CN109169636A - 一种猪鲜精4℃保存高效稀释粉及制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种猪鲜精4℃保存高效稀释粉及制备方法与应用，它是由重量份数的葡萄糖35‑40，果糖0.1‑0.4，乙二胺四乙酸钠1.2‑1.4，柠檬酸钠4‑8，碳酸氢钠1.2‑1.4，氯化钾0.7‑0.8，半胱氨酸0.3‑0.5，肌醇0.4‑0.6，青霉素1.0‑1.5，链霉素1.0‑1.5，大豆卵磷脂0.4‑1.0。其使用方法是猪精液采精后，用该稀释粉配制的1 L稀释液进行稀释，稀释后的精液在4℃冰箱中能够稳定保存11‑15天及以上，精液质量仍能满足输精要求，精子活率在0.6以上。本发明内容是历时2年，经过300多次试验所取得的成果，在猪场应用证明，猪精子4℃冰箱中保存11天仍具有授精能力，效果稳定。

Description

一种猪鲜精4℃保存高效稀释粉及制备方法与应用
技术领域
本发明属于家畜繁殖技术领域，涉及一种猪鲜精4℃保存高效稀释粉及制备方法与应用。
背景技术
随着我国养猪业规模化、集约化发展与联合育种工作的需要，猪人工授精技术已普遍应用。精液保存技术越来越受到重视，并日益显示出降低公猪饲养量和饲养成本、加快猪群品种改良、减少疾病传播等多方面优势。为此，近年来常温保存精液技术已广泛应用于猪的人工授精中，国内外研究者围绕猪精液常温保存稀释液开展了大量的研究工作，并研制出应用效果较好的稀释液配方。市场上的稀释粉一般分为短效（2-3天）、中效（3-5天）和长效（5-7天）等3种。在文献中能够检索到的稀释液种类中，BTS最为常见，为保存2-3天的短效稀释液。
与冷冻精液相比，液态保存精液人工授精后具有受胎率高、窝产仔数高、费用低、操作程序简单等优点。研究指出，猪精液保存温度下降到4℃或更低时，精子代谢活动水平降低，营养物质消耗减少，有利于延长精子的生命周期，使猪精液可以更长时间保存。因此，4℃保存技术能进一步扩大猪精液利用效率，提高养猪场经济效益。然而，相对于其他家畜，猪精子对低温耐受力较差、对温度变化较为敏感，在低温条件下猪精子质膜易受到损伤，导致精子功能异常、干扰精子代谢等等，妨碍了猪精液4℃保存技术在生产中的应用推广。而且，4℃冰箱比精子17℃保存用的恒温箱更易获得，运行状态也更加稳定，因此，研究开发猪精液4℃高效保存技术比17℃保存更具应用潜力。本项目组成员在猪精液鲜精保存多年研究基础上，结合前期猪精子低温保存研究经验，并借鉴国内外猪精液4℃保存方面最新研究成果，经过大量试验开发出一种猪精液4℃保存高效稀释粉，而且成本较低，平均每袋长效稀释液成本在4.5元左右，能够更好服务于我国生猪企业的快速、健康发展。
猪精液稀释液中的主要成分有：稀释剂(扩大精液容量)、营养剂(提供精子代谢所需的营养)、保护剂(缓冲不良环境对精子的影响)和抗菌剂。但是检索猪精液4℃保存研究资料，大多低温保护剂中均含有卵黄。卵黄为动物源性蛋白，容易向精液中导入某种病源，在生产应用上存在一定疾病风险。近年来，无动物性成分猪精液稀释液研究已逐渐成熟，并取得了较好的保存效果。大豆卵磷脂（Lecithin High Potency又称大豆蛋黄素）在医学上具有延缓衰老、保护肝脏、健脑益智和预防心血管疾病等多方面的作用。国外以大豆卵磷脂取代卵黄或奶类配制的牛精液冷冻稀释液已经实现商业化，且正在逐步取代传统的冷冻稀释液。国内学者在牛、羊上利用大豆卵磷脂取代动物性成分的精液稀释液研究也取得了一定的进展。大多数猪精液稀释剂中有较高浓度的葡萄糖使精子内pH值维持在6.0以下，使猪精子的糖酵解代谢很弱。非离子物质(如葡萄糖等)保证了渗透压浓度。稀释剂中碳酸氢钠和柠檬酸钠作为缓冲液。氯化钾以低浓度用于维持Na＋-K+泵，防止细胞外K+耗竭而使细胞失去活力。EDTA能捕获二价的金属离子，尤其是Ca2＋，可能抑制跨膜运动而阻止获能的启动和顶体反应。稀释剂中使用EDTA对推广猪精子液态保存是很重要的一步。此外，在精液保存过程中，精子呼吸代谢会产生大量的活性氧族(reactive Oxygen Species,ROS)，其中的氧自由基(O2-、H2O2和-OH)能使精子细胞膜中不饱和脂肪酸发生过氧化反应，导致精子质膜损伤。利用抗氧化剂如含有硫氢基团的物质，可能对稳定精子质膜有重要作用，也可抑制获能，从而提高精子液态保存的成活率。基于对上述猪鲜精保存原理的认识，本项项目组在前期猪鲜精保存成果基础上，适当添加了①半胱氨酸，其增强精子在储存过程中的抗氧化损伤能力；②肌醇，其是细胞膜的稳定剂，更好维持精子在储存过程中质膜的稳定性；③果糖，其与葡萄糖相互补充为精子代谢提供能量，而且维持精子较高渗透压，降低精子运动性，延长精子保存时间，④大豆卵磷脂，在4℃保存过程中为精子提供低温保护。在猪场和种公猪站的应用，证明了该猪精液4℃高效保存质量的可靠性，用低温保存11天的精液进行输精发情母猪50头，妊娠率和对照组无差异。对照组为用当天采集的精液进行人工输精，参考头数也为50头。
发明内容
为丰富猪鲜精保存技术手段，延长猪精液体外有效保存时间，扩大猪精子利用率和降低猪场运行成本，研发了猪鲜精4℃保存高效稀释粉，具体配方如下：
一种猪鲜精4℃保存高效稀释粉，其特征在于它是由下述重量份数的原料组成：
葡萄糖 35-40
乙二胺四乙酸钠 1.2-1.4
柠檬酸钠 4-8
碳酸氢钠 1.2-1.4
氯化钾 0.7-0.8
半胱氨酸 0.1-0.2
肌醇 0.4-0.6
青霉素 1.0-1.5
链霉素 1.0-1.5
大豆卵磷脂 0.4-1.0
果糖 0.1-0.4。
本发明进一步公开了猪鲜精4℃保存高效稀释粉的使用方法，其特征在于按如下的步骤进行：
（1）按照上述重量份数准确称量原料；
（2）将上述准确称量的原料放置于1000 mL烧杯中，然后在烧杯中加入1000 mL双蒸水，最后在37 ℃水浴锅中加热溶解和平衡1 h以上待用；
（3）猪精液采集后，在室温下稍作放置，使精液温度降到35-37 ℃，采用步骤（2）的稀释液进行稀释，稀释后将精液分装于集精瓶中，每瓶80 mL，分装后，将集精瓶放在室温下缓慢降温30-60 min，最后放置在4 ℃冰箱中储存，并每隔12 h在冰箱中翻动集精瓶一次，避免精子处于假死状态。
本发明更进一步公开了猪鲜精保存长效稀释粉在提高猪精液抗菌能力、提高猪精子存活率方面的应用。本发明内容是历时2年，经过300多次试验所取得的成果，其特点是，在猪鲜精常规稀释液BTS中（葡萄糖37g，乙二胺四乙酸钠 1.25g，柠檬酸钠6g，碳酸氢钠1.25g，氯化钾0.75g，青霉素1g，链霉素1g），适当的添加了①半胱氨酸，其增强精子在储存过程中的抗氧化损伤能力；②肌醇，其是细胞膜的稳定剂，更好维持精子在储存过程中质膜的稳定性；③果糖，其与葡萄糖相互补充为精子代谢提供能量，而且维持精子较高渗透压，降低精子运动性，延长精子保存时间，④大豆卵磷脂，在4℃保存过程中为精子提供低温保护，⑤提高青霉素含量，其作用是增强精液抗菌能力。在猪场和种公猪站的应用，证明了该猪精液4℃高效保存质量的可靠性，用低温保存11天的精液进行输精发情母猪50头，妊娠率和对照组无差异。
本发明主要解决了猪鲜精体外有效保存时间短、突破了17℃保存条件的限制，重点考察了保存过程中精子活率、活力以及质膜完整性、顶替完整性等质量指标。主要的难点在于低温（4℃）条件下既要确保猪精子免受冷打击，造成精子质量损伤，还要考虑精子在较长保存时间内的能量代谢、氧化应激以及维持精子质膜和顶体稳定性，使精子保持较好的授精能力。为此先后考察了稀释粉中的能量物质如果糖及与葡萄糖的协同作用、抗氧化如半胱氨酸、维持质膜质量的肌醇以及精子低温保护物质如大豆卵磷脂等药品试剂的筛选与最适添加量。
最后确定的方案是：在1000 mL双蒸水中加入，准确称量并加入如下药品：葡萄糖37g，乙二胺四乙酸钠1.25g，柠檬酸钠6g，碳酸氢钠1.25g，氯化钾0.75g，青霉素1.4g，链霉素1.4g，半胱氨酸0.3g，肌醇0.5g，果糖0.3g，大豆卵磷脂0.4g。然后，将配制的稀释液在37℃水浴锅中加热溶解和平衡1.5 h待用。
本发明公开的猪鲜精保存长效稀释粉及使用方法与现有的技术相比所具有的积极效果在于：
（1）丰富了猪鲜精保存技术手段。目前猪鲜精保存均于17℃恒温箱中，本技术将猪鲜精保存于4℃冰箱中，实验条件更容易满足，保存时间更长。
（2）效果稳定。不同品种、不同个体公猪精液本身质量差异较大，且易受到季节变化等环境的影响。市售的猪精液稀释粉效果大都不稳定，保存效果时好时坏。本项目组经过长期试验探索和有效物质的筛选，最终适量应用了抑菌剂、抗氧化剂和质膜稳定剂等药品，经过大量试验表明效果非常稳定，能够很好克服不同品种不同个体公猪精液本身差异，使保存前11-15天甚至保存时间更长，精子活率均在0.6以上。
（3）价格低。市售的长效稀释粉（精子有效保存5-7天）价格大都在15元/袋以上，价格较贵。而本长效稀释粉从研发开始就瞄准低成本、高效果这一目标，从数目众多的低价药品中开展大量筛选试验，预计本长效稀释粉市售价格最多7元/袋。给养猪企业节约成本一倍以上。
（4）使用方便。市售大多长效稀释粉都含有两个小包装，使用前需将两个包装拆开、然后将两个包装的稀释粉混到一块，最后再稀释；而本研发的长效稀释粉只有一个包装，打开后直接稀释，使用起来较为方便。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。本发明的实施例中所述的重量份数原料指的是克，使用前用1000 mL双蒸水进行稀释，即配成稀释液。所用到的葡萄糖、乙二胺四乙酸钠、柠檬酸钠、碳酸氢钠、氯化钾、半胱氨酸、肌醇、青霉素、链霉素、大豆卵磷脂、果糖等均有市售。
实施例1：
稀释液配制：
按照上述重量份数准确称量如下药品：葡萄糖37g，乙二胺四乙酸钠1.25g，柠檬酸钠6g，碳酸氢钠1.25g，氯化钾0.75g，青霉素1.4g，链霉素1.4g，半胱氨酸0.3g，肌醇0.5g，果糖0.3g，大豆卵磷脂0.4g。上述药品准确称量于1000 mL烧杯中，然后在烧杯中加入1000 mL双蒸水，最后在37 ℃水浴锅中加热溶解和平衡1.5 h待用。
实施例2
猪精液稀释，分装和保存：
猪精液采集后，在室温下稍作放置，使精液温度降到37 ℃左右，根据原精密度用本发明的稀释液进行稀释，使稀释后的精液密度在0.5亿/mL左右。稀释后将精液分装于集精瓶中，每瓶80 mL。分装后，将集精瓶放在室温下缓慢降温30-60 min，最后放置在4 ℃冰箱中储存，并每隔12 h翻动集精瓶一次，避免精子处于假死状态。
实施例3
精子保存质量检测：
精子活率、活力等运动状态质量检测，将集精瓶中的精液充分摇动使瓶中的精子分布均匀，取10 uL精液于专用精子计数板中，并盖上盖玻片，置于37℃的检测仪载物台上，保温2分钟后随机取10个视野进行分析。每天检测一次精子质量，当精子活率低于0.6时放弃保存，从而得出精子有效保存天数。
精子质膜完整性检测，采用低渗肿胀原理进行检测。
低渗液配制：准确称量二水柠檬酸钠7.35g，果糖13.51g，完全溶解于1000mL双蒸水中即可。
精子质膜完整性的检测：
取50µL精液放在1mL低渗液（37℃）中混匀。30 min后取出20µL滴在血细胞计数板上，400倍相差显微镜下观察，计算弯尾精子的百分率。因为质膜完整的精子在低渗液进入质膜后，会由于肿胀而导致精子尾部弯曲，而质膜损伤的精子由于膜的通透性增大，精子尾部不会弯曲。基于上述原理可以检测出精子质膜的完整性。
精子顶体损伤检测，采用金霉素（CTC）荧光染色法进行检测。
染色液配制：CTC 缓冲液: Tris 1.21g/500ml; Nacl 3.7986g, 用Hcl溶液调节pH值到7.8。CTC染液：CTC 0.0019g, Cystein 0.0033g, CTC缓冲液 5ml。该液最好现用现配，并避光低温储存。12.5％的多聚甲醛液：Tris6.05g/100ml(用盐酸调节PH=7.4)；多聚甲醛12.5g/100ml，3％的PVP溶液：PVP(40,000)3g；PBS:100ml，增光剂：甘油：PBS(9:1)10ml;1,4-diazabicyclo[2,2,2]octane 0.2468g。
精子顶体完整性检测方法：取出50µL精液用2mL孵育液稀释后，在37℃下孵育20min。在1.5mL离心管中放入1mL3％的PVP溶液，把精液轻轻地铺在PVP溶液上，500×g离心6min，去上清。沉淀精子用50µL mBO液悬浮均匀。再取45µL精子悬液加入45µL的CTC染液，混匀。然后加入8µL12.5%的多聚甲醛溶液，混匀。取10µL精子悬浮液加入等量的增光剂混匀后盖上盖玻片，用无色指甲油封片，避光保存并尽快用荧光显微镜观察。CTC荧光染料能着色精子顶体，在激发波长400－440nm、辐射波长470nm的紫外光照射下精子的顶体发出黄绿色，以此区分顶体的完整性。每次检测，用血细胞计数器计数200个精子，计算顶体完整性。
实施例4
对比试验
（1）试验材料
试验组：选用实施例1所述的稀释液；
对照组：选用常规的BTS稀释液。
（2）试验方法
将采集下来的原精平均分在2个500 mL预热的烧杯中，分别标记为试验组和对照组。然后用相应的稀释液根据原精密度进行等倍稀释，使稀释后的试验组和对照组精子密度相近，大约在0.5 X 108/mL左右。然后集精瓶分装、并室温下放置30-60 min，最后把集精瓶放在4℃冰箱中保存。精液稀释当天为第0天，以后每隔24 h检测精子质量，当精子活率低于0.6时终止保存，计算精子在4 ℃冰箱中有效保存天数。
（3）试验结果
本试验用不同猪场的不同公猪，如大白、长白和杜洛克等公猪精液重复50次。试验结果表明，采用本课题研发的稀释粉配制的稀释液，使来自不同猪场、不同公猪的精液在4℃保存11-15天甚至更长时间，其精子活率均稳定在0.6以上，试验结果稳定、可靠。在精液保存11天以后，由于公猪个体和身体质量差异等原因可造成精子保存质量发生变化。但从实验的总体观察，当精液保存达11天时，仍有70%以上的公猪精子活率维持在0.6以上，仍能满足输精要求。精子质膜完整性和顶体完整性方面，在50次的对比试验中观察到，在有效保存天数内（活率在0.6以上）精子的质膜完整性和顶体完整性都非常高，而本发明研发的鲜精稀释液对精子质膜和顶体的保护性更高。
总之，本发明的猪鲜精长效稀释粉配方能够较长时间（11-15天）使精子处于质量较高状态，仍能满足输精要求。
实施例5
输精对比试验
（1）试验材料
试验组：用4℃保存11天的猪精液进行输精，输精母猪50头；
对照组：用猪场选购的稀释粉，当天稀释的精液进行输精，输精母猪50头。
（2）试验方法
在对母猪进行发情鉴定后，确定适配母猪头数，然后随机分为2组，其中1组为实验组、另1组为对照组。在输精前将精液从4℃冰箱和17℃恒温箱中取出，室温下避光复苏10-15分钟，然后由同一个技术员采用相同方法对实验组和对照组母猪进行输精。统计母猪妊娠率。
（3）实验结果
本次输精实验证明，研发的“猪鲜精4℃保存高效稀释粉及制备方法与应用”技术，在精液保存11天的时间内，猪精子仍具有和当天采精精液相同的授精能力。

Claims (4)

1.一种猪鲜精4℃保存高效稀释粉，其特征在于它是由下述重量份数的原料组成：
葡萄糖 35-40
乙二胺四乙酸钠 1.2-1.4
柠檬酸钠 4-8
碳酸氢钠 1.2-1.4
氯化钾 0.7-0.8
半胱氨酸 0.3-0.5
肌醇 0.4-0.6
青霉素 1.0-1.5
链霉素 1.0-1.5
大豆卵磷脂 0.4-1.0
果糖 0.1-0.4。
2.权利要求1所述猪鲜精4℃保存高效稀释粉的使用方法，其特征在于按如下的步骤进行：
（1）按照上述重量份数准确称量原料；
（2）将上述准确称量的原料放置于1000 mL烧杯中，然后在烧杯中加入1000 mL双蒸水，最后在37 ℃水浴锅中加热溶解和平衡1-3h待用；
（3）猪精液采集后，在室温下稍作放置，使精液温度降到35-37 ℃，采用步骤（2）的稀释液进行稀释，稀释后将精液分装于集精瓶中，每瓶80 mL，分装后，将集精瓶放在室温下缓慢降温30-60 min，最后放置在4 ℃冰箱中储存，并每隔12 h翻动集精瓶一次，避免精子处于假死状态。
3.权利要求1所述猪鲜精保存长效稀释粉在提高猪精液抗菌能力方面的应用。
4.权利要求1所述猪鲜精保存长效稀释粉在提高猪精子存活率方面的应用。
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