CN109142700A - 一种对小鼠不同器官氧化应激作用的检测方法 - Google Patents

一种对小鼠不同器官氧化应激作用的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于脊椎动物的新品种技术领域，公开了一种对小鼠不同器官氧化应激作用的检测方法，选用清洁级、体重20g的雄性ICR小鼠，小鼠随机分组，CdSe/ZnS QDs通过尾静脉注射建立染毒小鼠模型；量子点QD605的低剂量组、中剂量组、高剂量组，量子点QD525的对照组、低剂量组，中剂量组，高剂量组；对照组均用生理盐水处理；每个剂量组的暴露时间分别为11天、22天、33天。本发明的观察量子点对小鼠的DNA损伤、肝脏和肾脏抗氧化酶相关基因和蛋白质组的影响，进一步揭示CdSe/ZnS量子点对动物体的分子毒性效应，为量子点的毒理学发明和生物安全评估提供基础材料。

Description

一种对小鼠不同器官氧化应激作用的检测方法
技术领域
本发明属于脊椎动物的新品种技术领域，尤其涉及一种对小鼠不同器官氧化应激作用的检测方法。
背景技术
目前，业内常用的现有技术是这样的：量子点在医学及生命科学等发明领域具有极大的应用前景。然而，随着量子点应用范围的不断扩大，其生物安全性逐渐引起人们的广泛关注。量子点结构的多样性及其毒理学数据的匮乏使得量子点的毒性作用机制目前尚不完全清楚。研究表明，量子点能够在生物体内各系统分布，并聚集在某些组织和器官中，对生物体具有潜在毒性。量子点对细胞和生物体的毒性作用与粒子的种类、尺寸大小、表面修饰(包括壳，配体和表面改性)以及量子点的使用剂量、暴露时间等密切相关。目前，对于QD在生命科学领域的研究仍局限于实验室，临床及实际生活中的应用尚未推广。究其原因，主要是因为QD是由重金属物质构成，其是否会对机体产生副作用，是否会对环境产生破坏作用，这一系列疑问至今未有定论。由于量子点结构的多样性及其毒理学数据的匮乏使得量子点对生物体毒性作用机制目前尚不完全清楚。因此，这就需要研究者们从生物材料安全性出发对其毒性作用与机制进行研究，而对毒理学机制的研究，目前量子点在体外的细胞毒性作用科学工作者已做了大量的工作，但对于量子点在生物体内的毒性研究任重而道远。
综上所述，现有技术存在的问题是：
(1)量子点使动物体内的过氧化氢酶、超氧化物歧化酶活性均有改变。这种改变的原因是什么？作为一种纳米材料，量子点本身是不是影响酶活的主要原因？
(2)CdSe/ZnS QDs对抗氧化酶基因cat、Cu/ZnSOD、MT表达产生怎样的影响(通过RT-PCR分析)
(3)CdSe/ZnS QDs对染毒小鼠脏器组织蛋白质组的影响(双向电泳技术分析)
解决上述技术问题的难度和意义：研究CdSe/ZnS QDs在动物体内的毒性效应，不同粒径、不同浓度、不同暴露时间的CdSe/ZnS QDs对小鼠抗氧化酶基因cat、Cu/Zn SOD、MT的表达和蛋白组的影响进行分析，证实CdSe/ZnS QDs对机体的分子水平的毒性作用；分析CdSe/ZnS QDs在生物体内对抗氧化酶基因及蛋白组的影响，初步探讨CdSe/ZnS QDs在生物体内的毒性作用机理，进一步揭示CdSe/ZnS QDs对机体的毒性效应。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种对小鼠不同器官氧化应激作用的检测方法。
本发明是这样实现的，一种对小鼠不同器官氧化应激作用的检测方法，所述对小鼠不同器官氧化应激作用的检测方法通过不同粒径、不同浓度的CdSe/ZnS量子点暴露的不同时间发明CdSe/ZnS对小鼠不同器官氧化应激作用的影响；观察量子点对小鼠的DNA损伤、肝脏和肾脏抗氧化酶相关基因和蛋白质组的影响，揭示CdSe/ZnS量子点对动物体的分子毒性效应。
进一步，所述对小鼠不同器官氧化应激作用的检测方法量子点对小鼠脏器氧化应激作用的测定，取相应暴露时间的各组小白鼠肝脏和肾脏组织，在冰冷的生理盐水中漂洗，去掉表面血迹，滤纸拭干，称重，加入一定量冰的生理盐水，用匀浆器在0～4℃制成10％的组织匀浆，将匀浆液以4℃，3000rpm/min的转速离心10min，取上清液，进行肝脏、肾脏SOD、CAT活性测定和MDA、GSH含量测定，评估量子点CdSe/ZnS的体内氧化应激作用。
进一步，所述对小鼠不同器官氧化应激作用的检测方法CAT活性测定，CAT活性用试剂盒进行测定时要进行预试验，选择最佳的稀释比例，使百分抑制率在30％-55％之间；对照OD-测定OD/对照OD在0.30-0.55，若百分抑制率>60％，要对样本进行稀释；若抑制率<20％，加取样量；故测定之前先将10％的肾脏组织匀浆用生理盐水稀释成7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍不同比例，摸索最佳稀释比例；两次预实验后选取稀释12倍为最佳稀释比例，进行CAT活性检测。
进一步，所述对小鼠不同器官氧化应激作用的检测方法蛋白测定时，为达到线性关系范围，蛋白浓度必须稀释至1.3g/L以下；测定前先进行预试验，将10％组织均浆稀释为20倍、25倍、30倍；对测定的吸光值比较分析后选用30倍的稀释比例。
进一步，所述对小鼠不同器官氧化应激作用的检测方法组织中CAT活性的计算：
本发明的另一目的在于提供一种所述对小鼠不同器官氧化应激作用的检测方法使用的CdSe/ZnS量子点对小鼠氧化应激作用的动物模型，所述CdSe/ZnS量子点对小鼠氧化应激作用的动物模型为：选用清洁级、体重20g的雄性ICR小鼠，小鼠随机分组，CdSe/ZnSQDs通过尾静脉注射建立染毒小鼠模型；量子点QD605的低剂量组、中剂量组、高剂量组，量子点QD525的对照组、低剂量组，中剂量组，高剂量组；对照组均用生理盐水处理；每个剂量组的暴露时间分别为11天、22天、33天。
进一步，所述量子点QD605的低剂量组1nmol/kg、中剂量组10nmol/kg、高剂量组15nmol/kg，量子点QD525的对照组生理盐水、低剂量组6nmol/kg，中剂量组30nmol/kg，高剂量组150nmol/kg。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：
选取小鼠作为发明对象，通过不同粒径、不同浓度的CdSe/ZnS量子点暴露的不同时间发明CdSe/ZnS对小鼠不同器官氧化应激作用的影响。观察量子点对小鼠的DNA损伤、肝脏和肾脏抗氧化酶相关基因和蛋白质组的影响，进一步揭示CdSe/ZnS量子点对动物体的分子毒性效应，为量子点的毒理学发明和生物安全评估提供基础材料。
附图说明
图1是本发明实施例提供的CdSe/ZnS-QD525量子点对小鼠氧化应激作用的动物模型的构建方法流程图。
图2是本发明实施例提供的CdSe/ZnS-QD605小鼠氧化应激作用的动物模型的构建方法流程图。
图3是本发明实施例提供的暴露11天小鼠肝脏肾脏MDA含量示意图。
图4是本发明实施例提供的暴露22天小鼠肝脏肾脏MDA含量示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
量子点在医学及生命科学等发明领域具有极大的应用前景。随着量子点应用范围的不断扩大，其生物安全性逐渐引起人们的广泛关注。设计不同粒径、不同浓度、不同暴露时间，发明CdSe/ZnS量子点在生物体内对不同器官氧化应激作用的影响。观察量子点对小鼠的DNA损伤、肝脏和肾脏抗氧化酶相关基因和蛋白质组的影响，进一步揭示CdSe/ZnS量子点对动物体的分子毒性效应，为量子点的毒理学发明和生物安全评估提供基础材料。
本发明实施例提供的CdSe/ZnS量子点对小鼠氧化应激作用的动物模型为选用清洁级、体重20g的雄性ICR小鼠，小鼠随机分组，CdSe/ZnS QDs通过尾静脉注射建立染毒小鼠模型；量子点QD605的低剂量组(1nmol/kg)、中剂量组(10nmol/kg)、高剂量组(15nmol/kg)，量子点QD525的对照组(生理盐水)、低剂量组(6nmol/kg)，中剂量组(30nmol/kg)，高剂量组(150nmol/kg)。对照组均用生理盐水处理。每个剂量组的暴露时间分别为11天、22天、33天。
本发明实施例提供的CdSe/ZnS量子点对小鼠氧化应激作用的动物模型的构建方法包括以下步骤：
选用清洁级、体重约20g的雄性ICR小鼠，小鼠随机分组，CdSe/ZnS QDs通过尾静脉注射建立染毒小鼠模型。进行预实验结果，量子点QD605的低剂量组(1nmol/kg)、中剂量组(10nmol/kg)、高剂量组(15nmol/kg)，量子点QD525的对照组(生理盐水)、低剂量组(6nmol/kg)；中剂量组(30nmol/kg),高剂量组(150nmol/kg)。对照组均用生理盐水处理。每个剂量组的暴露时间分别为11天、22天、33天。
本发明通过不同粒径、不同浓度的CdSe/ZnS量子点暴露的不同时间发明CdSe/ZnS对小鼠不同器官氧化应激作用的影响。观察量子点对小鼠的DNA损伤、肝脏和肾脏抗氧化酶相关基因和蛋白质组的影响，进一步揭示CdSe/ZnS量子点对动物体的分子毒性效应。
量子点对小鼠脏器氧化应激作用的测定，取相应暴露时间的各组小白鼠肝脏和肾脏组织，在冰冷的生理盐水中漂洗，去掉表面血迹，滤纸拭干，称重，加入一定量冰的生理盐水，用匀浆器在0～4℃制成10％的组织匀浆，将匀浆液以4℃，3000rpm/min的转速离心10min，取上清液，进行肝脏、肾脏SOD、CAT活性测定和MDA、GSH含量测定，评估量子点(CdSe/ZnS)的体内氧化应激作用。
CAT活性测定，CAT活性用试剂盒进行测定时要进行预试验，选择最佳的稀释比例，使百分抑制率在30％-55％之间。即(对照OD-测定OD)/对照OD在0.30-0.55之间，若百分抑制率>60％，要对样本进行稀释；若抑制率<20％，可以加取样量。故测定之前先将10％的肾脏组织匀浆用生理盐水稀释成7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍不同比例，摸索最佳稀释比例。两次预实验后选取稀释12倍为最佳稀释比例，进行CAT活性检测。
蛋白测定时，为达到线性关系范围，蛋白浓度必须稀释至1.3g/L以下。测定前先进行预试验，将10％组织均浆稀释为20倍、25倍、30倍。对测定的吸光值比较分析后选用30倍的稀释比例。
组织中CAT活性的计算：
下面结合实验对本发明的应用原理作进一步的描述。
1、染毒小鼠模型的建立：选用清洁级、体重约20g的雄性ICR小鼠，小鼠随机分组，CdSe/ZnS QDs通过尾静脉注射建立染毒小鼠模型。参考相关文献及本发明进行的预实验结果，量子点QD605的低剂量组(1nmol/kg)、中剂量组(10nmol/kg)、高剂量组(15nmol/kg)，量子点QD525的对照组(生理盐水)、低剂量组(6nmol/kg),中剂量组(30nmol/kg),高剂量组(150nmol/kg)。对照组均用生理盐水处理。每个剂量组的暴露时间分别为11天、22天、33天。
2、暴露11天、22天、33天的小鼠肝脏、肾脏SOD、CAT活性测定，MDA、GSH含量测定；酶活测定之前，任选一例实验组样本做预实验，确定10％组织匀浆的稀释倍数和取样量可以使百分抑制率在15～55％之间，按照说明书，用分光光度计分别测定每一组的吸光度值。
3、分析不同粒径、不同浓度、不同暴露时间的CdSe/ZnS QDs对小鼠抗氧化酶基因cat、Cu/ZnSOD、MT的表达和蛋白组的影响，同时检测Cd2+在生物体内的分布情况：
(1)中子活化法分析镉离子在生物体内的分布情况；
(2)SCGE检测CdSe/ZnS QDs对小鼠DNA的损伤；
(3)荧光定量PCR检测CdSe/ZnS QDs对抗氧化酶基因表达的影响；
(4)双向电泳检测CdSe/ZnS QDs对小鼠脏器组织中蛋白质组的影响。
下面结合附图对本发明的应用原理作进一步的描述。
1、暴露11天对小鼠肝脏MDA含量的影响
暴露11天的小鼠随着CdSe/ZnS-QD525注射剂量的增大其肝脏、肾脏MDA含量出现均出现先降低后增大的趋势。但对照组分别与低、中、高剂量组进行比较，结果均无显著性差异(P>0.05)
如图3暴露11天小鼠肝脏肾脏MDA含量
表1暴露11天的小鼠肝脏、肾脏MDA含量
2.暴露22天对小鼠肝脏MDA含量的影响
暴露22天的小鼠随着CdSe/ZnS-QD525注射剂量的增大其肝脏MDA含量出现先降低后增大的趋势。其中对照组与中剂量组进行比较，其结果有显著性差异(P<0.05)，与低、高剂量组相比，无显著性差异(P>0.05)。肾脏MDA含量先增大后降低，但对照组分别与低、中、高剂量组进行比较，结果均无显著性差异(P>0.05)。
如图4暴露22天小鼠肝脏肾脏MDA含量
表2暴露22天的小鼠肝脏、肾脏MDA含量
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种对小鼠不同器官氧化应激作用的检测方法，其特征在于，所述对小鼠不同器官氧化应激作用的检测方法通过不同粒径、不同浓度的CdSe/ZnS量子点暴露的不同时间发明CdSe/ZnS对小鼠不同器官氧化应激作用的影响；观察量子点对小鼠的DNA损伤、肝脏和肾脏抗氧化酶相关基因和蛋白质组的影响，揭示CdSe/ZnS量子点对动物体的分子毒性效应。
2.如权利要求1所述的对小鼠不同器官氧化应激作用的检测方法，其特征在于，所述对小鼠不同器官氧化应激作用的检测方法量子点对小鼠脏器氧化应激作用的测定，取相应暴露时间的各组小白鼠肝脏和肾脏组织，在冰冷的生理盐水中漂洗，去掉表面血迹，滤纸拭干，称重，加入一定量冰的生理盐水，用匀浆器在0～4℃制成10％的组织匀浆，将匀浆液以4℃，3000rpm/min的转速离心10min，取上清液，进行肝脏、肾脏SOD、CAT活性测定和MDA、GSH含量测定，评估量子点CdSe/ZnS的体内氧化应激作用。
3.如权利要求1所述的对小鼠不同器官氧化应激作用的检测方法，其特征在于，所述对小鼠不同器官氧化应激作用的检测方法CAT活性测定，CAT活性用试剂盒进行测定时要进行预试验，选择最佳的稀释比例，使百分抑制率在30％-55％之间；对照OD-测定OD/对照OD在0.30-0.55，若百分抑制率>60％，要对样本进行稀释；若抑制率<20％，加取样量；故测定之前先将10％的肾脏组织匀浆用生理盐水稀释成7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍不同比例，摸索最佳稀释比例；两次预实验后选取稀释12倍为最佳稀释比例，进行CAT活性检测。
4.如权利要求1所述的对小鼠不同器官氧化应激作用的检测方法，其特征在于，所述对小鼠不同器官氧化应激作用的检测方法蛋白测定时，为达到线性关系范围，蛋白浓度必须稀释至1.3g/L以下；测定前先进行预试验，将10％组织均浆稀释为20倍、25倍、30倍；对测定的吸光值比较分析后选用30倍的稀释比例。
5.如权利要求1所述的对小鼠不同器官氧化应激作用的检测方法，其特征在于，所述对小鼠不同器官氧化应激作用的检测方法组织中CAT活性的计算：
6.一种权利要求1所述对小鼠不同器官氧化应激作用的检测方法使用的CdSe/ZnS量子点对小鼠氧化应激作用的动物模型，其特征在于，所述CdSe/ZnS量子点对小鼠氧化应激作用的动物模型为：选用清洁级、体重20g的雄性ICR小鼠，小鼠随机分组，CdSe/ZnS QDs通过尾静脉注射建立染毒小鼠模型；量子点QD605的低剂量组、中剂量组、高剂量组，量子点QD525的对照组、低剂量组，中剂量组，高剂量组；对照组均用生理盐水处理；每个剂量组的暴露时间分别为11天、22天、33天。
7.如权利要求6所述的CdSe/ZnS量子点对小鼠氧化应激作用的动物模型，其特征在于，所述量子点QD605的低剂量组1nmol/kg、中剂量组10nmol/kg、高剂量组15nmol/kg，量子点QD525的对照组生理盐水、低剂量组6nmol/kg，中剂量组30nmol/kg，高剂量组150nmol/kg。
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