CN109111584A

CN109111584A - 一种利用热稳定重组细菌漆酶制备蛋白/多糖复合膜的方法及其产品和应用

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Publication number: CN109111584A
Application number: CN201810690653.5A
Authority: CN
Inventors: 张充; 步国建; 张晓健
Original assignee: Taixing Dongsheng Bio Tech Co ltd; Nanjing Agricultural University
Current assignee: Taixing Dongsheng Bio Tech Co ltd; Nanjing Agricultural University
Priority date: 2018-06-28
Filing date: 2018-06-28
Publication date: 2019-01-01

Abstract

本发明属于食品工业生物技术领域，涉及一种蛋白/果胶/壳聚糖复合膜的制备方法及应用。该复合膜是通过将蛋白(明胶蛋白、大豆蛋白、酪蛋白、乳清蛋白中的任意一种)、果胶、壳聚糖、增塑剂、表面活性剂、热稳定重组细菌漆酶共混制备得到成膜液，pH调节到5‑8并超声脱气后，倒入聚四氟乙烯板,60‑90℃酶催化反应10‑20分钟,100‑120℃灭酶、杀菌处理10‑20分钟，控制湿度RH30％‑50％、温度20‑30℃，干燥12‑18h揭膜制得。本发明以蛋白、果胶、壳聚糖为基料，添加增塑剂、表面活性剂，通过添加热稳定重组细菌漆酶作为交联剂所制备的复合膜，拉伸强度、延展性、抗菌性、阻气性、阻水性、可塑性等方面均表现出良好的性质。

Description

一种利用热稳定重组细菌漆酶制备蛋白/多糖复合膜的方法及其产品和应用

技术领域

本发明属于食品工业生物技术领域，涉及一种利用热稳定重组细菌漆酶制备蛋白/多糖复合膜的方法及其产品和应用。

背景技术

可食性包装材料是以天然可食性物质，如蛋白质、多糖等为基料，通过不同分子间相互作用而形成具有多孔网络结构的能保鲜食品、无毒、可食用的包装材料。目前可食用包装膜的应用并不广泛，无法取代化学类包装膜，主要是由于制备的可食用膜拉伸强度、延展性能、阻气性、阻水性、稳定性、透明度、可塑性等方面无法同化学类包装膜相比。

以明胶蛋白、大豆蛋白、酪蛋白、乳清蛋白等蛋白质为基质的可食膜，具有优良的阻气性，但有拉伸强度、延展性能等方面较差。多糖类可食膜具有良好的机械性能和透明度，以多糖物质为基质制备的膜具有良好的应用前景，但是单一多糖制备的阻气性、阻水性及稳定性有待提高。

以蛋白和多糖进行共混获得的复合膜，能够弥补单一组分膜在某些性能方面的缺陷，但是与化学类包装膜相比，仍存在较大差距。造成上述两方面的问题的原因正是可食性包装材料的核心问题之一是：仍未寻找到良好的起到分子间相互交联作用的交联剂。

酶制剂具有催化效率高的本质，其本身就是蛋白质，经食品加工后，变性为无毒无害的食品组分，酶制剂是标准的绿色食品添加剂。因此，利用酶催化蛋白、多糖的交联作用，以酶制剂作为可食性包装材料的交联剂将是必然趋势。

漆酶(Laccase，EC1.10.3.2，Lac)，是自然界普遍存在的一种含铜金属酶类，可催化各种酚类物质如儿茶酸、单宁、黄酮等的交联反应，是目前研究发现的对蛋白质、多糖有交联作用的主要酶制剂之一。大量关于漆酶的研究工作取材于真菌，分泌漆酶的真菌主要集中于担子菌门(Basidiomycota)、子囊菌门(Ascomycota)及半知菌类(Imperfect fungi)等真菌。真菌漆酶最大的问题是其热稳定性差，不适合于实际的生产加工应用。细菌来源漆酶具有良好热稳定性，在催化蛋白质或多糖的交联中与加热物理变性可以起到协同作用，促进交联反应的进行。

而目前，以蛋白质、果胶、壳聚糖为基质，以热稳定重组细菌漆酶为交联剂制备复合膜的研究还未见报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种性能优良的蛋白/多糖复合膜。

本发明的另一目的是提供该多蛋白/多糖复合膜的制备方法。

本发明的又一目的是提供该蛋白/多糖复合膜的应用。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

一种利用热稳定重组细菌漆酶制备蛋白/多糖复合膜的方法，该复合膜主要通过以下步骤制备得到：将蛋白、果胶、壳聚糖、增塑剂、表面活性剂溶解于水中共混，加入热稳定重组细菌漆酶，制备得到成膜液，成膜液pH为5.5-6.5，超声脱气，倒入聚四氟乙烯板，60-90℃酶催化交联反应10-20分钟；100℃-120℃灭酶并杀菌处理10-20分钟；控制湿度、温度干燥后揭膜；

其中,成膜液中蛋白含量为6％-8％、果胶含量为1％-2％、壳聚糖含量为1％-2％，增塑剂含量为2％-4％，表面活性剂含量为2％-4％，重组细菌漆酶量为10-20U/100g成膜液；所述的％表示质量百分含量。

其中，所述的酶催化交联反应温度优选80-90℃。

所述的蛋白优选自鱼、猪或牛来源的明胶蛋白、大豆蛋白、酪蛋白、乳清蛋白中的任意一种。

所述的增塑剂优选自甘油、山梨醇、聚乙二醇中的任意一种。

所述的表面活性剂优选自吐温80、司盘、烷基葡糖苷、脂肪酸甘油酯中的任意一种。

所述的重组细菌漆酶优选热稳定的重组死亡谷芽孢杆菌漆酶，该重组细菌漆酶通过如下方法制备：

(1)以保藏号为CGMCC No.6198的死亡谷芽孢杆菌fmb-103基因组DNA为模板，序列为 SEQ ID NO.3的上游引物和序列为SEQ ID NO.4的下游引物PCR扩增含有SacI和XhoI酶切位点的漆酶基因序列；

(2)将纯化的上一步PCR产物经SacI、XhoI双酶切后插入载体pET-23a的SacI/XhoI酶切位点之间，获得含有漆酶基因的表达质粒pET-23a-fmb-L103；

(3)将表达质粒pET-23a-fmb-L103转化大肠杆菌表达宿主菌株BL21(DE3)pLysS，在37℃培养10-11小时后挑取小菌落,接入含有氨苄青霉素的50ml LB液体培养基，70-90rpm 30℃培养过夜,按照1:40的体积比取种子液加入到含有氨苄青霉素的100ml LB液体培养基,35℃180rpm振荡2-3小时至OD600约为0.6时加IPTG(终浓度100μg/ml)诱导，5小时后离心收集菌体；

(4)将诱导表达收集到的菌体，用磷酸缓冲液重悬菌体，超声波破碎菌体，4℃，10000×g 离心10min，收集上清液作为粗酶液，将处理得到的粗酶液按照Ni-NTA His TagKit说明书进行纯化。

所述的利用热稳定重组细菌漆酶制备蛋白/多糖复合膜的方法，进一步优选包含如下步骤：将壳聚糖溶解于1wt％的酸溶液中，所述的酸溶液选自盐酸、醋酸、乳酸、苹果酸或柠檬酸中的一种或多种酸溶液；蛋白质、果胶分别通过水溶解；三种溶液混合，加入增塑剂、表面活性剂及重组细菌漆酶得成膜液，成膜液pH用NaOH或HCl溶液调节至5-8，超声脱气后，倒入聚四氟乙烯板，60-90℃酶催化交联反应10-20分钟；100℃-120℃灭酶并杀菌处理10-20分钟；控制湿度RH30％-50％、温度20-30℃，干燥12-18h揭膜。

按照上述方法制备的热稳定重组细菌漆酶制备蛋白/多糖复合膜。

本发明所述的热稳定重组细菌漆酶制备蛋白/多糖复合膜在食品保鲜中的应用。

所述的应用优选将本发明所述的热稳定重组细菌漆酶制备蛋白/多糖复合膜包裹果蔬、肉制品，达到保鲜效果；或将成膜液直接涂于果蔬、肉制品表面，达到保鲜效果。

有益效果：

明胶蛋白、大豆蛋白、酪蛋白及乳清蛋白来源广泛，成膜性好，具有优良的阻气性能；以果胶制备的膜有较好的机械性能；壳聚糖具有较好的成膜性和抗菌活性。

热稳定重组细菌漆酶催化成膜原料分子内和分子间的多种交联反应，包括：(1)催化蛋白分子内交联；(2)果胶分子内交联；(3)催化蛋白质分子含苯环氨基酸与果胶阿魏酰基团的分子间交联；(4)催化果胶阿魏酰基团与壳聚糖氨基团的分子间交联；同时，高温反应条件下，蛋白和多糖大分子的结构被充分打开，因此热效应与酶催化效应产生协同效果。上述交联反应能够显著的增强复合膜的机械性能和热稳定性能。

本发明从现有的成膜材料中选择上述特定的可食用蛋白质成分、抗菌成分壳聚糖、膜稳定成分果胶、增塑剂及表面活性剂，添加热稳定性重组细菌漆酶作为交联剂。通过控制成膜条件，获得的复合膜，在机械性能、热稳定性及抗菌性方面表现出了良好的性质，性能优于利用真菌漆酶处理和未用酶处理的对照组，具有重要的应用价值。

附图说明

图1不添加热稳定性重组细菌漆酶与添加酶制备的复合膜电镜扫描图

A不添加热稳定性重组细菌漆酶的复合膜电镜扫描图

B添加热稳定性重组细菌漆酶的复合膜电镜扫描图

生物材料保藏信息

死亡谷芽孢杆菌fmb-103，分类命名为Bacillus vallismortis，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2012年06月08日，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC No.6198。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。

实施例1：死亡谷芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)fmb-103漆酶基因的克隆

离心收集死亡谷芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)fmb-103菌体(CGMCCNo.6198)，用上海生工基因组DNA提取试剂盒提取死亡谷芽孢杆菌(Bacillusvallismortis)fmb-103的基因组DNA。

根据Genebank数据库中已登录的芽孢杆菌漆酶基因(No.GU972592.1)设计两个引物：

上游引物F-1：5’-ATGACACTTGAAAAATTTGTGGATGC-3’(SEQ ID NO.3)；

下游引物R-1：5’-TTATTTATGGGGATCAGTTATATC-3’(SEQ ID NO.4)；

在50μl体系中，引物终浓度各为1μM，dNTPs终浓度为0.2mM,fmb-103菌株基因组DNA 10ng，2U Pfu DNA聚合酶。扩增程序为94℃3min；30×(94℃40s，53℃50s，72℃90s)；72℃10min。琼脂糖凝胶电泳，切胶，采用上海生工试剂盒回收，将回收的PCR产物与TaKaRapMD19-simple-T vector连接，转化E.coli DH5α，涂于含有IPTG、X-gal、氨苄青霉素的 LB平板，37℃培养13-14小时，挑白色菌落，振荡培养，提取质粒，确定连接成功后送到上海生工测序，用计算机软件DNAMAN分析测序结果，得到一个序列如SEQ ID NO.1所示的长度为1542bp的ORF，即fmb-103漆酶基因(fmb-L103)，编码一个由514个氨基酸组成的蛋白质，序列如SEQ ID NO.2所示。

实施例2：死亡谷芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)fmb-103漆酶基因原核表达载体的构建

根据获得的漆酶基因序列，设计两个引物，上游引物加上SacI识别序列，下游引物加上 XhoI识别序列(下划线部分为限制酶识别序列):

上游引物F-2：5′-CGCGAGCTCATGACACTTGAAAAATTTGTGGATGC-3′(SEQ ID NO.5),

下游引物R-2:5′-CCGCTCGAGTTATTTATGGGGATCAGTTATATC-3′(SEQ ID NO.6),

按照下列PCR体系加入各成分，扩增漆酶基因:

PCR程序为：94℃3min；30×(94℃40s；53℃50s；72℃90s)；72℃10min。

用上海生工PCR产物纯化试剂盒纯化PCR产物，加SacI、XhoI双酶切，灭活，乙醇沉淀， ddH₂O重溶，与适量的用相同限制酶消化的载体pET-23a连接，转化大肠杆菌DH5α。从转化平板上随机挑取几个菌落，接入LB液体培养基，振荡培养，小量提取质粒，电泳，以电泳滞后的质粒为模板进行PCR验证，确定连接成功后送到上海生工测序。

实施例3：死亡谷芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)fmb-103漆酶基因在大肠杆菌中的表达

将含有fmb-L103表达质粒pET-23a-fmb-L103转化大肠杆菌表达宿主菌株 BL21(DE3)pLysS，在37℃培养10-11小时后挑取小菌落，接入含有氨苄青霉素的50ml LB液体培养基，70-90rpm 30℃培养过夜，按照1:40的体积比取种子液加入到含有氨苄青霉素的100ml LB液体培养基，35℃180rpm振荡2-3小时至OD600约为0.6时加IPTG(终浓度 100μg/ml)诱导。1.5小时后离心收集菌体。破碎菌体，离心收集上清液，获得重组死亡谷芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)漆酶(fmb-rL103)的粗酶液。

漆酶活性测定采用2,2’-连氮-二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS)法稍作改动：反应体系总体积3mL，包括2.45mL 0.2mol/L pH 5.0柠檬酸-磷酸盐缓冲液、0.5mL 6mmol/LABTS 及50μl用pH 5.0柠檬酸-磷酸盐缓冲液适当稀释的酶粗提液，45℃测定反应的前3min内反应液在420nm处吸光值OD的增加量，以灭活酶液做空白对照。将每分钟内生成1μmol反应物所需的酶量定义为一个酶活力单位。漆酶酶活计算公式：漆酶活力(U)＝V_总×ΔOD/(V_酶×ε×Δt×10^-6)×总酶酶液稀释倍数；其中，ε＝3.6×10⁴mol/cm；Δt：3min；ΔOD：3min内吸光度OD的变化值；V_总：酶反应中，反应液的总体积；V_酶：酶反应中，酶液的体积。实验重复3次，取平均值。

采用上述方法测得pET-23a-fmb-L103转化BL21(DE3)pLysS后的工程菌，重组漆酶的产量为12000U/ml发酵液。

实施例4：重组死亡谷芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)fmb-103漆酶(fmb-rL103)的分离纯化

采用NTA(镍柱，GE公司产品)亲和层析法对实例3中获得的fmb-rL103粗酶液进行分离纯化。

样品中加5mM咪唑(终浓度)，增强吸附柱。

上样前，用20mM咪唑平衡层析柱。样品过三次柱材料，达到fmb-rL103与亲和柱材料充分结合的目的。

上样结束后，用100mM咪唑洗脱(分别用10个柱床体积)，收集洗脱液测酶活。上述纯化制备的重组漆酶fmb-rL103酶活为3.6U/mg蛋白。

实施例5：明胶蛋白/多糖复合膜的制备流程

(1)称取鱼明胶蛋白粉溶于超纯水中，配制成质量百分含量18％的鱼明胶蛋白溶液；称取果胶溶于超纯水中，配制成质量百分含量为3％的果胶溶液；称取壳聚糖粉溶于1％的乳酸溶液，配制成质量百分含量为3％的壳聚糖溶液。

(2)上述鱼明胶蛋白溶液、果胶溶液、壳聚糖溶液按照1:1:1的体积比混合。

(3)向上述混合液中加入2％的甘油，2％的吐温80，所述％为质量百分含量。

(4)磁力搅拌使上述混合液充分溶解后，用NaOH或HCl溶液调节pH至6，加入热稳定重组细菌漆酶fmb-rL103，添加量优选15U/100mL成膜液。

(5)超声脱气后，倒入聚四氟乙烯板，优选80℃酶催化交联反应15分钟。

(6)120℃灭酶并杀菌处理15分钟。

(7)控制湿度RH30％、温度30℃，干燥15h揭膜。

实施例6：大豆蛋白/多糖复合膜的制备流程

(1)称取大豆蛋白粉溶于超纯水中，配制成质量百分含量18％的大豆蛋白溶液；称取果胶溶于超纯水中，配制成质量百分含量为3％的果胶溶液；称取壳聚糖粉溶于1％的乳酸溶液，配制成质量百分含量为3％的壳聚糖溶液。

(2)上述大豆蛋白溶液、果胶溶液、壳聚糖溶液按照1:1:1的体积比混合。

(3)向上述混合液中加入2％的山梨醇，2％的司盘，所述％为质量百分含量。

(4)磁力搅拌使上述混合液充分溶解后，用NaOH或HCl溶液调节pH至6，加入热稳定重组细菌漆酶fmb-rL103，添加量优选20U/100mL成膜液。

(6)120℃灭酶并杀菌处理15分钟。

(7)控制湿度RH30％、温度30℃，干燥15h揭膜。

实施例7：酪蛋白/多糖复合膜的制备流程

(1)称取酪蛋白粉溶于超纯水中，配制成质量百分含量20％的酪蛋白溶液；称取果胶溶于超纯水中，配制成质量百分含量为5％的果胶溶液；称取壳聚糖粉溶于1％的乳酸溶液，配制成质量百分含量为3％的壳聚糖溶液。

(2)上述酪蛋白溶液、果胶溶液、壳聚糖溶液按照1:1:1的体积比混合。

(3)向上述混合液中加入2％的聚乙二醇，2％的脂肪酸甘油酯，所述％为质量百分含量。

(6)120℃灭酶并杀菌处理15分钟。

(7)控制湿度RH30％、温度30℃，干燥15h揭膜。

实施例8：乳清蛋白/多糖复合膜的制备流程

(1)称取乳清蛋白粉溶于超纯水中，配制成质量百分含量24％的乳清蛋白溶液；称取果胶溶于超纯水中，配制成质量百分含量为6％的果胶溶液；称取壳聚糖粉溶于1％的乳酸溶液，配制成质量百分含量为3％的壳聚糖溶液。

(2)上述乳清蛋白溶液、果胶溶液、壳聚糖溶液按照1:1:1的体积比混合。

(3)向上述混合液中加入2％的甘油，2％的烷基葡糖苷，所述％为质量百分含量。

(4)磁力搅拌使上述混合液充分溶解后，用NaOH或HCl溶液调节pH至6，加入热稳定重组细菌漆酶fmb-rL103，添加量优选10U/100mL成膜液。

(6)120℃灭酶并杀菌处理15分钟。

(7)控制湿度RH30％、温度30℃，干燥15h揭膜。

实施例9：蛋白/多糖复合膜性能的测定

膜感官指标的测定：感官评定膜的颜色，表面光滑度以及膜的黏性，是否易揭膜。

膜厚度(mm)的测定：在被测膜上随机(除膜的最边缘)取五个点，用电子数显卡尺测量其厚度，取其平均值并记录。

膜折痕(FM)的测定：将膜对折，依据折痕程度来判断膜的折痕，用0-4作为指标，0表示无折痕，1表示折痕轻微，2表示膜折痕明显，3表示膜对折后部分断裂，4表示膜对折的部分全部断裂。

透光率的测定：将试样裁成一定规格(0.8mm*4.5cm)的长方形，贴入比色皿的内光滑面，在500nm的波长下测定其透射比即透光率，以空比色皿作为对照。每个试样做2个平行。

膜水溶性测定：将膜样(2cm×2cm)在105℃条件下干燥至恒重,称重后根据干、湿重之差计算水分含量.将测定完水分含量的膜放入盛有30mL水的烧杯中,在室温下溶解24h,再将膜在 105℃条件下干燥至恒重,称重,根据两次干重之差计算水溶性.

水蒸气透过率测定:取直径3cm、深4cm的圆形敞口塑料杯,加入3g干燥的CaC1₂,将裁切成直径7cm的膜样品,盖住杯口,膜与杯之间的接口用石蜡封住。而后将各杯置于底部加入 1000mL的蒸馏水的干燥器中(25℃,相对湿度100％)。每12h称量1次,持续1周。通过杯重的增加量确定水蒸气的透过量。按ASTM方法(E96-93,1993)计算水蒸气转移速率(WVTR)和水蒸气透过率(WVP)。

机械性能测定：将薄膜裁剪成4cm*2cm规格的长条，并固定于物性仪上测定。设置物性仪两夹具的初始距离为20mm，速度为1mm/sec。测定结束后，记录膜拉断瞬间的力(g)和膜断裂时两夹具的距离L。每个试样取三个平行样品测定。

拉伸强度TS(g)：用膜拉断时瞬间的力表示拉伸强度。

断裂伸长率E(％)按下式计算：

E＝(L1－L0)/L0

式中：E—膜的断裂伸长率(％)；

L1—膜断裂时两夹夹具的距离(mm)；

L0—两夹具初始时的距离(mm)。

实施例10：热稳定重组细菌漆酶对蛋白/多糖复合膜性能的影响分析

添加热稳定重组细菌漆酶制备的鱼明胶蛋白/壳聚糖/果胶复合膜与未加酶制备复合膜的性能指标对比如表1。

对两种方法制备出的鱼明胶蛋白/壳聚糖/果胶复合膜进行电子扫描电镜分析与比较，如附图1所示，未添加热稳定重组细菌漆酶制备的复合膜在表面有裂痕出现。而添加酶制备的复合膜，未发现有裂痕出现的问题。

表1不同处理制备的鱼明胶蛋白/壳聚糖/果胶复合膜性能

添加热稳定重组细菌漆酶制备的大豆蛋白/壳聚糖/果胶复合膜与未加酶制备复合膜的性能指标对比如表2。

表2不同处理制备的大豆蛋白/壳聚糖/果胶复合膜性能

添加热稳定重组细菌漆酶制备的酪蛋白/壳聚糖/果胶复合膜与未加酶制备复合膜的性能指标对比如表3。

表3不同处理制备的酪蛋白/壳聚糖/果胶复合膜性能

添加热稳定重组细菌漆酶制备的乳清蛋白/壳聚糖/果胶复合膜与未加酶制备复合膜的性能指标对比如表4。

表4不同处理制备的乳清蛋白/壳聚糖/果胶复合膜性能

实施例11：复合膜对果蔬的保鲜应用

以鱼明胶蛋白/壳聚糖/果胶复合膜对草莓的保鲜效果为例进行说明。

草莓处理

选择大小一致，颜色一致，形状均匀，无缺缺陷和疾病的草莓装入保鲜盒中(每个保鲜盒装10颗)，对照组用非酶处理的复合膜密封，处理组用重组细菌漆酶催化的复合膜密封。然后放到RH50％，21℃的恒温恒湿箱中6天，每两天测一次生理生化指标。

草莓生理指标测定

草莓果实重量采用电子天平称量。SOD酶活性的测定采用试剂盒(WST-1法)进行；电导率采用电导仪测定法；维生素C含量测定采用2,6-二氯酚靛酚法；有机酸采用酸碱滴定法；草莓果实硬度的测定采用GY-1型手持式硬度计，单位为牛(N；kg/cm²)

草莓保鲜效果

不同组份和条件制备出的保鲜膜对草莓储藏6天的保鲜效果如表5所示。

表5可食性保鲜膜的对草莓的保鲜效果

从表5中储藏6天的草莓各项生理生化指标，可以看出用重组细菌漆酶处理的明胶蛋白/ 壳聚糖/果胶复合膜，对草莓储藏保鲜效果优于未经酶处理的复合膜。

实施例12：复合膜对肉制品的保鲜应用

以鱼明胶蛋白/壳聚糖/果胶复合膜对冷却肉的保鲜效果为例进行说明。

冷却肉处理

将冷鲜肉按照按照测定的标准精确称取，随机分成六组，将其中五组用不同的复合膜进行包裹处理，对照组用非酶处理的复合膜包裹，处理组用重组细菌漆酶催化的复合膜包裹，然后放置冰箱中进行储藏，储藏温度为4±0.5℃。每2d取样测定指标。

冷却肉菌落总数

参照GB 4789.2-2010食品安全国家标准，食品微生物学检验菌落总数测定中的方法测定。

挥发性盐基氮(TVB-N)

参照GB/T 5009.44-2003中的半微量定氮法测定。

硫代巴比妥酸反应物(TBARS)

称取5g样品加入15mL A液(称取75.0g三氯乙酸、1.0gEDTA和1.0g没食子酸丙酯，以ddH₂O定容至1L)，均质后过滤。吸取5.0mL滤液于具塞刻度试管中，加入5mL B液后混合均匀，于100℃沸水中反应40min，测定吸光度。对照丙二醛(MDA)标准曲线计算MDA 含量，TBARS值表示为mg MDA/kg。

pH值的测定

参照GB/T 9695.5—2008《肉与肉制品pH测定》进行测定。

冷却肉保鲜效果

不同组份和条件制备出的可食性保鲜膜对冷却肉储藏6天的保鲜效果如表6所示。

表6可食性保鲜膜对冷却肉的保鲜效果

从表6中储藏6天的冷却肉的各项品质指标，可以看出用重组细菌漆酶处理的明胶蛋白/ 壳聚糖/果胶复合膜，对冷却肉储藏保鲜效果优于未经酶处理的复合膜。

序列表

<110> 南京农业大学

泰兴市东圣生物科技有限公司

<120> 一种利用热稳定重组细菌漆酶制备蛋白/多糖复合膜的方法及其产品和应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1542

<212> DNA

<213> fmb-103(Bacillus vallismortis fmb-103)

<400> 1

atgacacttg aaaaatttgt ggatgctctc ccaatcccag atacactaaa gccagtgcag 60

caatcaaaag aaaaaacata ctacgaagtc accatggagg aatgcactca tcagcttcac 120

cgcgatctcc ctccgacccg cctgtggggc tacaacggct tatttccggg ccctaccatt 180

gaggttaaaa gaaatgaaaa tgtatatgtg aaatggatga ataatcttcc ttccacgcat 240

ttccttccgg ttgatcacac cattcatcac agtgacagcc agcatgaaga acccgaagta 300

aagactgttg ttcatttaca tggcggcgtc acgccagatg acagcgacgg gtatccggag 360

gcttggtttt ccaaagactt tgaacaaaca ggaccttatt tcaaaagaga ggtttatcat 420

tatcctaatc agcagcgcgg ggctatattg tggtatcacg atcacgccat ggcgctcacc 480

aggctaaatg tctatgccgg acttgtcggc gcttatatca ttcatgatcc aaaggaaaaa 540

cgcttaaagc tgccttcagg cgaatacgat gtgccgcttc ttatcacaga ccgcacgatc 600

aatgaggacg gttctttgtt ttatccgagc ggaccggaaa atccttctcc gtcactgcct 660

aatccttcaa tcgttccggc tttttgcgga gaaaccatac tcgtcaacgg gaaggtatgg 720

ccatacttgg aagtcgagcc gaggaaatac cgattccgcg tcatcaacgc ctccaatacc 780

agaacctata atctgtcact cgataatggc ggagagttta ttcaggtcgg ttcagatgga 840

gggctcctgc cgcgatctgt taaattgaat tctttcagtc ttgcgcctgc tgaacgttac 900

gatatcatca ttgacttcac agcgtatgaa ggagaatcga tcattttggc aaacagcgcg 960

ggctgcggcg gtgacgtcaa tcctgaaaca gatgcgaata tcatgcaatt caaagtcaca 1020

aaaccattag cgcaacaaga cgaaagcaga aagccgaagt acctcgcctc atacccttcc 1080

gtacagcatg aaagaataca aaacatcaga acactaaaac tggcaggaac ccaagacaaa 1140

tacggcagac ccgtccttct gcttaataac aaacgctggc acgatcctgt cacagaagca 1200

ccaaaagccg gcacaactga aatatggtcc attatcaacc cgacacgcgg aacacatccg 1260

attcacctgc atctggtctc cttccgtgta ttagaccggc gtccgtttga tatcgcccgt 1320

tatcaagaaa gcggggaatt gtcctatacg ggtccggcta tcccgccgcc gccaagtgaa 1380

aagggatgga aagacacaat tcaagcgcat gcgggtgaag tcctgagaat cgcggcgaca 1440

ttcgggccgt acagcggacg atacgtatgg cactgccata ttcttgaaca tgaggactac 1500

gacatgatga gaccgatgga tataactgat ccccataaat aa 1542

<210> 2

<211> 513

<212> PRT

<213> fmb-103(Bacillus vallismortis fmb-103)

<400> 2

Met Thr Leu Glu Lys Phe Val Asp Ala Leu Pro Ile Pro Asp Thr Leu

1 5 10 15

Lys Pro Val Gln Gln Ser Lys Glu Lys Thr Tyr Tyr Glu Val Thr Met

20 25 30

Glu Glu Cys Thr His Gln Leu His Arg Asp Leu Pro Pro Thr Arg Leu

35 40 45

Trp Gly Tyr Asn Gly Leu Phe Pro Gly Pro Thr Ile Glu Val Lys Arg

50 55 60

Asn Glu Asn Val Tyr Val Lys Trp Met Asn Asn Leu Pro Ser Thr His

65 70 75 80

Phe Leu Pro Val Asp His Thr Ile His His Ser Asp Ser Gln His Glu

85 90 95

Glu Pro Glu Val Lys Thr Val Val His Leu His Gly Gly Val Thr Pro

100 105 110

Asp Asp Ser Asp Gly Tyr Pro Glu Ala Trp Phe Ser Lys Asp Phe Glu

115 120 125

Gln Thr Gly Pro Tyr Phe Lys Arg Glu Val Tyr His Tyr Pro Asn Gln

130 135 140

Gln Arg Gly Ala Ile Leu Trp Tyr His Asp His Ala Met Ala Leu Thr

145 150 155 160

Arg Leu Asn Val Tyr Ala Gly Leu Val Gly Ala Tyr Ile Ile His Asp

165 170 175

Pro Lys Glu Lys Arg Leu Lys Leu Pro Ser Gly Glu Tyr Asp Val Pro

180 185 190

Leu Leu Ile Thr Asp Arg Thr Ile Asn Glu Asp Gly Ser Leu Phe Tyr

195 200 205

Pro Ser Gly Pro Glu Asn Pro Ser Pro Ser Leu Pro Asn Pro Ser Ile

210 215 220

Val Pro Ala Phe Cys Gly Glu Thr Ile Leu Val Asn Gly Lys Val Trp

225 230 235 240

Pro Tyr Leu Glu Val Glu Pro Arg Lys Tyr Arg Phe Arg Val Ile Asn

245 250 255

Ala Ser Asn Thr Arg Thr Tyr Asn Leu Ser Leu Asp Asn Gly Gly Glu

260 265 270

Phe Ile Gln Val Gly Ser Asp Gly Gly Leu Leu Pro Arg Ser Val Lys

275 280 285

Leu Asn Ser Phe Ser Leu Ala Pro Ala Glu Arg Tyr Asp Ile Ile Ile

290 295 300

Asp Phe Thr Ala Tyr Glu Gly Glu Ser Ile Ile Leu Ala Asn Ser Ala

305 310 315 320

Gly Cys Gly Gly Asp Val Asn Pro Glu Thr Asp Ala Asn Ile Met Gln

325 330 335

Phe Lys Val Thr Lys Pro Leu Ala Gln Gln Asp Glu Ser Arg Lys Pro

340 345 350

Lys Tyr Leu Ala Ser Tyr Pro Ser Val Gln His Glu Arg Ile Gln Asn

355 360 365

Ile Arg Thr Leu Lys Leu Ala Gly Thr Gln Asp Lys Tyr Gly Arg Pro

370 375 380

Val Leu Leu Leu Asn Asn Lys Arg Trp His Asp Pro Val Thr Glu Ala

385 390 395 400

Pro Lys Ala Gly Thr Thr Glu Ile Trp Ser Ile Ile Asn Pro Thr Arg

405 410 415

Gly Thr His Pro Ile His Leu His Leu Val Ser Phe Arg Val Leu Asp

420 425 430

Arg Arg Pro Phe Asp Ile Ala Arg Tyr Gln Glu Ser Gly Glu Leu Ser

435 440 445

Tyr Thr Gly Pro Ala Ile Pro Pro Pro Pro Ser Glu Lys Gly Trp Lys

450 455 460

Asp Thr Ile Gln Ala His Ala Gly Glu Val Leu Arg Ile Ala Ala Thr

465 470 475 480

Phe Gly Pro Tyr Ser Gly Arg Tyr Val Trp His Cys His Ile Leu Glu

485 490 495

His Glu Asp Tyr Asp Met Met Arg Pro Met Asp Ile Thr Asp Pro His

500 505 510

Lys

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgacacttg aaaaatttgt ggatgc 26

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttatttatgg ggatcagtta tatc 24

<210> 5

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cgcgagctca tgacacttga aaaatttgtg gatgc 35

<210> 6

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ccgctcgagt tatttatggg gatcagttat atc 33

Claims

1.一种利用热稳定重组细菌漆酶制备蛋白/多糖复合膜的方法，其特征在于该复合膜主要通过以下步骤制备得到：将蛋白、果胶、壳聚糖、增塑剂、表面活性剂溶解于水中共混，加入热稳定重组细菌漆酶，制备得到成膜液，成膜液pH为5.5-6.5，超声脱气，倒入聚四氟乙烯板，60-90℃酶催化交联反应10-20分钟；100℃-120℃灭酶并杀菌处理10-20分钟；控制湿度、温度干燥后揭膜；

2.根据权利要求1所述的利用热稳定重组细菌漆酶制备蛋白/多糖复合膜的方法，其特征在于酶催化交联反应温度为80-90℃。

3.根据权利要求1所述的利用热稳定重组细菌漆酶制备蛋白/多糖复合膜的方法，其特征在于所述的蛋白选自鱼、猪或牛来源的明胶蛋白、大豆蛋白、酪蛋白、乳清蛋白中的任意一种。

4.根据权利要求1所述的利用热稳定重组细菌漆酶制备蛋白/多糖复合膜的方法，其特征在于所述的增塑剂选自甘油、山梨醇、聚乙二醇中的任意一种。

5.根据权利要求1所述的利用热稳定重组细菌漆酶制备蛋白/多糖复合膜的方法，其特征在于所述的表面活性剂选自吐温80、司盘、烷基葡糖苷、脂肪酸甘油酯中的任意一种。

6.根据权利要求1所述的利用热稳定重组细菌漆酶制备蛋白/多糖复合膜的方法，其特征在于所述的重组细菌漆酶为热稳定的重组死亡谷芽孢杆菌漆酶，该重组细菌漆酶通过如下方法制备：

(1)以保藏号为CGMCC No.6198的死亡谷芽孢杆菌fmb-103基因组DNA为模板，序列为SEQ ID NO.3的上游引物和序列为SEQ ID NO.4的下游引物PCR扩增含有SacI和XhoI酶切位点的漆酶基因序列；

(4)将诱导表达收集到的菌体，用磷酸缓冲液重悬菌体，超声波破碎菌体，4℃，10 000×g离心10min，收集上清液作为粗酶液，将处理得到的粗酶液按照Ni-NTA His Tag Kit说明书进行纯化。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的利用热稳定重组细菌漆酶制备蛋白/多糖复合膜的方法，其特征在于包含如下步骤：将壳聚糖溶解于1wt％的酸溶液中，所述的酸溶液选自盐酸、醋酸、乳酸、苹果酸或柠檬酸中的一种或多种酸溶液；蛋白质、果胶分别通过水溶解；三种溶液混合，加入增塑剂、表面活性剂及重组细菌漆酶得成膜液，成膜液pH用NaOH或HCl溶液调节至5-8，超声脱气后，倒入聚四氟乙烯板，60-90℃酶催化交联反应10-20分钟；100℃-120℃灭酶并杀菌处理10-20分钟；控制湿度RH30％-50％、温度20-30℃，干燥12-18h揭膜。

8.按照权利要求1-6中任一项所述的方法制备的热稳定重组细菌漆酶制备蛋白/多糖复合膜。

9.权利要求8所述的热稳定重组细菌漆酶制备蛋白/多糖复合膜在食品保鲜中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于将权利要求8所述的热稳定重组细菌漆酶制备蛋白/多糖复合膜包裹果蔬、肉制品，达到保鲜效果；或将成膜液直接涂于果蔬、肉制品表面，达到保鲜效果。