CN109142797B - 一种液滴型扫描离子电导显微镜及其探针和扫描方法 - Google Patents
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Abstract
本发明一种液滴型扫描离子电导显微镜及其探针和扫描方法，所述的探针包括双通道微流控芯片和θ型双管玻璃管。所述的显微镜包括PC机、FPGA主控制器、微流量控制器、载物盘控制单元、探针控制单元、以及上述探针。所述的扫描方法包括对每扫描行进行正方向大像素点间距逐点粗扫描；识别该扫描行的感兴趣区域、次感兴趣区域和不感兴趣区域；对该扫描行进行反向变像素点间距扫描；完成所有扫描行的正向和反向扫描；组合每一行正向粗扫描和反向变像素点间距扫描测量点数据，得到整体扫描图像。能够避免由于大量电导介质的使用引起的电化学干扰，提高液滴型扫描离子电导显微镜成像精度和成像速度。
Description
技术领域
本发明涉及扫描离子电导显微镜，具体为一种液滴型扫描离子电导显微镜及其探针和扫描方法。
背景技术
基于扫描隧道显微镜和原子力显微镜，扫描离子电导显微镜(Scanning ionconductance microscopy,SICM)作为扫描探针显微镜家族中的新成员已被广泛应用于纳米级生物细胞、新材料、医学、制药等领域。SICM最大优点就是可在液态生理条件下对样品形貌进行无损害、纳米分辨率成像。且其操作相对简单无需脱水、固化、金属喷涂等复杂的样本预处理，因此，SICM在生命科学、电化学等领域也得到广泛应用。
当前，SICM的各项性能(主要包括稳定性、快速性、测量能力以及应用范围等)得到长足发展。但其各项性能仍有提升空间。从影响扫描离子电导显微镜测量准确性和稳定性为主要因素，主要包括有电化学干扰、系统抵抗噪声的能力以及离子电流漂移等；而影响快速性因素包括探针Z向跳跃幅值和速度；近年来虽然多功能SICM的研究也有研究人员开展，但仍然存在诸如没有考虑大量电导溶液使用存在的电化学干扰问题、被测样本体积大小要求苛刻的问题、传统跳跃模式扫描成像速度慢等问题。所以抑制扫描成像过程中存在的大量电导介质，避免电化学干扰同时加快扫描速度对于提高SICM综合性能具有重要意义。
当前大多SICM采用的都是被测样本需浸泡在电导介质溶液中完成测量，随着被测样品体积的增加，电导介质需要同步增加。这样一来无可避免地加大了各种电化学干扰的可能，对被测样品的精确测量产生负面影响。此外，扫描速度在液滴型SICM综合性能上也是一个不可忽视的因素，一个高速的SICM成像系统不仅可以提高研究效率而且可以实现各种复杂生物实时动态观察，研究实时激励以及动态响应对生命科学领域具有重要意义。
当前大多SICM系统均采用跳跃扫描模式，由于跳跃模式先天存在反复接近和撤离样本测量点的弊端，导致跳跃模式远不能满足当前对生物样本动态测量要求。虽然研究人员相继提出各种方法来解决这一发展瓶颈问题，诸如改进探针Z向压电驱动结构的【PAVELNOVAK,ANDREW SHEVCHUK,et al.Imaging Single Nanoparticle Interactions withHuman Lung Cells Using Fast Ion Conductance Microscopy[J].Nano Lett.2014,14(3):1202-1207.】、【ASTRID GESPER,A PHILIPP HAGEMANNA,et al.A Low-cost,LargeField-of-view Scanning Ion Conductance Microscope for Studying Nanoparticle–cell Membrane Interactions[J].Nanoscale.2017,37(9):14172】和【SHINJI WATANABEL,TOSHIO ANDOB.High-speed XYZ-Nanopositioner for Scanning Ion ConductanceMicroscopy[J].Applied Physics Letters.2017,111(9):113106】方法，采用闭环运动控制算法的【JUNG G.,NOH H.,et al.Closed-loop ARS Mode for Scanning IonConductance Microscopy With Improved Speed and Stability for Live CellImaging Applications.[J].Nanoscale.2015,7(25):10989-10997】，横向形貌预测模型的方法【ZHUANG JIAN，JIAO YANGBOHAN，MUGABO VINCENT.A New Scanning Mode To ImproveScanning Ion Conductance Microscopy Imaging Rate With Pipette PredictedMovement[J].Micron.2017,101(10)：177-185.】，混合扫描的方法【Zhukov,A.,Richards,O.,Ostanin,V.,Korchev,Y.,&Klenerman,D.(2012).A hybrid scanning mode for fastscanning ion conductance microscopy(SICM)imaging.Ultramicroscopy,121,1-7.】和standing approach mode(STA mode)的方法【Takahashi,Y.,Murakami,Y.,Nagamine,K.,Shiku,H.,Aoyagi,S.,Yasukawa,T.,...&Matsue,T.(2010).Topographic imaging ofconvoluted surface of live cells by scanning ion conductance microscopy in astanding approach mode.Physical Chemistry Chemical Physics,12(34),10012-10017.】，以及基于STA的改进方法【HIROKI IDA,YASUFUMI TAKAHASHI.High SpeedScanning Ion Conductance Microscopy for Quantitative Analysis of NanoscaleDynamics of Microvilli[J].Analytical Chemistry.2017,89:6015-6020.】等，上述方法分别从硬件机械结构角度、软件控制算法以及两者结合方式来克服传统SICM扫描成像速度慢的问题。在压电驱动机械结构方面，由于共振频率与行程这对天生矛盾关系的存在，很难使两者同时达到最优。虽然文献【PAVEL NOVAK,ANDREW SHEVCHUK,et al.Imaging SingleNanoparticle Interactions with Human Lung Cells Using Fast Ion ConductanceMicroscopy[J].Nano Lett.2014,14(3):1202-1207.】采用双压电驱动结构可使SICM的探针Z向接近速度高达500nm/ms，但是其硬件机械结构从发难免增加了系统的成本。相比于机械硬件结构，从软件控制扫描算法方面解决扫描速度慢的问题有诸多优点，比如易于实现、成本相对低廉等，但仍不同程度地存在考虑因素不全、难以适应复杂形貌样本测量等问题。如文献【PAVEL NOVAK,ANDREW SHEVCHUK,et al.Imaging Single NanoparticleInteractions with Human Lung Cells Using Fast Ion Conductance Microscopy[J].Nano Lett.2014,14(3):1202-1207.】没有考虑压电驱动器非线性、迟滞等因素引起过冲问题。文献【HIROKI IDA,YASUFUMI TAKAHASHI.High Speed Scanning Ion ConductanceMicroscopy for Quantitative Analysis of Nanoscale Dynamics of Microvilli[J].Analytical Chemistry.2017,89:6015-6020.】存在探针与被测样本碰撞断裂最终导致扫描失败的风险。可见，现有文献大多采用的是恒定像素点间距逐点测量策略，而该种测量方式并没有考虑到被测样本、尤其是生物样本存在大量非特征区域，该区域是我们不感兴趣区域，对该区域一并进行高分辨率扫描成像将消耗大量时间，最后难免降低总的扫描成像时间。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种液滴型扫描离子电导显微镜及其探针和扫描方法，能够避免由于大量电导介质的使用引起的电化学干扰，提高液滴型扫描离子电导显微镜成像精度和成像速度。
本发明是通过以下技术方案来实现：
一种液滴型扫描离子电导显微镜的探针，包括双通道微流控芯片和θ型双管玻璃管；
所述的双通道微流控芯片上对称开设有呈夹角设置的吸收微流道和注射微流道；
所述的θ型双管玻璃管内部由中间隔离墙形成相对独立的两个通道，两个通道内分别插入对应的电极形成离子电流回路；
θ型双管玻璃管固定在双通道微流控芯片上，沿两个微流道夹角的对称线设置，θ型双管玻璃管尖端超出同侧的双通道微流控芯片端面设置。
优选的，双通道微流控芯片由聚二甲基硅氧烷制成。
优选的，两个微流道夹角为5～10度，微流道的宽度为10～20μm。
一种液滴型扫描离子电导显微镜，包括PC机、FPGA主控制器、微流量控制器、载物盘控制单元、探针控制单元、以及如上述任意一项所述的探针；
PC机与FPGA主控制器连接，用于发送压电陶瓷控制信号以及接受FPGA主控制器采集到的离子电流信号和扫描图像信息；
FPGA主控制器用于通过AD模块连接离子电流放大器采集电极上的离子电流，并通过DA模块分别连接载物盘控制单元和探针控制单元；
微流量泵控制器用于接收PC机发送的控制信号，通过分别控制与吸收微流道和注射微流道连接的微流量泵，控制θ型玻璃管尖端的微液滴大小；
载物盘控制单元用于控制载物盘的水平运动；
探针控制单元用于控制探针的垂直运动。
进一步，载物盘控制单元包括第一Z向短行程压电陶瓷定位器、XY向压电陶瓷定位器和XY向微电机；
探针控制单元包括第二Z向长行程压电陶瓷定位器和Z向微电机；
第一Z向短行程压电陶瓷定位器用于控制载物盘在Z向的运动；XY向微电机用于控制载物盘对探针进行单向重复性精度至少为0.1μm的粗略定位；XY向压电陶瓷定位器用于探针的精确定位，精确定位的精度为0.4nm，线性度为0.02％，重复性定位精度为±2nm；
第二Z向长行程压电陶瓷定位器和Z向微电机用于协同控制探针进入工作区，进入工作区后的扫描过程则由第二Z向长行程压电陶瓷单独控制完成；
PC机用于通过微电机控制器分别控制XY向微电机和Z向微电机；
FPGA主控制器通过DA模块连接压电陶瓷控制器分别控制XY向压电陶瓷定位器和第二Z向长行程压电陶瓷定位器。
进一步，FPGA主控制器通过DA模块连接线性电压放大电路与第一Z向短行程压电陶瓷定位器连接，对载物盘的Z向运动进行控制。
一种液滴型扫描离子电导显微镜的扫描方法，包括如下步骤，
步骤1，对每扫描行进行正方向大像素点间距逐点粗扫描，获得该扫描行的行形貌轮廓曲线；
步骤2，根据行形貌轮廓曲线识别该扫描行的感兴趣区域、次感兴趣区域和不感兴趣区域；
步骤3，对该扫描行进行反向变像素点间距扫描，对感兴趣区域和次感兴趣区域进行小像素点间距的精扫描，对不感兴趣区域进行大像素点间距的粗扫描或不扫描；精扫描的分辨率大于粗扫描的分辨率；
步骤4，重复步骤1-3完成所有扫描行的正向和反向扫描；
步骤5，组合每一行正向粗扫描和反向变像素点间距扫描测量点数据，得到整体扫描图像。
进一步，步骤2，根据行形貌轮廓曲线识别该扫描行的感兴趣区域、次感兴趣区域和不感兴趣区域；具体步骤如下，
步骤2.1，计算行形貌轮廓线曲线中相邻像素点的数据的高度差Δh得到该行粗扫描的形貌变化剧烈程度；行形貌轮廓线曲线中变化剧烈的位置为感兴趣区域；所述的感兴趣区域内的形貌轮廓曲线的斜率大于0，即形貌突起区域；形貌突起区域之间的为形貌平缓区域；
步骤2.2，计算该扫描行形貌轮廓线曲线中所有像素点的数据的平均值为形貌轮廓平均值；
步骤2.3，将形貌轮廓平均值与整个扫描行的形貌高度值做大小对比，不小于形貌轮廓平均值的平缓区域为次感兴趣区域；小于形貌轮廓平均值的平缓区域为不感兴趣区域。
再进一步，还包括如下初始化的步骤，
步骤一，对θ型双通道玻璃管进行电导介质溶液灌注并分别在两个通道内插入Ag/AgCl电极，连接好系统回路，通过控制注射和吸收微流量泵的流量大小使离子电流回路导通；
步骤二，通过计算机人机交互界面使扫描探针进入扫描起始位置，扫描起始位置与待测样本的距离等于扫描探针尖端开口的半径，设定扫描参数，对θ型双管探针的垂直接近曲线进行测试，得到θ型双管探针的垂直接近曲线距离与离子电流变化关系，以离子电流最大值的3％～10％为离子电流反馈阈值，通过控制第二Z向长行程压电陶瓷驱动器使得θ型双管探针以设定跳跃幅值进行跳跃扫描；所述的扫描参数包括像素点N的大小，以及像素点间距的设定。
进一步，在探针逐渐接近待测样本时，对夹持探针的长行程的Z向压电定位器施加电压控制信号，控制扫描探针的Z向接近速度为50～200nm/ms；通过FPGA主控制器的AD模块记录待测样本所在溶液中的离子电流变化，当离子电流减小到设定阈值时，对Z向压电定位器施加复位电压，使探针撤离待测样本，离子电流恢复到稳定值。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
本发明所述的探针以θ型双通道玻璃管为基础，并安装一块加工有两个成一定角度微流道的双通道微流控芯片作为液滴型扫描离子电导显微镜的扫描探针，从而利用在探针尖端产生的电导溶液介质微液滴来导通系统回路，可使扫描离子电导显微镜具有测量大体积样本的能力，减少了外部电化学对测量系统的干扰。双通道微流控芯片通过与双通道对应的两个微流量泵来实现扫描探针尖端微液滴的精确控制，其中一个通道用来注射电导溶液，另外一个用来抽取电导溶液，保证了探针尖端电导溶液液滴大小的恒定以及对陡峭样本的适应能力。
本发明一种液滴型扫描离子电导显微镜，在微流控芯片技术、微液滴形成理论以及精确控制等相关理论基础上，结合扫描离子电导显微镜现有扫描跳跃模式，通过FPGA和PC机的上层控制，通过各个控制单元的协调，使得扫描离子电导显微镜在探针尖端的电导溶液形成微液滴条件下实现被测样本感兴趣区域的局部成像；进一步扩大扫描离子电导显微镜的应用范围以及减小了由于大量电导溶液的使用而引入的电化学干扰。
进一步的，通过FPGA主控制器对载物盘的Z向运动进行控制，使载物台可实现高频振荡并具有交流扫描模式的功能，从而增强离子电流抗干扰能力。
本发明所述的方法采用同一扫描行正反两个方向扫描，其中正方向采用小像素点间距粗扫描，依据每一行形貌轮廓识别被测样本的感兴趣区域和不感兴趣区域，依此在反向扫描时对感兴趣区域进行高分辨率扫描、对不感兴趣区域进行低分辨率扫描，形成一种正向恒像素点间距、反向变像素点间距的扫描模式，扫描速度快；而且不受样本邻近感兴趣区域的不感兴趣区域表面电化学活性影响，极大地提升了扫描离子电导显微镜的应用范围、抗电化学干扰能力以及快速成像能力，进一步提升了SICM系统的测量稳定性和精度。
附图说明
图1是本发明实例中所述的液滴型SICM的扫描探针结构示意图。
图2是本发明实例中所述液滴型SICM的系统结构框图。
图3是本发明实例中所述的扫描方法流程图。
图中：θ型双管玻璃管尖端1，双通道微流控芯片2，吸收微通道3，中间隔离墙4，注射微通道5，θ型双管玻璃管6。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
本发明一种液滴型扫描离子电导显微镜以其扫描方法，是建立在微流控芯片技术、微液滴控制、机械结构设计和扫描离子电导显微镜高速成像算法基础上的。
针对扫描离子电导显微镜扫描过程中需要使被测样品放入电导溶液介质中，该条件限制了被测样本的体积，大量电导溶液介质的使用会引入系统内部更多的电化学干扰的问题；本发明提出了液滴型扫描离子电导显微镜及其扫描方法，液滴型扫描离子电导显微镜仅关心被测样品感兴趣区域的扫描成像，其他不感兴趣区域或者外部环境的电化学干扰不会通过电导介质传递到感兴趣区域。通过使得液滴型SICM探针尖端形成一个微小液滴来充当传统SICM电导溶液的功能。可大幅度降低SICM系统抵抗噪声干扰能力。
而在液滴型SICM中，探针尖端的微液滴是实现该功能的关键所在，本发明通过利用双微流量泵和双通道微流控芯片技术实现这一功能，实现了一个探针尖端微液滴的精确控制。
本发明一种液滴型扫描离子电导显微镜的探针，如图1所示，包括双通道微流控芯片2和θ型双管玻璃管6；双通道微流控芯片2上对称开设有呈夹角设置的吸收微流道3和注射微流道5；θ型双管玻璃管6内部由中间隔离墙4形成相对独立的两个通道，两个通道内分别插入对应的电极形成离子电流回路；θ型双管玻璃管6固定在双通道微流控芯片2上，沿两个微流道夹角的对称线设置，θ型双管玻璃管尖端1超出同侧的双通道微流控芯片2端面设置。本优选实例中，双通道微流控芯片2由聚二甲基硅氧烷制成。两个微流道夹角为5～10度，微流道的宽度为10～20μm。
针对传统扫描离子电导显微镜所用跳跃模式存在平等看待感兴趣区域和不感兴趣区域，采用了恒定像素点间距的扫描模式，该扫描模式大量时间消耗在不感兴趣区域的扫描上，导致整体扫描速度的降低；现有SICM包括液滴型SICM均存在扫描成像速度慢这一通病。
本发明从被测样本感兴趣区域和不感兴趣区域角度出发，提出采用正反双向变像素点间距逐点扫描测量算法，具体需要先对每扫描行进行正方向大像素点间距逐点扫描测量，以该正方向测量数据为先验知识，采用形貌单行轮廓线感兴趣和不感兴趣区域识别算法对该行数据识别，依据识别结果再进行反向逐点扫描成像，其中不感兴趣区域采用大像素点间距扫描、感兴趣区域采用小像素点间距扫描，最终达到一种自适应变像素点间距逐点扫描算法，而且正反向粗精扫描测量可互相补充，避免单方向做无用的扫描测量，最终达到像素点间距有大有小，大小得当的一种自适应像素点间距扫描模式，从而加快SICM成像速度。本优选实例中，对该扫描行进行反向变像素点间距扫描，对感兴趣区域和次感兴趣区域进行小像素点间距的精扫描，例如取0.1μm，具体依据探针开口尺寸综合考虑确定；对不感兴趣区域进行大像素点间距的粗扫描或不扫描，例如取0.2μm，具体依据探针开口尺寸综合考虑确定；精扫描的分辨率大于粗扫描的分辨率；精扫描的像素点间距小于粗扫描的像素点间距。
具体的，如图2所示，本发明所述的液滴型SICM包括，包括PC机、FPGA主控制器、微流量控制器、载物盘控制单元、探针控制单元、以及上述的探针；其中，
PC机与FPGA主控制器连接，用于发送压电陶瓷控制信号以及接受FPGA主控制器采集到的离子电流信号和扫描图像信息；
FPGA主控制器用于通过AD模块连接离子电流放大器采集电极上的离子电流，并通过DA模块分别连接载物盘控制单元和探针控制单元；
PC机通过RS232串口向微流量泵控制器发送控制信号，微流量泵控制器用于接收PC机发送的控制信号，通过分别控制与吸收微流道3和注射微流道5连接的微流量泵，控制θ型玻璃管尖端1的微液滴大小；
载物盘控制单元用于控制载物盘的水平运动；
探针控制单元用于控制探针的垂直运动。
载物盘控制单元包括第一Z向短行程压电陶瓷定位器、XY向压电陶瓷定位器和XY向微电机；
探针控制单元包括第二Z向长行程压电陶瓷定位器和Z向微电机；
第一Z向短行程压电陶瓷定位器用于控制载物盘在Z向的运动；XY向微电机用于控制载物盘对探针进行单向重复性精度至少为0.1μm的粗略定位；XY向压电陶瓷定位器用于探针的精确定位，精确定位的精度为0.4nm，线性度为0.02％，重复性定位精度为±2nm；
第二Z向长行程压电陶瓷定位器和Z向微电机用于协同控制探针进入工作区，进入工作区后的扫描过程则由第二Z向长行程压电陶瓷单独控制完成。
本优选实例中，XYZ向微电机用于粗定位，由控制载物台水平方向运动的XY向微电机和垂直夹持探针的Z向微电机组成，XYZ向微电机分别与微电机控制器相连，用于控制微电机运动，所述微电机控制器与PC机相连。所述PC机与FPGA主控制器相连，用于控制压电陶瓷定位器和采集系统产生的离子电流；FPGA主控制器通过DA模块连接压电陶瓷控制器，压电陶瓷控制器分别控制XY向压电陶瓷定位器和第一Z向短行程压电陶瓷定位器PZT1，使其输入的控制信号和压电陶瓷的形变量满足要求的线性关系。
XY向压电陶瓷定位器用于水平驱动载物台，第一Z向短行程压电陶瓷定位器PZT1用于垂直驱动载物台，使载物台可实现高频振荡并具有交流扫描模式的功能，从而增强离子电流抗干扰能力。第二Z向长行程压电陶瓷定位器PZT2用于垂直方向驱动扫描探针。其中，第一Z向短行程压电陶瓷驱动器PZT1为短行程压电陶瓷定位器，第二Z向长行程压电陶瓷定位器PZT2为长行程压电陶瓷驱动器。
XYZ向压电陶瓷定位器分别对应安装在XYZ向微电机上，XYZ向微电机分别带动XYZ向压电陶瓷整体运动，微电机行程相对大，精度低，用于粗略控制探针和载物台运动，压电陶瓷定位器行程短，但精度高，用于精确控制探针和载物台运动；所述FPGA主控制器通过AD模块与离子电流放大器相连，所述离子电流放大器用于放大系统中产生的纳安级离子电流，所述离子电流放大器与θ型双通道玻璃管中两根Ag/AgCl电极相连。
如图1所示，所述两根Ag/AgCl分别插入θ型玻璃管的两个通道内，所述θ型双通道玻璃管6和双通道微流控芯片2固定在一起，所述双通道微流控芯片6加工有5-10度夹角的两个微流道，用于保持所述θ型玻璃管尖端1的微液滴大小，其中一个为注射微流道5用来注射电导溶液，而另一个吸收微流道3用来吸取电导溶液，如图2所示，所述两个微流道分别经电导溶液毛细管与两个微流量泵相连，所述微流量泵与微流量泵控制器相连，用于精确控制液滴型扫描离子电导显微镜探针尖端微液滴的大小，以便于保证扫描过程中微液滴大小保持，避免外界环境温度变化引起的蒸发问题以及适应陡峭样本的测量时探针运动引起的液滴不连续。
本发明一种液滴型扫描离子电导显微镜的扫描方法，如图3所示，其包括以下步骤：
步骤一：对θ型双通道玻璃管6进行电导介质溶液灌注并分别在两个通道内插入Ag/AgCl电极。连接好系统回路，安装好Z向压电陶瓷驱动器并观察系统是否产生离子电流；
步骤二：在连接好系统回路后，先对θ型双通道玻璃管6内灌注电导溶液并观察离子电流的变化情况，如果双通道已导通，则先观察液滴型扫描离子电导显微镜中θ型探针的垂直接近曲线，即探针尖端-样本距离与系统离子电流变化关系，然后依据该曲线，以离子电流最大值的3％～10％为离子电流反馈阈值并控制第二Z向长行程压电陶瓷定位器PZT2使扫描探针以设定跳跃幅值开始跳跃扫描。
所述θ型双通道玻璃管6在安装到Z向压电陶瓷定位器上进行扫描之前需要进行垂直接近曲线测试，以便于依靠垂直接近曲线趋势(探针尖端-样本距离与系统离子电流变化关系)合理确定离子电流反馈阈值；
在上述步骤中需对双通道微流控芯片2中入口微通道电导介质溶液进行定量控制，也就是对注射用微流量泵施加控制信号，使得注射流量达到所需值；通过离子电流的大小变化情况来实时调节注射泵和吸取泵流量值，对吸收用微流量泵施加控制信号，使得注射电导溶液和吸收电导溶液能够保持稳定，依次适应陡峭样本的逐点测量；
步骤三：通过计算机人机交互界面初始化系统，并实现扫描探针进入扫描起始位置，扫描起始位置与待测样本的距离等于扫描探针尖端开口的半径，设定扫描参数并开始扫描；所述的扫描参数包括像素点N的大小，以及像素点间距的设定(N×N Pixels,L×Lμm)；逐点扫描时，在扫描探针逐渐接近待测样本时，对夹持探针的长行程的Z向压电驱动器施加电压控制信号，通过FPGA主控制器的AD模块记录待测样本所在溶液中的离子电流变化，当离子电流减小到设定阈值时，立即对Z向压电定位器施加复位电压，以便于使扫描探针迅速撤离待测样本，此时离子电流恢复到稳定值；
当离子电流趋于稳定后，利用XY向压电定位器驱动载物台移动到下一个像素测量点，重复上述逐点扫描步骤进行正向或反向的单行逐点扫描，完成循环测量。
另外，逐点扫描中，对Z向压电陶瓷定位器施加控制电压信号时，控制扫描探针的Z向接近速度设在50～200nm/ms。
步骤三：先对样本第一扫描行进行正方向大像素点间距扫描，本优选实例中为32×32pixels，间距2μm(仅是举例说明而已)，使得SICM探针能够测量到样本首行轮廓，采用的是Standing Approach Mode(STA模式)扫描模式，此时获得了首行的正方向扫描轮廓线。
步骤四：对首行的正方向扫描轮廓线进行分析，通过计算相邻像素点的数据的高度差可以获得该行粗扫描的形貌变化剧烈程度，即Δhi＝hi+1-hi，式中hi(i＝1,2,……N)为第i个测量点的形貌高度值Δh为相邻测量点间形貌高度的差值。并记录下该行形貌变化剧烈的位置，为下文感兴趣区域和不感兴趣区域识别做铺垫。行形貌轮廓线曲线中形貌突起区域，即变化剧烈的位置为感兴趣区域，也就是说Δh值大，即行形貌轮廓线曲线中斜率大于0的区域为样本扫描行轮廓线变化剧烈的区域；
另外，在形貌变化剧烈的位置处当采用反向扫描时采用合理的探针Z向撤离幅值，依次可减少探针在样本平缓区域不必要的撤离幅值。
步骤五：计算该扫描行数据的平均值，并定义为形貌轮廓平均值，即
为次感兴趣区域识别做准备，对于某扫描行轮廓线而言，不仅要获得形貌突起的位置，还要识别到位于突起形貌中间的形貌部分，虽然该部分形貌可能变化也较为平缓，但是这部分形貌被认为是感兴趣的区域，其他一些变化同样较平缓的区域(例如承载样本的基底等)为不感兴趣区域，因此问题的关键变为如何把位于两侧凸起形貌中间的可能的感兴趣区域与其他平缓区域(如基底)识别开来，我们得到轮廓线后，计算轮廓线的平均值并与上述两类平缓区域做大小对比，不小于形貌轮廓平均值的区域被认为是感兴趣的平缓区域，即次感兴趣区域；而小于形貌轮廓平均值的区域被认为是不感兴趣区域。即将形貌轮廓平均值
与整个扫描行的形貌高度值hi(i＝1,2,……N)做大小对比，若
则区域p≤i≤q被确定为不感兴趣区域；若
则区域p≤i≤q被确定为次感兴趣区域。
步骤六：最终联合步骤四中识别出来的形貌突起区域的位置和步骤五中变化平缓的次感兴趣区域位置，我们获得了整个样本的感兴趣区域，该区域的成功识别有助于探针反方向二次变像素点间距扫描时有选择地进行变像素点间距扫描，例如在基底(或样本平缓位置，被视为不感兴趣区域)所在位置采用二次低分辨率(大像素点间距)扫描测量，或者跳过不再扫描测量，而在步骤四和五识别出来的感兴趣区域和次感兴趣区域进行高分辨率的精扫描测量。另外，依据步骤一，步骤六中所采用的STA扫描模式的撤离幅值同样得到最大程度的优化。也就是说在平缓区域撤离幅值小，在陡峭区域撤离幅值大。
步骤七：当以正方向低分辨率扫描数据为先验知识，依靠感兴趣区域和不感兴趣区域识别结果选取了合理的扫描分辨率和探针撤离幅值后；相比于现有SICM采用的恒定撤离幅值的跳跃模式，本文扫描模式在成像速度上大幅提升，结合正向粗扫描数据和反向自适应分辨率和撤离幅值扫描数据，我们得到了一幅变像素点间距SICM扫描图像，采用图像修补技术可以得到较好的图像结果。
步骤八：对其他扫描行进行上述步骤三到步骤七的重复过程，直到所有扫描行都扫描完成。
Claims (10)
1.一种液滴型扫描离子电导显微镜的探针，其特征在于，包括双通道微流控芯片(2)和θ型双管玻璃管(6)；
所述的双通道微流控芯片(2)上对称开设有呈夹角设置的吸收微流道(3)和注射微流道(5)；
所述的θ型双管玻璃管(6)内部由中间隔离墙(4)形成相对独立的两个通道，两个通道内分别插入对应的电极形成离子电流回路；
θ型双管玻璃管(6)固定在双通道微流控芯片(2)上，沿两个微流道夹角的对称线设置，θ型双管玻璃管尖端(1)超出同侧的双通道微流控芯片(2)端面设置。
2.根据权利要求1所述的一种液滴型扫描离子电导显微镜的探针，其特征在于，双通道微流控芯片(2)由聚二甲基硅氧烷制成。
3.根据权利要求1所述的一种液滴型扫描离子电导显微镜的探针，其特征在于，两个微流道夹角为5～10度，微流道的宽度为10～20μm。
4.一种液滴型扫描离子电导显微镜，其特征在于，包括PC机、FPGA主控制器、微流量控制器、载物盘控制单元、探针控制单元、以及如权利要求1-3任意一项所述的探针；
PC机与FPGA主控制器连接，用于发送压电陶瓷控制信号以及接受FPGA主控制器采集到的离子电流信号和扫描图像信息；
FPGA主控制器用于通过AD模块连接离子电流放大器采集电极上的离子电流，并通过DA模块分别连接载物盘控制单元和探针控制单元；
微流量泵控制器用于接收PC机发送的控制信号，通过分别控制吸收微流道(3)和注射微流道(5)连接的微流量泵，控制θ型玻璃管尖端(1)的微液滴大小；
载物盘控制单元用于控制载物盘的水平运动；
探针控制单元用于控制探针的垂直运动。
5.根据权利要求4所述的一种液滴型扫描离子电导显微镜，其特征在于，载物盘控制单元包括第一Z向短行程压电陶瓷定位器、XY向压电陶瓷定位器和XY向微电机；
探针控制单元包括第二Z向长行程压电陶瓷定位器和Z向微电机；
第一Z向短行程压电陶瓷定位器用于控制载物盘在Z向的运动；XY向微电机用于控制载物盘对探针进行单向重复性精度至少为0.1μm的粗略定位；XY向压电陶瓷定位器用于探针的精确定位，精确定位的精度为0.4nm，线性度为0.02％，重复性定位精度为±2nm；
第二Z向长行程压电陶瓷定位器和Z向微电机用于协同控制探针进入工作区，进入工作区后的扫描过程则由第二Z向长行程压电陶瓷单独控制完成；
PC机用于通过微电机控制器分别控制XY向微电机和Z向微电机；
FPGA主控制器通过DA模块连接压电陶瓷控制器分别控制XY向压电陶瓷定位器和第二Z向长行程压电陶瓷定位器。
6.根据权利要求5所述的一种液滴型扫描离子电导显微镜，其特征在于，FPGA主控制器通过DA模块连接线性电压放大电路与第一Z向短行程压电陶瓷定位器连接，对载物盘的Z向运动进行控制。
7.一种液滴型扫描离子电导显微镜的扫描方法，其特征在于，基于权利要求4-6任意一项所述的液滴型扫描离子电导显微镜，包括如下步骤，
步骤1，对每扫描行进行正方向大像素点间距逐点粗扫描，获得该扫描行的行形貌轮廓曲线；
步骤2，根据行形貌轮廓曲线识别该扫描行的感兴趣区域、次感兴趣区域和不感兴趣区域；
步骤3，对该扫描行进行反向变像素点间距扫描，对感兴趣区域和次感兴趣区域进行小像素点间距的精扫描，对不感兴趣区域进行大像素点间距的粗扫描或不扫描；精扫描的分辨率大于粗扫描的分辨率；
步骤4，重复步骤1-3完成所有扫描行的正向和反向扫描；
步骤5，组合每一行正向粗扫描和反向变像素点间距扫描测量点数据，得到整体扫描图像。
8.根据权利要求7所述的一种液滴型扫描离子电导显微镜的扫描方法，其特征在于，步骤2，根据行形貌轮廓曲线识别该扫描行的感兴趣区域、次感兴趣区域和不感兴趣区域；具体步骤如下，
步骤2.1，计算行形貌轮廓线曲线中相邻像素点的数据的高度差Δh得到该行粗扫描的形貌变化剧烈程度；行形貌轮廓线曲线中变化剧烈的位置为感兴趣区域；所述的感兴趣区域内的形貌轮廓曲线的斜率大于0，即形貌突起区域；形貌突起区域之间的为形貌平缓区域；
步骤2.2，计算该扫描行形貌轮廓线曲线中所有像素点的数据的平均值为形貌轮廓平均值；
步骤2.3，将形貌轮廓平均值与整个扫描行的形貌高度值做大小对比，不小于形貌轮廓平均值的平缓区域为次感兴趣区域；小于形貌轮廓平均值的平缓区域为不感兴趣区域。
9.根据权利要求7所述的一种液滴型扫描离子电导显微镜的扫描方法，其特征在于，还包括如下初始化的步骤，
步骤一，对θ型双通道玻璃管(6)进行电导介质溶液灌注并分别在两个通道内插入Ag/AgCl电极，连接好系统回路，通过控制注射和吸收微流量泵的流量大小使离子电流回路导通；
步骤二，通过计算机人机交互界面使扫描探针进入扫描起始位置，扫描起始位置与待测样本的距离等于扫描探针尖端开口的半径，设定扫描参数，对θ型双管探针的垂直接近曲线进行测试，得到θ型双管探针的垂直接近曲线距离与离子电流变化关系，以离子电流最大值的3％～10％为离子电流反馈阈值，通过控制第二Z向长行程压电陶瓷驱动器使得θ型双管探针以设定跳跃幅值进行跳跃扫描；所述的扫描参数包括像素点N的大小，以及像素点间距的设定。
10.根据权利要求9所述的一种液滴型扫描离子电导显微镜的扫描方法，其特征在于，在探针逐渐接近待测样本时，对夹持探针的长行程的Z向压电定位器施加电压控制信号，控制扫描探针的Z向接近速度为50～200nm/ms；通过FPGA主控制器的AD模块记录待测样本所在溶液中的离子电流变化，当离子电流减小到设定阈值时，对Z向压电定位器施加复位电压，使探针撤离待测样本，离子电流恢复到稳定值。
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