC），高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography, HPLC）和毛细管电泳（CapillaryElectrophoresis, CE）等多种色谱方法对农药残留物及其代谢产物进行了分析。由于GC和HPLC具有高灵敏度和选择性而成为了当前检测农药残留最常用的方法。然而，由于许多农药表现出热不稳定性和低挥发性，因此GC和HPLC需要使用大量的有机溶剂对样品进行繁琐的预处理程序和衍生化反应才能完成检测。因此，CE已成为分析农药残留及其降解产物的首选替代GC和HPLC的方法。CE由于分离效率高，分离时间短，试剂消耗少，操作简便等特点，广泛应用于农药测定，但与紫外-可见光检测器结合时，其浓度敏感性较低。为了克服这个限制，CE可以与样品离线预处理或高浓缩因子的在线浓缩技术结合使用。

发明内容

本发明旨在构建一种快速检测有机杂环类除草剂残留的方法，提高其检测有机杂环类除草剂残留的敏感性，从而有效有机杂环类除草剂的残留，建立高效的毛细管电泳检测有机杂环类除草剂的技术体系。

为了实现本发明的目的，本发明构建一种快速检测有机杂环类除草剂残留的方法，具体的操作步骤如下：

1）、毛细管电泳检测条件的筛选

首先就有机杂环类除草剂的毛细管电泳检测条件进行筛选优化，并选出了一种最佳的毛细管电泳分离条件；其主要研究的参数包括：检测波长的选择、运行缓冲液的选择、分离介质的确定（分别对比硼砂溶液的浓度梯度为5、10、15、20和25 mmol/L）、PH参数筛选（筛选PH分别为8、8.5、9、10和10.5）、有机试剂体积分数的确定（选用甲醇作为有机改性试剂，并设置了其体积分数为0、5、7.5、10、15、20%的六个浓度梯度进行筛选）、表面活性剂对分离的影响（选择十二烷基硫酸钠10、20、30、40、50和60 mmol/L进行筛选）和分离电压（筛选了六个电压梯度从5、10、15、20、25和30 KV）；

最后确定了其检测的基本条件和运行参数：以10 mmol/L硼砂做为运行缓冲液，PH为9.5，30 mmol/L十二烷基硫酸钠，7.5%甲醇溶液为最佳分离介质；其它条件的设置为：进样压力为0.5 psi，进样时间为5s，分离电压为15 KV，毛细管柱温为：25℃，检测波长为221nm；为后续实际应用中检测有机杂环类除草剂的残留奠定基础；

2）、标准曲线的建立

在上述最佳毛细管电泳（Capillary Electrophoresis，CE）检测条件下，依次对五种农药的不同浓度（0.5、1、2、5、10 mg/L）标准液的测定并记录其检测的峰面积；每个检测重复三次，利用Excel软件处理数据；以五种样品组分的浓度做为横坐标（X），以所测得的峰面积为纵坐标（Y），对两者做回归分析，发现5种农药样品在0.1-10 μg/mL浓度下都具有良好的的线性关系；根据线性关系建立相应图表，同时可以计算出五种农药：西玛津、氰草津、西草净、扑草净、及特丁津的检出限为0.05 μg/mL；根据样品预处理方法的检出限为0.1 μg/g；

筛选出的最佳检测条件建立了五种农药毛细管电泳检测方法的标准曲线；实验结果表明五种农药在0.1-10 μg/mL范围内有线性；方法的检出限为0.05-0.1 μg/mL（S/N=5）范围内，方法平均加标回收率在72-100%之间，相对标准偏差（RSD）小于3%；方法符合农药残留检测要求。

结果表明，实验结合了固相萃取的样品前处理技术对农田水样中四种除草剂的成功检测，方法再次验证了本论文所建立的毛细管电泳检测农药残留的方法有效。实验检测到在喷药一周后农田水样中四种除草剂西玛津、氰草津、西草净、扑草净的浓度分别为0.029、0.025、0.042、0.053 μg/mL。

总之，本次利用毛细管电泳技术对五种农药进行检测条件筛选与优化后所建立的毛细管电泳检测标准曲线，结合固相萃取技术做为样品前处理技术可做为有效的农田水样中五种除草剂的检测方法。该方法简单，快速、灵敏度高，稳定性好，同时样品需求量少，成本低等优点的农药残留检测方法。

附图说明

图1为五种除草剂标样浓度与峰面积的标准曲线图。

图2为农田水样CE检测图。

图3为五种除草剂在不同电压下迁移时间变化折线图。

图4为不同硼砂浓度对五种除草剂迁移时间影响图。

图5为缓冲液PH对五种除草剂迁移时间影响图。

图6为甲醇对五种除草剂迁移时间影响图。

图7为SDS浓度对五种除草剂迁移时间影响图。

具体实施方式

下面对本发明作进一步说明，本发明构建一种快速检测有机杂环类除草剂残留的方法，具体的操作步骤如下：

本次实验所筛选出的最佳色谱检测条件为：10 mmol/L硼砂，30 mmol/L十二烷基硫酸钠，7.5%甲醇溶液，运行缓冲液的PH为9.5。其它条件的设置：进样压力为0.5 psi，进样时间为5 s，分离电压为15 KV，毛细管柱温为25 ℃，检测波长为221 nm。

毛细管电泳检测检具体参数的筛选

检测波长的选择

检测波长的选择对CE检测的灵敏度很重要，二极管阵列检测器具有多波长检测功能，本次实验采用全波长进行检测，对这五种农药进行紫外吸收扫描发现这五种农药的最大吸收波长为221 nm,所以本实验中采用221 nm作为后续实验的检测波长。

分离电压的选择

分离电压是影响CE检测分析中样品组分分离度和迁移时间的一个重要因素。由于其原理是高压直流电场，可以通过改变分离电压来改变电场强度，从而改变样品的迁移时间，增加电压可以缩短样品分离时间，但由于在高电压下分离电流会增大，从而会产生过多的焦耳热，引起区带增宽，从而降低CE分离效率。所以，选择一个合适的分离电压对于CE检测也是很重要的。

在10 mmol/L硼砂，30 mmol/L十二烷基硫酸钠，7.5%甲醇溶液，运行缓冲液的PH为9.5条件下，考查了六个电压梯度从5、10、15、20、25、30 KV，基本含盖了CE所能达到的电压设置范围。从图3中可以看出这五种农药的迁移时间都随着电压的增大而减小。其中特丁津与扑草净的迁移时间相差不大，而氰草津与西玛津的迁移时间也相差不大。在上图中如果仅仅凭折线图基本上分辩不出哪一个电压情况下可以使这五种农药的标准品达到基线分离，而选择出一个合适的电压。但是通过对CE的几个图谱进行比较发现，五种农药可以在电压为15 KV时可以达到基线分离，而且此时的检测电流基本在30 μA左右，在这一电流下即能够保证CE仪的正常检测，也能使五种样品正常分离，又不会产生太大的焦耳热。如果再继续降低分离电压则分离效果不佳，而分离时间也会大量延长。若分离电压大于15 KV，则五种农药也不能达到基线分离。综合上述确定15 KV为本实验的最佳检测分离电压。

图3为五种除草剂在不同电压下迁移时间变化折线图。

运行缓冲液浓度的选择

运行缓冲溶液不同的浓度会影响到毛细管表面Zeta电势的大小以及背景电解质溶液的黏度，进而会影响电渗流和分离效果。在一定范围内增加缓冲液的浓度可以增强柱效，提高样品的分离效率。在30 mmol/L十二烷基硫酸钠，7.5%甲醇溶液，运行缓冲液的PH为9.5，分离电压为15 KV条件下，设置硼砂溶液的浓度梯度为5、10、15、20、25 mmol/L时对样品分离度的影响，不同硼砂浓度下各样品的迁移时间及分离效果如图4。从图4中可以发现五种样品随着硼砂浓度的增大其迁移时间变长。各样品的分离度也随着硼砂浓度的增大而改善。可以发现硼砂浓度在5、10、15、20 mmol/L时五种农药基本上都可以达到基线分离，但是硼砂浓度为5 mmol/L时，其检测电流过低在25 μA左右，并不适合毛细管电泳的正常检测；当硼砂浓度为10 mmol/L时，检测电流达到31 μA适合毛细管电泳检测；当硼砂浓度在15、20mmol/L时出现了前拖峰，峰型不理想；当硼砂浓度为25 mmol/L时，前两种样品没有达到基线分离，也出现了前拖峰。综上所述，实验最后确定10 mmol/L做为硼砂的最佳浓度。

图4为不同硼砂浓度对五种除草剂迁移时间影响图。

缓冲液PH的选择

缓冲溶液的p H值也能影响到电渗流的大小和分析物的电离程度，进而可以改变分析物的迁移行为和分离效果。本实验通过固定缓冲液的浓度为10 mmol/L硼砂，通过氢氧化钠溶液和硼酸溶液来调节运行缓冲液的PH。本实验考查了PH值范围在8-10.5之间时，五种农药的迁移时间拆线图如图5。从图5中可以看出，随着PH值的增大，实验中的五种农药标准品的迁移时间都有一定的延长，可以看出PH对农药迁移时间的影响不及硼砂浓度。通过比较CE检测图谱，当PH为8.5时，样品没有达到基线分离；当PH为9.0时，样品也没有达到基线分离；当PH为9.5时，五种实验样品都达到基线分离，峰型好；当PH为10.0时，后面两种样品没有达到基线分离；当PH为10.5时检测基线不平稳且样品没有达到基线分离；所以综合上述可以确定PH等于9.5为最佳检测PH。

图5为缓冲液PH对五种除草剂迁移时间影响图。

有机试剂体积分数的确定

在CE检测研究中，通常加入一些有机试剂在缓冲液中，向缓冲液中加入有机试剂可使溶液的电导率减小，电流降低，从而影响电渗流和分离度。本实验中选用甲醇作为有机改性试剂，并设置了其体积分数为0、5、7.5、10、15、20%的六个浓度梯度，其影响结果如图6。从图6中可以发现，增加有机试剂的浓度，五种组分的迁移时间都会延长。当甲醇的体积分数为0%时五种样品组分没有达到基线分离；当甲醇体积分数为5%时五种样品接近基线分离，样品峰稍有一点前拖；当甲醇体积分数为7.5%时，五种样品组分都达到基线分离，样品峰型理想；当甲醇体积分数为10%时样品没有达到基线分离，且基线不平稳有杂峰；当甲醇体积分数为15%时，样品没有达到基线分离，且分离度很差，有两种样品的峰与另外两种重合，一共只出现三个峰；当甲醇体积分数为20%时，五样品基本达到基线分离，但是迁移时间太长达到35 min；最终本实验确定最佳甲醇体积分数为7.5%。

图6为甲醇对五种除草剂迁移时间影响图。

表面活性剂对分离的影响

SDS（十二烷基硫酸钠）表面带负电，在CE检测过程中与电渗流的方向恰好相反，分离过程中会往阳极迁移，而SDS的浓度也对样品分离的影响比较大。当不加SDS时，也就是毛细管的区带电泳模式，但是实验中的五种组分的迁移时间都基本相同，所以不加表面活性剂对本实验不合适。进而考察SDS从10-60 mmol/L范围共设六个浓度梯度，各浓度下五种样品的迁移时间如图7。从图7中可以看出五种样品的迁移时间随着SDS的浓度的增加而增加。当SDS浓度为10 mmol/L时，五种样品组分的分离效果不好，没有达到基线分离；当SDS浓度为20 mmol/L时，五种样品组分没有达到基线分离，且样品峰型不好；当SDS浓度为30 mmol/L时，五种样品组分达到基线分离，样品峰型好；当SDS浓度为40、50、60 mmol/L时，五种样品组分都没有达到基线分离。所以综合上述，可以确定30 mmol/L为最佳SDS浓度。

图7为SDS浓度对五种除草剂迁移时间影响图。

通过以上几个单因素实验，确定了这五种农药检测五个影响因素的最佳参数，即：10mmol/L硼砂，30 mmol/L十二烷基硫酸钠，7.5%甲醇溶液，运行缓冲液的PH为9.5，分离电压为15 KV。最后利用所选出来的最佳组合可以得到本实验检测的这五种除草剂的标准检测图谱。实验中的五种组分可以在24分钟内达到基线分离。

毛细管电泳检测标准曲线的建立

溶液配制

购买的五种农药标准溶液都为100 μg/mL,将五种标准品溶液混合并用甲醇稀释至10mg/L做母液，再分别配制成0.5、1、2、5、10 mg/L的标准混合溶液备用。

毛细管电泳条件

新毛细管的清洁与活化处理及毛细管每天使用前处理与第二章的处理步骤相同。通过第二章节所筛选出的最佳CE检测条件：10 mmol/L硼砂，30 mmol/L十二烷基硫酸钠，7.5%甲醇溶液，运行缓冲液的PH为9.5。其它条件的设置：进样压力为0.5 psi，进样时间为5 s，分离电压为25 KV，毛细管柱温为：25 ℃，检测波长为221 nm。

五种农药CE检测标准曲线

在上述最佳CE检测条件下，依次对五种农药的不同浓度（0.5、1、2、5、10 mg/L）标准液的测定并记录其检测的峰面积。每个检测重复三次，利用Excel软件处理数据。以五种样品组分的浓度做为横坐标（X），以所测得的峰面积为纵坐标（Y），对两者做回归分析，发现5种农药样品在0.1-10 μg/mL浓度下都具有良好的的线性关系。五种农药组分的标准曲线方程及线性参数如下表1。同时可以计算出五种农药：西玛津、氰草津、西草净、扑草净、及特丁津的检出限为0.05 μg/mL。根据样品预处理方法的检出限为0.1 μg/g。

表1：五种样品组分的标准曲线方程及线性参数如下：

有机杂环类除草剂的毛细管电泳检测的应用验证

样品预处理

在一星期前喷过四种除草剂的试验田中取水样500 mL，利用0.45 μm滤膜减压过滤后量取200 mL,再用由甲醇、乙睛和水活化过的ODS－C18固相萃取小柱吸附。分别用6 mL超纯水、5%的甲醇水溶液冲洗固相萃取柱后,连续抽真空5 min,最后用5 mL甲醇洗脱柱上农药,洗脱液在氮吹仪上于40 ℃下蒸发至近干,精确加入0.2 mL超纯水溶解用于CE检测。

CE检测分离条件

新毛细管的清洁与活化处理及毛细管每天使用前处理与第二章的处理步骤相同。电泳条件为第二章所筛选出的最佳CE检测条件：10 mmol/L硼砂，30 mmol/L十二烷基硫酸钠，7.5%甲醇溶液，运行缓冲液的PH为9.5。其它条件的设置：进样压力为0.5 psi，进样时间为5s，分离电压为25 KV，毛细管柱温为25 ℃，检测波长为221 nm。

农田水样CE检测结果

从图2及表2中可以看出利用先前所建立的CE检测方法能够对这四种除草剂进行检测，在利用固相萃取处理过的水样中检测到西玛津、氰草津、西草净、扑草净的残留分别为2.921、2.520、4.224、5.281 μg/mL。而在实际水样中的残留量分别为：0.029、0.025、0.042、0.053 μg/ml。

表2农田水样检测结果如下

结果表明：此次建立的CE检测这五种除草剂农药的方法简单、方便、快捷、灵敏度高、稳定性好、同时样品需求量少，成本低等优点。可以作为农药检测的有效方法。

Claims (1)

1.一种快速检测有机杂环类除草剂残留的方法，其特征在于：所述方法包括以下操作步骤：

1）、毛细管电泳检测条件的筛选

首先就有机杂环类除草剂的毛细管电泳检测条件进行筛选优化，并选出了一种最佳的毛细管电泳分离条件；其主要研究的参数包括：检测波长的选择、运行缓冲液的选择、分离介质的确定（分别对比硼砂溶液的浓度梯度为5、10、15、20和25 mmol/L）、PH参数筛选（筛选PH分别为8、8.5、9、10和10.5）、有机试剂体积分数的确定（选用甲醇作为有机改性试剂，并设置了其体积分数为0、5、7.5、10、15、20%的六个浓度梯度进行筛选）、表面活性剂对分离的影响（选择十二烷基硫酸钠10、20、30、40、50和60 mmol/L进行筛选）和分离电压（筛选了六个电压梯度从5、10、15、20、25和30 KV）；

最后确定了其检测的基本条件和运行参数：以10 mmol/L硼砂做为运行缓冲液，PH为9.5，30 mmol/L十二烷基硫酸钠，7.5%甲醇溶液为最佳分离介质；其它条件的设置为：进样压力为0.5 psi，进样时间为5s，分离电压为15 KV，毛细管柱温为：25℃，检测波长为221nm；为后续实际应用中检测有机杂环类除草剂的残留奠定基础；

2）、标准曲线的建立

在上述最佳毛细管电泳（Capillary Electrophoresis，CE）检测条件下，依次对五种农药的不同浓度（0.5、1、2、5、10 mg/L）标准液的测定并记录其检测的峰面积；每个检测重复三次，利用Excel软件处理数据；以五种样品组分的浓度做为横坐标（X），以所测得的峰面积为纵坐标（Y），对两者做回归分析，发现5种农药样品在0.1-10 μg/mL浓度下都具有良好的的线性关系；根据线性关系建立相应图表，同时可以计算出五种农药：西玛津、氰草津、西草净、扑草净、及特丁津的检出限为0.05 μg/mL；根据样品预处理方法的检出限为0.1 μg/g；

筛选出的最佳检测条件建立了五种农药毛细管电泳检测方法的标准曲线；实验结果表明五种农药在0.1-10 μg/mL范围内有线性；方法的检出限为0.05-0.1 μg/mL（S/N=5）范围内，方法平均加标回收率在72-100%之间，相对标准偏差（RSD）小于3%；方法符合农药残留检测要求。