CN109232378B - 从喙果皂帽花中提取的具有抗菌活性的马兜铃内酰胺类化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

从喙果皂帽花中提取的具有抗菌活性的马兜铃内酰胺类化合物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种从喙果皂帽花中提取的具有抗菌活性的马兜铃内酰胺类化合物及其制备方法和应用，从喙果皂帽花根部分离得到了三种新马兜铃内酰胺类化合物，分别为连有2个甲氧基和2个羟基的马兜铃内酰胺（化合物Ⅰ）、3个甲氧基和2个羟基的马兜铃内酰胺（化合物Ⅱ，7位为羟基）、3个甲氧基和2个羟基的马兜铃内酰胺（化合物Ⅲ，7位为甲氧基），化合物Ⅱ和化合物Ⅲ是同分异构体。其中化合物Ⅰ和化合物Ⅱ对蜡状芽孢杆菌有明显的抗菌活性，化合物Ⅰ和化合物Ⅱ对白色葡萄球菌(Staphylococcus albus)和大肠杆菌(Escherichia coli)有微弱的抑菌活性。

Description

从喙果皂帽花中提取的具有抗菌活性的马兜铃内酰胺类化合 物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物化学医药技术领域，具体涉及一种从喙果皂帽花中提取的具有抗菌活性的马兜铃内酰胺类化合物及其制备方法和应用。
背景技术
番荔枝科(Annonaceae)皂帽花属(Dasymaschalon)植物，全世界共有16种，分布于亚洲热带地区，作为民间常用药用植物，皂帽花属植物对疟疾、风湿性骨痛等疾病有较好的疗效。近几十年国内外学者对皂帽花属植物粗提物或单体化合物的生物活性进行了筛选，发现皂帽花属植物具有广泛的药理活性，如抗菌、抗炎、抗病毒、抗肿瘤、抗疟等活性。在对其化学成分研究中分离得到了生物碱、黄酮、环己烯衍生物、番荔枝内酯类、芳香族类等化合物。
喙果皂帽花(Dasymaschalon rostratum Merr.)为番荔枝科(Annonaceae)皂帽花属(Dasymaschalon)植物，是一种生长在山地疏林之中灌木或者小乔木，主要分布在印度、菲律宾以及中国的亚热带地区，在民间主要用于治疗疟疾、风湿性骨痛等疾病。该属植物在我国有3种，分别为黄花皂帽花(D.sootepense)、喙果皂帽花(D.rostratum)和皂帽花(D.trichophorum)，分布在海南及广东西南部等地区。据文献报道，皂帽花属植物中富含生物碱、黄酮、环己烯衍生物、番荔枝内酯、芳香族类等化合物，并表现出抗菌、抗肿瘤等生物活性，但喙果皂帽花根的化学成分及生物活性未见研究报道。
马兜铃内酰胺是皂帽花属植物中典型的一类化学成分，该类化学成分和药理作用的研究一直受到国内外学者的广泛关注。马兜铃内酰胺类化合物具有较好的细胞毒活性、抗菌、抗氧化、抗疟、抗炎、抗血小板凝聚和其他生物活性。本发明为了寻找更好的具有生物活性的单体化合物，对富含马兜铃内酰胺的喙果皂帽花进行了系统的分离，以期为今后皂帽花属的研究提供更好的依据。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供从喙果皂帽花中提取的具有抗菌活性的含有两个羟基的马兜铃内酰胺类化合物及其制备方法和应用。
实现本发明目的的技术方案是一种从喙果皂帽花中提取的具有抗菌活性的马兜铃内酰胺类化合物，其结构如式Ⅰ所示：
Figure GDA0003688414610000021
一种如式Ⅰ所述的马兜铃内酰胺类化合物的制备方法，包括以下步骤：
①浸膏提取：将喙果皂帽花根放在通风阴凉处阴干后粉碎，用乙醇溶液在室温下浸泡，将乙醇浸泡的药液进行浓缩提取，得到乙醇浸膏。
②植物浸膏的萃取：将步骤①乙醇提取的粗浸膏分散在蒸馏水中，用乙酸乙酯萃取，合并各次萃取液并减压蒸馏浓缩，得到乙酸乙酯部位的总浸膏。
③将步骤②萃取所得的乙酸乙酯浸膏拌样，通过硅胶柱层析色谱进行分离，乙酸乙酯浸膏用石油醚：乙酸乙酯(100:0–50:50，V/V)以及氯仿-甲醇(100:0–0:100，V/V)混合溶剂浓度递增进行分离，按照每次500mL来收集馏出的组份，通过TLC的检测，合并相似组份，得到Fr.1至Fr.12共12个组份。
④对于步骤③得到的Fr.7组份，Fr.7经正相硅胶柱分离，用石油醚：乙酸乙酯(1:0–0:1,V/V)浓度梯度洗脱得到9个组分(Fr.7-1～Fr.7-9)；对于其中的Fr.7-8组份，Fr.7-8经葡聚糖凝胶柱色谱，分离得到化合物Ⅰ。
一种如权式Ⅰ所述的马兜铃内酰胺类化合物在制备抗蜡状芽孢杆菌药物中的应用。
一种从喙果皂帽花中提取的具有抗菌活性的马兜铃内酰胺类化合物，其结构如式Ⅱ所示：
Figure GDA0003688414610000022
一种如式Ⅱ所述的马兜铃内酰胺类化合物的制备方法，包括以下步骤：
①浸膏提取：将喙果皂帽花根放在通风阴凉处阴干后粉碎，用乙醇溶液在室温下浸泡，将乙醇浸泡的药液进行浓缩提取，得到乙醇浸膏。
②植物浸膏的萃取：将步骤①乙醇提取的粗浸膏分散在蒸馏水中，用乙酸乙酯萃取，合并各次萃取液并减压蒸馏浓缩，得到乙酸乙酯部位的总浸膏。
③将步骤②萃取所得的乙酸乙酯浸膏拌样，通过硅胶柱层析色谱进行分离，乙酸乙酯浸膏用石油醚：乙酸乙酯(100:0–50:50，V/V)以及氯仿-甲醇(100:0–0:100，V/V)混合溶剂浓度递增进行分离，按照每次500mL来收集馏出的组份，通过TLC的检测，合并相似组份，得到Fr.1至Fr.12共12个组份。
④对于步骤③得到的Fr.7组份，Fr.7经正相硅胶柱分离，用石油醚：乙酸乙酯(1:0–0:1,V/V)浓度梯度洗脱得到9个组分(Fr.7-1～Fr.7-9)；对于其中的Fr.7-3组份，Fr.7-3经葡聚糖凝胶柱色谱，得到Fr.7-3-1，Fr.7-3-1经高效液相色谱分离，分离得到化合物Ⅱ。
一种如式Ⅱ所述的马兜铃内酰胺类化合物在制备抗蜡状芽孢杆菌药物中的应用。
一种从喙果皂帽花中提取的具有抗菌活性的马兜铃内酰胺类化合物，其结构如式Ⅲ所示：
Figure GDA0003688414610000031
一种如式Ⅲ所述的马兜铃内酰胺类化合物的制备方法，包括以下步骤：
①浸膏提取：将喙果皂帽花根放在通风阴凉处阴干后粉碎，用乙醇溶液在室温下浸泡，将乙醇浸泡的药液进行浓缩提取，得到乙醇浸膏。
②植物浸膏的萃取：将步骤①乙醇提取的粗浸膏分散在蒸馏水中，用乙酸乙酯萃取，合并各次萃取液并减压蒸馏浓缩，得到乙酸乙酯部位的总浸膏。
③将步骤②萃取所得的乙酸乙酯浸膏拌样，通过硅胶柱层析色谱进行分离，乙酸乙酯浸膏用石油醚：乙酸乙酯(100:0–50:50，V/V)以及氯仿-甲醇(100:0–0:100，V/V)混合溶剂浓度递增进行分离，按照每次500mL来收集馏出的组份，通过TLC的检测，合并相似组份，得到Fr.1至Fr.12共12个组份。
④对于步骤③得到的Fr.7组份，Fr.7经正相硅胶柱分离，用石油醚：乙酸乙酯(1:0–0:1,V/V)浓度梯度洗脱得到9个组分(Fr.7-1～Fr.7-9)；对于其中的Fr.7-3组份，Fr.7-3经葡聚糖凝胶柱色谱，得到Fr.7-3-1，Fr.7-3-1经高效液相色谱分离，分离得到化合物Ⅱ。
本发明具有积极的效果：(1)本发明从喙果皂帽花根部分离提取得到了三种新马兜铃内酰胺类化合物，分别为连有2个甲氧基和2个羟基的马兜铃内酰胺(化合物Ⅰ)、3个甲氧基和2个羟基的马兜铃内酰胺(化合物Ⅱ，7位为羟基)、3个甲氧基和2个羟基的马兜铃内酰胺(化合物Ⅲ，7位为甲氧基)，化合物Ⅱ和化合物Ⅲ是同分异构体。其中化合物Ⅰ和化合物Ⅱ对蜡状芽孢杆菌有明显的抗菌活性，化合物Ⅰ和化合物Ⅱ对白色葡萄球菌(Staphylococcus albus)和大肠杆菌(Escherichia coli)有微弱的抑菌活性。
(2)本发明的马兜铃内酰胺类化合物制备工艺简单，是对喙果皂帽花根的乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部位分离得到，对皂帽花属植物的利用和开发提供实践依据。
附图说明
图1为化合物Ⅰ的1H NMR(400MHz,Acetone-d6)谱；
图2为化合物Ⅰ的13C NMR(100MHz,Acetone-d6)谱；
图3为化合物Ⅰ的HSQC(100MHz,Acetone-d6)谱；
图4为化合物Ⅰ的HMBC(100MHz,Acetone-d6)谱；
图5为化合物Ⅰ的1H-1HCOSY(100MHz,Acetone-d6)谱；
图6为化合物Ⅰ的HR-ESI-MS图；
图7为化合物Ⅱ的1H NMR(400MHz,DMSO-d6)谱；
图8为化合物Ⅱ的13C NMR(100MHz,DMSO-d6)谱；
图9为化合物Ⅱ的HSQC(100MHz,DMSO-d6)谱；
图10为化合物Ⅱ的HMBC(100MHz,DMSO-d6)谱；
图11为化合物Ⅱ的HR-ESI-MS图；
图12为化合物Ⅲ的1H NMR(400MHz,DMSO-d6)谱；
图13为化合物Ⅲ的13C NMR(100MHz,DMSO-d6)谱；
图14为化合物Ⅲ的HSQC(100MHz,DMSO-d6)谱；
图15为化合物Ⅲ的HMBC(100MHz,DMSO-d6)谱；
图16为化合物Ⅲ的HR-ESI-MS图。
具体实施方式
本发明制备马兜铃内酰胺类化合物使用的是2017年1月从海南省昌江县霸王岭采集的喙果皂帽花，经过海南师范大学生命科学学院钟琼芯教授鉴定为番荔枝科皂帽花属植物—喙果皂帽花(D.rostratum Merr.)根，植物样本现放于海南师范大学热带药用植物化学教育部重点实验室标本室内。
(实施例1)
本实施例为化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的制备方法，包括以下步骤：
①浸膏提取：将喙果皂帽花根放在通风阴凉处阴干后粉碎，用90％(V/V)的乙醇溶液在室温下浸泡3次，浸泡时间7天/次，将乙醇浸泡的药液进行浓缩提取，得到乙醇浸膏。
②植物浸膏的萃取：将步骤①90％(V/V)的乙醇提取的粗浸膏分散在1L蒸馏水中，用乙酸乙酯萃取，萃取3～5次；萃取层无颜色后，合并各次萃取液并减压蒸馏浓缩，得到乙酸乙酯部位的总浸膏。
③将步骤②萃取所得的乙酸乙酯浸膏(37.1g)拌样，通过(100目～200目)硅胶柱层析色谱进行分离，乙酸乙酯浸膏用石油醚：乙酸乙酯(100:0–50:50，V/V)以及氯仿-甲醇(100:0–0:100，V/V)混合溶剂浓度递增进行分离，按照每次500mL来收集馏出的组份。通过TLC的检测，合并相似组份，得到Fr.1至Fr.12共12个组份。
④对于步骤③得到的Fr.7组份，Fr.7经正相硅胶柱(200-300目)分离，用石油醚：乙酸乙酯(1:0–0:1,V/V)浓度梯度洗脱得到9个组分(Fr.7-1～Fr.7-9)。
对于其中的Fr.7-3组份，Fr.7-3经葡聚糖凝胶柱色谱(氯仿：甲醇＝1:1)得到Fr.7-3-1，Fr.7-3-1经高效液相色谱分离，乙腈-水(24:76)为流动相，流速3mL·min-1，分离得到化合物Ⅱ(20.6mg)，化合物Ⅲ(11mg)。所用的葡聚糖凝胶柱色谱为葡聚糖LH-20凝胶，Sephadex LH-20，Pharmacia公司。
对于其中的Fr.7-8组份，Fr.7-8经葡聚糖凝胶柱色谱(氯仿：甲醇＝1:1)得到化合物Ⅰ(10.2mg)。所用的葡聚糖凝胶柱色谱为葡聚糖LH-20凝胶，Sephadex LH-20，Pharmacia公司。
化合物Ⅰ为棕黄色粉末。易溶于丙酮等有机溶剂。
化合物Ⅰ的结构式如下：
Figure GDA0003688414610000051
化合物Ⅰ的结构表征谱图见图1至图6。
分析所用的核磁共振仪型号Bruker AV-400MHz(瑞士Bruker公司)；红外光谱仪型号Avatar360(美国Nicolet公司)；高分辨质谱仪型号Varian 7.0T FTICR-MS；质谱仪型号Finnigan-MAT-95-MS；下同。
分析如下：
HR-ESI-MS m/z:312.0866[M+H]+(计算值312.0867)，确定化合物的分子式为C17H13NO5。红外数据表明化合物中存在羟基(3419cm-1)、羰基(1675cm-1)和苯环(1549,1461,1255和1098cm-1)等官能团。
化合物Ⅰ的1H NMR和13C NMR数据见下表1。
表1化合物Ⅰ的1H NMR和13C NMR数据(400/100MHz,Acetone-d6)
Figure GDA0003688414610000061
1H NMR谱中，在低场区显示4个芳环或芳杂环氢信号δH 8.76(1H,d,J＝8.4Hz,H-5),7.65(1H,s,H-9),7.33(1H,t,J＝8,16.4Hz,H-6)和7.05(1H,dd,J＝0.8,7.6Hz,H-7)，1个连氮氢信号δH 9.82(1H,s,N-H)；高场区显示2个甲氧基氢信号δH 4.46(3H,s,2-OCH3)和4.10(3H,s,3-OCH3)。此外，13C NMR谱中低场区显示有15个碳信号，其中包括一个酰胺羰基碳信号δC 167.4，为典型的马兜铃内酰胺骨架。此外，HMBC谱中可以看到H-5对C-7(111.4),C-4a(117.3)和C-8a(124.6)相关，H-6对C-7(111.4),C-8(154.3)和C-4b(128.5)相关，H-7对C-5(118.9),C-8(154.3)和C-8a(124.6)相关，H-9对C-8(154.3),C-10(134.7),C-4b(128.5)和C-10a(123.2)相关。在1H-1H COSY谱中，H-5和H-6，H-6和H-7直接相关，说明这些片段的连接方式。
化合物Ⅱ为黄色粉末，易溶于DMSO。
化合物Ⅱ的结构式如下：
Figure GDA0003688414610000062
化合物Ⅱ的结构表征谱图见图7至图11，分析如下：
HR-ESI-MS m/z:342.0972[M+H]+(计算值342.0972)，确定化合物的分子式为C18H15NO6。红外数据表明化合物中存在羟基(3425cm-1)、羰基(1677cm-1)和苯环(1462,1252和1065cm-1)等官能团。
化合物Ⅱ的1H NMR和13C NMR数据见下表2。
表2化合物Ⅱ的1H NMR和13C NMR数据(400/100MHz,DMSO-d6)
Figure GDA0003688414610000071
该化合物13C NMR谱低场区显示有15个碳信号其中包括一个酰胺羰基碳信号δC166.7，为典型的马兜铃内酰胺骨架。此外，1H NMR谱中，低场区显示3个芳环或芳杂环氢信号δH 8.58(1H,s,H-5),7.25(1H,s,H-8)和6.96(1H,s,H-9)，1个连氮氢信号δH 10.71(1H,s,N-H)；高场区显示3个甲氧基氢信号δH 4.30(3H,s,2-OCH3),4.02(3H,s,3-OCH3)和3.94(3H,s,6-OCH3)。HMBC谱中可以看到H-5对C-6(146.9),C-7(146.5),C-4a(115.9)和C-8a(129.0)相关，H-8对C-6(146.9),C-7(146.5),C-9(103.2)和C-4b(118.9)相关，H-9对C-8(112.9),C-10(133.2),C-4b(118.9),C-8a(129.0)和C-10a(120.0)相关。
化合物Ⅲ为黄色粉末，易溶于DMSO。
化合物Ⅲ的结构式如下：
Figure GDA0003688414610000072
化合物Ⅲ的结构表征谱图见图12至图16，分析如下：
HR-ESI-MS m/z:342.0973[M+H]+(计算值342.0972)，确定化合物的分子式为C18H15NO6。红外数据表明化合物中存在羟基(3435cm-1)、羰基(1692cm-1)和苯环(1549,1463,1256和1072cm-1)等官能团。
化合物Ⅲ的1H NMR和13C NMR数据见下表3。
表3化合物Ⅲ的1H NMR和13C NMR数据(400/100MHz,DMSO-d6)
Figure GDA0003688414610000081
该化合物13C NMR谱低场区显示有15个碳信号，其中包括一个酰胺羰基碳信号δC166.7，为典型的马兜铃内酰胺骨架。此外，1H NMR谱中，在低场区显示3个芳环或芳杂环氢信号δH 8.49(1H,s,H-5),7.22(1H,s,H-8)和7.02(1H,s,H-9)；高场区显示3个甲氧基氢信号δH 4.33(3H,s,2-OCH3),4.07(3H,s,3-OCH3)和3.89(3H,s,7-OCH3)。比较其1H NMR和13CNMR数据与化合物Ⅱ，化合物Ⅲ仅在部分化学位移上有所差别，可知两者含有相同的取代基，仅在取代基的位置上有区别。HMBC谱中可以看到H-5对C-7(145.7),C-4a(115.6)和C-8a(127.8)相关，H-8对C-6(145.3),C-9(105.2)和C-4b(119.3)相关，H-9对C-8(113.1),C-10(132.0),C-4b(119.3),C-8a(127.8)和C-10a(123.8)相关。
(试验例、抗菌活性测试)
1、实验材料
供试细菌：5种人致病菌，分别为：四联球菌(Micrococcus tetragenus)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、白色葡萄球菌(Staphylococcus albus)和大肠杆菌(Escherichia coli).
供试样品：化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。
实验仪器与试剂：96孔板、锥形瓶、酒精灯、超净工作台、酶标仪(ELx800)、各种量程的移液器、接种针、高温灭菌锅、培养皿、恒温振荡器、培养基恒温培养箱。
2、实验方法
测试方法：采用微量稀释法，此方法常用于测定敏感性药物或新药对人致病菌的抑菌活性试验，操作方法简便，可用于大数量的抑菌试验。一般使用营养肉汤培养基，将活化好的人致病菌接种到培养基内配置成菌液，待测药品用DMSO溶解配成1mg/mL。用二倍浓度递减稀释的方法对96孔板进行逐行稀释，稀释度为1:500-1:1000；将稀释后的含菌培养液分别定量加至96孔板的各个孔中；然后再加入已稀释的菌液，留出两孔作为对照，一孔只加培养基，而另一孔只加菌液，稀释完毕后震荡混合均匀，再将96孔板放置于37℃恒温培养箱中培养20h，用酶标仪测630nm下的吸光度，测算出最小抑制浓度MIC的值。
3、实验步骤
(1)致病菌株的准备：将5株致病菌分别从超低温冰箱拿出，活化备用。
(2)化合物的初筛：将培养基配好待用，每种细菌做两组平行初筛，将每种致病菌接种到各培养基中，然后放入恒温培养箱培养，时间为震荡培养6-12h。培养好的致病菌用培养液进行稀释(稀释梯度为1:500-1:1000)，将稀释后的含菌培养液分别定量加至96孔板的各个孔中；将待测样品配制成1mg/mL，分别取定量加至第一排孔中，然后等浓度梯度稀释。加完后置于恒温培养箱中37℃恒温培养，而后用酶标仪在630nm下测各孔吸光度。
(3)最小抑菌浓度的测试：将培养好的致病菌用培养液进行稀释，稀释梯度为1:500-1:1000；将稀释后的含菌培养液分别定量加至96孔板的第一排各孔中；然后将各样品分别加入至第一列孔中，然后依次等浓度梯度稀释。加完后置于恒温培养箱中37℃恒温培养，而后用酶标仪在630nm下测各孔吸光度。
4、实验结果，见下表4。
表4部分化合物的抗菌活性测试结果
Figure GDA0003688414610000091
注：环丙沙星为阳性对照。
从测试结果可知，化合物Ⅰ和Ⅱ对蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)有明显的抑菌活性。化合物Ⅰ和Ⅱ对白色葡萄球菌(Staphylococcus albus)和大肠杆菌(Escherichiacoli)有微弱的抑菌活性。

Claims (3)

1.一种从喙果皂帽花中提取的具有抗菌活性的马兜铃内酰胺类化合物的制备方法，其结构如式Ⅰ所示，
Figure FDA0003688414600000011
包括以下步骤：
①浸膏提取：将喙果皂帽花根放在通风阴凉处阴干后粉碎，用乙醇溶液在室温下浸泡，将乙醇浸泡的药液进行浓缩提取，得到乙醇浸膏；
②植物浸膏的萃取：将步骤①乙醇提取的粗浸膏分散在蒸馏水中，用乙酸乙酯萃取，合并各次萃取液并减压蒸馏浓缩，得到乙酸乙酯部位的总浸膏；
③将步骤②萃取所得的乙酸乙酯浸膏拌样，通过硅胶柱层析色谱进行分离，乙酸乙酯浸膏用石油醚-乙酸乙酯以及氯仿-甲醇混合溶剂浓度递增进行分离，洗脱剂石油醚-乙酸乙酯的体积比为100:0–50:50，洗脱剂氯仿-甲醇的体积比为100:0–0:100；
按照每次500mL来收集馏出的组份，通过TLC的检测，合并相似组份，得到Fr.1至Fr.12共12个组份；
④对于步骤③得到的Fr.7组份，Fr.7经正相硅胶柱分离，用体积比1:0–0:1的石油醚：乙酸乙酯梯度洗脱得到9个组分，分别为Fr.7-1～Fr.7-9；对于其中的Fr.7-8组份，Fr.7-8经葡聚糖凝胶柱色谱，分离得到化合物Ⅰ。
2.一种从喙果皂帽花中提取的具有抗菌活性的马兜铃内酰胺类化合物的制备方法，其结构如式Ⅱ所示：
Figure FDA0003688414600000012
包括以下步骤：
①浸膏提取：将喙果皂帽花根放在通风阴凉处阴干后粉碎，用乙醇溶液在室温下浸泡，将乙醇浸泡的药液进行浓缩提取，得到乙醇浸膏；
②植物浸膏的萃取：将步骤①乙醇提取的粗浸膏分散在蒸馏水中，用乙酸乙酯萃取，合并各次萃取液并减压蒸馏浓缩，得到乙酸乙酯部位的总浸膏；
③将步骤②萃取所得的乙酸乙酯浸膏拌样，通过硅胶柱层析色谱进行分离，乙酸乙酯浸膏用石油醚：乙酸乙酯以及氯仿-甲醇混合溶剂浓度递增进行分离，洗脱剂石油醚-乙酸乙酯的体积比为100:0–50:50，洗脱剂氯仿-甲醇的体积比为100:0–0:100；
按照每次500mL来收集馏出的组份，通过TLC的检测，合并相似组份，得到Fr.1至Fr.12共12个组份；
④对于步骤③得到的Fr.7组份，Fr.7经正相硅胶柱分离，用体积比1:0–0:1的石油醚：乙酸乙酯浓度梯度洗脱得到9个组分，分别为Fr.7-1～Fr.7-9；对于其中的Fr.7-3组份，Fr.7-3经葡聚糖凝胶柱色谱，得到Fr.7-3-1，Fr.7-3-1经高效液相色谱分离，分离得到化合物Ⅱ。
3.一种从喙果皂帽花中提取的具有抗菌活性的马兜铃内酰胺类化合物的制备方法，其结构如式Ⅲ所示，
Figure FDA0003688414600000021
包括以下步骤：
①浸膏提取：将喙果皂帽花根放在通风阴凉处阴干后粉碎，用乙醇溶液在室温下浸泡，将乙醇浸泡的药液进行浓缩提取，得到乙醇浸膏；
②植物浸膏的萃取：将步骤①乙醇提取的粗浸膏分散在蒸馏水中，用乙酸乙酯萃取，合并各次萃取液并减压蒸馏浓缩，得到乙酸乙酯部位的总浸膏；
③将步骤②萃取所得的乙酸乙酯浸膏拌样，通过硅胶柱层析色谱进行分离，乙酸乙酯浸膏用石油醚：乙酸乙酯以及氯仿-甲醇混合溶剂浓度递增进行分离，洗脱剂石油醚-乙酸乙酯的体积比为100:0–50:50，洗脱剂氯仿-甲醇的体积比为100:0–0:100；
按照每次500mL来收集馏出的组份，通过TLC的检测，合并相似组份，得到Fr.1至Fr.12共12个组份；
④对于步骤③得到的Fr.7组份，Fr.7经正相硅胶柱分离，用体积比1:0–0:1的石油醚：乙酸乙酯浓度梯度洗脱得到9个组分，分别为Fr.7-1～Fr.7-9；对于其中的Fr.7-3组份，Fr.7-3经葡聚糖凝胶柱色谱，得到Fr.7-3-1，Fr.7-3-1经高效液相色谱分离，分离得到化合物Ⅲ。
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