CN109187443B

CN109187443B - 基于多波长透射光谱的水体细菌微生物准确识别方法

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Publication number: CN109187443B
Application number: CN201811189192.XA
Authority: CN
Inventors: 赵南京; 刘建国; 殷高方; 杨瑞芳; 马明俊; 甘婷婷; 刘文清
Original assignee: Hefei Institutes of Physical Science of CAS
Current assignee: Hefei Institutes of Physical Science of CAS
Priority date: 2018-10-12
Filing date: 2018-10-12
Publication date: 2021-06-15
Anticipated expiration: 2038-10-12
Also published as: CN109187443A

Abstract

本发明公开了基于多波长透射光谱的水体细菌微生物准确识别方法，基于微结构成分差异提取了细菌微生物多波长透射光谱特征参数并构建了指纹特征光谱，解决了识别分析中关键光谱量化特征缺少的问题，构造了细菌微生物微结构成分光谱的综合相似性指数，并与多变量分析相结合，实现了复杂背景共存组份干扰下目标细菌微生物的准确识别。为水体细菌微生物特别是饮用水源典型危害致病菌的快速识别预警提供了手段，并为细菌微生物的结构组成、生理与机理科学研究提供了方法。

Description

基于多波长透射光谱的水体细菌微生物准确识别方法

技术领域

本发明涉及环境水体污染识别监测及微生物分析技术领域，尤其涉及水体细菌微生物准确识别方法。

背景技术

近年来,基于光学/光谱技术的细菌微生物检测方法不断涌现，可归结为两类：(1)基于分子吸收产生的吸收/发射光谱，包括拉曼光谱(显微拉曼光谱、表面增强拉曼光谱)、红外光谱(傅里叶变换红外光谱、太赫兹光谱)以及荧光光谱(激光诱导荧光、三维荧光光谱)等；(2)基于分子散射产生的散射光谱，主要是多角度光散射技术。

对于细菌微生物的准确识别，存在主要问题如下：

(1)特征信息数据单一，细菌微生物特征信息包含物质结构(外部、内部)和化学组成(核酸、蛋白质等)两个部分，上述方法所获取的特征信息数据仅包含了部分特征。如：光散射法仅提供了细菌微生物的结构信息(主要是外部结构：粒径、形状)，拉曼光谱、红外光谱、荧光光谱则集中在细菌微生物的化学组成成分。

(2)特征数据信息量少，细菌微生物对光的吸收与散射是入射光波长的函数，在紫外波段有较强的吸收，可见光波段则散射较强。目前多角度光散射、拉曼光谱、荧光光谱主要采用的还是单一入射光波长，由于多数细菌微生物粒径尺寸较小(0.5-5μm)、化学成分相近且含量较少，单一入射光波长下仅可获得一个或几个信号特征非常微弱的表征信息。

(3)准确识别分析困难，由于代表不同细菌微生物的特征信息不够充分，且自然水体环境复杂、多种微生物组份共存，目前仅是根据个别特征谱带进行比对统计分析，结合化学计量学、神经网络(聚类分析、主成分分析)等方法研究了细菌微生物的快速分类鉴别，误差较大且难以量化。

不同波长下的吸收(发射则是基于吸收)与散射特征相结合(即：多波长透射光谱)，不仅可提供细菌微生物的外部结构、内部结构、化学组分等信息，而且包含了对不同波长光的响应函数特征，为细菌微生物的准确识别与定量分析提供了更加丰富的特征信息数据，但目前国内外对细菌微生物的多波长透射光谱特性尚不清楚。因此，全面认识并充分利用细菌微生物的结构组成特征是实现细菌微生物准确识别的重要前提，也是细菌微生物快速检测技术的发展趋势。

发明内容

本发明目的是针对水体细菌微生物准确识别检测需求，发明了细菌微生物微结构成分特征构建与光谱综合相似性指数分析的多波长透射光谱准确识别方法，一方面用于饮用水源典型危害致病菌的快速识别预警，为及时的响应处理提供最佳时机；另一方面为细胞生物学、生物医学、食品微生物学等微生物的结构组成、生理与机理科学研究提供方法。

本发明是通过以下技术方案实现：

基于多波长透射光谱的水体细菌微生物准确识别方法，通过划分细菌微生物微结构成分，确定微结构成分光谱特征解析方法，获取细菌微生物多波长透射光谱，提取微结构成分特征参数并重建特征光谱，构建不同细菌微生物指纹光谱库，构造微结构成分光谱综合相似性指数，结合指纹光谱库与微结构成分光谱综合相似性指数进行实测光谱多变量分析，实现细菌微生物准确识别。

所述的基于多波长透射光谱的水体细菌微生物准确识别方法，包括以下步骤：

(1)微结构成分划分：将细菌微结构分为外部结构和内部结构；

(2)微结构成分光谱特征解析方法：细菌微生物对光的吸收与散射是入射光波长的函数，在光谱解析时，光的散射特征重点解析外部结构和内部结构大小、形状、折射率参数，吸收特性解析化学组分组成，并反演核酸、氨基酸、蛋白质的组分含量；

(3)细菌微生物多波长透射光谱获取：利用商品化分光光度计或自行搭建的多波长透射光谱快速测量系统获取细菌微生物多波长透射光谱；

(4)微结构成分特征参数提取与特征光谱重建：利用不同细菌微生物的已知标准样品进行特征光谱解析，提取微结构成分特征参数，基于不同细菌微生物的光谱特征是其在微结构成分上的差异体现，在对特征参数提取的基础上重建不同细菌微生物的指纹特征光谱；

(5)不同细菌微生物指纹光谱库构建：将指纹特征光谱分为外部结构、内部结构以及化学组分三个部分光谱结构进行表征，根据不同种类细菌微生物的光谱结构特性与特征，对不同细菌微生物进行分组、归类，建立不同细菌微生物的多波长透射光谱特征数据库；

(6)微结构成分光谱综合相似性指数构造：基于分解产生的细菌微生物外部结构、内部结构以及化学组分光谱与光谱库中种类进行比对；

(7)实测光谱多变量分析：结合指纹光谱库，分别计算实测光谱分解后的外部结构光谱、内部结构光谱、化学组分光谱及特征峰位与其标准谱的相似性，进行光谱多变量分析分离多组份共存光谱；

(8)细菌微生物准确识别：根据不同细菌微生物各自的特征光谱，通过对共存光谱中不同细菌微生物逐个进行光谱提取，准确识别细菌微生物种类。

所述步骤1中外部结构包括细胞壁、细胞膜、荚膜，内部结构包括细胞质、核糖体。

所述步骤3中自行搭建的多波长透射光谱快速测量系统中所用光源为氘灯-卤钨灯，分光器件为光栅分光，探测器为CCD。

所述步骤4中微结构成分特征参数包括结构权重比例系数、外部结构参数、内部结构参数、外部结构与内部结构化学组分、外部结构与内部结构化学组分浓度以及各化学组分所占比例系数。

所述外部结构参数和内部结构参数包括粒径、形状、折射率，所述外部结构与内部结构化学组分包括核酸、氨基酸、蛋白质。

所述步骤6中比对过程主要考虑光谱特征峰位的吻合程度和光谱波形的相似性，构造外部结构光谱相似性、内部结构光谱相似性和化学组分光谱相似性的加权或乘积指数。

本发明的原理是：

细菌微生物多波长透射光谱主要是由细菌微生物的结构与成分对不同波长光的散射和吸收构成，基于光谱分布特征与强度分析细菌微生物的结构大小、形状、组分含量等参量，并利用光谱特征差异性来实现对不同细菌微生物的识别。

本发明的优点是：

本发明基于微结构成分差异提取细菌微生物多波长透射光谱特征参数并构建指纹特征光谱，解决识别分析中关键光谱量化特征缺少问题；通过构造细菌微生物微结构成分光谱的综合相似性指数，并与多变量分析相结合，解决复杂背景共存组份干扰及环境因素影响难题，实现目标细菌微生物的准确识别，根据本发明中提出的基于多波长透射光谱的水体细菌微生物准确识别方法，在实验室中有效地实现了水体中细菌微生物，包括沙门氏菌、志贺杆菌、致病性大肠杆菌、李斯特菌、金黄色葡萄球菌、霍乱弧菌、结核杆菌、滤过性病毒和原生动物等的准确识别。

附图说明

图1所示为本发明识别过程框图，其中1为微结构成分划分；2为微结构成分光谱特征解析方法确定；3为细菌微生物多波长透射光谱获取；4为微结构成分特征参数提取与特征光谱重建；5为不同细菌微生物指纹光谱库构建；6为微结构成分光谱综合相似性指数构造；7为实测光谱多变量分析；8为细菌微生物准确识别。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例

(1)水体细菌微生物高灵敏高分辨率多波长透射光谱快速获取

目前，透射光谱通用实验测量仪器主要是分光光度计(光源：氘灯-卤钨灯，探测器：光电倍增管)，多为光栅分光、机械转动扫描光谱测量，目前一条光谱最快获取时间约5-8分钟(测量范围：200-900nm，分辨率：0.1nm)，不具备光谱强度积分功能，多次测量平均则耗时较长(如30次测量至少需150分钟)，难以快速获取光谱数据用于实时分析。

搭建的光谱测量系统能够一次同时获得宽的光谱范围和高光谱分辨率的全谱，不需要光源分光、机械扫描部件，一条光谱的获取可在几个ms完成，多次测量非常快速(如100次测量可在1秒内实现)，通过合理选择闸门宽度有效控制光谱积分时间，自动实现多条光谱的累加与平均，提高光谱信号探测的信噪比及灵敏度，且可以实现光源输出与光谱探测的同步，减少背景光谱的干扰。系统核心部件为：①光源：氘灯-溴钨灯复合宽带光源，可获得200-900nm波长范围光强同时输出；②光谱分光器：中阶梯光栅，光谱范围200-900nm，光谱分辨率小于0.1nm，光源光束通过样品后由光纤耦合导入后分光；③探测器：具有时间闸门的高灵敏增强型ICCD探测器，内置延时分辨率几十ps量级的数字延时发生器，通过合理选择闸门宽度(根据测量光谱信号情况，积分时间可在纳秒-秒范围内设置，对于透射光谱，一般ms量级足够)有效控制光谱积分时间，提高光谱信号探测的信噪比及灵敏度。

(2)从细菌微生物光散射吸收特性与光谱分布特征分析出发，建立细菌微生物微结构成分多波长透射光谱解析方法

虽然多数细菌微生物具有粒径尺寸较小、化学组分相近、光谱变化平缓的特征，但由于其在微结构成分上的差异(即：粒径、形状、折射率、组份及含量等的差异将产生不同的光谱特征)，为实现细菌微生物更加准确的识别提供了思路。本发明基于米散射理论(透射光谱可看作光束透过被测样品后的前向散射光)建立细菌微生物多波长透射光谱解析方法，剖析细菌微生物微结构成分光学特性与光谱特征，为特征参数提取提供方法。

根据米散射理论，均匀球型粒子在波长λ处的透射率τ(λ)可表述如下：

式中N_p为单位体积内粒子数浓度，

为光程，Q_ext为米散射消光效率因子且是粒子复折射率m(λ)和粒子直径D的函数，f(D)为粒径谱分布。

根据细菌微生物微结构成分特征，其结构可划分为M个组成部分，且每一部分由其对光的散射和吸收特性的不同进行表征。因此，根据不同部分消光贡献比例的权重，公式(1)可改写为：

式中x_i(i＝1→M)为每一部分的权重比例系数，且有

实际情况下，细菌微生物形状包括球型、椭球型、柱型等，将细菌微生物作为椭球型粒子近似并进行米散射理论修正，并在结构组份划分时，将细菌微生物分为外部结构和内部结构两个组成部分，且每个组成部分最多含有三种化学组份进行透射光谱的解析；由于不同细菌微生物粒径变化非常小，将粒径谱分布f_i(D)近似为平均粒径D_i，由此，公式(2)可简化为：

式中下标out和in分别代表细菌微生物的外部结构和内部结构，消光效率因子Q_ext可通过米散射理论编程计算得到。由式(3)直接模拟计算不同细菌微生物的多波长透射光谱，通过对测量光谱与模拟计算光谱进行拟合与残差相关分析，来评价解析方法的灵敏度与可靠性，并释义不同细菌微生物的多波长透射光谱特征。

(3)提取细菌微生物微结构成分特征参数，重建指纹特征光谱，构建不同细菌微生物特征光谱库

在光谱解析方法建立的基础上，利用不同细菌微生物的已知标准样品进行特征光谱解析、光谱解析方法优化以及提取特征参数，重建不同细菌微生物的指纹特征光谱并构建特征光谱数据库，为复杂背景共存多组份光谱解析与目标细菌微生物的准确识别提供特征数据。

在光谱解析时，基于细菌微生物对不同波长光的散射与吸收特性，选择400-900nm散射波段进行外部结构和内部结构大小、形状、折射率等分析，在200-400nm吸收波段提取细菌微生物的化学组分相关参数。

在特征参数提取前，通过对已知标准样品的测量光谱作归一化处理，以消除细菌浓度、测量光程等对特征光谱分析的影响。由式(3)可得理论模拟计算光谱如下：

因此，根据式(4)可模拟不同参数下的光谱结构，利用非负矩阵分解交替最小二乘迭代等算法便可对已知标准样品细菌微生物的测量光谱进行分析，提取不同细菌微生物的结构权重比例系数x，外部结构参数(粒径D_out、形状r_out、折射率m_out)、内部结构参数(粒径D_in、形状r_in、折射率m_in)、外部结构与内部结构化学组分(核酸、氨基酸、蛋白质等，因种类不同化学组分有差异)、外部结构与内部结构化学组分浓度(c_out,c_in)以及各化学组分所占比例系数(ω_out,ω_in)等。

基于不同细菌微生物的光谱特征是其在微结构成分(粒径、形状、折射率、组份及含量等)上的差异体现，在对特征参数有效提取的基础上，因此利用式(4)进行不同细菌微生物的指纹特征光谱重建。

为了有效用于光谱识别分析并充分体现不同细菌微生物的光谱差异性，将指纹特征光谱分为外部结构(τ_out)、内部结构(τ_in)以及化学组分(τ_comp)三个部分光谱结构进行表征，并根据不同种类细菌微生物的光谱结构特性与特征，对不同细菌微生物进行分组、归类，建立不同细菌微生物的多波长透射光谱特征数据库。同时，数据库中可加入不同类型与环境条件下水质以及可能污染物的指纹特征光谱，以便进行复杂背景目标细菌微生物的分析。

(4)以综合相似性指数与多变量分析相结合，建立细菌微生物多组份共存光谱解析与种类识别方法

根据已建立的不同细菌微生物特征光谱库和待测样品测量光谱，通过构造细菌微生物外部结构、内部结构以及化学组分多波长透射光谱的综合相似性指数，采用综合相似性指数与多变量分析相结合，实现对细菌微生物多组份共存光谱的解析与种类的准确识别。

利用光谱去卷积方法对分解产生的细菌微生物外部结构、内部结构以及化学组分光谱与光谱库中种类进行比对，主要考虑光谱特征峰位的吻合程度和光谱波形的相似性，以皮尔逊相关系数作为光谱波形相似性度量，以高斯函数形式的相似性指数作为特征峰位的吻合程度度量。

根据皮尔逊相关系数，假设测量光谱和参考光谱分别为

τ_j(计算前首先进行标准化处理)，则这两个光谱的相似性指数计算为：

式中T表示转置，i＝1,…,N(N为测量光谱数量)，j＝1,…,M(M为参考光谱数量)，0≤r_j,i≤1，最大的r_j,i对应的特征光谱数据库中的成份为

对应的物质几率最大。

综合利用细菌微生物的外部结构、内部结构以及化学组分光谱特征信息，综合考虑外部结构光谱、内部结构光谱、化学组分光谱和特征峰位相似性指数，得到乘积综合相似性指数可表示为：

利用Tucker一致系数分别计算分解后的外部结构光谱、内部结构光谱、化学组分光谱及特征峰位与其标准谱的相似性；利用乘积综合相似性指数进行多组份共存光谱精确分离与种类准确识别，各组份细菌微生物种类准确识别的过程，也是光谱精确分离的过程。通过逐一计算测量光谱与参考光谱的相似性指数，由于特征光谱库中不同细菌微生物种类均有各自的特征光谱，通过上述工作的完成，可准确确定出细菌微生物种类，并在共存光谱中精确分离出各细菌微生物的光谱。

Claims

1.基于多波长透射光谱的水体细菌微生物准确识别方法，其特征在于，通过划分细菌微生物微结构成分，确定微结构成分光谱特征解析方法，获取细菌微生物多波长透射光谱，提取微结构成分特征参数并重建特征光谱，构建不同细菌微生物指纹光谱库，构造微结构成分光谱综合相似性指数，结合指纹光谱库与微结构成分光谱综合相似性指数进行实测光谱多变量分析，实现细菌微生物准确识别；

（1）微结构成分划分：将细菌微结构分为外部结构和内部结构；

（2）微结构成分光谱特征解析方法：细菌微生物对光的吸收与散射是入射光波长的函数，在光谱解析时，光的散射特征重点解析外部结构和内部结构大小、形状、折射率参数，吸收特性解析化学组分组成，并反演核酸、氨基酸、蛋白质的组分含量；

（3）细菌微生物多波长透射光谱获取：利用商品化分光光度计或自行搭建的多波长透射光谱快速测量系统获取细菌微生物多波长透射光谱；

（4）微结构成分特征参数提取与特征光谱重建：利用不同细菌微生物的已知标准样品进行特征光谱解析，提取微结构成分特征参数，基于不同细菌微生物的光谱特征是其在微结构成分上的差异体现，在对特征参数提取的基础上重建不同细菌微生物的指纹特征光谱；

（5）不同细菌微生物指纹光谱库构建：将指纹特征光谱分为外部结构、内部结构以及化学组分三个部分光谱结构进行表征，根据不同种类细菌微生物的光谱结构特性与特征，对不同细菌微生物进行分组、归类，建立不同细菌微生物的多波长透射光谱特征数据库；

（6）微结构成分光谱综合相似性指数构造：基于分解产生的细菌微生物外部结构、内部结构以及化学组分光谱与光谱库中种类进行比对；

（7）实测光谱多变量分析：结合指纹光谱库，分别计算实测光谱分解后的外部结构光谱、内部结构光谱、化学组分光谱及特征峰位与其标准谱的相似性，进行光谱多变量分析分离多组份共存光谱；

（8）细菌微生物准确识别：根据不同细菌微生物各自的特征光谱，通过对共存光谱中不同细菌微生物逐个进行光谱提取，准确识别细菌微生物种类。

2.根据权利要求1所述的基于多波长透射光谱的水体细菌微生物准确识别方法，其特征在于，所述步骤（1）中外部结构包括细胞壁、细胞膜、荚膜，内部结构包括细胞质、核糖体。

3.根据权利要求1所述的基于多波长透射光谱的水体细菌微生物准确识别方法，其特征在于，所述步骤（3）中自行搭建的多波长透射光谱快速测量系统中所用光源为氘灯-卤钨灯，分光器件为光栅分光，探测器为CCD。

4.根据权利要求1所述的基于多波长透射光谱的水体细菌微生物准确识别方法，其特征在于，所述步骤（4）中微结构成分特征参数包括结构权重比例系数、外部结构参数、内部结构参数、外部结构与内部结构化学组分、外部结构与内部结构化学组分浓度以及各化学组分所占比例系数。

5.根据权利要求4所述的基于多波长透射光谱的水体细菌微生物准确识别方法，其特征在于，所述外部结构参数和内部结构参数包括粒径、形状、折射率，所述外部结构与内部结构化学组分包括核酸、氨基酸、蛋白质。

6.根据权利要求1所述的基于多波长透射光谱的水体细菌微生物准确识别方法，其特征在于，所述步骤（6）中比对过程主要考虑光谱特征峰位的吻合程度和光谱波形的相似性，构造外部结构光谱相似性、内部结构光谱相似性和化学组分光谱相似性的加权或乘积指数。