CN109136206A - Pfkfb3蛋白的第194位酪氨酸的磷酸化及其应用 - Google Patents

Pfkfb3蛋白的第194位酪氨酸的磷酸化及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN109136206A
CN109136206A CN201710451646.5A CN201710451646A CN109136206A CN 109136206 A CN109136206 A CN 109136206A CN 201710451646 A CN201710451646 A CN 201710451646A CN 109136206 A CN109136206 A CN 109136206A
Authority
CN
China
Prior art keywords
pfkfb3
phosphorylation
albumen
src
tyrosine
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201710451646.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN109136206B (zh
Inventor
李勤喜
马欢欢
张佳
李晓彤
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Xiamen University
Original Assignee
Xiamen University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Xiamen University filed Critical Xiamen University
Priority to CN201710451646.5A priority Critical patent/CN109136206B/zh
Publication of CN109136206A publication Critical patent/CN109136206A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109136206B publication Critical patent/CN109136206B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/06—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from serum
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/44—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/01—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1)
    • C12Y207/01105—6-Phosphofructo-2-kinase (2.7.1.105)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

PFKFB3蛋白的第194位酪氨酸的磷酸化及其应用，涉及PFKFB3蛋白酪氨酸第194位的磷酸化。通过各种基于抗原‑抗体的方法检测细胞或组织中PFKFB3‑Y194位点的磷酸化水平；开发能抑制PFKFB3‑Y94位点磷酸化的药物，制备该位点磷酸化的单克隆抗体或多克隆抗体。当PFKFB3‑Y194位点被酪氨酸激酶磷酸化后，PFKFB3的酶活性上调，糖酵解增强，氧化性戊糖磷酸途径减弱，从而促进肿瘤的发生、发展和转移；PFKFB3‑Y194的磷酸化水平不仅能用于指标PFKFB3及上游蛋白激酶的活性，且能用于评估肿瘤细胞的增殖、迁移和转移能力，及开发能抑制PFKFB3‑Y194位磷酸化的药物。

Description

PFKFB3蛋白的第194位酪氨酸的磷酸化及其应用
技术领域
本发明涉及PFKFB3蛋白酪氨酸第194位的磷酸化，尤其是涉及人和鼠的PFKFB3蛋白的第194位酪氨酸的磷酸化及其应用。
背景技术
癌症是威胁人类健康的重大疾病，根据WHO的报告，2000年全球癌症死亡已经突破700万，占全部死亡人数的12％。2015年我国恶性肿瘤发病人数为429.2万，死亡281.4万，癌症成为威胁人民生命财产安全的最严重的疾病之一[1]。因此，鉴定新型的肿瘤筛选及诊断标记、发现新的肿瘤治疗靶点对提高癌症的防治手段、降低癌症死亡率至关重要。
c-Src基因作为在动物中发现的第一个原癌基因，它编码一个分子量为60kDa的酪氨酸激酶c-Src，是一个重要的非受体酪氨酸激酶。c-Src是胞内非受体酪氨酸激酶家族(Src激酶家族)的一个成员，该家族包括c-Src、Fyn、Yes,Blk,Yrk,Fgr,Hck,Lck和Lyn共9个成员[2]。c-Src激酶由一个催化结构域，三个src同源结构域(SH2、SH3、SH4)和一个位于C端的负调控结构域构成[3]。正常情况下c-Src羧基末端的第530位酪氨酸会被磷酸化，与其自身的SH2结构域结合形成分子内结构，从而抑制了其本身的激酶活性。细胞因子受体、粘附受体、酪氨酸激酶受体等跨膜蛋白能激活磷酸酶使c-Src的第530位酪氨酸去磷酸化，从而解除分子内抑制，激活c-Src的激酶活性[4]，激活的c-Src能通过磷酸化一系列底物蛋白激活细胞生长、血管生成、细胞增殖和细胞迁移等信号途径，在肿瘤诱发、恶化和转移中起重要作用[5]。研究表明，在大约50％的结肠癌、肝癌、肺癌、乳腺癌和胰腺癌组织中都存在c-Src通路的过度激活。在小鼠模型中VEGF、AKT和ERK信号通路可激活c-Src，导致前列腺癌、卵巢癌和结肠癌的形成与转移[6,7]。
由于c-Src的高表达或激活与多种肿瘤的发生和发展密切相关，而Warburg效应是恶性肿瘤的基本特征之一，且以前没有关于c-Src调节Warburg效应的报道，因此，在前期工作中研究了c-Src与糖酵解及Warburg效应的关系。
糖酵解是发生在细胞质的无氧代谢过程，一分子葡萄糖经过十步酶促反应生成两分子丙酮酸和2个ATP。整个糖酵解通路有两个限速酶，第一个是己糖激酶(HK)，催化糖酵解的第一步反应，将葡萄糖磷酸化生成6-磷酸葡萄糖(glucose-6-P,G-6-P)，6-磷酸葡萄糖可进入后续的糖酵解和磷酸戊糖途径。第二个是磷酸果糖激酶1(PFK1)，催化6-磷酸果糖生成果糖1,6-二磷酸(fructose 1,6-bisphosphate,F-1,6-BP)。已知F-2,6-BP是PFK1的最强的变构激活剂，而磷酸果糖激酶-2(PFK2)能催化F-2-P生成F-2,6-BP。哺乳动物中，PFK-2有4种不同的同工酶，即PFKFB1、PFKFB2、PFKFB3和PFKFB4。其中PFKFB3是分布最广泛，且在所有同工酶中其激酶活性最强，对糖酵解的激活作用也最强[8,9]。另外，PFKFB3在肿瘤中高表达，与肿瘤的发生和发展密切相关[10,11]。
参考文献：
1.孙燕.中国肿瘤防治工作进入新时期[J].科技导报,2016,34(20):14-17.
2.Oppermann H,Levinson AD,Varmus HE,Levintow L,Bishop JM."Uninfectedvertebrate cells contain a protein that is closely related to the product ofthe avian sarcoma virus transforming gene(src)".Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1979；76(4):1804-1808
3.Brown MT.Cooper JA.Regulation,substrates and functions ofsrc.BiochemBiophysActa 1996；1287(2-3):121–149.
4.Brickell P.M.The p60 c-src family of protein-tyrosine kinases:Structure,regulation,and function.Crit Rev Oncogenesis 1992；3(4):401-446
5.Matsumoto T,Jiang J,Kiguchi K,Ruffino L,Carbajal S,Beltrán L,BolDK,Rosenberg MP,DiGiovanni J.Targeted expression of c-Src in epidermal basalcells leads to enhanced skin tumor promotion,malignant progression,andmetastasis.Cancer Res 2003；63(16):4819-4828.
6.Weis S,Cui J,Barnes L,Cheresh D.Endothelial barrier disruption byVEGF-mediated Src activity potentiates tumor cell extravasation andmetastasis.J Cell Biol2004；167(2):223-229.
7.Wiener JR,Nakano K,Kruzelock RP,Bucana CD,Bast RC Jr,GallickGE.Decreased Src tyrosine kinase activity inhibits malignant human ovariancancer tumor growth in a nude mouse model.Clin Cancer Res 1999；5(8):2164-2170.
8.Navarro-SabatéA,Manzano A,Riera L,Rosa JL,Ventura F,Bartrons R.Thehuman ubiquitous 6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-bisphosphatase gene(PFKFB3):promoter characterization and genomic structure.Gene.2001 Feb 7；264(1):131-138.
9.Yalcin A,Telang S,Clem B,Chesney J.Regulation of glucose metabolismby 6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-bisphosphatases incancer.ExpMolPathol.2009 Jun；86(3):174-179.
10.Atsumi T,Chesney J,Metz C,Leng L,Donnelly S,Makita Z,Mitchell R,Bucala R.High expression of inducible 6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-bisphosphatase(iPFK-2；PFKFB3)in human cancers.Cancer Res.2002 Oct 15；62(20):5881-5887.
11.Cantelmo AR,Conradi LC,BrajicAetal.Inhibition of the GlycolyticActivator PFKFB3 in Endothelium Induces Tumor Vessel Normalization,ImpairsMetastasis,and Improves Chemotherapy.Cancer Cell.2016 Dec 12；30(6):968-985.
发明内容
本发明的第一目的在于提供PFKFB3蛋白的第194位酪氨酸的磷酸化。
本发明的第二目的在于提供PFKFB3蛋白第194位酪氨酸磷酸化的抗体。
本发明的第三目的在于提供PFKFB3蛋白第194位酪氨酸磷酸化的抗体的制备方法。
本发明的第四目的在于提供PFKFB3蛋白第194位酪氨酸磷酸化在临床肿瘤中的检测。
本发明的第五目的在于提供PFKFB3蛋白第194位酪氨酸磷酸化在临床抗肿瘤药物的应用。
所述PFKFB3蛋白的第194位酪氨酸的磷酸化，c-Src蛋白能与PFKFB3蛋白相互作用，磷酸化PFKFB3蛋白的酪氨酸194位点，磷酸化位点的磷素化决定了PFKFB3蛋白的酶活性，即转化果糖-6-磷酸(F-6-P)为果糖-2，6-二磷酸(F-2，6-BP)，所述转化增强了糖酵解的速率，进而促进了肿瘤的发生、发展和转移；相反的，所述磷酸化位点的酪氨酸突变为苯丙胺酸(PFKFB3-Y194F)时，c-Src失去了对糖代谢的调控能力，因而失去了促进肿瘤发生、发展和转移的能力。
所述PFKFB3蛋白第194位酪氨酸磷酸化的抗体，为单克隆抗体或多克隆抗体；所述多克隆抗体的制备方法包括以下步骤：
1)多肽合成；
2)动物免疫；选用健康家兔2只，经过2mg/只、5次免疫后，收集血清50～70ml/只；
3)免疫血清的鉴定：利用10g/ml抗原包被，ELISA的方法鉴定血清的效价及特异性。
所述PFKFB3蛋白第194位酪氨酸磷酸化的抗体在检测第PFKFB3蛋白194位酪氨酸的磷酸化的应用。
当c-Src蛋白被激活时，PFKFB3蛋白第194位酪氨酸被磷酸化，PFKFB3蛋白的酶活性极大增强，对糖酵解的正向调控能力上调，从而促进c-Src对糖酵解的调控能力和促进肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭和转移的能力。
所述PFKFB3蛋白第194位酪氨酸磷酸化在临床肿瘤中的检测，包括在结肠癌、肝癌和乳腺癌等各种肿瘤中作为检测靶点；用于评估c-Src、PFKFB3及糖酵解的激活情况；用于肿瘤的分期、分级及预后评估；用于指导临床抗肿瘤药物的选择；用于指导开发能抑制PFKFB3磷酸化的抗肿瘤药物。
所述PFKFB3蛋白第194位酪氨酸磷酸化在临床抗肿瘤药物的应用，包括抗体在检测临床标本中PFKFB3蛋白的磷酸化水平，确定包括结肠癌、肝癌、乳腺癌和肠癌等各种c-Src激活的肿瘤标本中PFKFB3的磷酸化与c-Src的磷酸化之间的相关性，PFKFB3蛋白的磷酸化与肿瘤的分级、分期及预后的关系等的应用，及评估c-Src、PFKFB3及糖酵解的激活情况，用于指导临床抗肿瘤药物的选择和用于指导开发能抑制PFKFB3磷酸化的抗肿瘤药物。
PFKFB3蛋白的第194位酪氨酸残基是一个新的磷酸化位点，此位点的磷酸化决定了PFKFB3作为糖酵解的正向调控酶对糖代谢的调控，当该位点的酪氨酸残基突变为苯丙胺酸时，PFKFB3蛋白失去对糖酵解的调控作用，进而失去促进肿瘤细胞增殖、侵袭、迁移和转移的能力。本发明根据以上对PFKFB3新的磷酸化位点的研究成果，制备了针对此位点的多克隆特异性磷酸化抗体，此抗体能够特异识别PFKFB3的磷酸化状态。
当PFKFB3蛋白194位酪氨酸发生磷酸化时，PFKFB3蛋白的酶活性增强，糖酵解增强。因而，该位点的磷酸化可用来指示PFKFB3的酶活性及细胞的糖酵解水平。所述的应用包括，PFKFB3蛋白第194位点的磷酸化水平，可指示c-Src(GeneID：6714)及其家族其他激酶的活性水平。通过各种基于抗原-抗体的方法(如ELISA、WB、IP、IF、IHC等)检测细胞或组织中PFKFB3-Y194位点的磷酸化水平；开发能抑制PFKFB3-Y94位点磷酸化的药物，制备针对该位点磷酸化的单克隆抗体或多克隆抗体。所述的应用包括，该磷酸化位点在包括结肠癌，肝癌，乳腺癌和肠癌等各种肿瘤标本中，作为检测靶点，应用于评估c-Src、PFKFB3及糖酵解的激活情况；应用于肿瘤的分期、分级及预后评估；应用于指导临床抗肿瘤药物的选择；应用于指导开发能抑制PFKFB3磷酸化的抗肿瘤药物。
本发明检测了c-Src与PFKFB3的相互作用，发现c-Src与PFKFB3有很强的相互作用，且能高度磷酸化PFKFB3上的酪氨酸位点，进而促进糖酵解的速率和乳酸的生成。在本发明中，发现了PFKFB3的磷酸化激活模式，即c-Src及其家族激酶能通过磷酸化PFKFB3酪氨酸194位点而增强其酶活性，增强糖酵解速率，促进肿瘤的发生、发展和转移。
附图说明
图1为免疫共沉淀证明内源性PFKFB3和c-Src蛋白具有相互作用。
图2为c-Src能够磷酸化PFKFB3，磷酸化的强度与c-Src的活性呈正相关。
图3为确定PFKFB3上c-Src的磷酸化位点为酪氨酸194位点，且自制的抗PFKFB3-Y194的抗体有很好的特异性。
图4为PFKFB3 Y194位点的磷酸化能激活其激酶活性。
图5为c-Src通过磷酸化PFKFB3促进糖酵解。
图6为c-Src通过磷酸化PFKFB3促进细胞增殖。
图7为c-Src通过磷酸化PFKFB3促进肿瘤发生。
图8为肿瘤组织中c-Src的磷酸化水平和PFKFB3-Y194的磷酸化IHC染色结果图。
图9为肿瘤组织中c-Src的磷酸化水平和PFKFB3-Y194的磷酸化统计学图。
图10为c-Src通过磷酸化PFKFB3促进肿瘤细胞的迁移能力。
图11为c-Src通过磷酸化PFKFB3促进肿瘤细胞的侵袭能力。
图12为c-Src通过磷酸化PFKFB3促进肿瘤细胞转移能力的HE染色结果图。
图13为c-Src通过磷酸化PFKFB3促进肿瘤细胞转移能力的统计学图。
具体实施方式
图1为本发明通过免疫共沉淀实验发现c-Src能与PFKFB3相互作用。在结肠癌HCT116细胞中免疫沉淀了内源性的PFKFB3，在沉淀中能检测到c-Src，说明二者在内源水平有很强的相互作用。
图2给出c-Src能够磷酸化PFKFB3，磷酸化的强度与c-Src的活性呈正相关。由于c-Src是一个酪氨酸激酶，它对下游蛋白的调节作用主要是通过磷酸化作用实现的，因此在293T细胞中共表达了HA-PFKFB3和Flag标签的c-Src、c-Src的激酶失活突变体(c-Src-KD)、c-Src的持续性激活突变体(c-Src-CA)，免疫沉淀HA-PFKFB3，用抗磷酸化酪氨酸的抗体(anti-pTyr)检测PFKFB3，发现c-Src能强烈地磷酸化PFKFB3，c-Src-CA的磷酸化作用更强，而c-Src-KD没有作用，说明c-Src的确是PFKFB3的上游激酶。
图3进一步确定PFKFB3上c-Src的磷酸化位点为酪氨酸194位点，且自制的抗PFKFB3-Y194的抗体有很好的特异性。为了确定PFKFB3上最主要的磷酸化位点，质谱鉴定到并构建了PFKFB3-Y194F和PFKFB3-Y315F两个突变体，发现c-Src不能使PFKFB3-Y194F磷酸化，说明PFKFB3-Y194是c-Src的主要磷酸化位点(图3a)。随后合成了Y194磷酸化的PFKFB3的多肽，注射兔子，制备了能特异性识别Y194位点磷酸化的PFKFB3的多抗(命名为Anti-p-Y194)(图3b)。
图4为PFKFB3 Y194位点的磷酸化能激活其激酶活性。随后研究了Y194位点的磷酸化对PFKFB3的酶活性的影响，通过在PFKFB3 KO细胞中的补救实验(回补的表达载体前用前缀“r”标记，如rFlag-PFKFB3)发现c-Src能通过磷酸化Y194强烈地激活PFKFB3的酶活性(图4)。
图5为c-Src通过磷酸化PFKFB3促进糖酵解。通过在PFKFB3敲除的MHCC97H和HCT116细胞中补救表达野生型PFKFB3和不能被c-Src磷酸化的PFKFB3-Y194F，检测细胞对2-NBDG(一种荧光标记的葡萄糖类似物)的摄入(图5a)及乳酸的产生(图5b)，结果表明c-Src能通过磷酸化PFKFB3-Y194F促进糖酵解的速率和乳酸的生成。
图6为c-Src通过磷酸化PFKFB3促进细胞增殖。在发现了c-Src能通过磷酸化PFKFB3-Y194而激活糖酵解后，想知道该调节作用在细胞增殖及肿瘤发生中的作用。从绘制的细胞生长曲线可知，敲除PFKFB3能显著削弱HCT116细胞的增殖，该作用能被重新表达野生型PFKFB3补救，而不能被PFKFB3-Y194F补救，说明c-Src能通过磷酸化PFKFB3-Y194促进细胞的增殖(图6)。
图7为c-Src通过磷酸化PFKFB3促进肿瘤发生。研究了该磷酸化对小鼠移植瘤生长的影响。在PFKFB3 KO HCT116细胞中稳定表达了PFKFB3-Y194F，然后进行了裸鼠皮下移植瘤实验，同时与表达野生型PFKFB3的细胞及相应的KO细胞进行对比，发现c-Src通过磷酸化PFKFB3-Y194能促进肿瘤的发生。
图8和9给出肿瘤组织中c-Src的磷酸化水平和PFKFB3-Y194的磷酸化有很强的相关性。结肠癌组织芯片IHC染色可以看到肿瘤组织相较于癌旁组织，PFKFB3 Y194的磷酸化水平有显著的上调，并且和c-Src的活性水平也有很好的相关性。
图10为c-Src通过磷酸化PFKFB3促进肿瘤细胞的能力。表明，敲除PFKFB3能显著削弱HCT116细胞的迁移能力，该作用能被重新表达野生型PFKFB3补救，而不能被PFKFB3-Y194F补救，说明c-Src能通过磷酸化PFKFB3-Y194促进细胞的迁移。
图11为c-Src通过磷酸化PFKFB3促进肿瘤细胞的侵袭能力。表明，敲除PFKFB3能显著削弱HCT116细胞的侵袭能力，该作用能被重新表达野生型PFKFB3补救，而不能被PFKFB3-Y194F补救，说明c-Src能通过磷酸化PFKFB3-Y194促进细胞的侵袭。
图12和13为c-Src通过磷酸化PFKFB3促进肿瘤细胞的转移能力。随后研究了该磷酸化对肿瘤转移能力的影响。在PFKFB3 KD B16F10细胞中稳定表达了PFKFB3-Y194F，然后进行了裸鼠尾静脉注射实验，同时与表达野生型PFKFB3的细胞及相应的KD细胞进行对比，发现c-Src通过磷酸化PFKFB3-Y194能促进肿瘤的转移。
本发明给出PFFKB3蛋白酪氨酸第194位的磷酸化，提出了该位点的磷酸化对糖酵解的促进作用等，并制备了抗PFKFB3-Y194磷酸化的多克隆抗体，该抗体能用于检测结肠癌、肝癌等各种c-Src被激活的肿瘤等分级、分期，转移及预后评估，有重要的应用价值，同时可用于评估c-Src的激活程度，进一步考虑用c-Src的抑制剂来治疗肿瘤。研究结果对临床化疗药物的选择也有一定的指导意义，对c-Src和PFKFB3高度激活的肿瘤，考虑用c-Src的抑制剂。并且研究结果还可用于指导开发能抑制PFKFB3磷酸化的抗肿瘤药物。
材料与方法如下：
1、常用药品和试剂：
本说明使用的大部分药品与试剂分别购自美国Sigma公司、上海生工(Sangon)生物工程公司和New England Biolab(NEB)公司。此外，限制性内切酶、核酸外切酶Ⅲ(ExoⅢ)和DNA标准分子量Marker购自大连宝生(Takara)生物工程公司或Transgene公司；碱性磷酸酶(CIP)购自美国Promega公司；T4DNA连接酶(T4Ligase)购自美国Invitrogen公司；PVDF膜购自Millipore公司；用于免疫共沉淀和Western Blot分析的抗体购自美国Santa Cruz,Cell Signaling。此外，PFKFB3的抗体是用与GST融合的PFKFB3(aa440-520)蛋白免疫新西兰兔子，纯化血清获得；PFKFB3磷酸化的抗体是合成磷酸化的多肽{pTyr}EASYQPLDPDKC免疫新西兰兔子，通过CNBr beads纯化血清获得。Phos-tag是购买的Wako公司的。
2、免疫共沉淀(Co-IP)：
对于过量表达免疫共沉淀实验，以35mm的细胞培养皿为例。转染24～36h后收集细胞。将培养皿置于冰上，接下来的所有操作皆在冰上进行。用真空泵将35mm细胞培养皿中的培养液彻底吸干净，加入400μl细胞裂解液，用细胞刮将细胞从培养皿内刮下，将细胞裂解液收集在1.5ml Eppendorf管中。随后用手持式超声破碎仪30％的功率超声12次，每次1s。随后将细胞裂解液4℃13,500rpm离心15min。取30μl上清转移到新管，加入2×SDS样品缓冲液制备成TCL(Total cell lysis)，置沸水中煮5min，放于-20℃备用于western blot分析。剩余上清中取出350μl用于免疫共沉淀分析。以每个样品用量5μl protein A/G琼脂糖珠(Santa Cruz)(使用前用适量裂解缓冲液洗3次，每次3,000rpm离心1min)与1μg抗体或者M2beads(直接带有Flag的标签抗体)。将beads和350μl细胞裂解液混合，在4℃的垂直混合仪缓慢颠倒混匀3h，使目的蛋白从细胞裂解液中被特异性抗体免疫沉淀下来。随后4℃以3,000rpm速度离心2min，将beads离心至管底，弃上清，分别用500μl Lysis buffer洗beads三次，去除一些非特异的结合。最后向beads中加入50μl 1.2×SDS样品缓冲液，沸水煮5min，为IP(Co-IP)的样品，存于-20℃用于Western blot分析。
3、溶液配方：
lysis buffer：20mMTris-HCl(pH 7.5),150mMNaCl,1mM EDTA,1mM EGTA,1％Triton-X100,2.5mM sodium pyrovate,1mMβ-glycerolphosphate,1mM sodiumorthovanadate,1mM DTT,1μg/ml leupeptin,1mM PMSF。
2×SDS sample buffer(10ml)：2ml glycerol，4ml 10％SDS，2ml 4×stackinggel buffer，1mlβ-mercaptoethanol，0.002g bromophenol blue
1.2×SDS sample buffer：将2×SDS sample buffer用1×lysis buffer稀释即可。
5×SDS sample buffer(50ml)：5ml 3M Tris-HCl(pH 6.8),5g SDS,25mlglycerol,12.5mlβ-mercaptoethanol,25mg bromophenol blue，ddw 7.3ml
4、MTT assay：
MTT比色法检测细胞生长速率的原理是四唑盐(MTT)能够被细胞中脱氢酶还原成不溶于水的蓝色物质，并沉淀在细胞中，用DMSO能够将这种蓝色物质溶解，溶液的颜色在570nm处有最大吸收峰，用酶标仪测的吸光度表示细胞量的多少。
将细胞培养在96孔板中，分5d的计数量，细胞密度起始都是1×103。24h之后，测第一次增殖量，每个孔加入20μl MTT溶液(5mg/ml)，继续培养4h。将培养基吸干净，用150μlDMSO溶解甲瓒，测吸光度。连续测5d，将测得的吸光度为纵坐标，时间为横坐标绘制细胞生长曲线。
5、测定glucose uptake：
细胞种植于6孔板中，密度60％左右用low glucose DMEM处理细胞4h后，PBS缓冲液清洗一次，随后用no glucose DMEM加0.1mM 2-NBDG孵育细胞30min,随后收集细胞，PBS漂洗3次后重悬细胞于1mL的PBS缓冲液中，上流式细胞仪分析活细胞内2-NBDG水平。
6、PFK酶活测定：
PFK催化果糖-6-磷酸和ATP生成果糖-1,6-二磷酸和ADP，丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶进一步依次催化NADH氧化生成NAD+，在340nm下测定NADH下降速率，即可反映PFK活性。
7、乳酸检测：
乳酸使用北京华宇亿康乳酸检测试剂盒检测。
8、裸鼠肿瘤移植实验：
利用pBOBI载体或者pLKO.1载体构建慢病毒，感染细胞，建立稳定表达的细胞系，将细胞扩增起来。裸鼠的年龄大概为6周。每只小鼠注射1×107个细胞于裸鼠的后侧大腿与背部相邻的皮下位置。注射3周后，肿瘤长至合适大小，断颈法处死小鼠，拍照并解剖取得肿瘤称重。
9、裸鼠尾静脉注射实验：
利用pBOBI载体或者pLKO.1载体构建慢病毒，感染细胞，建立稳定表达的细胞系，将细胞扩增起来。裸鼠的年龄大概为6周。每只小鼠注射2×106个细胞于裸鼠的尾静脉。注射2周后，断颈法处死小鼠，拍照并解剖取得小鼠肺，福尔马林固定后脱水、包埋、切片以及IHC染色。
本发明涉及PFKFB3蛋白的第194位酪氨酸的磷酸化(PFKFB3-p-Y194)及针对该磷酸化位点的应用。应用包括：通过各种基于抗原-抗体的方法(如ELISA、WB、IP、IF、IHC等)检测细胞或组织中PFKFB3-Y194位点的磷酸化水平；开发能抑制PFKFB3-Y94位点磷酸化的药物，制备针对该位点磷酸化的单克隆抗体或多克隆抗体。当PFKFB3-Y194位点被酪氨酸激酶(如c-Src家族的蛋白激酶)磷酸化后，PFKFB3的酶活性上调，糖酵解增强，氧化性戊糖磷酸途径减弱，而非氧化性戊糖磷酸途径增强，从而促进了肿瘤的发生、发展和转移。本发明还涉及针对该位点的应用。PFKFB3-Y194的磷酸化水平不仅能用于指标PFKFB3及其上游蛋白激酶(如c-Src家族)的活性，而且能用于评估肿瘤细胞的增殖、迁移和转移能力，也能用于指导临床抗肿瘤药物的选择，及开发能抑制PFKFB3-Y194位磷酸化的药物。
以下给出有关缩写：
1、PFKFB3-Y194：PFKFB3蛋白的第194位酪氨酸；
2、PFKFB3-p-Y194：PFKFB3蛋白的第194位酪氨酸被磷酸化；
3、Anti-p-Y194：抗PFKFB3蛋白的第194位酪氨酸磷酸化的抗体。

Claims (8)

1.PFKFB3蛋白的第194位酪氨酸的磷酸化，其特征在于c-Src蛋白能与PFKFB3蛋白相互作用，磷酸化PFKFB3蛋白的酪氨酸194位点，磷酸化位点的磷素化决定PFKFB3蛋白的酶活性，即转化果糖-6-磷酸(F-6-P)为果糖-2，6-二磷酸(F-2，6-BP)。
2.PFKFB3蛋白第194位酪氨酸磷酸化的抗体，其特征在于为单克隆抗体或多克隆抗体。
3.如权利要求2所述多克隆抗体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1)多肽合成；
2)动物免疫；选用健康家兔2只，经过2mg/只、5次免疫后，收集血清50～70ml/只；
3)免疫血清的鉴定：利用10g/ml抗原包被，ELISA的方法鉴定血清的效价及特异性。
4.PFKFB3蛋白第194位酪氨酸磷酸化的抗体在检测第PFKFB3蛋白194位酪氨酸的磷酸化的应用。
5.如权利要求4所述应用，其特征在于当c-Src蛋白被激活时，PFKFB3蛋白第194位酪氨酸被磷酸化，PFKFB3蛋白的酶活性极大增强，对糖酵解的正向调控能力上调，从而促进c-Src对糖酵解的调控能力和促进肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭和转移的能力。
6.如权利要求4所述应用，其特征在于所述PFKFB3蛋白第194位酪氨酸磷酸化在临床肿瘤中的检测，包括在结肠癌、肝癌和乳腺癌各种肿瘤中作为检测靶点；用于评估c-Src、PFKFB3及糖酵解的激活情况；用于肿瘤的分期、分级及预后评估；用于指导临床抗肿瘤药物的选择；用于指导开发能抑制PFKFB3磷酸化的抗肿瘤药物。
7.PFKFB3蛋白第194位酪氨酸磷酸化在临床抗肿瘤药物的应用，其特征在于包括抗体在检测临床标本中PFKFB3蛋白的磷酸化水平，确定包括结肠癌、肝癌、乳腺癌和肠癌各种c-Src激活的肿瘤标本中PFKFB3的磷酸化与c-Src的磷酸化之间的相关性，PFKFB3蛋白的磷酸化与肿瘤的分级、分期及预后的关系的应用，及评估c-Src、PFKFB3及糖酵解的激活情况，用于指导临床抗肿瘤药物的选择和用于指导开发能抑制PFKFB3磷酸化的抗肿瘤药物。
8.PFKFB3蛋白的第194位酪氨酸残基为磷酸化位点，所述磷酸化位点的磷酸化决定PFKFB3作为糖酵解的正向调控酶对糖代谢的调控，当该位点的酪氨酸残基突变为苯丙胺酸时，PFKFB3蛋白失去对糖酵解的调控作用，进而失去促进肿瘤细胞增殖、侵袭、迁移和转移的能力。
CN201710451646.5A 2017-06-15 2017-06-15 Pfkfb3蛋白的第194位酪氨酸的磷酸化及其应用 Active CN109136206B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710451646.5A CN109136206B (zh) 2017-06-15 2017-06-15 Pfkfb3蛋白的第194位酪氨酸的磷酸化及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710451646.5A CN109136206B (zh) 2017-06-15 2017-06-15 Pfkfb3蛋白的第194位酪氨酸的磷酸化及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109136206A true CN109136206A (zh) 2019-01-04
CN109136206B CN109136206B (zh) 2021-07-23

Family

ID=64829799

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710451646.5A Active CN109136206B (zh) 2017-06-15 2017-06-15 Pfkfb3蛋白的第194位酪氨酸的磷酸化及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109136206B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116254343A (zh) * 2023-02-22 2023-06-13 深圳市第二人民医院(深圳市转化医学研究院) Rp11-713m15.2在制备治疗癌症的药物中的用途

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003016516A2 (en) * 2001-08-14 2003-02-27 Novartis Forschungsstiftung, Zweigniederlassung Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research Kinase crystal structures and materials and methods for kinase activation
US20120302631A1 (en) * 2011-05-10 2012-11-29 Yong-Hwan Lee Inhibitors of PFKFB3 for Cancer Therapy
CN104520274A (zh) * 2012-03-29 2015-04-15 先进癌症治疗有限责任公司 Pfkfb3抑制剂和用作抗癌治疗剂的方法
WO2016191660A1 (en) * 2015-05-28 2016-12-01 University Of Louisville Research Foundation, Inc. Combinations of pfkfb3 inhibitors and immune checkpoint inhibitors to treat cancer

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003016516A2 (en) * 2001-08-14 2003-02-27 Novartis Forschungsstiftung, Zweigniederlassung Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research Kinase crystal structures and materials and methods for kinase activation
US20120302631A1 (en) * 2011-05-10 2012-11-29 Yong-Hwan Lee Inhibitors of PFKFB3 for Cancer Therapy
CN104520274A (zh) * 2012-03-29 2015-04-15 先进癌症治疗有限责任公司 Pfkfb3抑制剂和用作抗癌治疗剂的方法
CN106074368A (zh) * 2012-03-29 2016-11-09 先进癌症治疗有限责任公司 Pfkfb3抑制剂和用作抗癌治疗剂的方法
WO2016191660A1 (en) * 2015-05-28 2016-12-01 University Of Louisville Research Foundation, Inc. Combinations of pfkfb3 inhibitors and immune checkpoint inhibitors to treat cancer

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MINSUH SEO: "《Insights into the role of PFKFB3 in cancer》", 《LSU博士学位论文》 *
NO REPORTED: "《ubiquitous 6-phosphofructo-2-kinase/fructose 2,6-bisphosphatase [Homo sapiens]》", 《GENBANK: AAD08818.1》 *
RENATE KESSLER等: "《Splice isoforms of ubiquitous 6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-bisphosphatase in human brain》", 《MOLECULAR BRAIN RESEARCH》 *
SONG-GUN KIM等: "《Crystal Structure of the Hypoxia-inducible Form of 6-Phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-bisphosphatase(PFKFB3)》", 《THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116254343A (zh) * 2023-02-22 2023-06-13 深圳市第二人民医院(深圳市转化医学研究院) Rp11-713m15.2在制备治疗癌症的药物中的用途
CN116254343B (zh) * 2023-02-22 2024-04-16 深圳市第二人民医院(深圳市转化医学研究院) Rp11-713m15.2在制备治疗癌症的药物中的用途

Also Published As

Publication number Publication date
CN109136206B (zh) 2021-07-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Kawaguchi et al. Combination treatment with recombinant methioninase enables temozolomide to arrest a BRAF V600E melanoma in a patient-derived orthotopic xenograft (PDOX) mouse model
Stover et al. Protein-tyrosine-phosphatase CD45 is phosphorylated transiently on tyrosine upon activation of Jurkat T cells.
Cooper et al. Dephosphorylation or antibody binding to the carboxy terminus stimulates pp60c-src
Day et al. Inhibition of collagen-induced discoidin domain receptor 1 and 2 activation by imatinib, nilotinib and dasatinib
Suzuki et al. PI3K and Btk differentially regulate B cell antigen receptor-mediated signal transduction
Storz et al. Cross‐talk mechanisms in the development of insulin resistance of skeletal muscle cells: Palmitate rather than tumour necrosis factor inhibits insulin‐dependent protein kinase B (PKB)/Akt stimulation and glucose uptake
Molz et al. Cpk is a novel class of Drosophila PtdIns 3-kinase containing a C2 domain
Mahajan et al. Ack1 tyrosine kinase activation correlates with pancreatic cancer progression
G Johnson et al. Stressed to death: targeting endoplasmic reticulum stress response induced apoptosis in gliomas
US20080194019A1 (en) Tumor Suppressor Lkb1 Kinase Directly Activates Amp-Activated Kinase
Zhang et al. Regulated association of protein kinase B/Akt with breast tumor kinase
Fraser et al. Regulation of the energy sensor AMP-activated protein kinase in the kidney by dietary salt intake and osmolality
Endo et al. Irreversible fixation of increased level of muscle type aldolase activity appearing in rat liver in the early stage of hepatocarcinogenesis
CN109069485A (zh) P27酪氨酸磷酸化作为cdk4活性的标志物及其使用方法
US20110038791A1 (en) Methods for inhibiting six1 and eya proteins
Zhao et al. Cell adhesion suppresses autophagy via Src/FAK-mediated phosphorylation and inhibition of AMPK
CN109136206A (zh) Pfkfb3蛋白的第194位酪氨酸的磷酸化及其应用
CN105326831B (zh) 肌醇磷脂4位激酶二型α亚型特异抑制剂PI-273的应用
US20100323957A1 (en) Novel assay for inhibitors of egfr
CN107635560A (zh) 用他塞利昔布进行治疗的方法
Jin et al. Cellular transformation and activation of the phosphoinositide-3-kinase–Akt cascade by the ETV6-NTRK3 chimeric tyrosine kinase requires c-Src
Leung et al. Pin1 overexpression is associated with poor differentiation and survival in oral squamous cell carcinoma
AU1543600A (en) Therapeutic and diagnostic uses of protein tyrosine phosphatase tc-ptp
US8809295B2 (en) Composition containing inhibitors of the expression or activity of SH3RF2 for preventing or treating cancer
Cao et al. I‐κB Kinase‐ε Deficiency Attenuates the Development of Angiotensin II‐Induced Myocardial Hypertrophy in Mice

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant