CN109096381A - 一种从桑条吐精炼液中提取丝胶蛋白的方法及超滤膜装置 - Google Patents

一种从桑条吐精炼液中提取丝胶蛋白的方法及超滤膜装置 Download PDF

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Abstract

本发明提出了一种从桑条吐精炼液中提取丝胶蛋白的方法及超滤膜装置,方法包括以下步骤:(1)将桑条吐精炼液依次通过三种不同孔径的振动筛进行预处理,获得过滤液;(2)将步骤(1)中得到的过滤液采用超滤膜进行精除渣,收集渗透液,透过液流量为180L/h·m2,压力0.25MPa,温度27℃‑32℃;(3)将步骤(2)中的渗透液采用纳滤膜浓缩,透过液流量为300L/h·m2,压力0.45‑0.55MPa,温度27℃‑35℃,再用无离子水反复洗涤浓缩2‑3h,最后浓缩至渗透液总体积的10%以下,收集浓缩液;(4)将步骤(3)中的浓缩液进行喷雾干燥处理得到丝胶蛋白。本发明丝胶蛋白回收率高、提取丝胶蛋白分子量确定且有利于丝胶蛋白开发的方法。

Description

一种从桑条吐精炼液中提取丝胶蛋白的方法及超滤膜装置
技术领域
本发明涉及丝胶蛋白的生产技术领域,特别是指一种从桑条吐精炼液中提取丝胶蛋白的方法及超滤膜装置。
背景技术
缫丝厂抽取获得的蚕丝称为桑条吐,做为绢纺行业的原材料,桑条吐主要有丝素和丝胶两部分构成,丝素为绢纺厂制备丝织品的目标物,而丝胶不利于丝织品的深加工,因此丝胶通常要被脱除。丝胶被覆于丝素表面,约占茧层质量的25%,对丝素起到保护和胶粘作用,除含少量蜡质、碳水化合物、色素和无机成分外,主要成分为丝胶蛋白。丝胶是一种球状蛋白质,相对分子量为1.4-100KD(D为道尔顿)不等,且随脱胶方法的不同而异。丝胶蛋白具有胶体的性质,等电点为3.8—4.5,易溶、吸水、凝胶化、可变性和抗氧化等特性,在化妆品、医药和生物材料等方面具有良好的开发潜能。长期以来,人们对丝素的研究利用较多,而对丝胶利用很少,因而在绢纺行业内,丝胶则随废水放排,不仅导致丝胶流失,而且造成环境污染,因此,如何将丝胶蛋白这一天然资源回收利用,变废为宝,是蚕丝业界迫切需要解决的一个问题。
通常,人们提取丝胶的方法有:酸析法、化学混凝法、离心法、超滤法、冷冻法,酸析法回收率不高,大约40%左右,而且对设备耐酸性较高,且丝胶中含有HCl或NaCl等,用做医用原料受到限制;化学混凝法和离心法回收丝胶纯度和回收率不高,且回收的丝胶分子量范围广,不利于丝胶的利用;冷冻法耗能较多,回收成本高。超滤法可选择不同的膜孔径,对丝胶蛋白进行选择性过滤回收,回收纯度高,回收率高,但是设备成本高,需要定期对过滤膜进行清洗和更换。
CN104558136A公开了一种从缫丝废水中获得丝胶蛋白的方法,在缫丝废水中通过膜过滤技术洗滤纯化,然后浓缩干燥,提取了丝胶蛋白。该方法是采用6000—100000和1000-6000的超滤膜配合过滤,最后浓缩干燥,此方法虽然能够得到丝胶蛋白,但是整个流程过于简单,没有对丝胶废液进行预处理即过滤较大的杂质,一方面会使设备受损,超滤膜易堵塞,增加了生产成本,另一方面丝胶浓缩液中的较大杂质因无法透过超滤膜而被浓缩干燥,得到的丝胶中含有杂质,导致丝胶使用级别降低,限制了丝胶蛋白产品的开发,对于做成不同功能的丝胶产品很不利。
发明内容
本发明提出一种从桑条吐精炼液中提取丝胶蛋白的方法及超滤膜装置,该方法丝胶蛋白回收率高、提取丝胶蛋白分子量确定且有利于丝胶蛋白开发的方法。
本发明的技术方案是这样实现的:一种从桑条吐精炼液中提取丝胶蛋白的方法,包括以下步骤:
(1)将桑条吐精炼液依次通过三种不同孔径的振动筛进行预处理,获得过滤液;
(2)将步骤(1)中得到的过滤液采用超滤膜进行精除渣,收集渗透液,透过液流量为180L/h·m2,压力0.25MPa,温度27℃-32℃;
(3)将步骤(2)中的渗透液采用纳滤膜浓缩,透过液流量为300L/h·m2,压力0.45-0.55MPa,温度27℃-35℃,再用无离子水反复洗涤浓缩2-3h,最后浓缩至渗透液总体积的10%以下,收集浓缩液;
(4)将步骤(3)中的浓缩液进行喷雾干燥处理得到丝胶蛋白。
进一步地,步骤(1)中桑条吐精炼液依次通过300目、500目和800目的振动筛进行预处理,去除精炼废水中粒径较大的杂质。
进一步地,步骤(2)中采用的是截留分子量为40000D的超滤膜进行精除渣,同时截留分子量大于40KD的丝胶蛋白到浓缩液中,最后浓缩至过滤液总体积的10%以下,收集渗透液,步骤(3)中采用的是截留分子量为8000D的纳滤膜。
进一步地,步骤(2)中的浓缩液加入木瓜蛋白酶和无离子水,浓缩液与木瓜蛋白酶和无离子水的质量比为100:0.2-0.5:800,在55-65℃下酶解40-55min,然后升温至90-95℃进行加热杀酶,然后冷却至27℃-32℃,将酶解溶液依次进行步骤(2)、(3)和(4)。
进一步地,步骤(3)中的渗透液经过活性炭吸附,达到排放标准。
一种用于上述的一种从桑条吐精炼液中提取丝胶蛋白的方法的超滤膜装置,包括陶瓷膜组件,陶瓷膜组件包括两组串联的陶瓷膜组件一和陶瓷膜组件二,陶瓷膜组件一和陶瓷膜组件二均包括两个并联的陶瓷膜管,陶瓷膜管的原液进口和浓液出口之间设置有多个交替连接的第一陶瓷膜管和第二陶瓷膜管,第二陶瓷膜管的直径小于第一陶瓷膜管,第二陶瓷膜管与第一陶瓷膜管一体成型,陶瓷膜壁厚度相同。
进一步地,超滤膜装置还包括过滤液桶、浓缩液桶和渗透液桶,过滤液桶和陶瓷膜组件一之间设置有第一供料泵,陶瓷膜组件二的浓液出口设置有浓液输送管,浓液输送管通过控制阀分别与循环管一、循环管二和排污管相连,循环管一和过滤液桶相连,循环管二与浓缩液桶相连,浓缩液桶和过滤液通之间设置有第二供料泵,陶瓷膜组件一和陶瓷膜组件二上均设置有清液出口,清液出口与渗透液桶相连。
进一步地,超滤膜装置还包括反冲罐,反冲罐的反冲输液管与清液出口相连,清液出口处设置有导流装置,导流装置包括环形管和设置于环形管下端的锥形导流罩,锥形导流罩内设置有斜向下的导流槽。
本发明的有益效果:本发明所采用的丝胶回收技术,首先经过振动筛预处理出渣和采用截留分子量为40000的超滤膜精出渣,能完全去除丝胶废液中颗粒较大的残渣,其次采用截留分子量为40000的超滤膜截留分子量为40KD以上的丝胶蛋白,而40KD以下的丝胶蛋白则透过超滤膜,获得渗透液,最后再用截留分子量为8000的纳滤膜浓缩渗透液,将浓缩后的渗透液洗涤纯化和喷雾干燥得到分子量为8KD—40KD的丝胶蛋白,采用该方法丝胶蛋白回收率高,提取过程中零添加,且得到的丝胶蛋白分子量范围较小,有利于丝胶产品的开发。
本发明对于含有40KD以上丝胶蛋白的浓缩液采用木瓜蛋白酶进行酶解,获得主要分子量在40KD以下的丝胶蛋白溶液,然后再进行超滤膜、纳滤膜和喷雾干燥获得丝胶蛋白,该种方法获得的丝胶蛋白含有微量的木瓜蛋白酶,可用于化妆品等开发利用,进一步提高了丝胶蛋白的回收利用率,减少了丝胶蛋白的流失。
本发明的超滤膜装置用于步骤(2)中,超滤膜装置采用陶瓷膜组件一和陶瓷膜组件二串联,丝胶蛋白过滤液经陶瓷膜组件一后,进入陶瓷膜组件二,并由陶瓷膜组件二的浓液出口回到过滤液桶,重新进行过滤,整体形成一个返回循环的体系,达到动态透析的目的。陶瓷膜管的原液进口和浓液出口之间设置多个交替连接的第一陶瓷膜管和第二陶瓷膜管,第二陶瓷膜管的直径小于第一陶瓷膜管,第二陶瓷膜管与第一陶瓷膜管一体成型,陶瓷膜壁厚度相同,对减缓液体流动的速度形成了多级障碍,增加液体在膜筒内的停留时间,增强渗透分离效果,减少循环的次数,而且陶瓷膜壁的厚度相同,液体从膜内到膜外的距离相同,避免在调整膜筒孔径的同时,增加了液体横向渗透的距离,从而减弱渗透的效果。
本发明通过导流装置将反冲液体从水平转换成竖向,避免反冲风带动清洗液对清液出口处的陶瓷膜管造成大的冲击,从而损伤膜管;通过环形管和锥形导流罩的配合,将反冲风及清洗液均布在陶瓷膜的周围,并沿陶瓷膜向下,同时第一陶瓷膜筒、第二陶瓷膜管与壳体之间水平距离不同,第一陶瓷膜管和壳体之间,因水平距离小,增大了反冲风及清洗液的反向渗透陶瓷膜管的压力,增强清洗效果,第二陶瓷膜管与壳体水平距离大,且在壳体外表面形成的环形凹槽,具有导向和汇聚反冲风及清洗液的作用,在反向清洗过程中,形成了汇聚-增压冲洗的循环过程,避免清洗液向下流动过快,以及反冲风及清洗液向下反冲力降低的问题,整体增强了反清洗的效果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例一丝胶蛋白电泳图谱;
图2为实施例二丝胶蛋白电泳图谱;
图3为超滤膜的结构示意图;
图4为陶瓷膜管的结构示意图;
图5为导流装置的结构示意图;
图6为壳体结构示意图。
陶瓷膜组件一1,陶瓷膜组件二2,壳体3,第一陶瓷膜管5,第二陶瓷膜管6,过滤液桶7,浓缩液桶8,渗透液桶9,原液供管10,原液输送管11,第一供料泵12,浓液输送管13,旁通管14,循环管一16,循环管二17,排污管18,浓液流量计19,第一供料管20,第二供料管21,循环管三22,第二供料泵23,清液输送管24,清液流量计25,导流装置26,环形管27,锥形导流罩28,导流槽29,反冲罐30,进气管31,排气管32,气压计33,反冲输液管34。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例一
一种从桑条吐精炼液中提取丝胶蛋白的方法,包括以下步骤:
(1)将桑条吐精炼液依次通过300目、500目和800目的振动筛进行预处理,去除精炼废水中粒径较大的杂质,获得过滤液;
(2)将步骤(1)中得到的过滤液采用的是截留分子量为40000D的超滤膜进行精除渣,同时截留分子量大于40KD的丝胶蛋白到浓缩液中,最后浓缩至过滤液总体积的10%,收集渗透液,透过液流量为180L/h·m2,压力0.25MPa,温度27℃-32℃;
(3)将步骤(2)中的渗透液采用截留分子量为8000D的纳滤膜浓缩,透过液流量为300L/h·m2,压力0.45-0.55MPa,温度27℃-35℃,再用无离子水反复洗涤浓缩2-3h,最后浓缩至渗透液总体积的10%,收集浓缩液;
(4)将步骤(3)中的浓缩液进行喷雾干燥处理得到丝胶蛋白。
其中,步骤(3)中的渗透液通过活性炭吸附过滤。
实施例一获得丝胶蛋白的质量质量检测委托谱尼测试机构进行检验,检验方法均按照食品和药品国标检测方法质检:
1)丝胶蛋白的性状:白色至微黄色微末;
2)溶解性:易溶于水;
3)总氮量:按照GB5009.5-2016测试总氮量,丝胶蛋白的总氮量为15.25%,高于已有文献报道的13.5%,接近一般纯蛋白质的含氮量平均16%;
4)干燥失重:按照2015版药典四部通则0831进行测试,丝胶蛋白的干燥失重为5.26%,接近已有文献报道值5%,符合化妆品卫生标准。
5)炽灼残渣:按照2015版药典四部通则0841进行测试,丝胶蛋白的炽灼残渣为3.5%,低于已有文献报道值5%,符合化妆品卫生标准。
所述已有文献指的是朱良均,张海萍,等.丝素、丝胶质量指标的研究.蚕业科学.2005,31(3);化妆品卫生标准指的是郝熤,李子健,蔡同一,等.保健(功能)食品通用标准GB16740-1997(S).北京:中国标准出版社,1997.4。
6)按照GB5009.124-2003进行氨基酸分析,丝胶蛋白中氨基酸种类及含量检测见下表,由下表可知,丝氨酸的含量为27%左右,含量最高,说明提取的蛋白质为丝胶蛋白:
氨基酸种类 样品1 样品2
天门冬氨酸 15.91 15.68
苏氨酸 7.41 6.67
丝氨酸 27.00 27.52
谷氨酸 5.94 6.88
脯氨酸 0.78 0.73
甘氨酸 7.29 7.10
丙氨酸 3.18 3.49
缬氨酸 2.73 2.91
蛋氨酸 0 0.10
异亮氨酸 0.59 1.09
亮氨酸 0.90 1.55
酪氨酸 2.58 2.89
苯丙氨酸 0.62 0.61
组氨酸 1.72 1.13
赖氨酸 1.24 1.62
精氨酸 3.96 3.84
色氨酸 0.116 0.118
胱氨酸 0.07
7)重金属含量
按照GB5009.17-2014进行汞含量的检测,按照GB5009.12-2017进行铅含量的检测,检测结果如下:检测丝胶蛋白中汞含量为0.001mg/kg、铅含量0.01mg/kg,均符合食品卫生标准。
8)微生物指标
按照GB4789.2-2010进行微生物检测,按照GB4789.3-2010进行大肠杆菌检测,按照GB4789.10-2010进行致病菌检测,检测结果如下:丝胶蛋白微生物指标为<100cfu/100g、大肠菌群<10cfu/100g和未检测出致病菌,均符合食品卫生标准。
9)分子量
采用30%的分离胶及4%的浓缩胶,做SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,如图1所示,条带1为分子量40KD以上丝胶蛋白的电泳带,条带2-4为分子量8KD-40KD之间丝胶蛋白的电泳带,可确定运用该方法提取丝胶蛋白的分子量为8KD-40KD。
实施例二
本实施例与实施例一基本相同,不同之处在于:步骤(2)中的浓缩液加入木瓜蛋白酶和无离子水,浓缩液与木瓜蛋白酶和无离子水的质量比为100:0.4:800,在55-65℃下酶解40-55min,然后升温至90-95℃进行加热杀酶,然后冷却至27℃-32℃,将酶解溶液依次进行步骤(2)、(3)和(4),获得丝胶蛋白粉末。
采用12%的分离胶,进行电泳测试,见图2所示,条带1为分子量40KD以上丝胶蛋白的电泳带,条带2-5为用木瓜蛋白酶水解分子量40KD以上丝胶蛋白后的电泳带,可确定经实施例一步骤(2)超滤膜进行精除渣后,浓缩液中的丝胶蛋白分子量为40KD以上,采用木瓜蛋白酶水解,获得丝胶蛋白的分子量主要集中于14.4-40KD之间,通过该方法可以进行水解后丝胶蛋白的回收。
实施例三
本实施例与实施例二基本相同,不同之处在于:浓缩液与木瓜蛋白酶和无离子水的质量比为100:0.5:800。
实施例四
本实施例与实施例二基本相同,不同之处在于:浓缩液与木瓜蛋白酶和无离子水的质量比为100:0.2:800。
实施例五
如图3-6所示,超滤膜装置包括陶瓷膜组件,陶瓷膜组件包括两组串联的陶瓷膜组件一1和陶瓷膜组件二2,陶瓷膜组件一1和陶瓷膜组件二2均包括两个并联壳体3,壳体3内设置有竖向的陶瓷膜管,陶瓷膜管的原液进口和浓液出口之间设置有多个交替连接的第一陶瓷膜管5和第二陶瓷膜管6,第二陶瓷膜管6的直径小于第一陶瓷膜管5,第二陶瓷膜管6的长度小于第一陶瓷膜管5,第二陶瓷膜管6与第一陶瓷膜管5一体成型,陶瓷膜壁厚度相同。
超滤膜装置还包括过滤液桶7、浓缩液桶8和渗透液桶9,过滤液桶7的进液口处设置有原液供管10,过滤液桶7的下端和陶瓷膜组件一1的原液进口之间设置有原液输送管11,原液输送管11上设置有第一供料泵12,陶瓷膜组件一1的浓液出口和陶瓷膜组件二2的原液进口相连,陶瓷膜组件二2的浓液出口设置有浓液输送管13,原液输送管11和浓液输送管13之间设置有旁通管14,旁通管14上设置有控制阀,浓液输送管13通过控制阀分别与循环管一16、循环管二17和排污管18相连,控制阀为手动阀或者电磁阀,循环管一16的出料口和过滤液桶7的上端相连,循环管一16上设置有浓液流量计19,循环管二17的出料口与浓缩液桶8的上端相连,浓缩液桶8的上端设置有第一供料管20和第二供料管21,浓缩液桶8为搪瓷反应釜,浓缩液桶8下端设置有循环管三22,循环管三22通过第二供料泵23与循环管一16相连,陶瓷膜组件一1和陶瓷膜组件二2的壳体3上部均设置有清液出口,清液出口通过清液输送管24与渗透液桶9相连,且清液输送管24上设置有清液流量计25。
清液出口处设置有导流装置26,导流装置26包括环形管27和设置于环形管27下端的锥形导流罩28,锥形导流罩28内设置有斜向下的导流槽29,超滤膜装置还包括反冲罐30,反冲罐30的上端通过控制阀分别连接有进气管31和排气管32,进气管31上设置有气压计33,进气管31与气泵相连,反冲罐30的下端连接有反冲输液管34,反冲输液管34的出液口与环形管27相连。
本实施例的使用方法:超滤膜装置用于步骤(2)中,经振动筛后获得的过滤液进入过滤液桶7内,过滤液通过第一供料泵12进入陶瓷膜组件一1后,进入陶瓷膜组件二2,并由陶瓷膜组件二2的浓液出口通过浓液输送管13和循环管一16回到过滤液桶7,重新进行渗透分离,陶瓷膜组件一1和陶瓷膜组件二2过滤获得渗透液通过导流装置26进入渗透液桶9,观察浓液流量计19和清液流量计25,当浓缩液无需再进行渗透分离时,关闭循环管一16的控制阀,打开循环管二17的控制阀,浓缩液经浓液输送管13和循环管二17进入浓缩液桶8,通过第一供料管20向浓缩液桶8内加入木瓜蛋白酶,通过第二供料管21向浓缩液桶8内加入无离子水,酶解完成后,通过第二送料泵送至过滤液桶7内重复上述渗透分离过程,观察浓液流量计19和清液流量计25,当该次浓缩液无需再进行渗透分离时,关闭循环管一16和循环管二17的控制阀,打开排污管18的控制阀。当需要进行陶瓷膜管反冲清洗时,向反冲罐30中加入清洗液,打开进气管31的控制阀,反冲气带动清洗液经经导流装置26流向壳体3内,进行陶瓷膜管的反冲清洗,反冲风和清洗液反冲进入陶瓷管内,陶瓷膜组件一1的反冲风和清洗液由陶瓷膜管下端的原液进口进入原液输送管11,并经旁通管14进入浓液输送管13,陶瓷膜组件二2的反冲风和清洗液由陶瓷膜管下端的浓液出口进入浓液输送管13,最终由排污管18排出。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种从桑条吐精炼液中提取丝胶蛋白的方法,其特征在于:包括以下步骤:
(1)将桑条吐精炼液依次通过三种不同孔径的振动筛进行预处理,获得过滤液;
(2)将步骤(1)中得到的过滤液采用超滤膜进行精除渣,收集渗透液,透过液流量为180L/h·m2,压力0.25MPa,温度27℃-32℃;
(3)将步骤(2)中的渗透液采用纳滤膜浓缩,透过液流量为300L/h·m2,压力0.45-0.55MPa,温度27℃-35℃,再用无离子水反复洗涤浓缩2-3h,最后浓缩至渗透液总体积的10%以下,收集浓缩液;
(4)将步骤(3)中的浓缩液进行喷雾干燥处理得到丝胶蛋白。
2.根据权利要求1所述的一种从桑条吐精炼液中提取丝胶蛋白的方法,其特征在于:步骤(1)中桑条吐精炼液依次通过300目、500目和800目的振动筛进行预处理,去除精炼废水中粒径较大的杂质。
3.根据权利要求1所述的一种从桑条吐精炼液中提取丝胶蛋白的方法,其特征在于:步骤(2)中采用的是截留分子量为40000D的超滤膜进行精除渣,收集渗透液,步骤(3)中采用的是截留分子量为8000D的纳滤膜。
4.根据权利要求1-3之一所述的一种从桑条吐精炼液中提取丝胶蛋白的方法,其特征在于:步骤(2)中的浓缩液中加入木瓜蛋白酶和无离子水,浓缩液、木瓜蛋白酶和无离子水的质量比为100:0.2-0.5:800,在55-65℃下酶解40-55min,然后升温至90-95℃进行加热杀酶,然后冷却至27℃-32℃,将酶解溶液依次进行步骤(2)、(3)和(4)。
5.根据权利要求4所述的一种从桑条吐精炼液中提取丝胶蛋白的方法,其特征在于:步骤(3)中的渗透液经过活性炭吸附。
6.一种用于权利要求1-5之一所述的一种从桑条吐精炼液中提取丝胶蛋白的方法的超滤膜装置,其特征在于:包括陶瓷膜组件,陶瓷膜组件包括两组串联的陶瓷膜组件一(1)和陶瓷膜组件二(2),陶瓷膜组件一(1)和陶瓷膜组件二(2)均包括两个并联的陶瓷膜管,陶瓷膜管的原液进口和浓液出口之间设置有多个交替连接的第一陶瓷膜管(5)和第二陶瓷膜管(6),第二陶瓷膜管(6)的直径小于第一陶瓷膜管(5),第二陶瓷膜管(6)与第一陶瓷膜管(5)一体成型,陶瓷膜壁厚度相同。
7.根据权利要求6所述的超滤膜装置,其特征在于:还包括过滤液桶(7)、浓缩液桶(8)和渗透液桶(9),过滤液桶(7)和陶瓷膜组件一(1)之间设置有第一供料泵(12),陶瓷膜组件二(2)的浓液出口设置有浓液输送管(13),浓液输送管(13)通过控制阀分别与循环管一(16)、循环管二(17)和排污管(18)相连,循环管一(16)和过滤液桶(7)相连,循环管二(17)与浓缩液桶(8)相连,浓缩液桶(8)和过滤液通之间设置有第二供料泵(23),陶瓷膜组件一(1)和陶瓷膜组件二(2)上均设置有清液出口,清液出口与渗透液桶(9)相连。
8.根据权利要求6或7所述的超滤膜装置,其特征在于:还包括反冲罐(30),反冲罐(30)的反冲输液管(34)与清液出口相连,清液出口处设置有导流装置(26),导流装置(26)包括环形管(27)和设置于环形管(27)下端的锥形导流罩(28),锥形导流罩(28)内设置有斜向下的导流槽(29)。
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