CN109187484A - 一种用亲和反应调控碳点催化sers检测生物素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用亲和反应调控碳点催化SERS检测生物素的方法,其特征是,包括如下步骤:(1)制备已知浓度的生物素标准溶液体系,测定其1617cm‑1处的SERS峰强度值为I;(2)制备空白对照溶液体系,亦测定其SERS峰强度值为I0;(3)计算∆I=I0‑I;(4)以ΔI对生物素的浓度做工作曲线;(5)制备被测样品溶液,测定其SERS峰强度值为I样品,计算ΔI样品=I0‑I样品;(6)依据工作曲线,计算出被测样品中的生物素的浓度。这种方法简便、快速、试剂无毒、选择性好、灵敏度高。
Description
技术领域
本发明涉及分析化学领域,具体是一种用亲和反应调控碳点催化SERS检测生物素的方法。
背景技术
碳点是指粒径小于10nm的新型荧光碳纳米材料,因其主要元素为碳、氢、氧和氮,不会发生重金属泄漏,有望成为重金属半导体量子点的理想替代材料。由于碳点具有荧光活性高、种类多样、生物相容性好、毒性低等优点,在生物检测、基因转运、药物传输和生物成像等领域得到了广泛应用。碳点优良的荧光性能已在分析化学领域中展现出重要的应用潜力,目前制备碳点的方法很多,大致可分为化学方法和物理方法两大类。化学方法主要有电化学合成法、高温热解/煅烧法、水热法、酸氧化法、模板法、微波法和超声法等;物理方法主要包括弧光放电法、激光消融/钝化法以及等离子体处理法,其中电弧放电法、激光法、电化学氧化法等也可归为自上而下法,即通过物理或化学方法使其由大变小,直至成为纳米颗粒;而热解法、支载合成法、微波法等可归为自下而上法,其大多为化学合成。制备碳点的碳源包括石墨烯、碳纳米管、蜡烛灰、氨基酸、壳聚糖等无机碳源及有机碳源,其中,以石墨烯等碳源制备的石墨烯量子点为典型的碳晶格结构,尺寸具有典型的各向异性,例如,一种基于微波热解法合成的荧光碳量子点(CQDs)的催化特性,可以增强鲁米诺-铁氰化钾体系的发光信号,因2-ME对这一体系的发光有抑制作用,且该作用与2-ME的浓度呈正比关系,建立了检出限为5.4×10-10g/mL的2-ME含量测定的新方法;一种采用聚乙烯亚胺(BPEI)功能化制备的碳点,用于Cu2+的测定,检出限为6nmol/L、10-1100nmol/L范围的荧光方法;一种以辣椒作为碳源制备了同时具有上转化和下转化性质的碳点,并用于实际样品中ClO-的检测,检出限为0.05μmol/L;一种通过电化学方法制备的具有优良电化学发光性能的碳点,在含有SO4 2-的溶液中检测五氯苯酚(PCP),检出限为1.3×10-12g/L、线性范围为10pg/L-1.0μg/L。
生物素-亲和素系统是一种新型生物反应放大系统,生物素(VH)与亲和素(Ad)之间高亲合力的牢固结合以及多级放大效应,使BAS免疫标记和有关示踪分析更加灵敏,它已成为目前广泛用于微量抗原、抗体定性、定量检测及定位观察研究的新技术。近年来,基于亲和素-生物素反应的检测方法已有报道。有文献报道了利用生物素与BODIPY染料共价标记,其可以经历有效的距离依赖性荧光自熄灭,由于荧光自猝灭而导致荧光强度降低,直接测定抗生物素蛋白和竞争性检测生物素的高灵敏度(<50pmol/L的抗生物素蛋白,<0.2nmol/L的生物素)和选择性的荧光方法;采用Fe3O4/Au纳米粒子为载体,利用生物素标记特异性抗体,然后利用ELISA测定方法检测Fe3O4/Au纳米粒子表面上的抗体,开发了生物素-抗生物素蛋白扩增ELISA以检测乙肝表面抗原(HBsAg);利用谐振频率为575MHz的AIN薄膜体声谐振器(FBAR)作为皮肿标志物粘蛋白1(MUC1)生物传感器在适体-Au缀合物和MUC1之间的识别之后,通过链霉抗生物素蛋白将生物素和缀合物一起捕获到FBAR的表面上,可以敏感地检测MUC1,这种生物传感器在频率位移和MUC1浓度范围在30到500nmol/L之间呈现良好的线性关系,其灵敏度约为818.6Hz nmol/L;通过生物素和亲和素蛋白之间的特异反应产生多酶系统,建立了生物素-亲和素扩增酶联免疫吸附试验(BA-ELISA)方法,并用于O,O-二乙基有机磷农药的测定,检测范围为0.1-10000μg/L、检出限为0.0248μg/L。
表面增强拉曼散射(SERS)是一种无损和超灵敏分子光谱技术,已引起人们越来越多的兴趣。将高选择性免疫反应与SERS结合的研究集中在使用拉曼活性标记物开发高度敏感的检测方案,即拉曼染料标记的免疫SERS测定法,然而,拉曼报告显示非特异性吸附常常导致假阳性结果,因此需要用于探测免疫反应的无标记方法的发展。应该有两个重要方面在进行基于SERS的无标记免疫测定之前要考虑的是免疫复合物通常具有低拉曼横截面,并且在将抗体或抗原附着到金属纳米颗粒(NP)之后维持抗体或抗原的生物活性至关重要,使用SERS进行无标记免疫分析的开发仍然是一个重要挑战,因为目前使用的SERS活性基底不能将生物相容性和高灵敏度结合起来。有文献报道了一种通过与抗生物素蛋白的强静电相互作用诱导纳米银(AgNP)聚集,并且生物素-缀合蛋白随后通过生物素-抗生物素蛋白生物特异性识别附着至Ag聚集体,由于SERS对第一层吸附物及其取向特别敏感,在抗原参与前后SERS光谱的差异可用于探测抗生物素蛋白聚集的Ag纳米颗粒中的蛋白质-蛋白质结合,检测范围为10-10-10-8mol/L,检出限为10-10mol/L;一种利用在氨水预处理过的滤纸上生长的AgNP,所得到的AgNP具有高度近似球形的形状,该镀银滤纸基底片能提供比用玻璃板为基底更高的SERS信号和重复性,该方法用于选择性检测水溶液中的酪氨酸,SERS信号增加50倍,线性范围可达100μmol/L,检出限为625n mol/L;利用马铃薯淀粉绿色合成的银纳米粒子建立了一个SERS检测0.02-10mmol/L抗坏血酸的新方法,检出限为0.02mmol/L;一种利用4MBA标记的SiO2@Ag免疫探针,4NTP标记的SiO2@Ag免疫探针和金膜半球阵列(Au-FHA)免疫底物组成的夹心免疫复合物构建了一个免疫分析平台,线性范围为10fg/mL-400ng/mL、检出限为3.38fg/mL前列腺、4.87fg/mL甲胎蛋白;但未见以NaH2PO2-RH6G反应、纳米银为基底的SERS法测定生物素的报道。
生物素(VH)又称维生素B7,维生素H,是一种水溶性B族维生素,由一个含有一个硫原子的脲基环和一条戊酸的侧链组成,目前已知有8种异构体。天然存在的d-生物素具有活性,它以羧化酶的辅酶形式微量存在于一切活细胞中,参与蛋白质、脂肪和糖类的代谢,是动物机体维持正常生理机能所必需的维生素之一,它被广泛应用与食品、医药、饲料、发酵等领域,对工农业生产和人们的日常产生重要的影响。检测生物素的方法也不断变化,目前文献可查的方法有微生物法、同位素稀释法、比色测定法、荧光测定法、化学发光法、薄层色谱法、气相色谱法、高压液相色谱法、液相色谱质谱联用法、滴定分析法、动力学电位法、蛋白质耦合法、竞争耦合化学发光法、酶标记竞争耦合法、薄层层析法、毛细管电泳法、动物试验法、酶联免疫吸附法、微分脉冲伏安等方法。一种利用植物乳杆菌(ATCC 8014)对生物素具有很高灵敏性的特点,其与生物素含量成一定的线性关系,通过测定培养后菌液吸光度的变化得出婴幼儿乳粉中生物素的含量,线性范围为0.1-1ng/kg;用高效液相色谱仪,以0.05mol/L的磷酸二氢钾与乙腈(9:1)为流动相,波长215nm条件下,对糖蜜中的生物素进行检测,其生物素含量为37.865mg/kg;利用生物素与链霉亲和素的特异识别,制作了一种传感器,用于测定天然果汁和药物中的生物素含量,线性范围为0.1-8.0μg/L。这些报道的方法中,大多数使用的仪器昂贵、操作繁琐。据我们所知,采用亲和素-生物素亲和反应调控碳点催化NaH2PO2-Rh6G反应生成具有SERS效应用于检测生物素的SERS法尚未见报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足,而提供一种用亲和反应调控碳点催化SERS检测生物素的方法。这种方法简便、快速、试剂无毒、选择性好、灵敏度高。
实现本发明目的的技术方案是:
一种用亲和反应调控碳点催化SERS检测生物素的方法,与现有技术不同的是,包括如下步骤:
(1)制备已知浓度的VH标准溶液体系:于不同的刻度试管中,依次加入5μL-110μL0.1ng/mL VH标准溶液、150μL-250μL 0.02μg/mL的Ad溶液、100μL-150μL 40μg/L碳点溶液、100μL-150μL pH1.5的NaAC-HCl缓冲溶液、80μL-150μL 0.5mol/L NaH2PO2溶液、80μL-120μL10μmol/L Rh6G溶液、100μL-200μL 0.4mmol/L AgNR溶液和10μL-50μL 1mol/L NaCl溶液,用二次蒸馏水定容至1.5mL,混匀,于80℃水浴反应20min,冰水冷却至室温;
(2)制备空白对照溶液体系:采用步骤(1)的方法不加VH标准溶液制备空白对照溶液体系;
(3)分别取按步骤(1)、(2)制备的VH标准溶液体系及空白对照溶液体系倾入石英比色皿中,在拉曼光谱仪上扫描获得体系的SERS光谱,测定1617cm-1处的SERS峰强度值为I,同时测定空白对照溶液体系的SERS峰强度值为I0,计算ΔI=I0-I;
(4)依据ΔI对VH的浓度关系做工作曲线;
(5)依照步骤(1)的方法制备样品溶液,其中加入的VH标准溶液替换为样品溶液,并按步骤(3)的方法测定样品溶液的荧光峰强度值为I样品,计算ΔI样品=I0-I样品;
(6)依据步骤(4)的工作曲线,计算出样品溶液VH的含量。
采用现有技术制备本技术方案中的碳点(简写为CD)的制备方法是:称取1g葡萄糖和0.7g亚硫酸铵溶于30mL二次蒸馏水中,溶解完全后,转入聚四氟乙烯为衬底的高压釜内,密封后设置消解仪参数,逐渐升温到180℃保温时间为10min,压力为30atm,得到CD溶液的浓度为0.032g/mL,用0.1mol/L NaOH调至中性后得到的浓度为0.02g/mL,使用时稀释所需浓度。
采用现有技术制备本技术方案所需的纳米银(简写为AgNP)的制备方法为:在三角烧瓶中,加入二次蒸馏水44mL,搅拌下依次加入2mL 10mmol/L AgNO3溶液、2.0mL100mmol/L柠檬酸三钠溶液、600μL 30%H2O2溶液、600μL 0.1mol/L NaBH4溶液,快速搅拌至颜色变蓝色,将制得的蓝色银纳米溶胶转入光波炉中,调整温度为250℃光波运行10min,得到橙红色透明银纳米溶胶,自然冷却后,用二次蒸馏水定容至50mL,其浓度为0.4mmol/L AgNP。
实现本技术方案的原理是:在NaAC-HCl缓冲溶液中,NaH2PO2-Rh6G反应缓慢,碳点(CD)能催化该反应,加入纳米银做基底,SERS信号降低;当加入生物素(Ad)时,Ad包裹了CD,抑制了CD对NaH2PO2-Rh6G的催化能力,SERS信号增强;加入生物素(VH)时,形成Ad-VH复合物,使CD从表面脱附,催化作用增强,随VH浓度的增加,催化NaH2PO2-Rh6G反应速率加快,体系SERS信号降低,SERS强度降低值与VH浓度呈线性关系。
这种方法的优点是:与现有的方法相比,这种方法利用亲和反应调控CD催化NaH2PO2还原Rh6G反应,且产物的SERS峰强度与被测物VH浓度呈线性关系,实现用SERS法定量测定VH,这种方法简便、快速、试剂无毒、选择性好、灵敏度高。
附图说明
图1为实施例中的SERS光谱示意图。
图中,a.8mmol/L pH1.5NaAC-HCl+33.3mmol/L NaH2PO2+0.67μmol/L Rh6G+3.2μg/L CD+2.9ng/mL Ad+40μmol/L AgNR+20mmoL/L NaCl b.a+0.00033ng/mL VH c.a+0.0033ng/mL VH d.a+0.0047ng/mL VH e.a+0.006ng/mL VH f.a+0.008ng/mL VH。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明内容作进一步的阐述,但不是对本发明的限定。
实施例:
一种用亲和反应调控碳点催化SERS检测生物素的方法,包括如下步骤:
(1)制备已知浓度的VH标准溶液体系:于5支不同的刻度试管中,依次加入5μL、50μL、70μL、90μL、120μL 0.1ng/mL VH标准溶液、220μL 0.02μg/mL的Ad溶液、120μL 40μg/L碳点溶液、120μL pH 1.5的NaAC-HCl缓冲溶液、100μL 0.5mol/L NaH2PO2溶液、100μL 10μmol/L Rh6G溶液、150μL 0.4mmol/L AgNR溶液和30μL 1mol/L NaCl溶液,用二次蒸馏水定容至1.5mL,混匀,于80℃水浴反应20min,冰水冷却至室温;
(2)制备空白对照溶液体系:采用步骤(1)的方法不加VH标准溶液制备空白对照溶液体系;
(3)分别取按步骤(1)、(2)制备的VH标准溶液体系及空白对照溶液体系倾入石英比色皿中,在拉曼光谱仪,设定仪器参数光源功率为4.0mW、狭缝为50μm扫描获得体系的SERS光谱,测定1617cm-1处的SERS峰强度值为I,同时测定空白对照溶液体系的SERS峰强度值为I0,计算ΔI=I0-I,如图1所示;
(4)依据ΔI对VH的浓度关系做工作曲线,获得线性回归方程为ΔI=368243C+219.2,其中VH浓度C的单位为ng/mL,测定线性范围为0.00033-0.008ng/mL,检出限为0.0001ng/mL;
(5)样品测定:从超市购买三种饮料:橙汁、苹果汁、葡萄汁为测试样品,分别吸取1.5mL置于离心管中,于7000r/min下离心10min,吸取1mL上清液为样品检测液;然后依照步骤(1)的方法制备被测样品,其中加入的VH标准溶液替换为被测样品,按步骤(2)-(4)操作,算出被测样品的ΔI样品=I0-I样品;
(6)依据步骤(4)的工作曲线,计算出橙汁、苹果汁、葡萄汁VH的含量分别为0.0011ng/mL、0.0008ng/mL、0.0012ng/mL。
本技术方案检测方法的验证:
取上述实施例步骤(5)中的三种样品检测液,加入浓度为0.0005ng/mL的VH标准溶液,进行加标回收实验,求得回收率分别为98.5%、99.6%、100.1%,相对标准偏差为4.5%、4.1%、3.3%,说明本技术方案方法准确可靠。
Claims (1)
1.一种用亲和反应调控碳点催化SERS检测生物素的方法,其特征是,包括如下步骤:
(1)制备已知浓度的VH标准溶液体系:于不同的刻度试管中,依次加入5μL-110μL0.1ng/mL VH标准溶液、150μL-250μL 0.02μg/mL的Ad溶液、100μL-150μL 40μg/L碳点溶液、100μL-150μL pH1.5的NaAC-HCl缓冲溶液、80μL-150μL 0.5mol/L NaH2PO2溶液、80μL-120μL10μmol/L Rh6G溶液、100μL-200μL 0.4mmol/L AgNR溶液和10μL-50μL 1mol/L NaCl溶液,用二次蒸馏水定容至1.5mL,混匀,于80℃水浴反应20min,冰水冷却至室温;
(2)制备空白对照溶液体系:采用步骤(1)的方法不加VH标准溶液制备空白对照溶液体系;
(3)分别取按步骤(1)、(2)制备的VH标准溶液体系及空白对照溶液体系倾入石英比色皿中,在拉曼光谱仪上扫描获得体系的SERS光谱,测定1617cm-1处的SERS峰强度值为I,同时测定空白对照溶液体系的SERS峰强度值为I0,计算ΔI=I0-I;
(4)依据ΔI对VH的浓度关系做工作曲线;
(5)依照步骤(1)的方法制备样品溶液,其中加入的VH标准溶液替换为样品溶液,并按步骤(3)的方法测定样品溶液的荧光峰强度值为I样品,计算ΔI样品=I0-I样品;
(6)依据步骤(4)的工作曲线,计算出样品溶液VH的含量。
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