CN109232899A - 一种pH和光响应性聚合物载体材料及其制备和固定化果胶酶的应用 - Google Patents
一种pH和光响应性聚合物载体材料及其制备和固定化果胶酶的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种pH和光响应性聚合物载体材料及其制备和固定化果胶酶的应用，该载体材料的结构式为：式中z的取值为50～60的整数，m取值为80～95的整数，n取值为10～30的整数，其通过原子转移自由基聚合、点击化学反应联合使用制备。本发明载体材料具有pH和光响应性，其与聚乙烯‑b‑聚甲基丙烯酸酯在水溶液中形成核‑壳型胶束，该胶束用于固定化果胶酶，使固定化果胶酶比游离果胶酶具有更好的温度、pH和储藏稳定性及其重复使用性。且通过环境刺激响应，使固定化果胶酶逐渐与底物相互接触发挥其催化作用。
Description
技术领域
本发明属于酶工程技术领域涉，具体及一种具有pH、光响应的聚合物载体材料，以及该载体材料的制备方法和其在固定化果胶酶中的应用。
背景技术
酶是一种具有高效性、专一性、特异性的生物催化剂，但酶的高级结构对于环境的改变很敏感，物理、化学、生物因素都有可能使酶失活甚至变性，例如高温、强酸、强碱等环境，而且在重复利用性和储藏稳定性方面也大大受到了限制。
介于此，固定化酶技术的发展越来越受重视。固定化酶可以在相同的极端环境下比自由酶表现出更好的稳定性，并且具有催化产品分离的优点，所以在许多领域已经有了很大的使用价值，例如，药物化学、食品化学和能源产品方面等。对于酶的固定化，载体是固定化技术的关键，良好的固定化载体材料具有稳定性好、对生物无毒性、机械强度高、不易引起酶变形等特点。一般固定化载体材料可分为天然高分子材料(海藻酸钠、纤维素等)、有机高分子材料(聚丙烯酰胺、聚乙烯醇等)和无机材料(二氧化硅、氧化铝等)。
多功能性高分子载体材料能够在外部环境的改变下导致相应的物理结构和化学性质的变化，具有良好的生物相容性、稳定性好等特点，是一种较好的固定化酶载体材料。其形貌结构可以通过环境的相应刺激而改变，间接性地调节固定化酶的活性。目前，关于酶的固定化方法主要分为物理吸附法，共价键法和包覆法。对于刺激响应型高分子载体，包覆法在环境的改变下会导致酶在反应体系中的遗漏；共价键法可以将酶以共价键的形式结合到载体上，但是由于酶分子结构的改变会影响酶的活性；物理吸附包括酶与载体之间的氢键、范德华力、亲疏水作用以及静电吸附作用，该方法既简单又不会影响酶的活性位点。
基于此，选择一种在不影响固定化酶量，保持酶的稳定性、重复利用性的基础之上，能够有效地调控固定化酶活性的载体材料对于固定化酶技术领域起着重要的作用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种具有pH和光响应性的聚合物载体材料，以及该载体材料的制备方法，并为该载体材料提供一种新的应用。
解决上述技术问题所采用的聚合物载体材料的结构式如下所示：
式中z的取值为50～60的整数，m取值为80～95的整数，n取值为10～30的整数。
上述聚合物载体材料的具体合成路线和合成步骤如下：
1、以溴异丁酸-5-丙炔基醚-2-硝基苄酯(alkyne-ONB-Br)为小分子引发剂、N,N-二乙基胺基甲基丙烯酸乙酯(DEAEMA)为单体、CuBr为催化剂、PMDETA为配体、环己酮(CYC)为溶剂，在氮气氛围下进行ATRP反应，得到式I所示的端基为炔基的聚N,N-二乙基胺基甲基丙烯酸乙酯(alkyne-ONB-PDEAEMA-Br)。
2、以alkyne-ONB-PDEAEMA-Br为引发剂、数均分子量为300的甲基丙烯酸单甲氧基聚乙二醇酯(PEGMA)为单体、CuBr为催化剂、PMDETA为配体、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)为溶剂，在氮气氛围下进行ATRP反应，得到式II所示的端基为炔基的聚N,N-二乙基胺基甲基丙烯酸乙酯-b-聚甲基丙烯酸单甲氧基聚乙二醇酯(alkyne-ONB-PDEAEMA-b-PPEGMA)。
3、以2-溴异丁酸-2-叠氮基乙酯(azide-Br)为小分子引发剂、苯乙烯(St)为单体、CuBr为催化剂、五甲基二乙烯三胺(PMDETA)为配体、丁酮(MIBK)和异丙醇(IPA)体积比1:1的混合液为溶剂，在氮气氛围下进行原子转移自由基聚合(ATRP)反应，得到式III所示的端基为叠氮的聚苯乙烯(azide-PS-Br)。
4、以azide-PS-Br和alkyne-ONB-PDEAEMA-b-PPEGMA为原料、CuBr为催化剂、PMDETA为配体、DMF为溶剂，在氮气氛围下进行点击化学反应，得到式IV所示的聚苯乙烯-溴异丁酸5-丙炔基醚-2-硝基苄酯-聚N,N-二乙基胺基甲基丙烯酸乙酯-b-聚甲基丙烯酸单甲氧基聚乙二醇酯(PS-ONB-PDEAEMA-b-PPEGMA)，即本发明pH和光响应性聚合物载体材料。
上述步骤1中，优选alkyne-ONB-Br与DEAEMA、CuBr、PMDETA的摩尔比为1:(80～120):(1～2):(1～2)。
上述步骤1中，进一步优选ATRP反应的温度为70～80℃、时间为10～12小时。
上述步骤2中，优选alkyne-ONB-PDEAEMA-Br与PEGMA、CuBr、PMEDTA的摩尔比为1:(30～60):(1～2):(1～2)。
上述步骤2中，进一步优选ATRP的反应温度为70～80℃、时间为10～12小时。
上述步骤3中，优选azide-Br与St、CuBr、PMDETA的摩尔比为1:(80～120):(1～2):(1～2)。
上述步骤3中，进一步优选ATRP反应的温度为60～70℃、时间为6～12小时。
上述步骤4中，优选alkyne-ONB-PDEAEMA-b-PPEGMA与azide-PS-Br、CuBr、PMDETA的摩尔比为1:1:(1～2):(1～2)。
上述步骤4中，进一步优选点击化学反应的温度为50～60℃、时间为24～48小时。
上述2-溴异丁酸2-叠氮基乙酯根据文献“ploymer chemistry,2015,53,2313-2319”中公开的方法合成；上述溴异丁酸-5-丙炔基醚-2-硝基苄酯根据文献“Polymer,2014,55,1436-1442.Polymer Chemistry,2010,1,161-163”中公开的方法合成。
本发明pH和光响应性聚合物载体材料在固定化果胶酶中的应用，具体方法如下：
1、将聚乙烯-b-聚甲基丙烯酸(PS-b-PMAA)和PS-ONB-PDEAEMA-b-PPEGMA溶于DMF中，将其混合溶液逐渐滴加到去离子水中，磁力搅拌30分钟，随后转移到截留分子量为8～14kDa的透析袋中，用去离子水透析2天，定期更换去离子水，得到核-壳型胶束(PS-b-PMAA/PS-ONB-PDEAEMA-b-PPEGMA)。
上述聚乙烯-b-聚甲基丙烯酸的结构式如下所示：
式中x的取值为50～60的整数，y的取值为80～90的整数，其根据文献“化学学报,2005,63,631-636”中公开的方法合成。
2、向步骤1制备的核-壳型胶束中加入果胶酶，在50～60℃下反应40～60分钟，离心分离，用pH为4.5～5.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液洗涤，得到固定化果胶酶。
上述固定化果胶酶中的应用，优选聚乙烯-b-聚甲基丙烯酸、pH和光响应性聚合物载体材料的质量比为1:1。
本发明是通过聚甲基丙烯酸嵌段上的羧基基团与果胶酶分子上的氨基基团之间的静电吸附作用将果胶酶固定在载体材料表面，实验证明，本发明的聚合物载体材料在溶液中有较好的稳定性，能为固定化果胶酶提供较多活性位点。果胶酶通过固定化后与游离果胶酶相比：在pH、温度变化的条件下有较宽的适用范围；储藏稳定性从20％提高到了34％～41％；重复使用性有所提升，重复使用8次后仍能保持初始酶活性的50％～55％；通过环境的刺激，证实相应的相对活性，储藏稳定性和重复使用性都会有所改变。因此，本发明具有刺激响应性的聚合物载体材料在固定化酶领域中具有潜在的应用。
附图说明
图1是实施例1制备的pH和光响应性聚合物载体材料的核磁氢谱图。
图2是实施例1制备的端基为炔基的聚N,N-二乙基胺基甲基丙烯酸乙酯(a)、端基为炔基的聚N,N-二乙基胺基甲基丙烯酸乙酯-b-聚甲基丙烯酸单甲氧基聚乙二醇酯(b)、端基为叠氮的聚苯乙烯(c)、pH和光响应性聚合物载体材料(d)的红外光谱图。
图3是芘在不同浓度实施例2制备的核-壳型胶束中的荧光谱图(激发波长为340nm)。
图4是图3中芘的I3/I1和核-壳型胶束浓度对数(logC)的分析谱图。
图5是通过动态光散射(DLS)检测实施例2制备的核-壳型胶束粒径随pH变化趋势图。
图6是实施例2制备的核-壳型胶束粒径在pH＝4.0缓冲溶液中紫外光照前后变化的DLS谱图。
图7是实施例2制备的核-壳型胶束在pH＝4.0缓冲溶液中365nm紫外光照前(A)和光照后(B)的透射图以及在pH＝5.0缓冲溶液(C)和pH＝7.0缓冲溶液(D)中的透射图。
图8是实施例1制备的载体材料固定化果胶酶和游离果胶酶的温度稳定性分析图。
图9是实施例1制备的载体材料固定化果胶酶和游离果胶酶的pH稳定性分析图。
图10是实施例1制备的载体材料固定化果胶酶和游离果胶酶的储藏稳定性分析图。
图11是实施例1制备的载体材料固定化果胶酶的重复使用性分析图。
具体实施方式
下面结合具体附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于这些实施例。
实施例1
式中z的取值为53，m的取值为86，n的取值为21。
1、分别将alkyne-ONB-Br(0.050g，0.142mmol)、PMDETA(0.025g，0.142mmol)、DEAEMA(2.230g，14.2mmol)、CYC(4mL)加入到干燥的50mL史莱克管中，在磁力搅拌下使溶液混合均匀后，在密封条件下进行两次氮气-真空-冷冻-解冻循环操作。随后快速加入CuBr(0.020g，0.142mmol)，进行第三次氮气-真空-冷冻-解冻循环操作。然后在70℃的氮气条件下反应12小时。反应结束后，将密封的反应体系敞开，暴露在空气中，并用四氢呋喃稀释，然后通过中性Al2O3层析柱除去CuBr，旋蒸除去四氢呋喃，将其装入3.5kDa规格的透析袋透析3天，冷冻干燥得到式I-1所示的alkyne-ONB-PDEAEMA-Br。
2、分别将式I-1所示的alkyne-PDEAEMA-Br(0.522g，0.0381mmol)、PMDETA(0.0066g，0.0381mmol)、PEGMA(1.143g，3.81mmol)、DMF(4mL)加入到干燥的50mL史莱克管中，在磁力搅拌下使溶液混合均匀后，在密封条件下进行两次氮气-真空-冷冻-解冻循环操作。随后快速加入CuBr(0.0054g，0.0381mmol)，进行第三次氮气-真空-冷冻-解冻循环操作。然后在70℃的氮气条件下反应12小时。反应结束后，将密封的反应体系敞开，暴露在空气中，并用四氢呋喃稀释，然后通过中性Al2O3层析柱除去CuBr，旋蒸除去四氢呋喃，将其装入12kDa规格的透析袋透析3天，冷冻干燥得到式II-1所示的alkyne-ONB-PDEAEMA-PPEGMA。
3、分别将azide-Br(0.010g，0.0424mmol)、PMDETA(0.0073g，0.0424mmol)、St(0.441g，4.24mmol)、MIBK和IPA的混合液(4mL，1:1，v/v)加入到干燥的50mL史莱克管中，在磁力搅拌下使溶液混合均匀后，在密封条件下进行两次氮气-真空-冷冻-解冻循环操作。随后，快速加入CuBr(0.0061g，0.0424mmol)，进行第三次氮气-真空-冷冻-解冻循环操作。然后在60℃的氮气条件下反应12小时。反应结束后，将密封的反应体系敞开，暴露在空气中，并用四氢呋喃稀释，然后通过中性Al2O3层析柱除去CuBr，旋蒸除去四氢呋喃，用甲醇和水的混合液(7:3，v/v)沉淀3次，在真空干燥箱中室温干燥12小时，得到式III-1所示的azide-PS-Br。
4、分别将式II-1所示的alkyne-ONB-PDEAEMA-b-PPEGMA(0.621g，0.0310mmol)、PMDETA(0.0107g，0.0620mmol)、式III-1所示的azide-PS-Br(0.172g，0.0310mmol)、DMF(4mL)加入到干燥的50mL史莱克管中，在磁力搅拌下使溶液混合均匀后，在密封条件下进行两次氮气-真空-冷冻-解冻循环操作。随后快速加入CuBr(0.0089g，0.0620mmol)，进行第三次氮气-真空-冷冻-解冻循环操作。然后在50℃的氮气条件下反应48小时。反应结束后，将密封的反应体系敞开，暴露在空气中，并用四氢呋喃稀释，然后通过中性Al2O3层析柱除去CuBr，旋蒸除去四氢呋喃，将其装入8～14kDa规格的透析袋透析3天，冷冻干燥得到式IV-1所示的PS-ONB-PDEAEMA-PPEGMA，即pH和光响应性聚合物载体材料。
本发明所合成产物通过核磁共振仪和红外光谱仪进行准确表征。图1中核磁氢谱的化学位移：1.00(-CH2 CH3 )、3.38(-OCH3 )、7.20-6.10(HAr)、7.50(-N-CH＝C-)以及图2中2016cm-1处叠氮峰的消失，证明pH和光响应性聚合物载体材料被成功合成。
通过凝胶渗透色谱分析得到，式I-1所示的alkyne-ONB-PDEAEMA-Br的Mn为13.68k，PDI为1.075；式II-1所示的alkyne-ONB-PDEAEMA-PPEGMA的Mn为20.04k，PDI为1.112；式III-1所示的azide-PS-Br的数均分子量(Mn)为5.54k，分子量分布(PDI)为1.032；式IV所示的pH和光响应性聚合物载体材料的Mn为26.50k，PDI为1.359。
实施例2
1、将式V所示的PS-b-PMAA(17.5mg，Mn为12.94k，PDI为1.230)和式IV-1所示的PS-ONB-PDEAEMA-b-PPEGMA(17.5mg)溶于DMF(10mL)中，将其混合溶液逐渐滴加到20mL去离子水中，磁力搅拌30分钟，随后转移到截留分子量为8～14kDa的透析袋，用去离子水透析2天，每隔7小时更换一次去离子水，得到核-壳型胶束(PS-b-PMAA/PS-ONB-PDEAEMA-b-PPEGMA)。
所得核-壳型胶束的临界胶束浓度以及环境刺激下的胶束粒径和形貌变化行为通过荧光分光光度计、激光粒度仪和透射电子显微镜和进行了表征，如图3～7。由图3和图4可见，所得核-壳型胶束在水溶液中的临界胶束浓度为0.0083mg/mL。由图5和图6可见，所得核-壳型胶束的pH临界点为6，且在365nm紫外光的照射下，胶束的粒径明显减小。由图7可见，在365nm紫外光照之前，pH＝5和pH＝7的条件下，所得核-壳型胶束粒径分别为80nm和40nm；在pH＝4的条件下，通过365nm紫外光照前后对比，胶束粒径由120nm变为85nm。
2、取10mL步骤1制备的核-壳型胶束，加入果胶酶，使体系中果胶酶的活性为10U/mL，然后在60℃的条件下振荡60分钟，离心分离，所得沉淀用pH为5.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液洗涤2次，得到固定化果胶酶。
发明人对实施例1制备的pH和光响应性聚合物载体材料固定化果胶酶的载酶量的影响，并对固定化果胶酶的温度稳定性、pH稳定性、储藏稳定性、重复使用性进行了研究，具体操作步骤如下：
1、固定化果胶酶的载酶量
1.1、固定化时间对载酶量的影响
向10mL实施例2步骤1制备的核-壳型胶束中加入果胶酶，使体系中果胶酶的活性为10U/mL，在60℃的条件下分别振荡15、30、45、60、90、120、150分钟，离心分离，取不同时间上清液2mL于10mL比色管，滴加等2mL DNS试剂后，沸水浴5分钟，冷却至室温，定容，通过紫外-可见分光光度计在540nm波长下测定其吸光度确定载酶量，结果见表1。
表1固定化时间对载酶量的影响
| 时间/分钟 | 15 | 30 | 45 | 60 | 90 | 120 | 150 |
| 载酶量mg/g | 159 | 185 | 214 | 223 | 223 | 221 | 222 |
1.2、pH对载酶量的影响
向10mL实施例2步骤1制备的核-壳型胶束中加入果胶酶，使体系中果胶酶的活性为10U/mL，并用柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液分别调节体系的pH为2.2、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，然后在60℃的条件下振荡60分钟，离心分离，取不同时间上清液2mL于10mL比色管，滴加等2mL DNS试剂后，沸水浴5分钟，冷却至室温，定容，通过紫外-可见分光光度计在540nm波长下测定其吸光度确定载酶量，结果见表2。
表2 pH对果胶酶吸附量的影响
| pH | 2.2 | 3.0 | 4.0 | 5.0 | 6.0 | 7.0 | 8.0 |
| 载酶量mg/g | 127 | 173 | 192 | 228 | 189 | 151 | 146 |
1.3、果胶酶浓度对载酶量的影响
向10mL实施例2步骤1制备的核-壳型胶束中加入果胶酶，使体系中果胶酶的活性分别为2、4、6、8、10、12U/mL，然后在60℃的条件下振荡60分钟，离心分离，取不同时间上清液2mL于10mL比色管，滴加等2mL DNS试剂后，沸水浴5分钟，冷却至室温，定容，通过紫外-可见分光光度计在540nm波长下测定其吸光度确定载酶量，结果见表3。
表3果胶酶浓度对果胶酶吸附量的影响
| 酶浓度U/mL | 2 | 4 | 6 | 8 | 10 | 12 |
| 载酶量mg/g | 174 | 185 | 201 | 221 | 223 | 222 |
1.4、温度对载酶量的影响
向10mL实施例2步骤1制备的核-壳型胶束中加入果胶酶，使体系中果胶酶的活性为10U/mL，分别在20、30、40、50、60、70℃的条件下振荡60分钟，离心分离，取不同时间上清液2mL于10mL比色管，滴加等2mL DNS试剂后，沸水浴5分钟，冷却至室温，定容，通过紫外-可见分光光度计在540nm波长下测定其吸光度确定载酶量，结果见表4。
表4温度对载酶量的影响
| 温度℃ | 20 | 30 | 40 | 50 | 60 | 70 |
| 载酶量mg/g | 160 | 168 | 189 | 208 | 221 | 187 |
综上所述，通过控制变量法，得出在果胶酶浓度为10U/mL，反应时间为60分钟，反应温度为60℃，反应体系pH为5.0时的固定化果胶酶量最大，可达223mg/g。
2、温度对固定化果胶酶活性的影响
向10mL实施例2步骤1制备的核-壳型胶束中加入果胶酶，使体系中果胶酶的活性为10U/mL，分别在20、30、40、50、60、70℃的条件下振荡30分钟。测定不同温度下的游离果胶酶和固定化果胶酶的相对活性(以酶活性最高值为100％)。如图8所示，由于载体材料对于酶的束缚，使固定化果胶酶活性总体上比游离果胶酶活性低，但固定化果胶酶的温度适应能力比游离果胶酶强，即酶稳定性有所提升。
3、pH对固定化果胶酶活性的影响
向10mL实施例2步骤1制备的核-壳型胶束中加入果胶酶，使体系中果胶酶的活性为10U/mL，并用柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液分别调节体系的pH为2.2、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，然后在60℃的条件下振荡30分钟。测定不同pH下的游离果胶酶和固定化果胶酶的相对活性(以酶活性最高值为100％)。如图9所示，虽然固定化果胶酶活性总体上比游离果胶酶活性低，但固定化果胶酶的pH适应能力比游离果胶酶强，即酶稳定性有所提升。值得注意的是，pH＝7.0时，固定化果胶酶的相对活性急剧下降，这是由于PDEAEMA链段在pH≥7.0条件下由质子化变为脱质子化，形貌变化由亲水性变为疏水性，保护了剩余酶活性避免在强碱条件下的失活。而且与紫外光照之前的固定化酶最大相对活性相比，由pH＝5.0变为pH＝4.0，说明该条件下的固定化酶具有更好的耐酸能力。
4、固定化果胶酶的储藏稳定性
将实施例2得到的固定化果胶酶与游离果胶酶至于4℃冰箱，随后通过在固定间隔时间的条件下(0、10、15、20、25、30、35、40天)测定固定化果胶酶和游离果胶酶的各自相对活性(以最初酶活性为100％)。如图10所示，固定化果胶酶的储藏稳定性由20％提高到了34％～41％。
5、固定化果胶酶的重复使用性
将10mg实施例2得到的固定化果胶酶加入到10mL 10mg/mL果胶水溶液中，在60℃的水浴中振荡30分钟，离心，用pH＝5.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液洗涤，继续加入等量果胶水溶液进行下一次反应，重复操作，测定每一次的相对酶活性(以酶活性最高值为100％)。如图11所示，随着重复次数的增加，相对酶活性也一直在减弱。重复八次后，相对酶活性仍可以保持至少50％。值得注意的是，紫外光照后的相对酶活性比紫外光照之前降低严重。果胶酶活性下降的原因在于洗涤过程中果胶酶的丢失或者酶分子构象发生改变。
以上对于固定化果胶酶活性、稳定性、重复实用性的研究足以说明，本发明载体材料为果胶酶提供了较为稳定的环境，可以避免在使用过程中果胶酶活性的快速下降。
Claims (9)
1.一种pH和光响应性聚合物载体材料，其特征在于：该载体材料的结构式如下所示：
式中z的取值为50～60的整数，m取值为80～95的整数，n取值为10～30的整数。
2.一种权利要求1所述的pH和光响应性聚合物载体材料的制备方法，其特征在于它由下述步骤组成：
(1)以溴异丁酸-5-丙炔基醚-2-硝基苄酯(ONB)为小分子引发剂，N,N-二乙基胺基甲基丙烯酸乙酯为单体，CuBr为催化剂，五甲基二乙烯三胺为配体，环己酮为溶剂，在氮气氛围下进行原子转移自由基聚合(ATRP)反应，得到式I所示的端基为炔基的聚N,N-二乙基胺基甲基丙烯酸乙酯；
(2)以端基为炔基的聚N,N-二乙基胺基甲基丙烯酸乙酯为引发剂、数均分子量为300的甲基丙烯酸单甲氧基聚乙二醇酯为单体、CuBr进行ATRP反应，得到式II所示的端基为炔基的聚N,N-二乙基胺基甲基丙烯酸乙酯-b-聚甲基丙烯酸单甲氧基聚乙二醇酯；
(3)以2-溴异丁酸-2-叠氮基乙酯为小分子引发剂、苯乙烯为单体、CuBr为催化剂、五甲基二乙烯三胺为配体、丁酮和异丙醇体积比1:1的混合液为溶剂，在氮气氛围下进行ATRP反应，得到式III所示的端基为叠氮的聚苯乙烯；
(4)以式III所示端基为叠氮的聚苯乙烯和式II所示端基为炔基的聚N,N-二乙基胺基甲基丙烯酸乙酯-b-聚甲基丙烯酸单甲氧基聚乙二醇酯为原料、CuBr为催化剂、五甲基二乙烯三胺为配体、N,N-二甲基甲酰胺为溶剂，在氮气氛围下进行点击化学反应，得到pH和光响应性聚合物载体材料。
3.根据权利要求1所述的pH和光响应性聚合物载体材料的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述的溴异丁酸-5-丙炔基醚-2-硝基苄酯与N,N-二乙基胺基甲基丙烯酸乙酯、CuBr、五甲基二乙烯三胺的摩尔比为1:(80～120):(1～2):(1～2)；所述原子转移自由基聚合反应的温度为70～80℃、时间为10～12小时。
4.根据权利要求1所述的pH和光响应性聚合物载体材料的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述的端基为炔基的聚N,N-二乙基胺基甲基丙烯酸乙酯与甲基丙烯酸单甲氧基聚乙二醇酯、CuBr、五甲基二乙烯三胺的摩尔比为1:(30～60):(1～2):(1～2)；所述原子转移自由基聚合反应的温度为70～80℃、时间为10～12小时。
5.根据权利要求1所述的pH和光响应性聚合物载体材料的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，所述的2-溴异丁酸-2-叠氮基乙酯与苯乙烯、溴化亚铜、五甲基二乙烯三胺的摩尔比为1:(80～120):(1～2):(1～2)；所述原子转移自由基聚合反应的温度为60～70℃、时间为6～12小时。
6.根据权利要求1所述的pH和光响应性聚合物载体材料的制备方法，其特征在于：步骤(4)中，所述的端基为炔基的聚N,N-二乙基胺基甲基丙烯酸乙酯-b-聚甲基丙烯酸单甲氧基聚乙二醇酯与端基为叠氮的聚苯乙烯、CuBr、五甲基二乙烯三胺的摩尔比为1:1:(1～2):(1～2)；所述点击化学反应的温度为50～60℃、时间为24～48小时。
7.权利要求1所述的pH和光响应性聚合物载体材料在固定化果胶酶中的应用。
8.根据权利要求7所述的pH和光响应性聚合物载体材料在固定化果胶酶中的应用，其特征在于：
(1)将聚乙烯-b-聚甲基丙烯酸、pH和光响应性聚合物载体材料溶于N,N-二甲基甲酰胺中，将其混合溶液逐渐滴加到去离子水中，磁力搅拌30分钟，随后转移到截留分子量为8～14kDa的透析袋中，用去离子水透析2天，得到核-壳型胶束；
上述的聚乙烯-b-聚甲基丙烯酸的结构式为：
式中x的取值为50～60的整数，y的取值为80～90的整数；
(2)向步骤(1)制备的核-壳型胶束中加入果胶酶，在50～60℃下反应40～60分钟，离心分离，用pH为4.5～5.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液洗涤，得到固定化果胶酶。
9.根据权利要求8所述的pH和光响应性聚合物载体材料在固定化果胶酶中的应用，其特征在于：步骤(1)中，所述聚乙烯-b-聚甲基丙烯酸、pH和光响应性聚合物载体材料的质量比为1:1。
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