CN109091677B - 一种cRGDfK多肽修饰的共载VP和AQ4N的多功能隐形纳米粒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种cRGDfK多肽修饰的共载VP和AQ4N的多功能隐形纳米粒及其应用，所述隐形纳米粒由氧化石墨烯、cRGDfK多肽、光敏剂维替泊芬和缺氧活化的前药AQ4N组成。本发明利用肿瘤血管靶向光动力治疗后诱发的肿瘤组织缺氧状态，将缺氧活化前药共同递送，利用缺氧环境进一步杀伤残余肿瘤细胞。本发明的cRGDfK‑pGO‑VP‑AQ4N纳米粒载药量高，靶向性强，对肿瘤细胞的杀伤作用及抗肿瘤作用显著增强。

Description

一种cRGDfK多肽修饰的共载VP和AQ4N的多功能隐形纳米粒及 其应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体地说，是一种cRGDfK多肽修饰的共载VP和AQ4N的多功能隐形纳米粒及其制备方法和应用。
背景技术
光动力治疗作为一种已经转化于临床应用的光触发肿瘤治疗手段，因具有微创性、独特的选择性和安全性而备受瞩目。其主要原理是将光敏剂高效的导入肿瘤细胞中，给予特定波长的光源照射病灶区，使组织吸收的光敏剂受到激发，产生活性氧以造成肿瘤细胞死亡、微血管损伤及诱导局部免疫等反应。据报道，肿瘤早期阶段采用光动力治疗可获得治愈，对于已失去手术机会的患者，光动力治疗也可显著延长生存期和改善生活质量。光动力治疗的原理在于肿瘤组织摄取光敏剂后，经特定波长和强度的激光照射，在分子氧的参与下发生光化学反应，产生单线态氧等活性氧，借以通过凋亡、坏死或自噬相关的细胞死亡直接杀伤肿瘤细胞；通过抗血管作用，引发肿瘤微血管损伤和微循环障碍，导致肿瘤组织缺氧坏死；诱导局部和全身的抗肿瘤免疫反应。
近些年来，光动力治疗的抗肿瘤血管作用受到了高度关注，一些研究探索通过血管靶向光动力治疗实现对肿瘤的有效控制，有的已进入临床试验阶段，然而血管靶向光动力治疗策略仍存在诱发和加重肿瘤组织缺氧应激的瓶颈有待进一步突破，进一步探索优化血管靶向光动力治疗新策略具有重要的研究价值。石墨烯属于富勒烯，是由碳原子以sp2方式杂化而成的具有二维蜂窝状片层结构的纳米材料，其厚度仅为0.335nm。目前研究较多的通常为石墨烯的衍生物-氧化石墨烯(graphene oxide，GO)。GO是石墨烯的氧化产物，含有大量的羟基、羧基和环氧基团，这些含氧活性基团的引入不仅使用其拥有良好的水溶性和稳定性，而且可使GO更易于修饰而具有功能化作用。除此之外，GO两面均具有芳香结构，且比表面积较大，可通过π—π共轭、氢键和疏水效应等非共价键与单链DNA和RNA以及芳香类药物分子如阿霉素(doxorubicin,DOX)、喜树碱(camptothecin,CPT)及衍生物等结合，Go被广泛应用于生物医学领域。整合素是一类细胞膜表面糖蛋白受体家族分子，由a、β两个亚基通过非共价键连接而成的异二聚体蛋白质，主要介导细胞与细胞之间及细胞与细胞外间质之间的黏附。目前研究发现受体家族包括至少18个a亚单位和9个β亚单位，共同组成超过25种不同的整合素。a、β两种亚基均由长的胞外段(氨基端)、跨膜段、短的胞内段(羧基端)三部分组成。a亚基的胞外段识别ECM的RGD序列(Arg-Gly-Asp，精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)介导细胞与ECM之间的黏附；β亚基的胞内段与细胞骨架相连。整合素参与构成的ECM，广泛影响细胞的生长、生存、增殖、分化、侵袭和转移等生物学行为。中国专利201410783149.1公开了一种葡聚糖/阿霉素键合药纳米粒及其制备方法，以抗肿瘤药物阿霉素作为疏水段，以未键合的葡聚糖链作为亲水段，通过自组装形成具有pH值敏感性的葡聚糖-阿霉素键合药纳米粒，并引入cRGDfk使纳米粒具有主动靶向的功能，提高药物的传递效率。AQ4N是一种专门针对肿瘤细胞内低氧状态设计的新型前药，为蓝色无味粉末，属烷基苯胺蒽醌类化合物，本身跟DNA结合力差，不管是体内还是体外都不能抑制拓扑异构酶II，而其被CYP450代谢产生毒性代谢产物AQ4是拓扑异构酶II的强抑制剂，是AQ4N本身的毒性作用至少100倍，所以AQ4N被称为抗肿瘤前药。
利用肿瘤血管靶向光动力治疗后诱发的肿瘤组织缺氧状态，将缺氧活化前药共同递送，可利用缺氧环境进一步杀伤残余肿瘤细胞，达到增强疗效的作用；另一方面，肿瘤缺氧诱导因子HIF-1α是肿瘤组织缺氧环境下的重要产物，会对肿瘤组织内相关下游信号通路产生重要作用，严重损害了光动力治疗后患者的预后。因此，理论上可以构建集肿瘤血管靶向光动力治疗与缺氧活化前药(AQ4N)双模式治疗纳米药物系统。其中肿瘤血管靶向光动力治疗与缺氧活化前药双模式纳米给药系统具体思路如下：以氧化石墨烯(graphene oxide，GO)为载体，cRGDfK多肽为靶向配体，光敏剂维替泊芬(VP)和缺氧活化的前药AQ4N为模型药物，构建新型纳米药物-cRGDfK多肽修饰的共携载光敏剂VP和缺氧活化的前药AQ4N的多功能隐形纳米粒(cRGDfK-pGO-VP-AQ4N)，研究上述双模式治疗纳米药物系统治疗作用，为肿瘤靶向治疗提供新的治疗方案。
发明内容
本发明的第一个目的是针对现有技术中的不足，提供一种cRGDfK多肽修饰的共载VP和AQ4N的多功能隐形纳米粒。
本发明的第二个目的是针对现有技术中的不足，提供如上所述的多功能隐形纳米粒的用途。
为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：
一种cRGDfK多肽修饰的共载VP和AQ4N的多功能隐形纳米粒，所述隐形纳米粒由氧化石墨烯、cRGDfK多肽、光敏剂维替泊芬和缺氧活化的前药AQ4N组成。
进一步，所述的氧化石墨烯载有光敏剂维替泊芬和缺氧活化的前药AQ4N，所述的cRGDfK多肽修饰在隐性纳米粒表面上。
进一步，所述多功能隐形纳米粒制备方法如下：
(1)合成氧化石墨烯，在氧化石墨烯的悬浮液中加入NaOH，将GO上存在的酯基，羟基，环氧化物基团转化为羧基，浓盐酸调节GO溶液pH至1，双蒸水洗涤GO溶液至中性；
(2)用EDC、NHS催化，将8臂PEG氨基端与GO的羧基基团发生反应得到pGO；
(3)将VP和AQ4N依次加入pGO溶液中，通过π—π堆垛作用将具有芳环分子结构的VP和AQ4N依次装载于pGO表面得到pGO-VP-AQ4N；
(4)采用BS3催化，将cRGDfK多肽修饰于纳米粒表面，得到cRGDfK-pGO-VP-AQ4N。
进一步，所述VP、AQ4N和pGO质量比为0.5-1.5:0.8-1.5:4.5-10。
进一步，所述VP、AQ4N和pGO质量比为0.75:1:5。
进一步，所述催化剂、cRGDfK多肽和纳米粒pGO-VP-AQ4N质量比为3.5-5:0.3-0.8:5-8。
进一步，所述催化剂、cRGDfK多肽和纳米粒pGO-VP-AQ4N质量比为3.5:0.4:5。
进一步，所述VP载药量大于或等于7％，所述AQ4N载药量大于或等于35％。
为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：
如上任一所述多功能隐形纳米粒在制备治疗实体肿瘤疾病药物中的应用。
进一步，所述实体肿瘤为前列腺癌。
本发明优点在于：
1、本发明利用肿瘤血管靶向光动力治疗后诱发的肿瘤组织缺氧状态，将缺氧活化前药共同递送，利用缺氧环境进一步杀伤残余肿瘤细胞，增强疗效。
2、本发明的cRGDfK-pGO-VP-AQ4N具有较高的载药量，VP载药量最高达5.5％，AQ4N载药量最高达30％。
3、本发明的cRGDfK-pGO-VP-AQ4N对HUVEC和PC-3具有更强的体外靶向性，cRGDfK多肽提高HUVEC和PC-3细胞摄取纳米药物的能力。
5、在常氧条件下，纳米粒装载的AQ4N未表现出对HUVEC的毒性作用；缺氧条件下，纳米粒中装载的AQ4N被高效活化并可有效杀伤PC-3细胞，且靶向纳米粒对于PC-3的杀伤显著强于非靶向纳米粒，本发明纳米粒装载的AQ4N活化对PC-3细胞具有显著的杀伤作用。
4、本发明的cRGDfK-pGO-VP-AQ4N双靶向光动力治疗结合缺氧活化的AQ4N化疗显著抑制BALB/c裸鼠皮下PC-3人前列腺肿瘤的生长，抗肿瘤效果显著增强。
附图说明
图1为cRGDfK-pGO-VP-AQ4N原子力显微镜图像(A)，动态光散射粒径76nm(B)和zeta电位-21.3mv(C)。
图2为cRGDfK修饰介导HUVEC和PC-3细胞对纳米粒的靶向摄取。
图3为cRGDfK-pGO-VP靶向纳米粒光动力治疗显著抑制HUVEC和PC-3增殖。
图4为cRGDfK-pGO-VP-AQ4N在缺氧环境下AQ4N活化对PC-3细胞的杀伤作用。
图5为cRGDfK-pGO-VP-AQ4N双靶向光动力治疗结合缺氧活化的AQ4N化疗显著抑制BALB/c裸鼠皮下PC-3人前列腺肿瘤的生长。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
本发明构建新型纳米药物—cRGDfK多肽修饰的共携载光敏剂VP和缺氧活化的前药AQ4N的多功能隐形纳米粒(cRGDfK-pGO-VP-AQ4N)，技术路线如下：根据改进的Hummers方法合成氧化石墨烯(GO)，在GO悬浮液中加入0.05M NaOH，水浴超声5h，将GO上存在的酯基，羟基，环氧化物等基团转化为羧基(-COOH)，浓盐酸调节GO溶液pH至1，双蒸水洗涤GO溶液至中性。采用EDC(5mM)、NHS(5mM)催化，将8臂PEG氨基端与GO的羧基基团发生反应得到pGO。将VP和AQ4N依次加入pGO溶液中搅拌过夜，通过π-π堆垛作用将具有芳环分子结构的VP和AQ4N依次装载于pGO表面得到pGO-VP-AQ4N。采用BS3催化，将cRGDfK多肽修饰于纳米粒表面，得到cRGDfK-pGO-VP-AQ4N。按课题组已有方法观察纳米粒表面形态，测定纳米粒的粒径、zeta电位、包封率、载药量等特性。
实施例1cRGDfK-pGO-VP-AQ4N构建及其治疗作用
(一)cRGDfK-pGO-VP-AQ4N双模式纳米给药系统
根据改进的Hummers方法合成氧化石墨烯(GO)，在GO悬浮液中加入0.05M NaOH，水浴超声5h，将GO上存在的酯基，羟基，环氧化物等基团转化为羧基(-COOH)，浓盐酸调节GO溶液pH至1，双蒸水洗涤GO溶液至中性。采用EDC(5mM)、NHS(5mM)催化，将8臂PEG氨基端与GO的羧基基团发生反应得到pGO。将VP和AQ4N依次加入pGO溶液中搅拌过夜，VP、AQ4N和pGO用量依次为0.75mg/ml，1mg/ml，5mg/ml，通过π—π堆垛作用将具有芳环分子结构的VP和AQ4N依次装载于pGO表面得到pGO-VP-AQ4N。采用BS3催化，将cRGDfK多肽修饰于纳米粒表面，得到cRGDfK-pGO-VP-AQ4N，催化剂、cRGDfK多肽和纳米粒pGO-VP-AQ4N用量依次为3.5mg/ml，0.4mg/ml，5mg/ml。观察纳米粒表面形态，测定纳米粒的粒径、zeta电位、包封率、载药量等特性。粒径和zeta电位采用Zeta Potential/Particle Sizer NICOMPTM 380ZLS测定。纳米粒的药物包封率是指单位体积或重量纳米粒制剂中被载入纳米粒中的药物重量与体系中药物重量比，其计算方法为：包封率＝(纳米粒中试剂药物量/纳米粒中理论投药量)×100％。纳米粒的载药量是指单位重量的纳米粒中所含药物的量，其计算方法为：载药量＝(纳米粒中所含药物重量/纳米粒总重量)×100％。
图1A为cRGDfK-pGO-VP-AQ4N原子力显微镜图像，图1B动态光散射粒径76nm，图1C为zeta电位-21.3mv，纳米系统VP载药量为7％，AQ4N载药量为35％。
(二)cRGDfK-pGO-VP-AQ4N对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)和人前列腺肿瘤细胞(PC-3)体外靶向性
采用高内涵药物筛选分析系统考察HUVEC和PC-3细胞2h对纳米粒的摄取情况，采用前述纳米药物相同制备方法，制备得到载有VP的(荧光标记)纳米药物(cRGDfK-pGO-VP)，并对VP含量进行定量。HUVEC和PC-3细胞以5×103/孔浓度接种于96孔板，24h后待细胞充分贴壁后，吸去原培养基并加入200μL/孔含有纳米药物培养基，其中分别设置1μg/mL和5μg/mL两个VP浓度组别。待达到孵育时间2h后，吸去含有纳米药物培养基，使用PBS冲洗3次，并加入DAPI标记细胞核。使用高内涵筛选分析系统对细胞内VP荧光强度进行定量分析，考察不同纳米药物浓度下cRGDfK多肽提高HUVEC和PC-3细胞摄取纳米药物的能力。
图2为cRGDfK修饰介导HUVEC和PC-3细胞对纳米粒的靶向摄取。以光敏剂VP作为荧光探针，HUVEC(A)和PC-3(C)分别与pGO-VP(仅装载VP的非靶向纳米粒)和cRGDfK-pGO-VP(仅装载VP的cRGDfK修饰的靶向纳米粒)孵育2h后，采用KineticScan全自动高内涵药物筛选分析系统(Ex:650nm，Em:690nm)观察细胞对于纳米粒的摄取。Bar，50μm。HUVEC(B)和PC-3(D)细胞内荧光强度统计(n＝4)。与pGO-VP相比，*p<0.05，**p<0.01。
(三)cRGDfK-pGO-VP-AQ4N光动力治疗对HUVEC和PC-3细胞增殖的影响
1、光动力治疗(激光照射VP)对HUVEC和PC-3细胞增殖的影响
将HUVEC和PC-3细胞接种于培养板上，24h后加入cRGDfK-pGO-VP-AQ4N，孵育6h，激光(690nm，30mW/cm2)照射10min后继续培养24h。采用LIVE/DEAD细胞活性检测试剂盒和CCK-8法测定细胞活力。其中Cell LIVE/DEAD试剂盒能通过钙黄绿素染活细胞，PI染死细胞，荧光显微镜拍摄下可直观地观察活细胞和死细胞的数量。实验设置非靶向纳米粒组和未照射组作为对照。
图3为cRGDfK-pGO-VP靶向纳米粒光动力治疗显著抑制HUVEC和PC-3增殖。将HUVEC和PC-3分别与pGO-VP和cRGDfK-pGO-VP共孵育6h，激光照射(690nm 30mW/cm2)10min，继续培养24h。采用LIVE/DEAD细胞活性检测试剂盒对细胞染色，荧光显微镜下拍照，注意到死细胞贴壁能力下降，存在脱落现象(Bar＝200μm)。同样条件处理，采用CCK-8方法检测细胞活力。(A，B)与pGO-VP相比，cRGDfK-pGO-VP在0.001μM和0.01μM浓度下光动力治疗对HUVEC的杀伤作用更强(n＝4)。*p<0.05，**p<0.01。(D，E)与pGO-VP相比，cRGDfK-pGO-VP在0.001μM(荧光显微镜图略)、0.01μM和0.1μM浓度下光动力治疗对PC-3的杀伤作用更强(n＝4)。**p<0.01，***p<0.001。未经光照射时，纳米粒对HUVEC(C)和PC-3(F)均无暗毒性。
2、cRGDfK-pGO-VP-AQ4N在缺氧环境下AQ4N活化对PC-3细胞的杀伤作用
将PC-3接种于培养板上，24h后加入cRGDfK-pGO-VP-AQ4N、大鼠肝微粒体酶和NADPH，置于缺氧培养箱内(90％N2，5％O2，5％CO2)孵育4h后，更换新鲜培养基，在常氧条件下继续孵育24h。测定cRGDfK-pGO-VP-AQ4N对PC-3增殖、凋亡和细胞周期的影响。实验设置常氧以及缺氧但不加肝微粒体酶等作为对照。
图4(A)常氧条件下，将HUVEC与仅装载AQ4N的纳米粒(pGO-AQ4N和cRGDfK-pGO-AQ4N)共孵育8h，采用CCK-8方法测定细胞活力。结果表明，常氧条件下，纳米粒装载的AQ4N未表现出对HUVEC的毒性作用。这一现象提示，在进行光照治疗前的这段时间(给药后8h以内)，靶向至肿瘤血管内皮细胞(一般为常氧环境)的纳米药物所装载的AQ4N未发生缺氧活化进而对肿瘤血管内皮细胞产生毒性，因此将不会影响VP光动力治疗介导的抗血管作用。(B)将PC-3与装载AQ4N的纳米粒共孵育，同时加入大鼠肝微粒体酶(3mg/ml，含CYP3A4和CYP2S1等酶)和NADPH(5mM)，置于缺氧培养箱内(90％N2，5％O2，5％CO2)孵育4h，更换新鲜培养基后，在常氧条件下继续培养24h，采用CCK-8方法测定细胞活力。实验同时设置常氧条件培养作为对照。结果表明，缺氧条件下，纳米粒中装载的AQ4N(0.08μM-2μM)被高效活化并可有效杀伤PC-3细胞，并且在AQ4N为0.4μM和2μM时，靶向纳米粒对于PC-3的杀伤显著强于非靶向纳米粒。**p<0.01，***p<0.001。
(四)cRGDfK-pGO-VP-AQ4N体内血管靶向光动力治疗结合缺氧活化的AQ4N化疗治疗评价
1、模型建立
雄性BALB/c裸鼠，右股皮下接种PC-3人前列腺肿瘤细胞(2×106个)，约10天形成肿瘤。
2、评价cRGDfK-pGO-VP-AQ4N的抗肿瘤作用
实验分组：①生理盐水组；②cRGDfK-pGO；③cRGDfK-pGO-AQ4N；④cRGDfK-pGO-VP；⑤pGO-VP-AQ4N；⑥cRGDfK-pGO-VP-AQ4N，按优化方案给药，评价指标为：①采用游标卡尺测定肿瘤大小，长径(a)、短径(b)，定量计算肿瘤体积(V＝1/2×a×b2)，绘制肿瘤生长曲线，比较小鼠肿瘤体积倍增时间DT＝(T×log2)/(logVF-logVi)，T为肿瘤体积从Vi(初始体积)生长至VF(终体积)所需时间；②以瘤体积2000mm3为终点，比较小鼠生存时间长短；③不同时间点考察肿瘤组织细胞凋亡(TUNEL法)、增殖(Ki-67免疫组化分析)和坏死情况(H&E染色分析)，统计学比较肿瘤细胞凋亡、增殖指数和坏死面积；④跟踪记录实验过程中小鼠一般健康状况，饮食、饮水和体重变化，比较副作用。
图5为cRGDfK-pGO-VP-AQ4N双靶向光动力治疗结合缺氧活化的AQ4N化疗显著抑制BALB/c裸鼠皮下PC-3人前列腺肿瘤的生长。静脉给予纳米药物(剂量为VP 1mg/kg，AQ4N5mg/kg)2h后，激光(690nm，50mW/cm2)照射肿瘤部位20min，连续观察肿瘤体积和小鼠体重。(A)PC-3肿瘤体积生长曲线。与其他各组相比，cRGDfK-pGO-VP-AQ4N抑制肿瘤生长的作用最强(n＝5)，肿瘤体积倍增时间为11天。(B)小鼠体重监测(n＝5)。治疗后48h取肿瘤组织，切片。(C)CD31免疫组化染色，考察肿瘤组织微血管密度。Bar＝25μm。(D)CD31免疫组化染色统计(n＝3)。(E)HIF-1α免疫组化染色，考察肿瘤组织缺氧情况。Bar＝25μm。(F)HIF-1α免疫组化染色统计(n＝3)。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
实施例2cRGDfK-pGO-VP-AQ4N构建及其治疗作用
根据改进的Hummers方法合成氧化石墨烯(GO)，在GO悬浮液中加入0.05M NaOH，水浴超声5h，将GO上存在的酯基，羟基，环氧化物等基团转化为羧基(-COOH)，浓盐酸调节GO溶液pH至1，双蒸水洗涤GO溶液至中性。采用EDC(5mM)、NHS(5mM)催化，将8臂PEG氨基端与GO的羧基基团发生反应得到pGO。将VP和AQ4N依次加入pGO溶液中搅拌过夜，VP、AQ4N和pGO用量依次为0.5mg/ml，1.5mg/ml，8mg/ml，通过π—π堆垛作用将具有芳环分子结构的VP和AQ4N依次装载于pGO表面得到pGO-VP-AQ4N。采用BS3催化，将cRGDfK多肽修饰于纳米粒表面，得到cRGDfK-pGO-VP-AQ4N，催化剂、cRGDfK多肽和纳米粒pGO-VP-AQ4N用量依次为4.5mg/ml，0.3mg/ml，8mg/ml。观察纳米粒表面形态，测定纳米粒的粒径、zeta电位、包封率、载药量等特性。粒径和zeta电位采用Zeta Potential/Particle Sizer NICOMPTM 380ZLS测定。纳米粒的药物包封率是指单位体积或重量纳米粒制剂中被载入纳米粒中的药物重量与体系中药物重量比，其计算方法为：包封率＝(纳米粒中试剂药物量/纳米粒中理论投药量)×100％。纳米粒的载药量是指单位重量的纳米粒中所含药物的量，其计算方法为：载药量＝(纳米粒中所含药物重量/纳米粒总重量)×100％。
检测方法与实施例1相同，纳米系统VP载药量为6.3％，AQ4N载药量为30％，抗肿瘤作用实验显示小鼠肿瘤体积倍增时间为7天。
实施例3cRGDfK-pGO-VP-AQ4N构建及其治疗作用
根据改进的Hummers方法合成氧化石墨烯(GO)，在GO悬浮液中加入0.05M NaOH，水浴超声5h，将GO上存在的酯基，羟基，环氧化物等基团转化为羧基(-COOH)，浓盐酸调节GO溶液pH至1，双蒸水洗涤GO溶液至中性。采用EDC(5mM)、NHS(5mM)催化，将8臂PEG氨基端与GO的羧基基团发生反应得到pGO。将VP和AQ4N依次加入pGO溶液中搅拌过夜，VP、AQ4N和pGO用量依次为1.5mg/ml，0.8mg/ml，7mg/ml，通过π—π堆垛作用将具有芳环分子结构的VP和AQ4N依次装载于pGO表面得到pGO-VP-AQ4N。采用BS3催化，将cRGDfK多肽修饰于纳米粒表面，得到cRGDfK-pGO-VP-AQ4N，催化剂、cRGDfK多肽和纳米粒pGO-VP-AQ4N用量依次为3.5mg/ml，0.4mg/ml，5mg/ml。观察纳米粒表面形态，测定纳米粒的粒径、zeta电位、包封率、载药量等特性。粒径和zeta电位采用Zeta Potential/Particle Sizer NICOMPTM 380ZLS测定。纳米粒的药物包封率是指单位体积或重量纳米粒制剂中被载入纳米粒中的药物重量与体系中药物重量比，其计算方法为：包封率＝(纳米粒中试剂药物量/纳米粒中理论投药量)×100％。纳米粒的载药量是指单位重量的纳米粒中所含药物的量，其计算方法为：载药量＝(纳米粒中所含药物重量/纳米粒总重量)×100％。
检测方法与实施例1相同，纳米系统VP载药量为5.5％，AQ4N载药量为30％，抗肿瘤作用实验显示小鼠肿瘤体积倍增时间为8天。
实施例4cRGDfK-pGO-VP-AQ4N构建及其治疗作用
根据改进的Hummers方法合成氧化石墨烯(GO)，在GO悬浮液中加入0.05M NaOH，水浴超声5h，将GO上存在的酯基，羟基，环氧化物等基团转化为羧基(-COOH)，浓盐酸调节GO溶液pH至1，双蒸水洗涤GO溶液至中性。采用EDC(5mM)、NHS(5mM)催化，将8臂PEG氨基端与GO的羧基基团发生反应得到pGO。将VP和AQ4N依次加入pGO溶液中搅拌过夜，VP、AQ4N和pGO用量依次为0.5mg/ml，1.2mg/ml，4.5mg/ml，通过π—π堆垛作用将具有芳环分子结构的VP和AQ4N依次装载于pGO表面得到pGO-VP-AQ4N。采用BS3催化，将cRGDfK多肽修饰于纳米粒表面，得到cRGDfK-pGO-VP-AQ4N，催化剂、cRGDfK多肽和纳米粒pGO-VP-AQ4N用量依次为3.5mg/ml，0.4mg/ml，5mg/ml。观察纳米粒表面形态，测定纳米粒的粒径、zeta电位、包封率、载药量等特性。粒径和zeta电位采用Zeta Potential/Particle Sizer NICOMPTM 380ZLS测定。纳米粒的药物包封率是指单位体积或重量纳米粒制剂中被载入纳米粒中的药物重量与体系中药物重量比，其计算方法为：包封率＝(纳米粒中试剂药物量/纳米粒中理论投药量)×100％。纳米粒的载药量是指单位重量的纳米粒中所含药物的量，其计算方法为：载药量＝(纳米粒中所含药物重量/纳米粒总重量)×100％。
检测方法与实施例1相同，纳米系统VP载药量为6.6％，AQ4N载药量为32％，抗肿瘤作用实验显示小鼠肿瘤体积倍增时间为9天。
实施例5cRGDfK-pGO-VP-AQ4N构建及其治疗作用
根据改进的Hummers方法合成氧化石墨烯(GO)，在GO悬浮液中加入0.05M NaOH，水浴超声5h，将GO上存在的酯基，羟基，环氧化物等基团转化为羧基(-COOH)，浓盐酸调节GO溶液pH至1，双蒸水洗涤GO溶液至中性。采用EDC(5mM)、NHS(5mM)催化，将8臂PEG氨基端与GO的羧基基团发生反应得到pGO。将VP和AQ4N依次加入pGO溶液中搅拌过夜，VP、AQ4N和pGO用量依次为0.8mg/ml，1.2mg/ml，10mg/ml，通过π—π堆垛作用将具有芳环分子结构的VP和AQ4N依次装载于pGO表面得到pGO-VP-AQ4N。采用BS3催化，将cRGDfK多肽修饰于纳米粒表面，得到cRGDfK-pGO-VP-AQ4N，催化剂、cRGDfK多肽和纳米粒pGO-VP-AQ4N用量依次为5mg/ml，0.8mg/ml，8mg/ml。观察纳米粒表面形态，测定纳米粒的粒径、zeta电位、包封率、载药量等特性。粒径和zeta电位采用Zeta Potential/Particle Sizer NICOMPTM 380ZLS测定。纳米粒的药物包封率是指单位体积或重量纳米粒制剂中被载入纳米粒中的药物重量与体系中药物重量比，其计算方法为：包封率＝(纳米粒中试剂药物量/纳米粒中理论投药量)×100％。纳米粒的载药量是指单位重量的纳米粒中所含药物的量，其计算方法为：载药量＝(纳米粒中所含药物重量/纳米粒总重量)×100％。
检测方法与实施例1相同，纳米系统VP载药量为4.8％，AQ4N载药量为28％，抗肿瘤作用实验显示小鼠肿瘤体积倍增时间为6天。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种 cRGDfK 多肽修饰的共载 VP 和 AQ4N 的多功能隐形纳米粒，其特征在于，所述隐形纳米粒由氧化石墨烯、cRGDfK多肽、光敏剂维替泊芬和缺氧活化的前药 AQ4N组成，所述的氧化石墨烯载有光敏剂维替泊芬和缺氧活化的前药AQ4N，所述的cRGDfK多肽修饰在隐性纳米粒表面上，所述多功能隐形纳米粒制备方法如下：
合成氧化石墨烯，在氧化石墨烯的悬浮液中加入NaOH，将GO上存在的酯基，羟基，环氧化物基团转化为羧基，浓盐酸调节GO溶液pH至1，双蒸水洗涤GO溶液至中性；
用EDC、NHS催化，将8臂PEG氨基端与GO的羧基基团发生反应得到pGO；
将VP和AQ4N依次加入pGO溶液中，通过π—π堆垛作用将具有芳环分子结 构的VP和AQ4N依次装载于pGO表面得到 pGO-VP-AQ4N；
采用BS3催化，将cRGDfK多肽修饰于纳米粒表面，得到 cRGDfK-pGO-VP-AQ4N1。
2.根据权利要求 1 所述的多功能隐形纳米粒，其特征在于，所述VP、AQ4N和pGO质量比为0.5-1.5:0.8-1.5:4.5-10。
3.根据权利要求 2 所述的多功能隐形纳米粒，其特征在于，所述VP、AQ4N和pGO质量比为0.75:1:5。
4.根据权利要求 1所述的多功能隐形纳米粒，其特征在于，所述催化剂、cRGDfK多肽和纳米粒pGO-VP-AQ4N质量比为 3.5-5:0.3-0.8:5-8。
5.根据权利要求4所述的多功能隐形纳米粒，其特征在于，所述催化剂、cRGDfK多肽和纳米粒pGO-VP-AQ4N质量比为 3.5:0.4:5。
6.根据权利要求1所述的多功能隐形纳米粒，其特征在于，VP载药量大于或等于7%， 所述AQ4N载药量大于或等于35%。
7.权利要求 1-6 任一所述多功能隐形纳米粒在制备治疗实体肿瘤疾病药物中的应用。
8.根据权利要求 7 所述的应用，其特征在于，所述实体肿瘤为前列腺癌。
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