CN109207370A

CN109207370A - 丛枝菌根属真菌的复合培养基和共生包合物及其应用

Info

Publication number: CN109207370A
Application number: CN201710547454.4A
Authority: CN
Inventors: 周霞萍
Original assignee: 周霞萍
Current assignee: Shanghai Zhen derivatives Technology Co., Ltd.
Priority date: 2017-07-06
Filing date: 2017-07-06
Publication date: 2019-01-15
Anticipated expiration: 2037-07-06
Also published as: CN109207370B

Abstract

本发明公开了一种培养丛枝菌根属真菌的复合培养基、丛枝菌根属真菌的培养方法及其与复合培养基的共生包合物，以及由共生包合物制成的生物有机肥和复合控释肥。所述复合培养基包括腐植酸提取物以及真菌培养基；其中腐植酸提取物是从2％桑根、5％葛根、10％食用菌残余物、80％泥炭和3％褐煤的混合物经发酵提取的。本发明的丛枝菌根属真菌可在复合培养基中离体纯培养，用共生包合物生产生物有机肥和复合控释肥，可作为腐植酸抗逆抗盐碱肥，腐植酸粮食、果蔬专用肥，腐植酸水生生物生长持续利用肥，还有在育苗、花卉、富营养水中NPK、矿物质等的在线提取等多种应用，通过生物防治保护水土环境，提高肥料利用率，应用范围广。

Description

丛枝菌根属真菌的复合培养基和共生包合物及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种丛枝菌根属真菌的复合培养基和共生包合物及其应用。

背景技术

丛枝菌根真菌(Aarbuscular mycorrhizal fungi，AMF)能与大多数陆生植物根系形成菌根共生体，其占土壤微生物总生物量的10％以上。AMF从宿主植物获得碳水化合物，同时为植物带来一系列好处，如促进宿主植物的生长、促进植物对磷等养分的吸收、提高植物对干旱、重金属和盐碱的耐受性，还能增强土壤的稳定性与保水性。此外，AMF的存在及多样性是影响植物群落结构、多样性和生产力的主要决定因素，尤其是在退化生态系统中，AMF在植被恢复及重建过程中发挥着至关重要的作用。王义等采用丛枝菌根真菌和腐植酸联合改良土壤的研究(王义等从枝菌根真菌和腐植酸联合作用对矿区沙土改良效应研究，科技导报，2014，(7)：29-34)，宋培玲、郝丽芬、李欣州等运用丛枝菌根真菌特性提高植物抗病性的综述性报道(宋培玲，郝丽芬，李欣州，等.丛枝菌根真菌特性及其提高植物抗病性的研究进展[J].内蒙古农业科技，2013，(3)：84-85)，说明AMF已成为一种新型的微生物肥料，其在减少化肥和农药施用、减少环境污染、提高农作物产量等方面具有不可替代的作用。

当前，利用分子生物学方法对AMF物种多样性进行研究，极大地促进了AMF物种多样性研究，这对于AMF物种多样性的评估和理论研究是非常便利的。但是，通过分子手段得到的仅仅是AMF的DNA或蛋白序列等，而对AMF资源的保护和利用则需依靠形态学方法，从这个意义上讲，将形态学与分子手段相结合才能更好地研究AMF物种多样性。对AMF的形态学研究，首先需要得到AMF的离体纯培养。然而，丛枝菌根属是一类专性活体营养共生菌，通常只有与活体植物根系建立共生才能正常生长。文献(S Cranenbrouck et.al，Methodologies for in Vitro Cultivation of Arbuscular Mycorrhizal Fungi withRoot Organs，In Vitro Culture of Mycorrhizas.Volume 4of the series SoilBiology，2005，VII：341-375)披露了AMF离体培养的胡萝卜根培养体系，另外，专利申请(用于丛枝菌根真菌在液体培养基中连续繁殖和大量生产的体系和方法，申请号201480059125X，申请公布号CN105682449)披露了一种根器官培养物中AMF的体外生产，虽然上述方法都能做到体外培养，但它们仍然不能脱离根器官，只能算半离体的培养方法。如何解决AMF离体纯培养的技术，可能是AMF物种资源保护和与其相关的各种应用首先需要克服的技术瓶颈(刘敏等，丛枝菌根真菌物种多样性研究进展，微生物学通报，2016,43(8):1836-1843)。

发明内容

本发明为了克服目前尚不能使丛枝菌根属离体纯培养的问题，提供了一种含腐植酸提取物的复合培养基，其可以离体纯培养丛枝菌根属真菌两性囊霉属(Ambispora sp.)和原囊霉属(Archaeospora sp.)，还提供一种丛枝菌根属真菌和复合培养基制成的共生包合物，该共生包合物可用于生产腐植酸生物有机肥和腐植酸复合控释肥。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案之一是：一种用于培养丛枝菌根属真菌的复合培养基，所述复合培养基包括腐植酸提取物以及真菌培养基；

所述腐植酸提取物是从2％桑根、5％葛根、10％食用菌残余物、80％泥炭和3％褐煤的混合物经发酵提取的，所述的百分比为占混合物的质量百分比；

根据本发明，所述真菌培养基可以是本领域常规的真菌培养基。较佳地，包括0.3-1％碳源、0.02-0.1％氮源和无机盐，所述氮源为酵母浸出物，所述碳源选自葡萄糖、蔗糖和木糖中的一种或多种，所述无机盐为0.02-0.05％硫酸镁、0.01-0.03％磷酸锌和/或0.01-0.15％磷酸钙，pH为5.5-6.8，所述的百分比为占复合培养基的质量百分比。

更佳地，所述的复合培养基，其氮源为0.1％的酵母浸出物，其碳源为总量占1％的选自葡萄糖、蔗糖和木糖的一种或多种，其无机盐为0.05％的硫酸镁，0.03％的磷酸锌和0.15％的磷酸钙，pH为6.8，每kg所述复合培养基补足水和/或生物活性泥炭至其总量为1kg，所述的百分比为占复合培养基的质量百分比。

在本发明较佳实施例中，所述腐殖酸提取物的发酵提取方法，可以依次包含以下步骤：

1)用小型锤式破碎机将所述混合物粉碎至不大于80目；

2)发酵温度为20-50℃，发酵时间为24-240小时，压力为0.1-0.5Mpa；

3)发酵后先离心除去沉淀，将上清用孔径0.22-0.45μm亲和纤维膜进行过滤；

较佳地，所述混合物粉碎到20目，发酵温度为28℃，发酵时间为120小时，压力为0.5Mpa；所述离心为10,000×g离心至少10分钟，所述过滤用孔径0.22μm亲和纤维膜进行过滤。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案之一是：一种腐殖酸提取物，所述腐植酸提取物是从2％桑根、5％葛根、10％食用菌残余物、80％泥炭和3％褐煤的混合物经发酵提取制得，所述的百分比为占混合物的质量百分比。

较佳地，所述发酵提取依次包含以下步骤：

1)用小型锤式破碎机将所述混合物粉碎至不大于80目；

更佳地，所述混合物粉碎到20目，发酵温度为28℃，发酵时间为120小时，压力为0.5Mpa；所述离心为10,000×g离心至少10分钟，所述过滤用孔径0.22μm亲和纤维膜进行过滤。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案之一是：一种丛枝菌根属真菌的培养方法，其包括下述步骤：

1)将按常规方法分离的丛枝菌根属真菌两性囊霉属(Ambispora sp.)和原囊霉属(Archaeospora sp.)在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基中进行培养，

2)将步骤1)的菌移植入本发明所述的复合培养基进一步培养。

优选地，所述两性囊霉属包括Ambispora fennica，所述原囊霉属包括Archaeospora leptoticha、Archaeospora trappei和/或Archaeospora schenckii。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案之一是：一种由上述本发明培养方法制得的丛枝菌根属真菌共生包合物。

优选地，所述丛枝菌根属真菌总量为所述共生包合物的0.1％-1％，所述PDA的总量为所述共生包合物的1％-69.9％，所述复合培养基的总量为所述共生包合物的30-98％。更优选地，所述丛枝菌根属真菌总量为所述共生包合物的0.5％，所述PDA的总量为所述共生包合物的20％，所述复合培养基的总量为所述共生包合物的79.5％；所述的百分比为占所述共生包合物的质量百分比。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案之一是：一种含本发明共生包合物的生物有机肥或复合控释肥，其中，所述的丛枝菌根属真菌在制成的生物有机肥或复合控释肥的浓度为0.2-2.0×10⁹个/g。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案之一是：本发明腐植酸生物有机肥在抗逆抗盐碱地、粮食及果蔬专用肥及水生生物生长和持续利用中的应用。复合控释肥在麦子、玉米、高粱育苗中的应用，花卉、果树育苗及生长中的应用，富营养水中NPK和矿物质的在线提取及水稻、茭白、莲藕等种植中的应用。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。本发明所用试剂市售可得。

本发明的积极进步效果在于：本发明包含腐植酸提取物的用于培养丛枝菌根属真菌的复合培养基，首次可离体纯培养丛枝菌根属真菌两性囊霉属(Ambispora sp.)和原囊霉属(Archaeospora sp.)，还由此获得了包含复合培养基和丛枝菌根属真菌的共生包合物。复合培养基制备方法简单方便，共生包合物中的丛枝菌根属性能稳定。本发明利用共生包合物制得的生物有机肥用于盐碱土改良、抗土壤病虫害、水生生物种植；制得的复合控释肥，可以用于育苗、花卉、果树栽培、富营养水中NKP的在线吸收、土壤非枸溶性磷的释放以及螯合性矿物质的分解利用。

附图说明

图1为丛生菌根属在平板上的生长；平板从左到右分别为从陆生裸子植物根系：a)南方的盐碱土、b)北方的盐碱土；水生挺水植物：c)江浙海水、d)天津渤海水、e)云南异龙湖水、f)广东佛山湖水进行丛枝菌根属平板划线生长。

图2为带孢子状的AMF。

图3为PCR扩增得到的丛生菌根属DNA，序号1和2分别表示两性囊霉属和原囊霉属。

图4为内生AMF，包括两性囊霉属和原囊霉属。

图5为外生AMF，包括两性囊霉属和原囊霉属。

图6为盐碱地土质修复情况的微生物经结紫晶染色后在显微镜下的形态。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

实施例1丛枝菌根属菌株的提取、培养和鉴定

A.丛枝菌根属菌株的提取和培养：本发明由南方盐碱表层土至土层下1米、北方盐碱土表层土至土层下1.5米处的陆生裸子植物，江浙东海海水、天津渤海海水、云南异龙湖水、广东佛山湖水的水生挺水植物根系的丛枝菌根真菌Arbuscular mycorrhizal fungi(AMF)中经生物学和分子生物学常规手段(张金政等，中国盐碱土壤中AM菌的初步调查，莱阳农学院学报1999，16(1)，p2-6；葛立傲等，栌菊木共生丛枝菌根真菌的分离鉴定，贵州农业科学2016，44(10)：66-69)，分离出两性囊霉属(Ambispora sp.)和原囊霉属(Archaeospora sp.)，于马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA，上海国药集团)平板中划线生长。进行定时镜检，跟踪活性保持程度。

B.AMF形态鉴定：从PDA或下述本发明复合培养基液中提取样本，用湿筛倾析-蔗糖离心法(具体操作步骤参考王幼珊等：中国大陆地区丛枝菌根真菌菌种资源的分离鉴定与形态学特征，微生物学通报，2016,43(10):2154-2165)获取AMF孢子，于体视显微镜下观察测定其颜色、大小、形态、细胞壁层次和厚度等，综合以上观察结果，根据Schenck&Perez的《VA菌根真菌鉴定手册》、国际VA菌根保藏中心(International Collection Center ofVesicular and Arbuscular Mycorrhizal Fungi，INVAM，http://invam.wvu.edu/)提供的相应分类单元的原始发表进行初步分类。两性囊霉属的孢子颜色通常透明，白色至淡黄色；形状大部分球形或近球形，常规不规则；尺寸分布：40-120μm。原囊霉属的孢子颜色通常完全透明，成熟时呈乳白色；形状大部分球形或近球形，偶尔不规则；尺寸分布：50-80μm。图2为带孢子状的AMF。

C.DNA鉴定：DNA提取参考董秀丽等(嵌套多重PCR——研究田间植物部分丛枝菌根真菌和微生物区系的一个可行技术)，在解剖镜下挑取单个孢子，置于Eppendorf管中,用ddH₂O清洗孢子,弃上清。在40μL TE缓冲液(10mM Tris-HCl,1mM EDTA,pH 8.0)中破碎,并加入10μL 20％Chelex-100,95℃。加热10min,得到DNA粗提液，10,000×g(5417R台式冷冻离心机，Eppendorf)离心5min。取上清液作为PCR反应的模板DNA，用于PCR扩增的AML1(序列如SEQ ID No.1所示)和AML2(序列如SEQ ID No.2所示)是一对真核生物通用引物(上海美吉生物医药有限公司合成，PCR方法参见Lee等，Improved PCR primers for thedetection and identification of arbuscular mycorrhizal fungi,2008,FEMSMicrobiology Ecology 65(2):339-49)。表1为PCR反应的总体积和各试剂(TaKaRa Ex)配比。

表1PCR反应体系

试剂	体积(μl)
		dNTPs	9.0
MgCl<sub>2</sub>	4.0
		Taq 10×缓冲液	7.0
AML1	2.5
		AML2	2.5
Taq多聚酶	0.2
		DNA提取物	1.0
水(无核酸酶)	23.8
		总体积	50

PCR反应程序如下所示：

热盖105℃，初始变性94℃，5分钟；

30循环：变性:94℃，30秒；退火:58℃，60秒；延伸:72℃，60秒；

最终延伸:72℃，10分钟；4℃维持至PCR结束。

得到的PCR产物割胶回收，图5为PCR扩增得到的部分丛生菌根属DNA，序号1和2分别为PCR产物1和3。送至上海美吉生物测序，测序仪为ABI 3730XL测序仪，测序结果在GenBank中进行同源检索，检索结果说明丛枝菌根属多为两性囊霉属(Ambispora sp.如SEQID NO.3和SEQ ID NO.4所示)和/或原囊霉属(Archaeospora sp.如SEQ ID NO.5、SEQ IDNO.6和SEQ ID NO.7所示)，如表2所示。

表2PCR产物测序结果

实施例2腐植酸提取物的制备

A.腐植酸提取物1制备：原料由2％桑根、5％葛根、10％食用菌残余物、80％泥炭和3％褐煤(原料在浙江、上海、云南、黑龙江等资源地及生产地自行采购或采集)组成，先用小型锤式破碎机(鹤壁市银河分析仪器有限公司)粉碎到大约80目，发酵温度在28℃；发酵时间为120小时；发酵在0.3Mpa压力的发酵罐(FMG-5L(II)，上海国强生化工程装备有限公司)中进行。腐植酸提取物使用以水为溶剂的提取法，10,000×g离心至少10分钟后，分步采用孔径0.45μm、0.22μm亲和纤维膜过滤除菌。

B.腐植酸提取物2制备：原料同上A部分；先用小型锤式破碎机粉碎到50目，发酵温度在20℃，发酵时间240小时，发酵压力在0.1Mpa。所述腐植酸提取物用10,000×g离心至少10分钟，取上清用孔径0.45μm亲和纤维膜进行过滤。

C.腐植酸提取物3制备：原料同上A部分；先用小型锤式破碎机粉碎到20目，发酵温度在50℃，发酵时间24小时，发酵压力在0.5Mpa。所述腐植酸提取物用10,000×g离心至少10分钟，取上清用孔径0.22μm亲和纤维膜进行过滤。

实施例3复合培养基和共生包合物的制备

A.复合培养基的制备

1)复合培养基1的配方为：腐植酸提取物1(实施例2A.制备)3.65g，酵母浸出物0.2g，葡萄糖2g，木糖1g，硫酸镁0.25g，磷酸锌0.1g，磷酸钙0.1g，pH为5.5，每kg所述复合培养基补足水或生物活性泥炭(上海臻衍生物科技有限公司自制)至其总量为1kg，分别制得液体培养基和固体培养基。培养基制备后，在120℃下灭菌30min。

2)复合培养基2的配方为：腐植酸提取物2(实施例2B.制备)7.9g，酵母浸出物1g，葡萄糖5g，蔗糖2g，木糖3g，硫酸镁0.5g，磷酸锌0.3g，磷酸钙1.5g，pH为6.8，每kg所述复合培养基补足水或生物活性泥炭至其总量为1kg，分别制得液体培养基和固体培养基。培养基制备后，在120℃下灭菌30min。

3)复合培养基3的配方为：腐植酸提取物3(实施例2C.制备)13.3g，酵母浸出物0.6g，葡萄糖5g，硫酸镁0.5g，磷酸锌0.3g，磷酸钙1.5g，pH为6.2，每kg所述复合培养基补足水或生物活性泥炭至其总量为1kg，分别制得液体培养基和固体培养基。培养基制备后，在120℃下灭菌30min。

B.AMF共生包合物的制备

将实施例1中获得的丛枝菌根属真菌两性囊霉属(Ambispora sp.)和原囊霉属(Archaeospora sp.)为1:1制成混合菌苔，即总量为1g干重或10g干重，连同PDA平板分别接种至1kg实施例3A配制的复合培养基1、2或3中，混合均匀放置到培养箱中(BPX-162电热恒温培养箱，博迅)，28℃培养，每隔7天，对丛枝根菌根属复合培养基进行镜检，跟踪活性保持程度。一般培养7天，至丛枝菌根属真菌生长为孢子状态时可得。采用孔径规格0.05-8μm亲和纤维膜过滤工艺进一步筛选得到的丛枝菌属，并繁殖(此处孔径的纤维膜应为保留真菌，和腐植酸提取物的纤维膜去除杂质不同)。丛枝菌根属真菌Ambispora sp.和Archaeosporasp.于复合培养基1、2和3中均生长良好。图4为内生AMF，包括Ambispora sp.和Archaeospora sp；图5为外生AMF，包括Ambispora sp.和Archaeospora sp.。

在上述复合培养基中，液体培养基中制得为液态共生包合物，固体培养基中制得为固态共生包合物。

所述丛枝菌根属真菌总量为所述共生包合物的0.1％-1％，所述PDA的总量为所述共生包合物的1％-69.9％，所述复合培养基的总量为所述共生包合物的30-98％；较佳地，所述丛枝菌根属真菌总量为所述共生包合物的0.5％，所述PDA的总量为所述共生包合物的20％，所述复合培养基的总量为所述共生包合物的79.5％；所述的百分比为占所述共生包合物的质量百分比。

实施例4含腐植酸肥料的制备

A.生物有机肥的制备：将上述实施例3B制得的共生包合物，按照常规方法用于生产腐植酸生物有机肥。本实验设一个实验组和一个对照组，实验组按亩施含腐殖酸的生物有机肥量20kg，对照组施用常规施化肥，即二铵8kg，尿素9kg，硫酸钾3kg。经鉴定发现生物有机肥具有抗逆抗盐碱的效果。在土面取样，水分22.15％，有机质从对照组的13.6％增加到实验组的26.4％，测土出现了原生动物(参见图6)，通过电导率仪测定电导率并换算测定盐碱地处理前后的盐分浓度，去盐碱有效率达90％。

其中，选用本发明液态共生包合物的，可制成用作喷施用的生物有机肥。

B.腐植酸复合控释肥的制备

含丛枝菌根属的腐植酸固态包合物作为根际控释肥料，其包括下述步骤：

(1)将上述实施例3B制得的固态共生包合物，按照常规方法用于生产腐植酸复合控释肥。

(2)分别与自制的氮素控释肥、磷素控释肥、钾素控释肥料等按照丛枝菌根属的营养特性活化包合。丛枝菌根属的浓度为0.2-2.0×10⁹个/g或腐植酸控释肥质量的0.01‰。

实施例5生物有机肥和复合控释肥的应用

A.生物有机肥在抗逆抗盐碱、粮食及果蔬生长的应用

施用实施例4A制得的丛枝菌根属腐植酸肥2年后，在土面取样，水分22.15％有机质从对照组13.6％增加到实验组26.4％(参见图6，测土出现了原生动物)，通过电导率仪测定电导率并换算测定盐碱地处理前后的盐分浓度，由电导率换算到含盐量计算得到去盐碱有效率达90％。采用GB11893-2012钼酸铵分光光度计法测定总磷，GB11894-2012碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法测定总氮TN，采用GB11914-2012测定化学耗氧量COD(后续的总磷、总氮和COD测定方法同)。下表3为对照组及实验组土壤主要数据的变化。

表3土壤的总磷总氮等数据

	总磷(ms/L)	氨氮(mg/L)	化学耗氧量COD(mg/L)
				对照组	5.0	9.30	510
实验组	0.35	2.70	62

将实施例4A制得的生物有机肥用于小麦、南瓜、西红柿等粮食果蔬专用肥，有良好的抗逆作用。以对照组为基点，粮食、果蔬收成提高15-30％，减少抗菌性农药使用10-15％。改变了单一使用化学作物营养的品位，提高了作物质量。

B.生物有机肥在水生生物生长和持续利用中的应用

富营养水中的N、P营养元素含量接近水体毒性水平时被认为是一种污染。将实施例4A制备的腐植酸生物有机肥去除富营养水。即：选取芦苇、凤眼莲等水生生物，在丛枝菌根属的作用下，增加根系吸收总磷(TP)、总氮(TN)，包括氨氮的有效性，通过分解作用、沉降作用达到促进水生生物生长以及去除富营养水的效率80-98％，总钾从5.3mg/L下降到0.18mg/L。下表4为对照组及实验组土壤主要数据的变化。

表4土壤的总磷总氮等数据

	总磷(ms/L)	氨氮(mg/L)	化学耗氧量COD(mg/L)
				对照组	4.2	7.5	270
实验组	0.25	1.5	39

C.复合控释肥的应用

实施例4B制备的腐植酸复合控释肥，应用在麦子、玉米、高粱育苗，花卉、果树育苗及生长，富营养水中NPK和矿物质的在线提取及水稻、茭白、莲藕等种植中。腐植酸复合控施肥的技术术语，为本领域常规的方法和条件，可参考文件(Semra et al.Effescts ofarbuscular mycorrhizal fungus,humic acid,and whey on wilt disease caused byVerticillium dahlia Kleb.In three solanaceous crops.Turkish Journal ofAgriculture&Fouestry，2015,(2):300-309)及(Wu et al,Removal of Cd²⁺from aqueoussolution by adsorption using Fe-montmorillonite,J Hazard Mater,2009,169:824-830)。

将实施例4B制备的腐植酸控释肥，即：分步完成腐植酸与N、P|、K的聚合态后，通过动力学模型(将1g腐植酸控释肥料溶于1000ml的去离子水中，每隔12h取出，测定水体的N、P、K等浓度，建立时间与释放浓度曲线)，以此考察丛枝根菌属对腐植酸控释肥料的释放速度，结果为90-180天。在种子育苗时，可同时考虑氮磷钾等元素的缓释-控速度，出苗率高、且长效不烧苗，移栽没有缓苗期。可以与种子混播，实现种肥同播，用于设施农业、无土栽培的屋顶农场等，避免肥料养分流失的效果可达90％以上。

应用于水稻种植，有精准使用肥料、植物营养周全等优点。如，根据作物的不同生长周期，生产的腐植酸控释专用肥，以1kg/亩的施用量，可以改变因流失造成的作物在生长期内的反复施肥的浪费现象，至少节约30-50％的其它肥料。用于水土循环系统回收富营养成分、降解水体化学好氧量和生物好氧量(COD/BOD)。使水质达到了地表水的排放标准，而水体淤泥在丛枝根菌属及重力作用下、除臭化、颗粒增大转为循环肥料。其中对造成水体淤泥发臭的氨氮、从处理前的9.0mg/L降低到处理后的2.5mg/L，总磷从处理前的5.1mg/L降低到0.48mg/L，对克服我国肥料超量磷、超量N、以及钾素等流失造成的损失有很好的改变作用。

SEQUENCE LISTING

<110> 周霞萍

<120> 丛枝菌根属真菌的复合培养基和共生包合物及其应用

<130> P1710085C

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> AML1m

<400> 1

atcaactttc gatggtagga tagw 24

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> AML2m

<400> 2

gaacccaaaw actttggttt cc 22

<210> 3

<211> 799

<212> DNA

<213> Ambispora sp.

<400> 3

atcaactttc gatggtagga tagaggccta ccatggtttt aacgggtaac ggggaattag 60

ggttcgattc cggagaggga gcctgagaaa cggctaccac atccaaggaa ggcagcaggc 120

gcgcaaatta cccaatcccg acacggggag gtagtgacaa taaataacaa tacagggctc 180

tcacgagtct tgtaattgga atgagtacaa tttaaatctc ttaacgagga acaattggag 240

ggcaagtctg gtgccagcag ccgcggtaat tccagctcca atagcgtata ttaaagttgt 300

tgcagttaaa aagctcgtag ttgaattttg ggtctggccg ggcggtccgc cctctgggtg 360

agcactgttc cgacgccggg cctatccttc tggtgagtcg gcatgtcctt tgttgggtgt 420

gtcggggaac caggaccatt accttgaaaa aattagagtg ttcaaagcag gcgtatgctc 480

ggatacatta gcatggaata atgaaatagg acgcgtggtg ctattttgtt ggtttctaga 540

accgccgtaa tgattaatag ggatagttgg gggcattagt attcaattgt cagaggtgaa 600

attcttggat ttattgaaga ctaacttctg cgaaagcatt tgccaaggat gttttcatta 660

atcaagaacg aaagttaggg gatcgaagac gatcagatac cgtcgtagtc ttaaccataa 720

actatgccga ctaggaatcg ggcgatgtta ttctcatgac tcgcccggcg ccttatggga 780

aaccaaagtg tttgggttc 799

<210> 4

<211> 798

<212> DNA

<213> Ambispora fennica

<400> 4

atcaactttc gatggtagga tagaggccta ccatggtttt aacgggtaac ggggaattag 60

ggttcgattc cggagaggga gcctgagaaa cggctaccac atccaaggaa ggcagcaggc 120

gcgcaaatta cccaatcccg acacggggag gtagtgacaa taaataacaa tacagggccc 180

ttacgggtct tgtaattgga atgagtacaa tttaaatctc ttaacgagga acaattggag 240

ggcaagtctg gtgccagcag ccgcggtaat tccagctcca atagcgtata ttaaagttgt 300

tgcagttaaa aagctcgtag ttgaattttg ggtctggccg ggcggtccgc cctccgggtg 360

agtactgttc cgacgccggg cctatccttc tggagagtcg gcatgtcctt tgttgggtgt 420

gccggggaac caggaccatt accttgaaaa aattagagtg ttcaaagcag gcgtatgctc 480

ggatacatta gcatggaata atgaaatgga cgcgtggtgc tattttgttg gtttctagaa 540

ccgccgtaat gattaatagg gatagttggg ggcattagta ttcaattgtc agaggtgaaa 600

ttcttggatt tattgaagac taacttctgc gaaagcattt gccaaggatg ttttcattaa 660

tcaagaacga aagttagggg atcgaagacg atcagatacc gtcgtagtct taaccataaa 720

ctatgccgac taggaatcgg gcgatgttat tctcatgact cgcccggcgc cttatgggaa 780

accaaagttt ttgggttc 798

<210> 5

<211> 799

<212> DNA

<213> Archaeospora leptoticha

<400> 5

atcaactttc gatggtagga tagaggccta ccatggtttt aacgggtaac ggggaattag 60

ggttcgattc cggagaggga gcctgagaaa cggctaccac atccaaggaa ggcagcaggc 120

gcgcaaatta cccaatcccg acacggggag gtagtgacaa taaataacaa tacagggccc 180

tcacgggtct tgtaattgga atgagtacaa tttaaatctc ttaacgagga acaattggag 240

ggcaagtctg gtgccagcag ccgcggtaat tccagctcca atagcgtata ttaaagttgt 300

tgcagttaaa aagctcgtat ttgaattttg ggtctggccg ggcggtccac cttccgggtg 360

agcactgttc cgacgccggg cctatccttc tggtgagacg gcatgccctt cgctgggtgt 420

gtcggggaac caggaccatt accttgaaaa aattagagtg ttcaaagcag gcgtttgctc 480

gaatacatta gcatggaata atgaaatagg acgcgtggta ctattttgtt ggtttctagg 540

accgccgtaa tgattaatag ggatagttgg gggcattagt attcaattgt cagaggtgaa 600

attcttggat ttattgaaga ctaacttctg cgaaagcatt tgccaaggat gttttcatta 660

atcaagaacg aaagttaggg gatcgaagac gatcagatac cgtcgtagtc ttaaccataa 720

actatgccga ctaggaatcg ggcgaagtta ttctaacgac tcgcccggcg ccttatggga 780

aaccaaagtt tttgggttc 799

<210> 6

<211> 796

<212> DNA

<213> Archaeospora trappei

<400> 6

atcaactttc gatggtagga tagtggccta ccatggtttt aacgggtaac ggggaattag 60

ggttcgattc cggagaggga gcctgagaaa cggctaccac ttctaaggaa ggcagcaggc 120

gcgcaaatta cccaatcccg acacggggag gtagtgacaa taaataacaa tacagggcct 180

ttacaggttt tgtaattgga tgagtacaat ttaaatctct taacgaggaa caattggagg 240

gcaagtctgg tgccagcagc cgcggtaatt ccagctccaa tagcgtatat taaagttgtt 300

gcagttaaaa agctcgtagt tgaattttgg attctgccag ttggtccatc ttttgatgag 360

tactgattgt gtggggtcta tccgcctggt gatacgtaat gtactttatt gtatgttacg 420

ggtagtcagg acctttacct tgaaaaaatt agagtgttta aagcaggctt atgccggaat 480

acattagcat ggaataatag aataggacga tgttgtttta ttttgttggt ttctaggaca 540

accgtaatga ttaataggga tagttggggg cattagtatt caattgtcag aggtgaaatt 600

cttggattta ttgaagacta actactgcga aagcatttgc caaggatgtt ttcattaatc 660

aagaacgaaa gttaggggat cgaagacgat cagataccgt cgtagtctta accataaact 720

atgccgacta gggatcgggc gatgttgttt ccatgactcg ctcggcacct tatgggaaac 780

caaagtgttt gggttc 796

<210> 7

<211> 797

<212> DNA

<213> Archaeospora schenckii

<400> 7

atcaactttc gatggtagga tagtggccta ccatggtttt aacgggtaac ggggaattag 60

ggttcgattc cggagaggga gcctgagaaa cggctaccac ttctaaggaa ggcagcaggc 120

gcgcaaatta cccaatcccg acacggggag gtagtgacaa taaataacaa tacagggcct 180

ttacaggtct tgtaattgga atgagtacaa tttaaatctc ttaacgagga acaattggag 240

ggcaagtctg gtgccagcag ccgcggtaat tccagctcca atagcgtata ttaaagttgt 300

tgcagttaaa aagctcgtag ttgaattttg gattccatca atcggtccat cttttgatga 360

gtactggttg tgtggggtct atccgcctgg tgatacgtaa tgtcctttat tggatgttgc 420

gggtagtcag gacgtttacc ttgaaaaaat tagagtgttt aaagcaggct tatgccggaa 480

tacattagca tggaataata gaataggacg aagttgtttt attttgttgg tttctaggac 540

aaccgtaatg attaataggg atagttgggg gcattagtat tcaattgtca gaggtgaaat 600

tcttggattt attgaagact aactactgcg aaagcatttg ccaaggatgt tttcattaat 660

caagaacgaa agttagggga tcgaagacga tcagataccg tcgtagtctt aaccataaac 720

tatgccgact agggatcggg cgatgttgtt tcaatgactc gctcggcacc ttatgggaaa 780

ccaaagtgtt tgggttc 797

Claims

1.一种用于培养丛枝菌根属真菌的复合培养基，其特征在于，所述复合培养基包括腐植酸提取物以及真菌培养基；

所述真菌培养基包括0.3-1％碳源、0.02-0.1％氮源和无机盐，所述氮源为酵母浸出物，所述碳源选自葡萄糖、蔗糖和木糖中的一种或多种，所述无机盐为0.02-0.05％硫酸镁、0.01-0.03％磷酸锌和/或0.01-0.15％磷酸钙，pH为5.5-6.8，所述的百分比为占复合培养基的质量百分比。

2.如权利要求1所述的复合培养基，其特征在于，所述腐植酸提取物占0.365-1.33％，优选0.79％；所述氮源为0.1％的酵母浸出物，所述碳源为总量占1％的选自葡萄糖、蔗糖和木糖的一种或多种，所述无机盐为0.05％的硫酸镁，0.03％的磷酸锌和0.15％的磷酸钙，pH为6.8，每kg所述复合培养基补足水和/或生物活性泥炭至其总量为1kg，所述的百分比为占复合培养基的质量百分比。

3.如权利要求1或2所述的复合培养基，其特征在于，所述腐殖酸提取物的发酵提取依次包含以下步骤：

1)用小型锤式破碎机将所述混合物粉碎到不大于80目；

2)发酵温度为20-50℃，发酵时间不少于24小时，压力为0.1-0.5Mpa；

4.一种腐植酸提取物，其特征在于，所述腐植酸提取物是从2％桑根、5％葛根、10％食用菌残余物、80％泥炭和3％褐煤的混合物经发酵提取制得，所述的百分比为占混合物的质量百分比。

5.如权利要求4所述的腐植酸提取物，其特征在于，所述发酵提取依次包含以下步骤：

1)用小型锤式破碎机将所述混合物粉碎到不大于80目；

6.一种丛枝菌根属真菌的培养方法，其包括下述步骤：

1)将按常规方法分离的丛枝菌根属真菌两性囊霉属(Ambispora sp.)和原囊霉属(Archaeospora sp.)在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基中进行培养；

2)将步骤1)中所述的培养基与丛枝菌根属真菌一起移植入如权利要求1或2所述的复合培养基进一步培养。

7.如权利要求5所述的培养方法，其特征在于，所述两性囊霉属包括Ambisporafennica，所述原囊霉属包括Archaeospora leptoticha、Archaeospora trappei和/或Archaeospora schenckii。

8.一种如权利要求5或6所述的培养方法制得的丛枝菌根属真菌共生包合物。

9.如权利要求7所述的共生包合物，其特征在于，所述丛枝菌根属真菌总量为所述共生包合物的0.1％-1％，所述PDA的总量为所述共生包合物的1％-69.9％，所述复合培养基的总量为所述共生包合物的30-98％；较佳地，所述丛枝菌根属真菌总量为所述共生包合物的0.5％，所述PDA的总量为所述共生包合物的20％，所述复合培养基的总量为所述共生包合物的79.5％；所述的百分比为占所述共生包合物的质量百分比。

10.一种含权利要求6～8任一项所述的共生包合物的生物有机肥或复合控释肥；较佳地，所述的丛枝菌根属真菌在制成的生物有机肥或复合控释肥的浓度为0.2-2.0×10⁹个/g。

11.如权利要求9所述的生物有机肥在抗逆抗盐碱地、粮食或果蔬生长或水生生物生长和持续利用中的应用；所述的复合控释肥在麦子、玉米或高粱育苗中的应用，花卉、果树育苗及生长中的应用，富营养水中NPK和矿物质的在线提取或者水稻、茭白、莲藕种植中的应用。