CN109195635A - 磁遗传学及其用途 - Google Patents

磁遗传学及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN109195635A
CN109195635A CN201580084263.8A CN201580084263A CN109195635A CN 109195635 A CN109195635 A CN 109195635A CN 201580084263 A CN201580084263 A CN 201580084263A CN 109195635 A CN109195635 A CN 109195635A
Authority
CN
China
Prior art keywords
mar
cell
subject
gene
disease
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201580084263.8A
Other languages
English (en)
Inventor
张生家
龙晓阳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tsinghua University
Original Assignee
Tsinghua University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tsinghua University filed Critical Tsinghua University
Publication of CN109195635A publication Critical patent/CN109195635A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61N—ELECTROTHERAPY; MAGNETOTHERAPY; RADIATION THERAPY; ULTRASOUND THERAPY
    • A61N2/00—Magnetotherapy
    • A61N2/002—Magnetotherapy in combination with another treatment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/033—Rearing or breeding invertebrates; New breeds of invertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A61K48/0058—Nucleic acids adapted for tissue specific expression, e.g. having tissue specific promoters as part of a contruct
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0083—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the administration regime
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61N—ELECTROTHERAPY; MAGNETOTHERAPY; RADIATION THERAPY; ULTRASOUND THERAPY
    • A61N2/00—Magnetotherapy
    • A61N2/02—Magnetotherapy using magnetic fields produced by coils, including single turn loops or electromagnets
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/465—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from birds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/70—Invertebrates
    • A01K2227/703—Worms, e.g. Caenorhabdities elegans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/0393—Animal model comprising a reporter system for screening tests
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61N—ELECTROTHERAPY; MAGNETOTHERAPY; RADIATION THERAPY; ULTRASOUND THERAPY
    • A61N2/00—Magnetotherapy
    • A61N2/004—Magnetotherapy specially adapted for a specific therapy
    • A61N2/006—Magnetotherapy specially adapted for a specific therapy for magnetic stimulation of nerve tissue
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/60—Fusion polypeptide containing spectroscopic/fluorescent detection, e.g. green fluorescent protein [GFP]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Radiology & Medical Imaging (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明提供了调节细胞活性的非侵入性方法，其包括将MAR基因递送至所述细胞中的步骤并向所述细胞施加磁刺激的步骤。本发明还提供了磁遗传学用于治疗疾病的医疗用途。

Description

磁遗传学及其用途
技术领域
本发明涉及磁遗传学领域。具体而言，本发明涉及响应于外部磁刺激的磁感应受体(magnetoreceptor)，和调节神经元活动、扰动生物过程和治疗疾病的非侵入性方法。
背景技术
复杂的神经微回路是大脑如何工作的基本组成部分，但它们在体内与相互依存的不同细胞类型、相互连接的连接图谱(wiring diagram)和互联网络复杂的连接体相互纠缠(Bargmann et al.,2014；Luo et al.,2008)。因此，理解神经回路如何响应外部刺激、产生放电模式(electric firing pattern)、处理信息、计算编码以及调控行为，对于神经科学家来说仍然是一个巨大的挑战(Harris and Mrsic-Flogel,2013；Huang and Zeng,2013)。随着不断的发展和成熟，许多神经科学工具包括光遗传学(Zhang et al.,2011)、化学遗传学(Lerchner et al.,2007；Vardy et al.,2015)、深部脑刺激(Wichmann and Delong,2006)、功能磁共振成像(fMRI)(Kwong et al.,1992；Logothetis,2008)已经被证明在解析(dissecting)、扰动(perturbing)和调节健康和患病大脑中相互连接的神经微回路中发挥重要作用。在那些完善的神经科学工具中，经典深部脑刺激和现代光遗传学使得绘制、监测和操控生理的和功能失调的神经微回路活动成为可能(Gradinaru et al.,2009；Logothetis,2008)。但是，它们都有其各自的局限性或缺点。经典深部脑刺激已成功用于治疗帕金森病和其它神经系统疾病，但其局限性是需要手术植入电线，缺乏空间选择性或特异性，以及低频刺激和高频刺激分别在神经元兴奋或抑制上的相反效果(Kringelbach etal.,2007)。尽管最流行的光遗传学可以在毫秒级精度上时空特异地激活或失活神经活动(Bi et al.,2006；Boyden et al.,2005；Han and Boyden,2007；Li et al.,2005；Zhanget al.,2007)，并且迅速改变了神经科学，但是视蛋白表达模式、激光诱导的加热、过度表达的泵或通道引起的异常离子分布和/或不希望的网络稳态带来的副作用可能使实验解释变得非常困难(2014)。光遗传学和深部脑刺激已被用于通过慢性手术永久植入电线或光纤来侵入性地操控完整哺乳动物大脑中特定子区域的神经元活动(Grosenick etal.,2015；Logothetis,2008；Okun,2012)。因此，对新一代以微观回路和宏观回路水平针对全脑的独有非浸入式神经扰动和神经调节工具箱有着很高的需求。
发明概要
一方面，本发明提供了调节细胞活性的方法，包括将MAR基因递送至所述细胞中的步骤和向所述细胞提供磁刺激的步骤。
所述细胞可以在体内被处理，例如在动物或人体中，或在体外被处理，例如在培养皿中。
特别地，所述细胞可以是神经元细胞、肌肉细胞或干细胞。在一个实施方案中，细胞可以位于受试者中，例如灵长类动物或人，或啮齿动物如小鼠、大鼠或兔子。
在一个实施方案中，所述MAR基因可以通过包含细胞类型特异性启动子或区域特异性启动子的载体递送至目标区域，例如特定细胞类型如神经元，或健康及患病器官的特定区域。所述载体可以包括慢病毒、逆转录病毒、腺相关病毒或质粒。
另一方面，本发明提供治疗受试者中神经退行性疾病的方法，包括通过载体将MAR基因递送至所述受试者中的步骤和向所述受试者进行磁刺激的步骤。
所述神经退行性疾病包括但不限于阿尔茨海默病、帕金森病、朊病毒病、运动神经元疾病、亨廷顿病、脊髓小脑性共济失调和脊髓性肌萎缩。
在一个实施方案中，所述MAR基因通过包含细胞类型特异性启动子或区域特异性启动子的载体靶向一个或更多个患病区域。
在一个实施方案中，通过将表达MAR的细胞植入所述受试者来递送所述MAR基因。
另一方面，本发明提供了修复受试者中脊髓损伤的方法，包括通过载体将MAR基因递送至受损目标区域的步骤和向所述受试者提供磁刺激的步骤。
另一方面，本发明提供对包括失明和视网膜色素变性在内的视网膜退行性疾病进行靶向磁遗传学治疗的方法，包括通过载体将MAR基因递送至目标区域的步骤和向所述区域提供磁刺激的步骤。
另一方面，本发明提供了用于靶向心脏治疗的方法，包括通过载体将MAR基因递送至心脏中的目标区域的步骤和向所述区域提供磁刺激的步骤。
另一方面，本发明提供了用于治疗受试者中干燥综合征(syndrome)的方法，包括通过载体将MAR基因递送至受试者中的步骤和向所述受试者提供磁刺激的步骤。
另一方面，本发明提供了用于递送磁感应受体MAR的载体，其包含编码MAR蛋白的核酸序列和细胞类型特异性启动子或区域特异性启动子。
在一个实施方案中，所述载体包括病毒，例如慢病毒、逆转录病毒或腺相关病毒，或质粒。
另一方面，本发明提供了表达外源MAR基因并能对外部磁刺激作出反应的转基因动物。在一些实施方案中，所述动物是果蝇、蠕虫(worm)、斑马鱼、小鼠、大鼠或狨猴(marmoset)。
另一方面，本发明提供了诊断性或治疗性磁共振成像与MAR依赖性磁刺激相结合的方法，包括：用磁共振成像监测神经反应，修饰表达MAR的靶向脑部区域域并用外部磁场刺激脑部以激活神经元活动。
另一方面，本发明提供了用于对包括心律不齐在内的心脏疾病的靶向磁遗传学治疗方法，包括通过载体将MAR基因递送至心脏中的目标区域的步骤和向心肌提供磁刺激的步骤。
另一方面，本发明提供了用于治疗受试者的药物组合物，包括：包含MAR基因的载体或表达MAR的细胞，以及药学上可接受的载剂(carrier)。
另一方面，本发明提供了用于治疗疾病诸如帕金森病、慢性疼痛、重度抑郁症、妥瑞氏综合征(Tourette syndrome)或癫痫等的用磁场进行深部脑刺激的方法，包括：将包含MAR基因的载体递送至目标患病区域的步骤和向所述区域提供磁刺激的步骤。
另一方面，本发明提供了对MAR靶向的脑部区域(brain region)进行非侵入性磁刺激的方法，包括将包含MAR基因的载体递送至所述MAR靶向的脑部区域的步骤和向所述区域提供磁刺激的步骤。
另一方面，本发明提供了治疗受试者的方法，包括将MAR基因递送至受试者中的目标区域的步骤和向所述区域提供磁刺激的步骤。受试者可以是健康的，患有疾病或损伤。
在另一方面，本发明提供了磁抑制受试者中目标区域的方法，其包括对所述受试者中的MAR基因和/或磁感应受体家族成员进行分子工程化的步骤和向所述区域提供磁刺激的步骤。
在另一方面，本发明提供了通过表达MAR蛋白和MAR相互作用受体在细胞中产生第二信使的方法，包括：将包含MAR基因的载体递送至所述细胞中的步骤和向所述细胞提供磁刺激的步骤，其中所述MAR蛋白的表达为所述细胞中第二信使的产生和/或信号转导通路的扰动提供了准备。
另一方面，本发明提供了包含与另一功能性蛋白偶联的MAR蛋白的融合蛋白，其中所述另一功能性蛋白是荧光蛋白，例如mCherry、GFP、YFP或CFP。
在一些实施方案中，所述另一功能性蛋白具有PDZ或AIS结构域。
在一些实施方案中，所述另一功能性蛋白靶向亚细胞区域。
另一方面，本发明提供了用以干扰记忆形成和回忆的控制记忆功能的方法，包括在脑部区域如海马区、杏仁核区和/或扣带皮质(cingulate cortex)中表达磁感应受体MAR的步骤和用外部磁场刺激脑部的步骤。
另一方面，本发明提供了治疗受试者中成瘾例如药物成瘾和酒精成瘾的方法，包括在脑部区域如伏隔核中表达磁感应受体MAR的步骤和用外部磁场刺激脑部的步骤。
在另一方面，本发明提供了控制神经干/祖细胞中兴奋和神经发生的方法，包括在干细胞中表达磁感应受体MAR的步骤和用外部磁场激活以增强神经发生的步骤。
另一方面，本发明提供了磁遗传学控制内皮细胞的方法，其通过输送MAR穿过血管屏障进入组织诸如脑和肺，并由施加的外部磁场控制血管特性诸如血管紧张度、动脉直径和血管生长来进行。
另一方面，本发明提供了包含MAR基因和诱导型启动子的核酸序列。
在一些实施方案中，所述诱导型启动子可由能对所施用的药物作出响应的反式作用因子进行诱导。
附图简要说明
附图描述了本文所公开技术的非限制性示例实施方案，以帮助读者理解本公开。
图1A至1F是显示了通过远程磁刺激HEK-293细胞的磁遗传学激活的图。
(A)由通电线圈引起的膜去极化。左部，通过一对通电线圈对MAR-GCaMP6s共转染的HEK-293细胞进行磁刺激的示意图。中间和右部，显示磁刺激前后荧光强度变化(ΔF/F0)的热度图。比例尺，50微米。
(B)用一对条形磁铁产生的磁场激活HEK-293细胞。中间和右部，外部磁场触发GCaMP6s荧光变化的彩色图。比例尺，50微米。
(C)群体活动显示在磁刺激后仅MAR阳性细胞中的荧光强度增加，而对照组的荧光强度保持在基线水平。实线，平均值；灰色阴影区域，标准误(S.E.M.)。蓝色横线显示磁场开启。插图是显示刺激起始后约13秒的起始潜伏(onset latency)的放大图。虚线表示当ΔF/F0是基线波动标准偏差的10倍时的响应起始。
图2A至2E是显示MAR能够磁控制神经元活动的图。
(A)对Tyrode溶液中培养的海马神经元进行钙成像的示意图。
(B)显示GCaMP6s和MAR共定位的共聚焦成像图。
(C)平均峰值ΔF/F0作为时间函数的时间进程(实线表示平均值，并且阴影灰色区域表示标准误)。仅在MAR转染组中观察到钙瞬变。橙色，MAR组，n＝42；黑色，对照组，n＝40。蓝色横条表示磁场开启。
(D)峰值ΔF/F0分布、起始潜伏和持续时间。每个灰点表示单个神经元的结果，而实心点表示平均值。平均峰值ΔF/F0为50.5±7.0％；平均起始潜伏为7.8±0.8秒；MAR诱发的钙瞬变平均持续时间为11.1±0.9秒。误差条，标准误.
(E)两个共表达MAR和GCaMP6s的神经元的代表性踪迹线(trace)。MAR能够通过外部磁场反复触发钙尖峰。蓝色横条表示磁场开启。
图3A至3D是显示以方向选择性和极性定向方式对神经活动进行磁遗传学控制的图。
(A)钙内流(calcium influx)的方向选择性磁激活。磁场激活钙内流具有方向选择性。双向磁刺激装置示意图(另见图S1)。
(B)响应X-Y平面中不同方向磁场的三个神经元的荧光强度的示踪迹线(sampletrace)。绿色箭头，沿X轴磁场方向。橙色箭头，沿Y轴磁场方向。绿色横线，沿X方向的磁场；橙色横线，沿Y方向的磁场。左部，代表性神经元在磁场开启至X轴方向时出现大的钙峰，而在磁场切换至Y轴时只观察到小峰。中间，示例神经元只对沿着Y轴的磁场作出反应。右部，代表性踪迹线显示对沿X轴和Y轴的磁场的钙尖峰。
(C)神经元活动的开启响应(on-response)模式和关闭响应(off-response)模式。示意图显示了开启和关闭磁场诱发的神经元活动的开启响应模式和关闭响应模式。
(D)荧光踪迹线显示三个具有不同响应模式的代表性神经元。上部，神经元在磁场开启时出现钙瞬变(开启响应模式)，但在磁场关闭时不出现(关闭响应模式)。中间，神经元显示关闭响应模式，而不是开启响应模式。下部，神经元同时显示开启响应模式和关闭响应模式。蓝色横线，磁场开启；橙色横线，磁场关闭。
图4A至4E是显示经由MAR通过磁场驱动的神经元脉冲放电活动(neuronalspiking activity)。
(A)全细胞膜片钳记录的实验方案。磁刺激是通过一对手持式磁铁实现。
(B)典型表达MAR-p2A-mCherry的神经元的共聚焦成像。比例尺，30微米。
(C)电流钳记录显示膜电位对磁刺激的变化。三个示例神经元针对磁场开启表现出膜去极化并且放电速率(firing rate)增高。比例尺，20秒和50mV。
(D)MAR触发动作电位显示开启响应模式和关闭响应模式。三个代表性神经元的电压踪迹显示对磁场开启和关闭呈现不同的放电模式(firing pattern)。上部，神经元仅在磁场开启时发出动作电位。相反，中间显示的神经元主要在磁铁移除时作出反应。而另一组则显示典型放电模式(下部)，磁场开启和关闭均引发动作电位。蓝色横线，磁场开启；橙色横线，磁场关闭。
(E)与自发放电速率相比，磁场诱发的动作电位数量明显增加(13.2±4.2脉冲(spike)相比1.0±0.5脉冲；n＝19；**，P<0.01，配对t检验)，平均反应延迟为5.3±1.1秒，平均持续时间为8.5±1.5秒。误差条，标准误。
图5A至5F是显示磁遗传学控制秀丽隐杆线虫(C.elegans)的行为的图。
(A)在启动子myo-3下秀丽隐杆线虫体壁中MAR表达的荧光图像。
(B)在明场照明(white field illumination)下，施加磁场时身体肌肉同时收缩。星号表示秀丽隐杆线虫的头部和尾部。左部，在磁场开启前的身体放松；右部，磁场开启后的身体收缩(contraction)。
(C)在磁场开启之前10秒和之后50秒以及在磁场关闭之后20秒，以1秒的间隔测量身体长度。通过将所测量的长度除以刺激开始前的平均身体长度来计算相对身体长度。橙色踪迹线显示身体长度减少到初始长度的94％，而N2野生型通过磁刺激未显示身体长度的明显变化(myo-3，n＝24；N2，n＝20)。
(D)在mec-4启动子下MAR在轻微触觉受体神经元中选择性表达。所示为PLM神经元。比例尺，5微米。
(E)磁场开启时，在mec-4转基因动物中引起退缩行为(withdrawal behavior)。来自刺激开启后0秒、3秒和6秒的三帧图像的动物位置分别以白色、橙色和蓝色轮廓显示。
(F)在连续五次实验中，通过磁刺激出现明显的退缩或前进行为(具有至少1/4身体长度的行进距离)的有反应的转基因动物的百分比。在第一次实验中zdEx22转基因秀丽隐杆线虫的比例为86％，并且在重复测试时显示逐渐适应性。
图S1A至S1C是显示通过重复磁刺激在培养的海马神经元中诱导钙内流的图。
(A)热度图显示在重复磁刺激下代表性神经元的荧光强度变化。比例尺，30微米。
(B)图A中通过磁场重复刺激引起的相对荧光变化踪迹线(trace)。蓝色横线，磁场开启。
(C)在t＝0时代表性神经元的自发荧光强度归一化为1.0。用单指数方程拟合归一化荧光，然后用得到的时间常数对光漂白效应进行校正。
图S2显示了通过磁刺激的神经元活动的方向依赖性和开启-关闭响应模式的比例分布(fraction distribution)。响应性神经元的轴突取向与相应的磁场刺激方向之间的夹角的量化。X方向响应组、Y方向响应组以及X方向和Y方向响应组之间没有显著差异(P>0.3，ANOVA检验，分别地，n＝9、6和4)。误差条，标准误。
图S3显示响应神经元的轴突取向与磁场方向之间的夹角的总结。
图S4A至S4D是显示MAR转染的神经元的磁场诱发电流和固有电生理特性。
(A-B)代表性踪迹线显示通过分别钳位在-70mV和0mV时神经元产生的内向(踪迹线#1-3)和外向(踪迹线#4-6)电流。
(C)磁场诱发的内向电流和自发电流之间的比较。磁刺激诱发的平均内向峰值电流为279.6±45.2pA，相比自发电流为33.3±17.8pA(***，P<0.001，配对t检验，n＝13)。诱发的事件平均数为9.3±3.95个相比0.46±0.24个(*，P<0.05，配对t检验)。
(D)MAR阳性和MAR阴性神经元之间的固有特性比较。表达MAR的神经元中静息膜电位(-53.4±3.2mV，n＝14)与不表达MAR的神经元(-52.3±2.4mV，n＝10)之间没有显著差异。P>0.4，Student t检验。在电压钳模式下通过注入10mV电压步骤测量膜电阻。在MAR阳性神经元和MAR阴性神经元之间没有发现统计学差异(130.6±18.9MΩ相比119.8±12.9MΩ)。P>0.3，Student t检验。
图S5A和S5B是显示表达MAR的肌肉细胞和机械感觉神经元的落射荧光图像(epifluorescence image)。
(A)落射荧光图像显示在启动子myo-3下(转基因zdEx12)箭头所示的是体壁肌肉中MAR的定位。
(B)六个机械感觉神经元中MAR表达的放大视图。左部，箭头表示三个神经元(AVM、ALMR、PLMR)。右部，另外三个神经元(PVM、ALML、PLML)的荧光图像。
发明详细描述
应该认识到，下面以各种详尽程度来描述本文公开的技术的某些方面、模式、实施方案、变型和特征以提供对该技术的实质理解，并且不应被解释为对如所附权利要求中限定的保护范围进行限制。
概述
现有的神经调节技术，如光遗传学和深部脑刺激正在改变基础和转译神经科学(translational neuroscience)。然而，这两种神经调节具有侵入性，因为需要手术植入光纤或线电极。在本文中，我们发明了将磁感应受体的基因靶向(genetic targeting)与远程磁刺激相结合的非侵入性磁遗传学。神经元的非侵入性激活是通过通过之前发现的并且进化上高度保守的外源磁感应受体的神经元表达来实现的。如超灵敏荧光钙指示剂GCaMP6s显示，在表达该磁感应受体的HEK-293细胞和培养的海马神经元中，外部磁场的施加以可重复和可逆的方式导致膜去极化和钙内流(calcium influx)。此外，神经元活动的磁遗传学控制可能取决于磁场的方向，并且对施加的外部磁场表现出开启响应模式和关闭响应模式。这种磁感应受体的激活可以去极化神经元并引起一连串动作电位(trains of actionpotentials)，这可以通过全细胞膜片钳记录中的远程磁场重复触发。在myo-3特异性肌肉细胞或mec-4特异性神经元中表达这种磁感应受体的转基因秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)中，施加外部磁场能引起蠕虫(worm)的肌肉收缩和退缩行为，分别指示了肌肉细胞和触觉受体神经元的磁场选择性激活。磁遗传学优于光遗传学的优点在于其独特的无创性、深度穿透性、无限可达性、空间均匀性和相对安全性。类似经历了长达十年改进的光遗传学，随着不断改进和成熟，磁遗传学将重塑当前神经调节工具的格局，并将在基础和转译神经科学以及其它生物科学领域有广泛的应用。我们预测磁性遗传学的新时代即将到来。
MAR
虽然磁感应机制仍然不清楚，但研究提出为了使动物感知地磁场的能力最大化，隐花色素(Cryptochrome,Cry)，一种已知的磁感受器(magnetosensor)需要与另一(another)磁感应受体(magnetoreceptor)相互作用。Cry有很多候选的相互作用配偶体以形成稳定的复合体，其中之一是细菌IscA1，一种铁硫蛋白(Cózar-Castellano et al.,2004)，可能能与Cry结合形成稳定的复合体以调节细胞内的铁簇组装蛋白(iron-clusterassembly)。有趣的是，IscA1在蝴蝶、大鼠、小鼠、鸽子、果蝇和人类中非常保守，具有非常高的同源性。我们推测那些极其保守的IscA1可能用作通用磁感应受体(称为MAR)并能在用外部磁场刺激后诱导神经元活动。由于鸽子具有最强的磁场感受系统，因此我们为小鼠、大鼠、狨猴(marmoset)和人类表达了密码子优化的鸽子磁感应受体版本(随后在我们的研究中命名为MAR)。
术语“IscA1”和“MAR”在本文中可互换使用，指的是在生物体中高度保守的相同蛋白。鸽子中的IscA1蛋白(或MAR蛋白)含有133个氨基酸。术语“IscA1”或“MAR”涵盖了不同生物体中与鸽子IscA1具有高度序列同一性，例如超过70％、75％、80％、85％、90％、95％或甚至98％，并且具有基本相同的响应磁刺激的生物学功能的IscA1的任何同源物。
如本文所用，术语“MAR蛋白”涵盖保持与天然完整MAR基本上相同的生物学功能的完整蛋白或其变体。
本领域技术人员将会理解，来自不同生物体包括细菌、蝴蝶、鸽子、小鼠、大鼠、狨猴、猴或人的天然MAR蛋白，或其功能变体可以用于本发明。
如本文所用，术语“蛋白”可与术语“多肽”或“肽”互换。
术语“MAR蛋白”涵盖天然存在的蛋白的变体。优选地，所述变体与天然存在的蛋白具有至少75％、优选80％、更优选85％，或者甚至90％、95％或98％的序列同一性。序列同一性可以使用本领域已知的标准技术例如BLAST来确定。
在优选的实施方案中，与天然MAR相比，本发明中的MAR蛋白是变体(也称为功能性变体)，但保持与天然MAR基本上相同的生物学功能。也就是说，所述变体MAR蛋白是在天然MAR序列中取代、缺失或插入了一个或几个氨基酸，例如3、5、8、10、12或15个氨基酸。
这些变体通常是如下制备，即通过对编码DNA中的核苷酸进行定点突变或本领域众所周知的其它技术以产生编码该变体的DNA，然后在重组细胞培养基中表达该DNA。所述变体通常表现出与天然存在的类似物相同的定性生物学活性。
本发明的MAR蛋白可以掺入非天然氨基酸以及天然氨基酸。非天然氨基酸可用于增强离子选择性、稳定性、兼容性，或者降低毒性。
本发明的一方面是包含MAR蛋白的融合蛋白。本领域众所周知的是，可以制备融合蛋白将产生具有几种蛋白的组合活性的单一蛋白。可以通过融合蛋白实现理想的特性例如延长的半衰期。
包含MAR蛋白的融合蛋白的一个实施方案是靶向细胞的亚细胞区域的融合蛋白。所述融合蛋白可以靶向例如神经元的轴突、树突和突触。在一个优选的实施方案中，PDZ(PSD-95、DIg和ZO-1)结构域与MAR融合可以靶向树突。在另一个优选的实施方案中，轴突初始片段(AIS)结构域与MAR融合可以靶向轴突。
本发明的另一方面提供了编码MAR蛋白的核酸序列。本领域技术人员应该理解，MAR蛋白可以被多种核酸编码。由于许多氨基酸可以由多于一个的密码子编码，因此没有编码特定蛋白的唯一核酸序列。本领域技术人员应当很好理解如何通过已知蛋白质的氨基酸序列来制备能编码MAR蛋白质的核酸。编码多肽或蛋白的核酸序列是该多肽或蛋白的“基因”。基因可以是RNA、DNA或其它编码多肽或蛋白质的核酸。基本上不改变MAR蛋白氨基酸序列的其它序列可以添加到MAR基因中，例如内含子。术语“MAR基因”是指编码MAR蛋白的核酸序列(参见例如SEQ ID NO:1-6)。
本领域技术人员已知，不同生物体中的密码子系统可能略有不同，因此当所期望的是来自给定生物体的给定蛋白的表达时，可对核酸序列进行修饰以在该生物体内表达。
在本发明的优选实施方案中，来自鸽子的MAR编码序列根据用于在秀丽隐杆线虫(C.elegans)中表达的密码子使用进行优化，并添加两种人工内含子以增强其表达(参见例如SEQ ID NO:11)。
本发明的一方面提供了用于在小鼠、大鼠、狨猴或人中表达而优化过的编码鸽子MAR蛋白的核酸序列(参见例如SEQ ID NO:7-10)。
本发明的另一方面提供了用于MAR蛋白的基因靶向表达的材料。基因靶向(genetic targeting)可以用于将MAR基因递送至特定细胞类型、生物体内的特定区域以及细胞内的亚细胞区域。基因靶向还涉及控制MAR蛋白的表达量和表达时间。
用于MAR蛋白的基因靶向表达的材料的优选实施方案包括含有MAR蛋白基因的载体。
如本文所用，术语“载体”是指能够在不同遗传环境之间转运与之可操作地相连的另一种核酸的核酸分子。术语“载体”还指能够转运核酸分子的质粒、病毒或生物体。一类优选的载体是附加体(episome)，即能够进行染色体外复制的核酸分子。优选的载体是能够自主复制和/或表达与之相连的核酸的那些载体。能够指导(directing)与之可操作地相连的基因表达的载体在本文中称为“表达载体”。其它优选的载体是病毒，如慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、狂犬病病毒、单纯疱疹病毒和噬菌体。优选的载体可以在体内或体外基因地插入(genetically insert)MAR基因。
如本文所用，术语“受试者”是指动物，优选哺乳动物例如人，但也可以是其它动物，例如斑马鱼、蝇、蠕虫(worm)、小鼠、大鼠和狨猴。
也可以使用与真核细胞相容的表达载体。真核细胞表达载体在本领域是公知的并且可商购获得。通常，这样的载体经提供含有用于插入期望的DNA同源物的方便的限制性位点。
本发明的一个优选表达载体包含MAR基因和mec-4启动子。
本发明的一个方面是包含MAR基因和用于MAR蛋白的基因靶向表达的启动子的核酸序列。通过选择启动子可以促进所述MAR蛋白的基因靶向表达。如本文所用的术语“启动子”是使特定基因能够被转录的核酸序列。启动子通常位于要被转录的DNA区域附近。通过使用适当的启动子，可以控制MAR蛋白的表达水平。细胞使用启动子来控制于何处、何时表达以及表达多少特定蛋白。因此，通过选择主要在一种细胞类型、一种细胞亚型、生物体内特定空间区域或细胞内亚细胞区域内选择性表达的启动子，可以相应地控制MAR表达。启动子的使用也允许控制MAR表达量和表达时间。启动子可以是原核启动子或真核启动子。
本发明的一个实施方案是包含MAR基因和细胞特异性启动子的核酸序列。细胞特异性启动子的实例是促生长素抑制素(somatostatin)、小清蛋白(parvalbumin)、GABAα6、L7和钙结合蛋白(calbindin)的启动子。其它细胞特异性启动子是激酶如PKC、PKA和CaMKII的启动子；其它配体受体如NMDAR1、NMDAR2B和GluR2的启动子；包括钙通道、钾通道、氯通道和钠通道在内的离子通道的启动子；以及标记经典成熟和分裂细胞类型的其他标记物如钙网膜蛋白(calretinin)、巢蛋白(nestin)和β3-微管蛋白(beta3-tubulin)的启动子。
细胞
本发明中的细胞可以使用包含DNA表达载体、病毒或生物体来产生。优选的载体包括质粒、慢病毒和逆转录病毒。在一些情况下，特别是在涉及稳健细胞系(robust cellline)的情况下，MAR的表达可以通过使用脂转染技术来诱导，例如将细胞系暴露于含有脂质体(Lipofectamine)或Fugene的胶束(micelle)中，然后进行FACS分选以分离稳定表达的细胞系。
任何来源的细胞，优选那些能够在组织培养基中生长的细胞，都是MAR基因转染或感染的候选细胞。可以在培养基中生长的特定细胞类型的非限制性实例包括成纤维细胞、骨骼组织细胞(骨和软骨细胞)、骨骼细胞、心脏和平滑肌细胞、上皮组织细胞(例如肝、肺、乳房、皮肤、膀胱和肾细胞)、神经细胞(神经胶质和神经元细胞)、内分泌细胞(肾上腺、垂体和胰岛细胞)、骨髓细胞和黑色素细胞。合适的细胞也可以是代表来自受试者的特定身体组织的细胞。身体组织的类型包括但不限于血液、肌肉、神经、脑、心脏、肺、肝脏、胰脏、脾脏、胸腺、食道、胃、肠、肾、睾丸、卵巢、毛发、皮肤、骨、乳房、子宫、膀胱、脊髓和各种体液。
也可以应用于生物体的不同发育阶段(胚胎或成人)的细胞，或者更具体地说各种发育起源包括外胚层、内胚层和中胚层的细胞。
特别感兴趣的是与特定疾病或特定疾病阶段相关的细胞，源自天然和诱导的免疫缺陷状态、心血管疾病、神经元疾病、由各种病原体引起的炎症状态和疾病的细胞。疾病细胞也可以通过引起所关注疾病的病原体的存在来确认(例如，对于艾滋病的HIV(艾滋病毒)和对于乙型肝炎的HBV(乙肝病毒))。
优选的细胞是哺乳动物细胞和衍生自哺乳动物细胞的细胞系。其它优选的细胞是胚胎干细胞和成人干细胞，包括造血干细胞、骨髓、神经干细胞、上皮干细胞和皮肤干细胞。适用于MAR表达的优选细胞系包括HEK细胞、神经干细胞系、胰岛细胞系和其它可兴奋的或分泌细胞。
细胞活力可以通过测量膜完整性来确认。评估膜完整性的方法是本领域已知的。
转基因动物
本发明的一方面是表达MAR蛋白的转基因动物。MAR蛋白在神经元特定亚群中的表达可用于分析精神性疾病的回路功能、行为、可塑性以及动物模型。
本发明优选的表达MAR蛋白的转基因动物物种包括斑马鱼(Danio rerio)、蝇(例如Drosophila melanogaster)、蠕虫(worm)(例如Caenorhabditis elegans)、小鼠、大鼠和狨猴。
本发明另一优选的表达MAR蛋白的转基因动物物种是小鼠。在一个优选的实施方案中，使用BAC(细菌人工染色体，bacterial artificial chromosom)转基因技术以及位置效应杂交技术制备表达MAR蛋白的小鼠。
表达MAR蛋白的本发明的转基因动物的一个优选实施方案是秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)。
本发明的另一优选实施方案是其中在特定启动子下表达MAR的转基因动物。本发明的另一优选实施方案是其中通过BAC技术导入在转基因动物中表达的MAR的转基因动物。本发明的另一优选实施方案是其中将MAR基因敲入已知基因座的转基因动物。
治疗方法
本发明的另一方面是治疗受试者的方法，包括将包含MAR基因的载体递送至例如受试者体内的可兴奋细胞，并将所述细胞暴露于外部磁场。
用于治疗受试者的方法的优选实施方案包括执行人体治疗功能，其中通过MAR的遗传添加来拯救(rescure)或控制细胞的功能，同时使用物理递送的磁刺激。通过病毒载体在人类患者中递送MAR蛋白使之能通过磁刺激控制可兴奋细胞。例如，通过病毒转导以表达MAR的外周神经元如皮肤疼痛抑制神经允许磁刺激激活背侧柱-内侧淋巴神经元(dorsalcolumn-medial lemniscus neurons)来抑制疼痛的C纤维的反应。修饰的疱疹病毒可用于将MAR递送至疼痛通路神经元(pain-pathway neuron)。类似地，患有视杆细胞或视锥细胞缺失(例如视网膜色素变性或黄斑变性)的患者可以通过病毒转导，以在视网膜神经节细胞中表达MAR蛋白，这恢复了调节视觉感知的通路中的光传导。因此，基于MAR表达的策略适用于视网膜退行性疾病。
在一个实施方案中，用于激发患者中表达MAR蛋白的细胞的磁性装置是可商购获得的。任何产生磁场的常规磁性装置都可用于本发明中以刺激表达MAR蛋白的细胞。
本文提供的方法和组合物可以为阿尔茨海默症患者提供有益的效果。优选通过本文所述的方法，通过向人类患者的脑部递送并激活MAR蛋白来治疗阿尔茨海默症患者。
类似地，本文提供的方法和组合物可以为帕金森病患者提供有益的效果。优选通过本文所述的方法，通过向人类患者的丘脑底核(subthalamic nuclei)和/或苍白球(globus pallidus)递送并激活MAR蛋白来治疗帕金森病患者。
使用MAR蛋白进行人体治疗的另一种途径是创建表达MAR蛋白的分泌细胞用于植入患者体内(例如，经纳米封装以避免免疫应答)，其中通过物理递送的磁刺激在细胞中刺激分泌。例如，释放甲状腺激素(如T4和TRH等)的表达MAR的神经内分泌细胞能通过皮下植入以允许在数月至数年的时间范围内受控释放肽。类似地，当用远程磁场刺激时，可使表达MAR蛋白的胰岛细胞释放胰岛素；植入的细胞使之能在不需要泵植入或其它侵入性治疗的情况下，在分钟-分钟时间尺度内控制糖尿病症状。
在一个实施方案中，表达MAR蛋白的细胞在植入患者之前被封装。所述细胞可以经大分子封装或纳米封装。封装(capsule)的实例包括但不限于半渗透膜、中空纤维、玻璃珠和平面扩散装置。
在另一个实施方案中，将能够分泌多巴胺的经分化的表达MAR蛋白的干细胞直接植入患者的脑中，然后使用磁刺激驱动其激活。在分化步骤之前或之后，可以通过如本文所述用MAR蛋白转染或感染多巴胺分泌细胞(dopamine-secreting cell)，然后可将这些细胞植入患者的脑中。
在另一个实施方案中，将表达MAR蛋白的分泌细胞植入患者的组织或器官中。所述分泌细胞如本文所述用MAR转染或感染，然后将这些细胞植入患者的组织或器官中。然后通过磁装置诱导所述表达MAR蛋白的分泌细胞以分泌化学物质。
可以植入表达MAR蛋白的分泌细胞的组织或器官的实例包括但不限于上皮细胞、结缔组织、神经组织、心脏、肺、脑、眼、胃、脾、胰腺、肾、肝、肠、皮肤、子宫和膀胱。
在一个实施方案中，将表达MAR蛋白的分泌细胞植入糖尿病患者或患者的皮肤中。然后通过磁装置诱导所述表达MAR蛋白的分泌细胞以分泌胰岛素。
实施例
引言
虽然磁感应机制仍然不清楚，但研究提出为了使动物感知地磁场的能力最大化，隐花色素(Cryptochrome,Cry)，一种已知的磁感受器需要与另一磁感应受体相互作用。Cry有很多候选的相互作用配偶体以形成稳定的复合体，其中之一是Isca1，iron-sulfurcluster assembly 1(铁硫簇组装蛋白1)(Cózar-Castellano et al.,2004)。由于Isca1在秀丽隐杆线虫、果蝇、蝴蝶、斑马鱼、鸽子、鸡、大鼠、小鼠、狗、奶牛、黑猩猩及人中非常保守，具有非常高的同源性，其可能与Cry结合并在电子转移反应中具有重要作用。我们推测携带Isca1的电子转移反应可能会触发表达Isca1的细胞中的动作电位，并在外部磁场刺激下诱导神经元活动。我们将这些高度保守的铁硫组装蛋白重新定义为可以对磁场响应的磁感应受体(MAR)。MAR家族包括不同物种中所有高度保守的Isca1同源物。在这项研究中，我们发明了随后命名为磁遗传学的非侵入性技术，其将磁感应受体的基因靶向与远程磁刺激相结合。由于鸽子具有最强的磁场感受系统，因此我们表达了鸽子Isca1，以及为小鼠、大鼠、狨猴和人的四个不同的经密码子优化的版本(参见SEQ ID No:7-10)，用来探索我们的体内和体外的磁遗传学。我们发现，在远程磁场激活下，Isca1可以在HEK-293细胞和培养的原代海马神经元中都引起膜去极化和动作电位，产生钙内流并触发神经元活动。因此，远程磁刺激和基因靶向的成功组合将重塑当前可用的神经扰动(neuroperturbation)和神经调节工具的格局，包括光遗传学和深部脑刺激。这种新技术使得复杂脑回路的独特非侵入性解析以及深部脑区域的调节成为可能，为完整哺乳动物大脑中的神经元活动和其它生物体中生物过程的非侵入性远程磁控制开启了一扇新的大门。
实验步骤
DNA构建体
所有质粒均通过标准分子生物学步骤构建，随后通过双链DNA测序进行验证。GCaMP6s和ASAp1来自Addgene。在嵌合启动子CAG(巨细胞病毒早期增强子元件和鸡β-肌动蛋白启动子的组合)下，通过2A多肽(P2A)连接AAV-CAG-MAR-P2A-GCaMP6s和Lenti-CAG-MAR-P2A-GCaMP6s。ASAP1表达质粒(pcDNA3.1/Puro-CAG-ASAP1)来自Addgene 52519。用多重PCR克隆产生AAV-CAG-MAR-P2A-ASAP1和Lenti-CAG-MAR-P2A-ASAP1。
HEK-293细胞和转染
HEK-293细胞用含有胎牛血清(FBS,Life Tech)的高葡萄糖达尔伯克氏改良伊格尔培养基(high-glucose Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM,Gibco/BRL))进行保持并连续传代。使用Lipofectamine-2000(Life Tech)或经典磷酸钙转染进行转染。
原代神经元培养和转染
大鼠海马区解剖取自胚胎期第18天的大鼠，并培养了原代培养的海马神经元，这已在先前进行了描述(Zhang et al.,2007；Du et al.,2000)。使用Lipofectamine-2000(Life Tech)或经典的磷酸钙转染方法在体外培养的不同日期进行转染。
rAAV制造
rAAV载体用AAV1衣壳假型化(Zhang et al.,2011)。通过使用标准磷酸钙方法以及腺病毒辅助质粒pHelper(Strategene，CA，USA)共转染人胚胎肾细胞系HEK-293来制备嵌合rAAV2/1。转染后12小时，用正常生长培养基代替DNA/CaCl2混合物。再培养60小时后，收集转染的细胞并进行三次冷冻/解冻。然后使用肝素亲和柱(HiTrap Heparin HP,GEHealthcare,和Sweden)纯化上清液。用Amicon Ultra-4离心过滤器100K装置(Millipore,MA,USA)浓缩纯化的rAAV2/1，并通过使用StepOnePlus实时PCR系统(StepOnePlus Real-Time PCR System)和TaqMan Universal Master Mix(Applied Biosystems,CA,USA)的实时定量PCR测定病毒滴度。用1×磷酸盐缓冲液将滴定的病毒稀释并滴定匹配至1.0×1012个病毒基因颗粒/毫升。
免疫荧光
对于免疫染色，将切片于室温在1×PBS中冲洗3次，每次10分钟，并在含有10％山羊血清的PBST(含有0.5％Triton X-100的1×PBS)中温育2小时。温育步骤之间的所有冲洗均使用PBST(Zhang et al.,2009)。冲洗后，将经处理的切片与MAR(自制，1:200)、NeuN(Millipore，1:500)和mCherry(Clontech，1:2000)的不同一抗于4℃在抗体封闭缓冲液中温育72小时。于室温在1×PBST中洗涤3次，每次15分钟后，将切片在分别与异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate)或Cy3缀合的二抗(Jackson ImmunoResearch,WestGrove,Pennsylvania,USA,1：2000)中于室温温育2小时。用1×PBST充分冲洗后，将切片置于载玻片上，并盖上盖玻片。
秀丽隐杆线虫系的生长和转基因
所有秀丽隐杆线虫品系(C.elegans strain)均在20℃培养的线虫生长培养基(nematode growth media,NGM)琼脂平板上生长并保持。NGM琼脂平板用OP50大肠杆菌接种。根据标准程序(EvEvans et al.,2006)，通过标准显微注射到N2蠕虫(worm)中产生转基因系。通过对转基因zdEx12[pmyo-3::MAR；pmyo-3::gfp]和zdEx22[pmec-4::MAR；PMEC-4::GFP；sur-5::mCherry]中的无标记MAR注射到N2中，产生分别携带染色体外阵列的ZD24和ZD34品系。将质粒pmyo-3::gfp、pmec-4::gfp和sur-5::mCherry作为标记共同注射以确保特定细胞成功遗传转基因阵列(transgenic array)。使用特定启动子驱动的GFP(myo-3和mec-4两个品系(strain)，参见表S1)来监测MAR的表达模式。在明场照明(bright fieldillumination)下记录秀丽隐杆线虫响应磁刺激的行为。
表1.秀丽隐杆线虫转基因和品系
转基因 基因型 品系
zdEx12[pmyo‐3::MAR；pmyo‐3::gfp] N2 ZD24
zdEx22[pmec‐4::MAR；pmec‐4::gfp；sur‐5::mCherry] N2 ZD34
培养的海马神经元的全细胞膜片钳记录
神经元浸入Tyrode溶液(Boyden et al.,2005)用Axon MultiClamp 700B放大器(Axon Instruments,USA)进行记录。玻璃吸液管的电极内液(intracellular)(电阻在3-8MΩ范围内)含有(以mM计)：125葡萄糖酸钾、0.5EGTA、4ATP镁、5NaCl、0.3GTP钠、10磷酸肌酸、10HEPES(用KOH调至pH 7.2)。图5C中进行电压钳，电极内液由以下构成(以mM计)：125Cs-葡萄糖酸盐、4ATP镁、0.3GTP钠、10磷酸肌酸、10HEPES、0.5EGTA、3.5QX-314、5TEA、2CsCl(用NaOH调至pH 7.2)。记录内向和外向电流，同时分别将神经元钳位在-70mV和0mV。通过在电压钳模式下注入持续100ms的10mV阶跃来测量膜电阻。
钙成像
用配备40×水浸物镜和Olympus DP-80CCD的Olympus BX61WI正置显微镜进行钙成像。使用ImageJ提取荧光强度的相对变化(ΔF/F0)。使用Matlab(MathWorks,USA)生成热度图。
结果
通过磁场由MAR诱导钙内流
我们研究了MAR是否可以作为磁响应蛋白发挥功能，并因此能用于和远程磁场进行神经元活动的磁遗传学控制。我们首先将该MAR与遗传编码的超灵敏钙指示剂GCaMP6s(Chen et al.,2013；Tian et al.,2009)共转染到人胚肾(human embryonic kidney,HEK)衍生细胞系HEK-293细胞中。我们构建了一个由两对线圈组成的定制磁场发生器，可以容纳标准35毫米细胞培养皿(图1A)。我们自制的磁场发生器可以在培养皿中心处产生最大约为1毫特斯拉(millitesla，mT)的磁场强度，在边缘约为2.5mT。当用我们自制的磁装置或手持式静磁棒刺激时，培养皿中不同位置的细胞受到不同量的磁场强度刺激(图1C)。
在我们开启磁场发生器之前，HEK-293细胞中GCaMP6s的荧光强度在基线水平上保持稳定。施加磁场后，我们检测到MAR转染的HEK-293细胞荧光强度显著增加(图1B)，与基线荧光强度(图1E)相比增加了近350％。荧光强度增加超过基线荧光强度标准偏差的10倍以上，平均持续时间为13秒，这由图1E插图中的灰色虚线表示。重要的是，在没有表达MAR的对照组中未观察到增加(图1E)。
通过对响应于在我们自制装置的培养皿中心处测量的范围为0～1mT的磁场强度的荧光强度的变化进行测试，我们测量了磁场强度的阈值(图1F)。为了激活MAR转染的HEK-293细胞，所需的最小磁场强度接近0.3mT，是地球的磁场强度的约6倍(Mouritsenand Ritz,2005)。当在我们工作环境下仅存在地球磁场时，没有观察到增加(数据未显示)，表明地磁场不能激活MAR，并且需要相对较强的磁场来引发经MAR转染的细胞中的响应。与诊断和治疗性功能磁共振成像(Logothetis,2008)中高达几个特斯拉的强磁场强度相比，我们研究中存在的用于刺激MAR的磁场强度仅为几毫特斯拉，这表明依赖于MAR的磁遗传学不仅能抵抗地磁场的影响，而且还是安全的。
为了消除由于我们自制的磁场发生器的通电线圈产生的磁场中潜在波动引起的背景干扰而可能造成的伪影，我们用手持式静磁铁棒代替了自制的磁场发生器(图1C)，其在培养皿的中心形成约2.5mT，并且发现了与磁场发生器所引起的剧烈荧光增加相同的观察结果(图1D)。这些观察结果一起表明磁感应受体(MAR)可以作为磁响应性激活剂(magnet-responsive activator)起作用，以磁场依赖性方式使细胞膜电位去极化并随后产生钙内流。
神经元中MAR诱发钙内流
我们接下来探究在MAR转染的神经元中MAR是否能够在施加外部磁场后激活神经元并诱发钙内流。当功能性形成富集过程时，我们用MAR与GCaMP6s共同转染或感染原代培养的大鼠海马神经元(Du et al.,2010；Zhang et al.,2007)。免疫荧光染色显示MAR似乎主要是躯干-树枝状(somato-dendritically)地表达(图2B)。MAR阴性神经元显示几乎没有MAR表达，表明至少在海马神经元中MAR是外源性而非内源性产生的。类似地，我们观察到在外部施加的磁场开启后(图2A)的7.8±0.8秒内(图2D)钙瞬变的增强(ΔF/F0＝50.5±7.0％，n＝42，图2E)。在图S1C中描绘的踪迹线经过光漂白校正。MAR转染的培养神经元中GCaMP6s持续时间为11.1±0.9秒(图2D)。作为对照，在MAR阴性神经元中观察到钙峰值没有显著增加(n＝48，图2C)。我们发现激活神经元所需的最小磁场强度与HEK-293中的相似。此外，我们可以反复激活MAR转染和感染的神经元，并检测类似的钙尖峰序列(calcium spiketrain)模式(图S1A和S1B)，这表明神经元活动的磁激活也是快速可逆的。因此，MAR的磁遗传学激活可以使神经元膜去极化并快速且可逆地触发动作电位。
神经元活动的磁方向选择性控制
由于磁场具有方向性(Winkhofer et al.,2012)，我们推断磁遗传学控制诱发的动作电位可能受施加的外部磁场方向的影响。为了研究这种可能性，我们测试了不同方向的磁刺激对神经元反应的影响。为了研究这种可能性，我们测试了对具有不同方向的磁场的神经元反应。我们首先检查了在我们基于二维线圈的磁场发生器中所施加的磁场的方向是否影响MAR诱发的GCaMP6s钙瞬变的响应(图3A)。由于在我们自制的磁场发生器中每次仅由两对正交线圈(a-b和c-d)的其中一对线圈产生磁场，所以我们沿两个正交方向，即X方向(从a到b)和Y方向(从c到d)中的任意一个方向产生磁场。
我们观察到，这22个磁响应神经元中有7个仅被沿X方向的磁场激活(图3B，上部)，而这22个神经元中有11个仅被沿Y方向的磁场激活(图3B，中部)。有趣的是，剩下的四个神经元(4/22)同时响应沿X方向和沿Y方向的两个磁场而显示出强烈的钙尖峰(图3B，下部)。我们进一步量化了MAR转染的神经元的轴突取向与施加的磁场方向之间的相关性是否影响MAR触发的响应。没有发现MAR触发响应与相对于所施加的外部磁场的轴突取向之间有明显的相关性(图S3)。由于我们在HEK-293细胞中也发现了类似的磁场方向依赖效应，所以这种方向效应可能不是神经元特异性的，而是由磁刺激导致表达的MAR在细胞膜上形成棒状结构重排而引起的。我们不能排除MAR表达水平、磁诱导MAR在细胞膜上的棒状簇重排、更高的磁场强度和/或均匀的磁场激活可能消除这种对神经元激活的磁场方向依赖异质性效应的可能性。这些结果表明，由于在我们的自制装置中最大磁场强度不能超过1mT，所以动作电位的磁遗传控制可能取决于我们特定设置(setup)中施加的外部磁场方向。在我们未来的实验中用更复杂的磁装置测试磁场极性对神经元活动的影响将十分有趣。
磁场对神经元活动的开启响应效应和关闭响应效应
由于开启或关闭磁场可能会改变膜的伸展，然后打开膜上的一些离子通道，我们假设施加的外部磁场的开启或关闭也会影响神经元活动(Winkhofer et al.,2012)。正如预期，我们在上述22个神经元中发现在开启或关闭磁场时神经元活动的开启响应模式、关闭响应模式以及开启-关闭响应模式(图3C)。我们发现在22个MAR-GCaMP6s共转染的神经元中有12个仅在磁场开启时荧光强度显著增加。然而当磁场关闭时，增加的钙瞬变回到基线水平(图3D，上部)。有趣的是，与之相反，22个MAR转染的神经元中有6个在磁场开启后没有显示出增加的活动，而当对同一组神经元关闭磁场时，GCaMP6s荧光显示出瞬时增加(图3D，中部)。有趣的是，当磁场从开启切换到关闭或从关闭切换到开启时，一小组神经元(n＝4)都产生响应(图3D，下部)。图S2总结了四种不同响应模式的分布。我们不能排除神经元中MAR异质性表达或细胞膜上由磁刺激MAR形成的棒状铁硫簇重排和/或我们自制的磁场发生器中磁场的不均匀分布可能导致如此差异性的神经元活动的开启-关闭响应的可能性(Winkhofer et al.,2012)。未来的实验应该使用功率更高和控制更精确的磁场发生器来进行。
MAR在神经元中诱发磁电流和尖峰电位
我们进一步研究使用电压钳和电流钳(图4A)以及一对手持式静磁铁(Mora etal.,2004；Semm and Beason,1990)，MAR是否在培养的海马神经元中能够去极化神经元并诱发一系列动作电位，所述一对手持式静磁铁用来避免我们自制装置的通电线圈产生的磁场中潜在的电势波动带来的干扰。我们用由鸡β肌动蛋白-CMV嵌合启动子(chicken betaactin-CMV chimeric promoter,CBA)驱动的P2A连接的MAR-mCherry转染神经元，确保所有经鉴定的mCherry阳性神经元与MAR共表达(图4B)。
磁场引起MAR阳性神经元中产生快速内向电流。代表性记录显示全细胞电流是通过在钳位于-70mV的mCherry阳性神经元中施加磁场来诱发的(图S4A，踪迹线#1-3)。平均内向峰值电流为279.6±45.2pA，平均峰值数为9.3±3.95(图S4C)。由于磁场倾向于刺激培养皿中表达MAR的兴奋性神经元和抑制性神经元，因此可以在电压钳位于0mV的神经元中来记录外向电流(Jackson,2001)(图S4B，踪迹线#4-6)。
我们接下来研究在与上述用于诱发磁电流的相同刺激下，MAR是否能在电流钳模式下驱动神经元放电。图4C所示的电压踪迹线是三个具有代表性的神经元(踪迹线#1-3)，由外部磁场刺激而放电速率增加。与从钙成像获得的结果(图3D)一致，我们还观察到三种类似的由外部磁场刺激引起的开启放电模式和关闭放电模式(图4D)：一种仅由开启响应而激活，另一种仅由关闭响应而激活，第三种是由开启响应和关闭响应而均激活。群体数据显示MAR诱发的峰值数量显著高于自发事件(n＝19；**，P＝0.003，Student t检验)，为13.2±4.2尖峰相比1.0±0.5尖峰。在磁场开启后，尖峰序列持续时间为8.5±1.5秒，延迟为5.3±1.1秒(图4E)。我们通过在MAR阳性和MAR阴性神经元中以电压钳模式注入10mV电压阶跃来量化固有电特性。静息膜电位和膜电阻两者在表达MAR的神经元和不表达MAR的神经元之间没有显著差异(图S3D)。因此，MAR能够快速诱导膜去极化、反复激发动作电位并远程控制神经元活动。
MAR能在秀丽隐杆线虫中触发运动并诱导退缩行为
为了探究磁场依赖性激活MAR是否可以触发转基因动物中的回路和网络行为，我们通过在启动子myo-3的控制下将MAR表达限制在秀丽隐杆线虫的肌肉细胞中，来构建转基因线虫秀丽隐杆线虫(Nagel et al.,2005)。为了提高秀丽隐杆线虫中MAR的表达水平，我们通过基于从鸽子中推断的氨基酸序列优化其密码子使用，并且通过添加两个已经被证实能增强其在秀丽隐杆线虫中表达的人工内含子来合成人工MAR基因(Husson et al.2013；Liu et al.,2009；Okkema et al.,1993)(SEQ ID NO:11)。在myo-3启动子下，MAR表达限制在肌肉细胞中(图5A和图S5A)。
在施加外部磁场后，zdEx12转基因动物显示出稳健可重复性的运动活性，在细菌喂养的NGM琼脂平板上表现出同时身体肌肉收缩和全身长度的明显缩短(图5B)。
为了量化MAR依赖性激活对运动的影响(Nagel et al.,2005；Zhang et al.,2007)，我们计算了身体收缩的百分比。这显示身体长度缩短高达6％(图5C)。相反，当施加外部磁场时，野生型N2秀丽隐杆线虫中没有检测到明显的收缩(p<0.001，配对t检验)。这些结果表明，MAR能触发秀丽隐杆线虫体内磁引发的身体收缩或缩小。
我们接下来评估磁引发的MAR是否能去极化神经元细胞并导致后续行为。我们制备了另一zdEx22转基因秀丽隐杆线虫，其中MAR由启动子mec-4驱动仅在6个机械感觉神经元AVM、ALML/R、PVM和PLML/R中选择性表达(O’Hagan et al.,2005；Zhang et al.,2007)。图5D显示MAR表达仅限于mec-4启动子下的机械感觉神经元(也见图5B)。当磁场开启时，MAR在秀丽隐杆线虫中触发了退缩行为(withdrawal behaviour)(图5E)。22个(86％)zdEx22转基因动物中的19个在磁场刺激下表现出稳健和可重复性的退缩行为，与之前MAR激活的神经元结果一致(Nagel et al.,2005)。值得注意的是，我们观察到在施加外部磁场后整个线虫身体产生剧烈的omega形运动，表明磁场的无限制可达性能激活所有6个机械感觉神经元。而用光遗传学不能获得同样的结果，其仅限于通过有限的光照穿透刺激6个机械感觉神经元中的一部分(Nagel et al.,2005)。偶尔，我们可以观察到一些转基因动物中的前进行为加速。退缩行为可以由外部磁场重复诱发(图5F)。相反，那些野生型对照动物没有显示出退缩或前进行为。总之，这些结果表明MAR对神经元活动的磁遗传学控制能够诱导活体行为输出。
讨论
我们研究的主要发现是磁遗传学的神经技术性和概念性发明。非侵入性磁遗传学将通过磁场依赖性磁感应受体MAR介导的遗传性激活神经元活动与外部磁场相结合，从而使之能对神经元活动进行非侵入性和无线干预。
基于纳米粒子的磁热控制神经调节
Anikeeva及其同事(Chen et al.,2015)最近报道了一种磁热神经调节工具，其涉及将热敏感的辣椒素受体TRPV1递送至特定的脑部区域，然后将产热(heat-emitting)纳米颗粒注入相同的区域。该两步骤磁热方法具有固有缺陷。首先，外源性Fe3O4磁性纳米颗粒永久性结合入大脑，以及由于产热磁纳米颗粒导致的43℃以上的温度，远远超过了生理温度所带来的重大安全问题。其次，扩散的磁性纳米颗粒可能会激活周围神经系统和中枢神经系统中表达的其它内源性热敏离子通道(Leibiger and Berggren,2015；Temel andJahanshahi,2015))。第三，由于通过交变磁场作用于磁纳米颗粒产生共振对于加热以打开TRPV1通道是必需的(Chen et al.,2015)，所以需要相对较强的磁场用于神经元激活(约180mT，相比于我们研究中的约2.5mT)。
磁感应的分子和细胞机制
Vidal-Gadea等人(Vidal-Gadea et al.,2015)最近发现了一对来自秀丽隐杆线虫的磁感觉神经元，称为AFD感觉神经元，它们响应地球地磁场并支持垂直迁移。然而，AFD感觉神经元如何检测和利用地球磁场来指导行为仍然不清楚。我们的发现首次证明编码磁感应受体MAR的单个基因可以作为控制神经元活动的磁激励器。我们推测MAR可能作为动物中的分子指南针，并在空间导航、迁徙、定位和归巢中发挥重要作用(Mouritsen and Ritz,2005)。我们预测这种新型的含铁磁感应受体(MAR)可能形成铁-硫簇组装蛋白，可以通过细胞骨架或微丝与细胞膜结合(Winkhofer,2012；Johnsen and Lohmann,2005)。在施加外部磁场之后，由于经MAR导致的磁驱动旋转力所引起的膜张力可能导致离子通道打开，从而诱发膜去极化和一连串动作电位(Fleissner et al.,2007；Winkhofer,2012；Wu andDickman,2012)。我们还不知道磁场方向和切换磁场开启或关闭是如何影响神经元活动的确切机制。通过研究MAR的表达水平、三维磁场刺激与表达MAR的神经元的轴突-树突取向之间的精确对准和/或磁场强度是否可能影响神经元活动的方向依赖性磁控制，可以获得进一步见解(Mouritsen and Ritz,2005)。对MAR相互作用伙伴(partner)和MAR自身高级结构的进一步研究可能揭示磁遗传学控制神经元活动的分子机制。
磁遗传学的优势
与经过十多年仍在优化的光遗传学相比，我们新发明的磁遗传学有明显优势：磁遗传学具有非侵入性、远程、穿透性、均匀性和安全性。与光遗传学中使用的光纤(Fenno etal.,2011)和在深部脑刺激中组装的电线(Creed et al.,2015)相比，不需要长期手术植入任何侵入性装置，因为外部磁场可以深入完整的哺乳动物大脑或其它生物系统中。尽管ReaChR(Lin et al.,2013)和Jaws(Chuong et al.,2014)等红移蛋白分别能允许经颅激活或抑制神经活动，但ReaChR和Jaws只能有效穿透啮齿动物大脑3mm的深度(Chuong et al.,2014)。同时，可控磁场可以具有精确基因靶向地均匀地作用于任何中枢神经系统或周围神经系统，克服因光吸收和散射引起的不均匀效应( 2014)。此外，mT量级的磁遗传学刺激不会造成光毒性或热毒型等副作用，使得磁遗传学更安全。
磁遗传学与其它神经元读取技术的结合
像所有现有的遗传和光遗传激活子(activator)、抑制子(silencer)、传感子(sensor)和效应子(effector)(Adamantidis et al.,2014)一样，为了有效的磁刺激，这种磁感应受体使用单一编码133个氨基酸的开放阅读框而不需要任何辅助因子。通过使用神经元细胞类型特异性、亚区特异性或亚层特异性启动子，将该磁感应受体递送至病毒和/或转基因技术可及动物中，将使之能以非侵入性方式进行神经元活动的回路特异性、投射靶向和时空映射、调控、检测和监测。磁遗传学与基因编码钙指示剂和电压传感器(2012；St-Pierre et al.,2013)、多电极阵列(Spira and Hai,2013)、功能磁共振成像(Desai et al.,2011；Lee et al.,2010)或多位点单元记录(Zhang et al.,2013)的组合将允许我们记录大规模神经元活动(Scanziani and 2009；2014)以及识别与特定行为功能对应的活动模式。磁遗传学的应用将加速对作为神经计算和编码基础的复杂且相互联系相互依赖的脑回路的系统性和因果性解析(Bargmann et al.,2014)。尽管我们的研究只关注MAR的磁场激活，但是通过比较基因组学发现突变的MAR或还未被发现的磁感应受体来实现相反方式的磁场抑制也是可行的。像直接光遗传学工程化一样(Zhang etal.,2011)，对不同磁感应受体家族不断进行分子工程化将拓展磁遗传学工具箱。
磁遗传学在转译神经科学中的应用
虽然深度脑刺激治疗帕金森病和其它神经系统疾病已被证明是有效的，但其使用手术植入金属电极，无任何细胞类型特异性地刺激目标区域(Benabid,2015；Creed etal.,2015；Gradinaru et al.,2009)。虽然非侵入性经颅磁刺激(TMS)利用磁场脉冲诱导微小电流刺激皮层的一小部分区域(Ridding and Rothwell,2007；Walsh and Cowey,2000)，但其在基础研究和疾病如抑郁症和帕金森病等的诊断性及治疗性应用中由于缺乏特异性、可靠性和可重复性而受到限制。结合细胞类型特异性启动子(Luo et al.,2008)，磁遗传学可以实现精确靶向的神经调节，克服非特异性并且有可能有益于治疗帕金森病以及其它神经性和神经精神性疾病。
磁遗传学展望
总之，利用磁感应受体的非侵入性磁激活神经元活动使得磁遗传学成为干预复杂回路活动的最佳工具，使之得具有细胞类型特异性、时空精确性、空间均匀性和非侵入性可逆地解析复杂神经元微回路。结合特定细胞类型和区域的基因靶向，磁遗传学将加速我们对实现神经科学终极目标的追求：了解大脑如何计算神经元算法、转换信息并产生认知和行为。磁遗传学不仅对基础和转译神经科学有广泛的应用，其利用磁场来非侵入性和时空性地控制生物系统的工作原理也将以在多种水平包括遗传、表观遗传和转录水平(Cong etal.,2013)来影响生命科学和生物医学工程的其它领域(Etoc et al.,2015；Stanley etal.,2015)。就像过去十年光学遗传学取得的进步一样，我们自信地预测，随着不断的研究、开发和优化，磁性遗传学的新时代即将到来。
参考文献
1.Neuron.2008Mar 13；57(5):634-60.doi:10.1016/j.neuron.2008.01.002.PMID:18341986
2.http://www.nih.gov/science/brain/2025/(US National Institutes ofHealth,2014).Bargmann,C.et al.BRAIN 2025:a scientific vision.Brain Researchthrough Advancing
3.Nature.2013 Nov 7；503(7474):51-8.doi:10.1038/nature12654.Review.PMID:24201278
4.Annu Rev Neurosci.2013 Jul 8；36:183-215.doi:10.1146/annurev-neuro-062012-170307.Epub2013 May 17.Review.PMID:23682658
5.Cell.2011 Dec 23；147(7):1446-57.doi:10.1016/j.cell.2011.12.004.PMID:22196724
6.Neuron.2015 May 20；86(4):936-46.doi:10.1016/j.neuron.2015.03.065.Epub 2015 Apr 30.PMID:25937170
7.Neuron.2007 Apr 5；54(1):35-49.PMID:17408576
8.Neuron.2006 Oct 5；52(1):197-204.Review.PMID:17015236
9.Proc Natl Acad Sci U S A.1992 Jun 15；89(12):5675-9.PMID:1608978
10.Nature.2008 Jun 12；453(7197):869-78.doi:10.1038/nature06976.Review.PMID:18548064
11.Science.2009 Apr 17；324(5925):354-9.doi:10.1126/science.1167093.Epub 2009 Mar 19.PMID:19299587
12.Nat Rev Neurosci.2007 Aug；8(8):623-35.PMID:17637800
13.Nat Neurosci.2005 Sep；8(9):1263-8.Epub 2005 Aug 14.PMID:16116447
14.Proc Natl Acad Sci U S A.2005 Dec 6；102(49):17816-21.Epub 2005 Nov23.PMID:16306259
15.Neuron.2006 Apr 6；50(1):23-33.PMID:16600853
16.Nat Methods.2014 Oct；11(10):1012-4.doi:10.1038/nmeth.3111.PMID:25264778
17.Neuron.2015 Apr 8；86(1):106-39.doi:10.1016/j.neuron.2015.03.034.Review.PMID:25856490
18.N Engl J Med.2012 Oct 18；367(16):1529-38.doi:10.1056/NEJMct1208070.PMID:23075179
19.Metallomics.2012 Aug；4(9):928-36.doi:10.1039/c2mt20065a.PMID:22885802
20.Biochim Biophys Acta.2004 Aug 2；1700(2):179-88.PMID:15262227
21.Nature.2013 Jul 18；499(7458):295-300.doi:10.1038/nature12354.PMID:23868258
22.Nat Methods.2009 Dec；6(12):875-81.doi:10.1038/nmeth.1398.Epub 2009Nov 8.PMID:19898485
23.Curr Opin Neurobiol.2005 Aug；15(4):406-14.Review.PMID:16006116
24.Neuron.2007 Feb 15；53(4):549-62.PMID:17296556
25.J Cell Biol.2000 Sep 18；150(6):1423-34.PMID:10995446
26.Science.2012 May 25；336(6084):991-2.doi:10.1126/science.1223786.Noabstract available.PMID:22628645
27.Nature.2004 Nov 25；432(7016):508-11.PMID:15565156
28.Brain Res Bull.1990 Nov；25(5):735-40.PMID:2289162
29.Curr Protoc Neurosci.2001 May；Chapter 6:Unit 6.6.doi:10.1002/0471142301.ns0606s00.PMID:18428516
30.Curr Biol.2005 Dec 20；15(24):2279-84.PMID:16360690
31.Genetics.1993 Oct；135(2):385-404.PMID:8244003
32.Biol Cell.2013 Jun；105(6):235-50.doi:10.1111/boc.201200069.Epub2013 Apr 26.PMID:23458457
33.Cell.2009 Oct 30；139(3):623-33.doi:10.1016/j.cell.2009.08.044.PMID:19879847
34.Nature.2007 Apr 5；446(7136):633-9.PMID:17410168
35.PLoS One.2007 Mar 21；2(3):e299.PMID:17375185
36.Nat Neurosci.2005 Jan；8(1):43-50.Epub 2004 Dec 5.PMID:15580270
37.Science.2015 Mar 27；347(6229):1477-80.doi:10.1126/science.1261821.Epub 2015 Mar 12.PMID:25765068
38.Nat Med.2015 Jan；21(1):14-6.doi:10.1038/nm.3782.PMID:25569545
39.Science.2015 Mar 27；347(6229):1418-9.doi:10.1126/science.aaa9610.No abstract available.PMID:25814569
40.Elife.2015 Jun 17；4.doi:10.7554/eLife.07493.PMID:26083711
41.Nat Rev Neurosci.2005 Sep；6(9):703-12.PMID:16100517
42.Science.2012 May 25；336(6084):1054-7.doi:10.1126/science.1216567.Epub 2012 Apr 26.PMID:22539554
43.Naturwissenschaften.2007 Aug；94(8):631-42.Epub 2007 Mar 15.PMID:17361399
44.Annu Rev Neurosci.2011；34:389-412.doi:10.1146/annurev-neuro-061010-113817.PMID:21692661
45.Science.2015 Feb 6；347(6222):659-64.doi:10.1126/science.1260776.PMID:25657248
46.Nat Neurosci.2013 Oct；16(10):1499-508.doi:10.1038/nn.3502.Epub2013 Sep 1.PMID:23995068
47.Nat Neurosci.2014 Aug；17(8):1123-9.doi:10.1038/nn.3752.Epub 2014Jul 6.PMID:24997763
48.Cold Spring Harb Protoc.2014 Aug 1；2014(8):815-22.doi:10.1101/pdb.top083329.PMID:25086025
49.Nat Rev Neurosci.2012 Oct；13(10):687-700.doi:10.1038/nrn3293.Epub2012 Aug 30.Review.PMID:22931891
50.Nat Neurosci.2014 Jun；17(6):884-9.doi:10.1038/nn.3709.Epub 2014Apr 22.PMID:24755780
51.Nat Nanotechnol.2013 Feb；8(2):83-94.doi:10.1038/nnano.2012.265.Review.PMID:23380931
52.Nature.2010 Jun 10；465(7299):788-92.doi:10.1038/nature09108.PMID:20473285
53.J Neurophysiol.2011 Mar；105(3):1393-405.doi:10.1152/jn.00828.2010.Epub 2010 Dec 15.PMID:21160013
54.Nature.2009 Oct 15；461(7266):930-9.doi:10.1038/nature08540.Review.PMID:25264778
55.Science.2013 Feb 15；339(6121):819-23.doi:10.1126/science.1231143.Epub 2013 Jan 3.
56.Nature.2015 Mar 19；519(7543):299-300.doi:10.1038/519299a.PMID:25788094
57.Nat Rev Neurosci.2007 Jul；8(7):559-67.Review.PMID:17565358
58.Nat Rev Neurosci.2000 Oct；1(1):73-9.Review.PMID:11252771
59.Nano Lett.2015 May 13；15(5):3487-94.doi:10.1021/acs.nanolett.5b00851.Epub 2015 Apr 28.PMID:25895433
60.Nat Med.2015 Jan；21(1):92-8.doi:10.1038/nm.3730.Epub 2014 Dec15.Erratum in:NatMed.2015 May；21(5):537.PMID:25501906
61.PLoS Genet.2009 Aug；5(8):e1000604.doi:10.1371/journal.pgen.1000604.Epub 2009 Aug 14.PMID:19680447
62.J Neurosci.2011 Mar 30；31(13):4978-90.doi:10.1523/JNEUROSCI.2672-10.2011.PMID:21451036

Claims (52)

1.调节细胞活性的方法，包括将MAR基因递送至所述细胞中的步骤和向所述细胞提供磁刺激的步骤。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞是神经元细胞、肌肉细胞或干细胞。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述细胞在体外被处理。
4.如权利要求1或2所述的方法，其中所述细胞位于受试者中。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述受试者是人。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述MAR基因经密码子优化用于在人体中表达。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述MAR基因的序列选自由SEQ ID NO:1-11构成的组。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述MAR基因通过包含细胞类型特异性启动子或区域特异性启动子的载体递送至目标位点。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述载体包括慢病毒、逆转录病毒、腺相关病毒或质粒。
10.治疗受试者的方法，包括将MAR基因递送至受试者中的目标区域的步骤和向所述区域提供磁刺激的步骤。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述受试者是健康的。
12.如权利要求10所述的方法，其中所述受试者患有疾病或损伤。
13.权利要求12的方法，其中所述受试者患有选自由脊髓损伤、神经退行性疾病、视网膜退行性疾病、心脏疾病、干燥综合征或成瘾构成的组的疾病或损伤。
14.如权利要求10-13中任一项所述的方法，其中所述MAR基因通过包含细胞类型特异性启动子或区域特异性启动子的载体靶向一个或更多个患病区域。
15.如权利要求10-13中任一项所述的方法，其中通过将表达MAR的细胞植入所述受试者来递送所述MAR基因。
16.治疗受试者中神经退行性疾病的方法，包括通过载体将MAR基因递送至所述受试者中的步骤和向所述受试者提供磁刺激的步骤。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述神经退行性疾病选自由阿尔茨海默病、帕金森病、朊病毒病、运动神经元疾病、亨廷顿病、脊髓小脑性共济失调和脊髓性肌萎缩构成的组。
18.如权利要求16或17所述的方法，其中所述MAR基因由包含细胞类型特异性启动子或区域特异性启动子的载体携带。
19.如权利要求16或17所述的方法，其中所述MAR基因通过包含细胞类型特异性启动子或区域特异性启动子的载体靶向一个或更多个患病区域。
20.如权利要求16或17所述的方法，其中通过将表达MAR的细胞植入所述受试者来递送所述MAR基因。
21.修复受试者中脊髓损伤的方法，包括通过载体将MAR基因递送至受损目标区域的步骤和向所述受试者提供磁刺激的步骤。
22.用于在受试者中对包括失明和视网膜色素变性在内的视网膜退化性疾病进行靶向磁遗传学治疗的方法，包括通过载体将MAR基因递送至目标区域的步骤和向所述区域提供磁刺激的步骤。
23.用于对包括心律不齐在内的心脏疾病进行靶向磁遗传学治疗方法，包括通过载体将MAR基因递送至心脏中的目标区域的步骤和向心肌提供磁刺激的步骤。
24.诊断性或治疗性磁共振成像与MAR依赖性磁刺激相结合的方法，包括：用磁共振成像监测神经反应，修饰表达MAR的靶向脑部区域并用外部磁场刺激脑部以激活神经元活动。
25.用于治疗受试者中干燥综合征的方法，包括通过载体将MAR基因递送至受试者中的步骤和向所述受试者提供磁刺激的步骤。
26.治疗受试者中成瘾例如药物成瘾和酒精成瘾的方法，包括在脑部区域如伏隔核中表达磁感应受体MAR的步骤和用外部磁场刺激脑部的步骤。
27.用于治疗疾病诸如帕金森病、慢性疼痛、重度抑郁症、妥瑞氏综合征或癫痫等的用磁场进行深部脑刺激的方法，包括将包含MAR基因的载体递送至目标患病区域的步骤和向所述区域提供磁刺激的步骤。
28.对MAR靶向的脑部区域进行非侵入性磁刺激的方法，包括将包含MAR基因的载体递送至所述MAR靶向的脑部区域的步骤和向所述区域提供磁刺激的步骤。
29.磁抑制受试者中目标区域的方法，其包括对所述受试者中的MAR基因和/或磁感应受体家族成员进行分子工程化的步骤和向所述区域提供磁刺激的步骤。
30.通过表达MAR蛋白和MAR相互作用受体在细胞中产生第二信使的方法，包括将包含MAR基因的载体递送至所述细胞中的步骤和向所述细胞提供磁刺激的步骤，其中所述MAR蛋白的表达为所述细胞中第二信使的产生和/或信号转导通路的扰动提供了准备。
31.用以干扰记忆形成和回忆的控制记忆功能的方法，包括在脑部区域如海马区、杏仁核区和/或扣带皮质中表达磁感应受体MAR的步骤和用外部磁场刺激脑部的步骤。
32.控制神经干/祖细胞中兴奋和神经发生的方法，包括在干细胞中表达磁感应受体MAR的步骤和用外部磁场激活以增强神经发生的步骤。
33.磁遗传学控制内皮细胞的方法，其通过输送MAR穿过血管屏障进入组织如脑和肺，并由施加的外部磁场控制血管特性如血管紧张度、动脉直径和血管生长来进行。
34.如权利要求21-33中任一项所述的方法，其中所述MAR基因通过包含细胞类型特异性启动子或区域特异性启动子的载体递送至一个或更多个靶向区域。
35.如权利要求21-33中任一项所述的方法，其中通过将表达MAR的细胞植入所述受试者来递送所述MAR基因。
36.用于递送磁感应受体MAR的载体，其包含编码MAR蛋白的核酸序列和细胞类型特异性启动子或区域特异性启动子。
37.如权利要求36所述的载体，其中所述载体包括病毒或质粒。
38.如权利要求36所述的载体，其中所述载体包括慢病毒、逆转录病毒或腺相关病毒。
39.包含MAR基因和诱导型启动子的核酸序列。
40.如权利要求39所述的核酸序列，所述诱导型启动子可由能对所施用的药物作出响应的反式作用因子进行诱导。
41.包含与另一功能性蛋白偶联的MAR蛋白的融合蛋白，其中所述另一功能性蛋白是荧光蛋白，例如mCherry、GFP、YFP或CFP。
42.如权利要求41所述的融合蛋白，其中所述另一功能性蛋白具有PDZ或AIS结构域。
43.如权利要求41所述的融合蛋白，其中所述另一功能性蛋白靶向亚细胞区域。
44.用于治疗受试者的药物组合物，其包括：包含MAR基因的载体或表达MAR的细胞；和药学上可接受的载剂。
45.表达外源性MAR基因并能对外部磁刺激作出反应的转基因动物。
46.如权利要求45所述的转基因动物，其中所述动物是果蝇、蠕虫、斑马鱼、小鼠、大鼠或狨猴。
47.MAR基因、包含MAR基因的载体或表达MAR的细胞在制备用于治疗受试者中神经退行性疾病的药物中的用途。
48.如权利要求47所述的用途，其中所述神经退行性疾病选自阿尔茨海默氏病、帕金森病、朊病毒病、运动神经元疾病、亨廷顿病、脊髓小脑性共济失调和脊髓性肌萎缩构成的组。
49.MAR基因、包含MAR基因的载体或表达MAR的细胞在制备用于修复受试者中脊髓损伤的药物中的用途。
50.MAR基因、包含MAR基因的载体或表达MAR的细胞在制备用于对包括失明和视网膜色素变性在内的视网膜退行性疾病进行靶向磁遗传学治疗的药物中的用途。
51.MAR基因、包含MAR基因的载体或表达MAR的细胞在制备用于受试者中靶向心脏治疗的药物中的用途。
52.MAR基因、包含MAR基因的载体或表达MAR的细胞在制备用于治疗受试者中干燥综合征的药物中的用途。
CN201580084263.8A 2015-08-31 2015-08-31 磁遗传学及其用途 Pending CN109195635A (zh)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/CN2015/000622 WO2017035682A1 (en) 2015-08-31 2015-08-31 Magnetogenetics and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN109195635A true CN109195635A (zh) 2019-01-11

Family

ID=58186472

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201580084263.8A Pending CN109195635A (zh) 2015-08-31 2015-08-31 磁遗传学及其用途

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20180353765A1 (zh)
EP (1) EP3344297A4 (zh)
JP (1) JP2018526439A (zh)
CN (1) CN109195635A (zh)
WO (1) WO2017035682A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111789044A (zh) * 2020-07-02 2020-10-20 江苏农牧科技职业学院 一种宠物美容用的毛发梳理装置

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8597883B2 (en) * 2011-02-14 2013-12-03 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Biomarkers for cancer-related fatigue and use thereof

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001071042A2 (en) * 2000-03-23 2001-09-27 Pe Corporation (Ny) Detection kits, such as nucleic acid arrays, for detecting the expression of 10,000 or more drosophila genes and uses thereof
US20060084066A1 (en) * 2004-02-20 2006-04-20 Sah Dinah W Y Surrogate markers of neuropathic pain

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8597883B2 (en) * 2011-02-14 2013-12-03 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Biomarkers for cancer-related fatigue and use thereof

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
IRENE CO´ZAR-CASTELLANO等: "hIscA: a protein implicated in the biogenesis of iron-sulfur clusters", 《BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA》 *
王东生等: "NLS-RARα与ISCA1相互作用在哺乳动物细胞中的验证", 《第四军医大学学报》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111789044A (zh) * 2020-07-02 2020-10-20 江苏农牧科技职业学院 一种宠物美容用的毛发梳理装置
CN111789044B (zh) * 2020-07-02 2022-04-15 江苏农牧科技职业学院 一种宠物美容用的毛发梳理装置

Also Published As

Publication number Publication date
US20180353765A1 (en) 2018-12-13
JP2018526439A (ja) 2018-09-13
EP3344297A4 (en) 2019-03-06
EP3344297A1 (en) 2018-07-11
WO2017035682A1 (en) 2017-03-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Long et al. Magnetogenetics: remote non-invasive magnetic activation of neuronal activity with a magnetoreceptor
US10369378B2 (en) System for optical stimulation of target cells
De Vry et al. In vivo electroporation of the central nervous system: a non-viral approach for targeted gene delivery
Macé et al. Targeting channelrhodopsin-2 to ON-bipolar cells with vitreally administered AAV restores ON and OFF visual responses in blind mice
CN107708796B (zh) 用于控制性局部治疗剂递送的电穿孔系统
US20070293893A1 (en) Method and apparatus for preconditioning of cells
JP6462684B2 (ja) カルシウム指示遺伝子
JP2022110036A (ja) 機能的脳回路解析の方法
Ohmura et al. In vivo electroporation to physiologically identified deep brain regions in postnatal mammals
CN109195635A (zh) 磁遗传学及其用途
Peng et al. Current approaches to characterize micro-and macroscale circuit mechanisms of Parkinson’s disease in rodent models
Doux et al. Plasmid-based gene transfer in mouse skeletal muscle by electroporation
US20170339930A1 (en) Method of regulating lifespan using transgenic caenorhabditis elegans
JP7175880B2 (ja) Ｃｈｒｉｍｓｏｎの変異型光誘導性イオンチャネル
Min et al. Visuomotor anomalies in achiasmatic mice expressing a transfer-defective Vax1 mutant
Berigan Neuroscience tools in novel contexts: developing thermogenetics in Drosophila and decoding autonomic activity in mouse major pelvic ganglion
JP6108469B2 (ja) ラット脳内光誘発けいれんモデル
JP2019522469A (ja) チャネルロドプシンの変異型光誘導性イオンチャネル
Zou et al. Targeted electroporation in embryonic, larval, and adult zebrafish
Caria et al. The mesencephalic–hypoglossal nuclei loop as a possible central pattern generator for rhythmical whisking in rats
Zou Connectivity, plasticity, and function of neuronal circuits in the zebrafish olfactory forebrain

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20190111

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication