CN109142292A - 一种经g插入序列合成的发光银簇对卡托普利的检测方法 - Google Patents
一种经g插入序列合成的发光银簇对卡托普利的检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种经G插入序列合成的发光银簇对卡托普利的检测方法，属于食品、药品检测领域。本发明设计一系列规则的富C碱基DNA序列合成纳米银簇，选择荧光亮度最好的G插入序列合成银簇，并建立了检测卡托普利的方法；向银纳米簇溶液中加入可能含有卡托普利的待测样品，经混合反应后，通过观测所形成的混合反应体系在最大激发波长下的荧光强度，实现对待测样品中的卡托普利的检测。本发明应用该DNA序列合成的银纳米团簇检测卡托普利，其检测的线性范围为0.05μg/mL～5μg/mL，灵敏度可达到0.05μg/mL，具有简便快速、成本低、灵敏度高等优点，可应用于保健品、食品、药物制品等健康产品中卡托普利的检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种经G插入序列合成的发光银簇对卡托普利的检测方法，属于食品、药品检测领域。
背景技术
银纳米簇(AgNCs)作为一种纳米材料，具有光致发光特性和催化活性，在分析化学、生物医学、细胞成像等领域广泛应用。以天然生物DNA为模板合成的DNA-AgNCs具有荧光特性，其荧光强度与DNA序列中的基因排列和结构有关。研究发现，Ag+可以选择性地配位C碱基并形成稳定的C-Ag+-C复合物，G(鸟嘌呤)富集的序列可以提高DNA-AgNCs在检测核酸、ATP、凝血酶和重金属时的荧光强度，而且一些具有高荧光强度的DNA封端的AgNCs通常富含C和G碱基的序列，所以创造性设计一系列规则的DNA序列，以探索插入G碱基的富C序列合成的DNA-AgNCs的荧光强度，可以帮助了解DNA碱基中的规则，并获得高荧光亮度的序列。
卡托普利[1-(D-3-巯基-2-甲基-1-氧代丙基)-L-脯氨酸，简称Cap]，是第一代用于治疗高血压的主要用于治疗高血压、冠心病和充血性心力衰竭的血管紧张素转换酶抑制剂。由于卡托普利便宜易得，商家可能会将其非法添加到某些可降低血压的保健品中以提高效果。
目前常用的卡托普利检测手段有气相色谱法、液相-质谱连用法、高效液相色谱法等，这些方法或耗时长、成本高，且需要在专门的实验室中由专业的实验人员进行，或灵敏度低，且容易造成环境污染。由于含巯基药物通过巯基与银纳米簇发生特异性作用,可以高选择性猝灭银纳米簇的荧光。本发明利用筛选得出的G插入序列合成的DNA-AgNCs，具有较高的荧光亮度，并建立了一种新的卡托普利检测方法，操作简单，反应速度快，灵敏度高，可视化程度高。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种卡托普利的荧光检测方法，应用G插入的DNA合成荧光核酸纳米银簇DNA-AgNCs，实现对卡托普利简单、快速、灵敏地进行检测。
在本发明的一种实施方式中，所述DNA-AgNCs含有SEQ ID NO.1所示的DNA。
在本发明的一种实施方式中，所述DNA-AgNCs按下述步骤制备而成：将DNA加入至磷酸盐缓冲液中，配制成DNA溶液，再加入AgNO3水溶液，搅拌20～30s，在0～4℃环境下保持15～30min后，加入NaBH4溶液并剧烈搅拌1～2min，将此混合物在室温下避光保存8～12h；所述DNA、AgNO3和NaBH4的摩尔比为1:6:6。
在本发明的一种实施方式中，所述DNA-AgNCs按下述步骤制备而成：将DNA加入至磷酸盐缓冲液中，获得浓度为5μM的DNA溶液，再按照DNA：AgNO3＝1：6的比例加入AgNO3水溶液，搅拌20～30s，在0～4℃环境下保持15～30min后，按照DNA：NaBH4＝1:6的比例加入NaBH4溶液并剧烈搅拌1～2min，将此混合物在室温下避光保存8～12h。
在本发明的一种实施方式中，所述方法包括如下步骤：
(1)向所述的DNA-AgNCs纳米簇溶液，加入终浓度为0.1～5mg/L的卡托普利溶液，室温下混合反应20min，于670nm发射光波长下测定荧光强度，建立卡托普利浓度-荧光强度标准曲线；
(2)卡托普利的检测：取待测样品加入至上述银纳米簇溶液中，反应体系为400μL，银簇终浓度为2.5μM，同时加入等量的水作空白对照，20min后，于670nm发射光波长下分别测定荧光强度，与空白对照相比，若荧光强度明显减弱，则该样品含卡托普利。
在本发明的一种实施方式中，所述方法还用于测定样品中的卡托普利浓度，方法的具体步骤包括：
(1)向DNA-AgNCs纳米簇溶液中加入终浓度为0.1～5mg/L的卡托普利溶液，室温下混合反应20min，于670nm发射光波长下测定荧光强度，建立卡托普利浓度-荧光强度标准曲线；
(2)取待测样品加入至上述银纳米簇溶液中，待测样品与银纳米簇溶液的体积比为1～5:1，混合后反应15～20min，于670nm发射光波长下测定荧光强度，将待测样品的荧光强度带入至步骤(1)制备的卡托普利浓度-荧光强度标准曲线，计算待测样品中的卡托普利浓度。
本发明的第二个目的是提供一种高亮度荧光核酸纳米银簇DNA-AgNCs，是将含有SEQ ID NO.1所示的DNA与AgNO3、NaBH4为原料，在磷酸盐缓冲液中制备而成。
在本发明的一种实施方式中，所述荧光核酸纳米银簇DNA-AgNCs是按照下述方式制备而成：取20μL磷酸盐缓冲液，加入终浓度为5μM的DNA水溶液，再加入2.0μL浓度为3.0mM的AgNO3水溶液，搅拌30s，在4℃环境下保持20min后，加入2.0μL新制的NaBH4水溶液并剧烈搅拌1min，将此混合物在室温下避光保存9h，制成DNA-AgNCs纳米簇溶液；
本发明的第三个目的是提供SEQ ID NO.1所示的DNA在荧光检测领域方面的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述应用包括制备荧光核酸纳米银簇DNA-AgNCs。
有益效果：本发明中合成的DNA-AgNCs，采用的DNA是经过一系列筛选获得的高荧光亮度的序列，对检测卡托普利具有简单、快速、便携、可视化、灵敏度高等优点，检测灵敏度可达0.05μg/mL，检测线性范围为0.05μg/mL～5μg/mL，可以快速准确地提供检测结果。
附图说明
图1为长度相当的10个不同富C碱基的DNA序列合成的DNA-AgNCs荧光强度对比图，发射波长为670nm，DNA序列从左到右分别为C6T、C4T、C3T、C6A、C4A、C3A、C6G、C4G、C3G、C12；
图2为G碱基数目及插入位置不同的富C碱基的DNA序列合成的DNA-AgNCs荧光强度对比图，发射波长为670nm，DNA序列从左到右分别为C6G、C4G、C3G、C2G、CG、C12；
图3为G碱基数目不同的富C碱基的DNA序列合成的DNA-AgNCs荧光强度对比图，发射波长为670nm，DNA序列从左到右分别为C6G、C6-2G、C6-3G、C6-4G、C6-5G、C6-6G；
图4为C6-5G-AgNCs的飞行时间质谱和透射电子显微镜表征图；
图5为本发明实施例2中测定卡托普利和AgNCs的反应稳定时间的荧光强度趋势图；
图6为本发明实施例2中卡托普利浓度-荧光强度标准曲线图；
图7为本发明实施例3中对于不同物质的选择性分析对比图，样品从左到右分别为空白、浓度为1μg/mL的卡托普利、50μg/mL的淀粉、50μg/mL的糊精、10μg/mL的麦芽糖、20μg/mL的明胶、10μg/mL的蔗糖、50μg/mL的乳糖、10μg/mL的葡萄糖的荧光强度。
图8为本发明实施例4中对于茶样中卡托普利检测的分析图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合实例对本发明做进一步详细说明，但本发明并不仅仅局限于下述实例。
实施例1
采用如下条件制备DNA-AgNCs溶液：
(1)DNA-AgNCs溶液的制备：取20μL磷酸盐缓冲液，加入终浓度为5μM的DNA水溶液，再加入2.0μL浓度为3.0mM的AgNO3水溶液，搅拌30s，在4℃环境下保持20min后，加入2.0μL新制的NaBH4水溶液并剧烈搅拌1min，将此混合物在室温下避光保存9h，制成DNA-AgNCs纳米簇溶液；
(2)DNA序列的筛选：选择表1中不同的富C碱基的DNA序列，按步骤(1)合成DNA-AgNCs，测定其在最大发射波长(670nm)的荧光强度，结果如图1所示，C4A和C6G序列对应的荧光强度较强，分别为26730和27394，可知C6G序列强度最高，故选择G插入序列进一步实验；
表1长度相当的10个不同富C碱基的DNA序列
选择G碱基数目及插入位置不同的富C碱基的DNA序列(表2)，按步骤(1)合成DNA-AgNCs，测定其在最大发射波长(670nm)下的荧光强度，结果如图2所示，C6G序列对应的荧光强度最强，达到27394；
表2 G碱基数目及插入位置不同的富C碱基的DNA序列
选择G碱基数目不同的富C碱基的DNA序列(表3)，按步骤(1)合成DNA-AgNCs，测定其在最大发射波长(670nm)下的荧光强度，结果如图3所示，C6-5G序列对应的荧光强度最强，达到41963；
表3 G碱基数目不同的富C碱基的DNA序列
(3)DNA-AgNCs的表征：选择荧光亮度最好的DNA序列(C6-5G)，合成DNA-AgNCs纳米簇溶液，以罗丹明B为标准对照测定量子产率为28％，通过飞行时间质谱和透射电子显微镜对该纳米银簇进行表征，结果如图4所示，其中5054峰表示C6-5G DNA序列的质量比，而5162峰表示C6-5G-AgNCs的质量比，差值为108，恰好是一个Ag原子，表明每个C6-5G银纳米簇含有一个Ag；用TEM拍摄的AgNCs图像如图4插图所示，可知C6-5G-AgNCs具有非常小的尺寸(<2nm)；
(4)确定反应稳定时间：选择荧光亮度最好的DNA序列(C6-5G)，按步骤(1)合成C6-5G-AgNCs纳米簇溶液，总反应体积为400μL，其中C6-5G-AgNCs浓度为2.5μM，加入终浓度为1μg/mL的卡托普利，使用荧光光谱仪的时间测量模块来测量荧光强度以及反应时间，每5s记录一次数据，实验结果如图5所示，DNA-AgNCs峰值荧光强度随时间显着下降，然后在约1200s时保持平衡，故选择1200秒(20分钟)作为反应平衡时间；
实施例2
向实施例1制备的浓度为2.5μM的C6-5G-AgNCs纳米簇溶液中加入不同浓度的卡托普利，总反应体积为400μL，卡托普利终浓度分别为0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0μg/mL，充分反应20min后，于670nm发射光波长下测定荧光强度，由此建立卡托普利浓度-荧光强度标准曲线，如图6所示，在卡托普利浓度范围(0～1μg/mL)内有较好的线性关系，线性方程为y＝-42774.68x+45953.36(R2＝0.9446)。检测灵敏度可达0.05μg/mL，检测线性范围为0.05μg/mL～5μg/mL。
实施例3
总反应体积为400μL，其中C6-5G-AgNCs浓度为2.5μM，向C6-5G-AgNCs纳米簇溶液中分别加入浓度为1μg/mL的卡托普利，50μg/mL的淀粉、50μg/mL的糊精、10μg/mL的麦芽糖、20μg/mL的明胶、10μg/mL的蔗糖、50μg/mL的乳糖、10μg/mL的葡萄糖，并作空白对照，充分反应20min后，于670nm发射光波长下测定荧光强度，以确定C6G5-AgNCs对卡托普利检测的选择性，结果如图7所示，只有添加有卡托普利的C6-5G-AgNCs在荧光中被明显猝灭，空白对照的荧光强度为72251，卡托普利组为7737，淀粉组为63195，乳糖组为50311，且在图7(b)中可直接观察到加入卡托普利的样品的亮度远弱于其他八个，表明C6G5-AgNCs用于检测卡托普利的选择性很好。
实施例4
应用不含卡托普利的的茶样对实施例3的检测方法进行验证。
称取2g青钱柳茶加至200g 95℃热水中，浸提10min，过滤并冷却至室温；取浸提液，加入C6-5G-AgNCs水溶液，二者体积比为1:1；总反应体积为400μL，其中C6-5G-AgNCs浓度为2.5μM，同时将另一相同体积和浓度的C6-5G-AgNCs在水中作空白对照，20min后，分别测定荧光强度，确定茶样中是否含有卡托普利，结果如图8所示，实线黑色线表示空白对照组(以水作为溶剂的C6-5G-AgNCS)荧光光谱，灰色实线表示C6-5G-AgNCs的荧光光谱(以青钱柳提取物作为溶剂)。可以看出，两组之间的荧光强度只有轻微的差异，这表明该茶样中不含卡托普利，茶样中也没有任何影响AgNCs荧光强度的因素。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种经G插入序列合成的发光银簇对卡托普利的检测方法
<160> 17
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ccccccgggg gcccccc 17
<210> 2
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cccccctccc ccc 13
<210> 3
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cccctcccct cccc 14
<210> 4
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ccctccctcc ctccc 15
<210> 5
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ccccccaccc ccc 13
<210> 6
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ccccacccca cccc 14
<210> 7
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
cccacccacc caccc 15
<210> 8
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ccccccgccc ccc 13
<210> 9
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
ccccgccccg cccc 14
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<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
cccgcccgcc cgccc 15
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<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
cccccccccc cc 12
<210> 12
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
ccgccgccgc cgcc 14
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<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
cgcgcgcgcg cgc 13
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
ccccccggcc cccc 14
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<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
ccccccgggc ccccc 15
<210> 16
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
ccccccgggg cccccc 16
<210> 17
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
ccccccgggg ggcccccc 18
Claims (9)
1.一种卡托普利的荧光检测方法，其特征在于，应用G插入的DNA合成荧光核酸纳米银簇DNA-AgNCs进行检测；所述DNA-AgNCs含有SEQ ID NO.1所示序列的DNA。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述DNA-AgNCs按下述步骤制备而成：将含有SEQ ID NO.1所示序列的DNA加入至磷酸盐缓冲液中，配制成DNA溶液，再加入AgNO3水溶液，搅拌20～30s，在0～4℃环境下保持15～30min后，加入NaBH4溶液并剧烈搅拌1～2min，将此混合物在20～25℃下避光保存8～12h；所述DNA、AgNO3和NaBH4的摩尔比为1:5～6:5～6。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，取待测样品加入至上述银纳米簇溶液中反应15～20min，于670±2nm发射光波长下测定荧光强度，以加入等量的水为空白对照；反应后的待测样品与反应后的空白对照相比，若荧光强度明显减弱，则该样品含卡托普利。
4.一种卡托普利的荧光定量检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)向DNA-AgNCs纳米簇溶液中加入终浓度为0.1～5mg/L的卡托普利溶液，室温下混合反应20min，于670nm发射光波长下测定荧光强度，建立卡托普利浓度-荧光强度标准曲线；
(2)取待测样品加入至上述银纳米簇溶液中反应15～20min，于670nm发射光波长下测定荧光强度，将待测样品的荧光强度带入至步骤(1)制备的卡托普利浓度-荧光强度标准曲线，计算待测样品中的卡托普利浓度。
5.一种DNA，其特征在于，含有SEQ ID NO.1所示的序列。
6.权利要求5所述DNA在检测技术领域的应用。
7.一种高亮度荧光核酸纳米银簇DNA-AgNCs，其特征在于，将含有SEQ ID NO.1所示的DNA与AgNO3、NaBH4为原料，在磷酸盐缓冲液中制备而成。
8.一种制备权利要求7所述的高亮度荧光核酸纳米银簇DNA-AgNCs的方法，其特征在于，将DNA加入至磷酸盐缓冲液中，配制成DNA溶液，再加入AgNO3水溶液，搅拌20～30s，在0～4℃环境下保持15～30min后，加入NaBH4溶液并剧烈搅拌1～2min，将此混合物在室温下避光保存8～12h；所述DNA、AgNO3和NaBH4的摩尔比为1:5～6:5～6。
9.权利要求7所述的高亮度荧光核酸纳米银簇DNA-AgNCs在食品、药品检测领域的应用。
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| PB01 | Publication | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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