CN109073554A - 利用双光子激发荧光的生物亲和性测定方法 - Google Patents

利用双光子激发荧光的生物亲和性测定方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于定性和/或定量测定生物流体或悬浮液的样品中的分析物(4)的无分离的生物分析测定方法。本发明在于除了现有技术中公知的基于双光子激发的测定方法的基本步骤之外，该方法还包括其它步骤：a)记录设备的多个微粒(1)的聚焦位置和相应的双光子激发的荧光发射光子计数；b)采用记录的聚焦位置和相应的双光子激发的荧光发射光子计数来计算设备的校正矩阵，和c)采用校正矩阵校正来自所述设备的微粒(1)的双光子激发的荧光发射光子计数，所述校正矩阵采用记录的聚焦位置和相应的双光子激发的荧光发射计数对于设备获得。

Description

利用双光子激发荧光的生物亲和性测定方法
发明的技术领域
本发明涉及体外诊断测定和双光子激发的荧光作为测量生物亲和性测定的检测原理的用途。
发明背景
本文用于说明本发明的背景的出版物和其它材料，和特别是提供关于实践的其它细节的实例通过引用并入。
荧光在生物亲和性测定中的应用
已经在生物分析领域中发现单光子激发荧光的各种应用。在过去的几十年期间，已经引入使用荧光作为检测方法的应用，例如免疫测定、DNA杂交测定和受体结合测定。这些测定利用特异性生物亲和性反应来测定样品中的分析物。可以通过监测取决于结合分析物的量的荧光信号来确定分析物的量。这些测定还可以基于监测特定结合反应时荧光性质的变化。荧光性质的这种变化可以是荧光强度的变化、发射波长的变化、衰减时间的变化或荧光偏振的变化。
免疫测定已广泛用于体外诊断以确定某些疾病或生理状况。免疫测定可分为两种不同类型的测定，竞争性和非竞争性测定。在竞争性方法中，标记抗原(第二生物特异性试剂)与分析物竞争结合到有限量的抗体(第一生物特异性试剂)。分析物的浓度可以由结合到抗体的标记抗原的比例或由标记抗原的游离部分的比例确定。在非竞争性方法(免疫测定方法)中，分析物结合到过量的结合抗体(第一生物特异性试剂)。过量的标记抗体(第二生物特异性试剂)结合到分析物的另一个位点。可以基于结合到分析物的标记抗体的部分来确定分析物的量。除非检测原理能够将结合部分的信号与游离部分的信号区分开，否则在检测之前通常需要物理分离结合和游离部分。因此，测定方法分为分离测定和无分离测定，通常也称为非均相和均相测定。[Miyai K., Principles and Practice ofImmunoassay, (Price C.P.和Newman D.J.编辑) Stockton Press, New York 1991, 246和Hemmilä I.A., Applications of Fluorescence in Immunoassays, (WinefordnerJ.D.编辑) John Wiley & Sons, New York 1991]。
双光子激发的荧光
当通过聚焦强光源，每单位体积和每单位时间的光子密度变得足够高以使两个光子被相同发色团同时吸收时，产生双光子激发。吸收的能量是两个光子的能量之和。双光子激发的概率取决于光子密度的二次方。因此，两个光子的吸收是二阶非线性过程。通过一个发色团同时吸收两个光子产生处于激发态的发色团。然后通过自发发射具有比照明光子更高能量的光子使该激发态弛豫。在这种情况下，包括双光子激发和随后的辐射弛豫的过程称为双光子激发的荧光。TPE通常具有与相同发色团的单光子激发荧光的发射性质类似的发射性质[Xu C.和Webb W.W., J. Opt. Soc. Am. B, 13 (1996) 481]。
双光子激发的关键特点之一是激发仅发生在焦点的明显受限的三维(3D)附近。该特点的结果是产生的荧光发射的高3D空间浓度。由于激发的非线性特性，在焦点体积外，即在周围的样品介质中和在光学部件中产生最小的背景荧光。双光子激发的另一个关键特点是照明和发射在基本上不同的波长范围内发生。该性质的结果是通过使用低通滤波器(衰减至少10个数量级)，可以容易地衰减荧光发射的检测通道中的散射照明光的泄漏。由于激发体积非常小(在飞升的范围内，即10-15升)，双光子激发最适合于观察小的样品体积和结构。
如果用箔(或其它类型的盖子)覆盖比色皿且用薄的分配针通过箔进行样品分配，则与打开的比色皿相比，溢出的概率将降低。在这种情况下，溢出的概率将与穿刺针的直径成比例。然而，即使在这种情况下，在震动期间很可能发生溢出且在孵育期间可能发生显著蒸发。这些会损害测定性能。
利用双光子激发的荧光的生物分析应用
关于双光子激发的分析应用的早期报道之一由Sepaniak等人[Anal. Chem. 49(1977), 1554]发表。他们讨论使用双光子荧光激发进行HPLC检测的可能性。证明系统的低背景和简单性。Lakowicz等人[J. Biomolec. Screening 4 (1999) 355]报道在高通量筛选应用中使用多光子激发。他们已经表明在高密度多孔板中可以可靠地测量双光子诱导的荧光素荧光。
文献中描述的双光子激发的荧光的大多数生物分析应用涉及双光子成像显微术[Denk W.等人, US 5,034,613, Denk W.等人, Science 248 (1990) 73]。在激光扫描显微术中使用双光子荧光激发提供固有的3D空间分辨率，而没有使用针孔，这是共聚焦显微术所必须的。用简单的光学设计，双光子激发显微术提供与普通单光子激发共聚焦显微术的3D空间分辨率相当的3D空间分辨率。该发展还导致双光子激光扫描显微镜系统的工业制造。双光子激发技术的缺点是需要昂贵的激光器，其能够产生具有高重复频率的强烈超短脉冲。
较便宜的激光技术的发展使得能够在常规生物分析应用中使用双光子荧光激发技术[Hänninen P.等人, Nat. Biotechnol. 18 (2000) 548； Soini J.T.等人 SingleMol. 1 (2000) 203； Soini JT (2002) Crit. Rev. Sci. Instr., WO 98/25143, WO99/63344和WO 05/078438]。根据WO 98/25143、WO 99/63344和WO 05/078438，替代昂贵的锁模激光器，被动调Q二极管泵浦微芯片激光器可用于双光子激发。这些激光器是单片、小型、简单且低成本。WO 98/25143和WO 99/63344描述双光子激发的荧光在检测生物亲和性测定中的用途。该生物亲和性测定技术采用微粒作为第一生物特异性试剂所结合的生物亲和性结合固相。该生物亲和性测定技术利用用双光子荧光染料标记的生物特异性第二试剂。根据WO 98/25143和WO 99/63344中描述的方法，在微粒表面上形成生物亲和性复合物，并通过测量来自单个微粒的双光子激发的荧光来量化生物亲和性复合物的量。因此，该测定技术使得能够在微量体积中实现无分离的生物亲和性测定。
标记的第二生物亲和性试剂通过分析物分子结合在微粒表面上以形成三组分生物亲和性复合物(非竞争性、免疫测定方法)或其直接结合到第一生物特异性试剂以形成双组分生物亲和性复合物(竞争性结合方法)。第一和第二生物特异性试剂是生物活性分子，例如半抗原、生物活性配体、药物、肽、多肽、蛋白质、抗体或抗体片段、核苷酸、寡核苷酸或核酸。根据WO 98/25143和WO 99/63344，将具有高双光子激发效率的激光聚焦到反应悬浮液中，且当单个微粒漂浮通过激光束的焦点体积时，从单个微粒测量双光子激发的荧光。或者，可以用光阱捕获微粒以进行一段时间的荧光检测，该光阱由激光束引起。微粒捕获到激光束的焦点是基于由照明激光在微粒上产生的光学压力。通过二维压电驱动的扫描仪从反应悬浮液主动搜索微粒。当在焦点体积附近发现微粒时，扫描仪能够暂时停止扫描动作。来自单个微粒的荧光信号通过光电倍增管检测。
发明目的和概述
本发明的目的是提供一种用于定性和/或定量测定生物流体或悬浮液样品中的分析物的改进的无分离的生物分析测定方法，所述方法包括以下步骤：
a) 使包含对所述分析物生物特异性的第一试剂所结合的微粒的生物亲和性固相与所述样品和对用荧光标记物标记的所述分析物生物特异性的第二试剂在反应体积中同时接触，从而引发反应，
b)使用光束偏转扫描仪和由光学移动微粒的激光束产生的双光子激发体积扫描所述反应体积内的双光子激发焦点体积，
c) 当所述双光子激发体积接近随机位于反应体积中的微粒时，暂时中断所述双光子激发焦点体积的扫描或降低所述双光子激发焦点体积的扫描速度，
d) 对所述微粒施加光学力使得它移动到由所述激光束产生的双光子激发体积中并在其中移动，和
e) 检测来自所述微粒的双光子激发的荧光发射光子计数。
因此，本发明提供用于定性和/或定量测定生物流体或悬浮液样品中的分析物的这种无分离的生物分析测定方法，该方法还包括以下步骤：
f) 记录设备的多个所述微粒的聚焦位置和相应的双光子激发的荧光发射光子计数；
g) 通过采用所述记录的聚焦位置和所述相应的双光子激发的荧光发射光子计数来计算所述设备的校正矩阵，和
h) 通过采用所述校正矩阵校正来自所述设备的所述微粒的双光子激发的荧光发射光子计数，所述校正矩阵通过采用所述记录的聚焦位置和所述相应的双光子激发的荧光发射计数对于所述设备获得。
附图简述
图1示意性显示反应混合物成分、固相反应载体、游离荧光抗体示踪剂、分析物、形成的三组分免疫复合物和来自样品基质的非结合荧光物质。
图2示意性显示用于用聚焦光扫描溶液的光学装置的横截面。
图3示意性显示粒子接受体积、可变照明强度和灵敏度。
图4示意性显示光学装置。
图5示意性显示根据本发明的自适应校正方法的优选实施方式。
图6示意性显示根据本发明的自适应校正方法的实施方式的细节。
图7显示来自一系列粒子的信号值的直方图。
图8显示示例性校正矩阵的等高线图。
图9显示一系列等高线图，示出校正矩阵随时间的变化。
发明详述
技术问题
当设定定性体外诊断测定的截止值时，灵敏度和特异性通常是可互换的。当诊断分析基于悬浮固相粒子的荧光性质的测量时，由生物化学变化和粒子如何进入焦点的变化引起的单个粒子的荧光亮度中存在固有的变化，且因此通常需要测量多个粒子以更准确地评估实际信号，且因此评估目标分析物的浓度。生物亲和性测定的粒子的平均亮度取决于试剂和目标分析物之间的反应状态及其浓度。测量设备中的任何变化都将导致结果中的较大变化，并导致需要测量更多的粒子，这需要更长的荧光扫描时间，或更高的截止值，这两者都是不希望的。
控制悬浮粒子的位置增加设备的成本和复杂性。另外对于双光子荧光激发系统，获得荧光所需的功率密度非常大，以至于一次只能以小体积获得且甚至然后仅以相对短的脉冲获得。这是由于光源的可用性以及悬浮流体排出多余热量的有限能力二者。由于这些原因，使用扫描仪系统来找到悬浮液中的粒子。在这种类型的扫描系统中，粒子存在于扫描体积内实际上随机的位置。
分析物可以是但不限于由以下组成的组：半抗原、生物活性配体、药物、肽、寡核苷酸、核苷酸、核酸、多肽、蛋白质、抗体、抗体片段、碳水化合物、微生物、细胞或细胞群组。固体粒子的尺寸也可以在几个数量级上变化，至少从数百纳米到数十微米，但是通常在一种应用中，一次使用一种类型的粒子。分析物的浓度也可以从每个反应的仅少量单个分析物到非常大的量变化。这表示即使对于使用相同粒子的相同测量设备，测量的荧光强度也可以非线性地取决于浓度且可以取决于分析物。
现有技术表明，光学装置的视场中的照明强度和检测灵敏度差异是常见问题，且已经设计了几种解决方案来校正它们。对于使用非线性激发的系统，该问题可能特别严重，或换句话说，与例如明场荧光激发相比，测量的荧光强度对照明强度的变化更敏感。当系统通量问题迫使测量尽可能少的粒子时，问题就更加严重。当粒子数量较少时，在高或低照明强度和高或低荧光读数灵敏度的区域中找到所有粒子的概率开始支配(dominate)截止值设置，即必须提高截止值，否则测试特异性受到影响。
促成测量体积中的位置之间的照明强度和灵敏度的变化的因素包括物镜和其它光学部件中的光学像差、机械结构中的制造公差和组装公差。虽然这些中的许多可以减少，但它可能导致昂贵和庞大的设计。此外，这些因素中的许多可能在设备的寿命期间发生变化。由于表面上的灰尘和其它杂质物镜性能可能会变化，振动和冲击震动可能会改变光路的调谐。
额外的时间相关方差源是激光功率，其由于用于将镜附接到其支架的粘合剂的老化和变化而改变。
其中双光子激发的概率高的聚焦体积的三维形状和尺寸将由于设备中的上述时间相关性变化而改变。这些变化将耦合到测量，因为在测量期间影响粒子轨迹的光学力将改变。在聚焦上花费的时间以及相对于聚焦体积的高强度部分的位置将改变。这些将继而改变从表面结合的荧光示踪剂和悬浮在溶液中但在粒子测量期间也将被激光激发的示踪剂获得的荧光之间的比率。如果使用诸如表面等离子体共振的光学现象来增强荧光信号，则将看到由于焦点变化引起的附加效果。
所有上述问题都将影响设备需要维护的频率以及需要何种类型的维护。此外，通常定期需要外部校准以补偿测定之间以及随时间的变化。外部校准通常很繁琐，且会干扰设备进行常规诊断测试的使用。
结果的有效性取决于设备的稳定性。如果设备在运行期间存在变化，则设备能够检测到将导致违反规范的变化是重要的。
解决方案
使用通过由临床样品测量的粒子给出的荧光值测量信号的位置相关性。位置相关性从来自临床样品的粒子和设计成具有与临床样品中的粒子(其接近平均亮度，导致测量结果接近截止值)类似的荧光易感性的粒子的组合测量。当不同分析物的截止值差异太大而发生显著差异时，对每种分析物单独进行校正矩阵的计算。
当使用多重测定形式且可以或者直接从荧光或通过间接方式例如光散射的差异或者从固有荧光粒子从单个粒子测量识别测量的分析物时，可以产生必要数量的不同校正矩阵以最佳地最小化每个多重测试的位置相关变化。
无论何时测量合适的粒子或经过合适的时间段，都要重新计算校正表面。在开始用于某个设备时，可以使用在工厂进行的校准测量作为定义初始校正值的粒子组。为了将校正值中的噪声降低到可接受的水平，需要测量许多粒子，且可以改变粒子被接受以进行计算的时间长度以实现合适的噪声水平且同时使校正矩阵对系统中的变化起反应。
校正值中的变化用于监测设备的健康。如果值变化超出预设极限，则设备可能会报告错误并暂停操作，等待维护或评估问题。如果校正值的变化率超过预定值，则可以重新安排维护，或可以在设备暂停操作之前准备替换设备。
发明的优点
由于对设备健康的更好的实时监测，设备超出规范的概率更小。
早期检测到问题减少用户停机时间并提高系统可靠性。
测试灵敏度、特异性、精度和/或准确度得到改进。当溶液背景信号被单独测量并从自粒子获得的测量信号减去时尤其如此，且样品基质引起高溶液背景信号。采用本发明允许改进定量分析型分析的精度。当条件阴性样品结果在较窄的窗口内时，改进的精度允许在保持高特异性的同时使用较低的截止值。这改进灵敏度和/或特异性，并最终在定性测试中提供更好的准确性。
术语
本申请中使用的术语可以如下定义：
•生物亲和性测定：基于生物亲和性结合反应，即其中形成生物亲和性复合物的反应的所有生物测定的通用名称。
•校正矩阵：在优选实施方案中，以行和列排列的二维矩形数字阵列。更通常，具有维度大小n1...nk的k维阵列。
•二向色镜：是反射选定的电磁辐射带并通过其它的镜。
•错误状态：与数据库中的测量结果相关的数字或描述。在许多情况下，当测量一个量时，同时测量其它量，这些可能表明测量结果不如最佳结果准确或是干扰的结果。
•微粒：通常接近球形的粒子，尺寸为微米级。所描述的测量系统也可以使用更小或更大的粒子，但通常微米级粒子是最佳选择。
•调Q：或巨大的脉冲形成或Q-突变(Q-spoiling)。其中激光谐振器Q值显著降低，同时增益介质被泵浦且仅在调Q释放时发生系带(lacing)的技术。导致脉冲激光的峰值功率非常高。
•双光子激发(TPE)：其中两个光子在单个量子事件中激发荧光团的现象。使得有可能从由荧光团产生的低功率荧光有效地过滤高功率激发光。由于低双光子激发横截面，需要非常高的功率密度，以产生双光子激发，这些可以通过聚焦激光束来实现。附加益处是在焦点体积外的荧光团工作波长处的激发变得非常不可能，且因此可以进行无分离测定。
•双光子激发的荧光：由双光子激发产生的光。除了起源之外，与普通光没有区别，这里用来引起对波长的注意。
•孔：这里用来容纳试剂和悬浮流体的小容器。通常以条带或阵列在板中排列。在优选实施方案中，在孔的底部具有光学质量窗口。
本发明的优选实施方案
本发明的一个典型实施方案包括用于定性和/或定量测定生物流体或悬浮液样品中的分析物的无分离的生物分析测定方法，所述方法包括以下步骤：
a) 使包含对所述分析物生物特异性的第一试剂所结合的微粒的生物亲和性固相与所述样品和对用荧光标记物标记的所述分析物生物特异性的第二试剂在反应体积中同时接触，从而引发反应，
b) 使用光束偏转扫描仪和由光学移动微粒的聚焦激光束产生的双光子激发体积扫描所述反应体积内的双光子激发焦点体积，
c) 当所述双光子激发体积接近随机位于反应体积中的微粒时，暂时中断所述双光子激发焦点体积的扫描或降低所述双光子激发焦点体积的扫描速度，
d) 对所述微粒施加光学力使得它移动到由所述激光束产生的双光子激发体积中并在其中移动，和
e) 检测来自所述微粒的双光子激发的荧光发射光子计数。
其特征在于所述方法还包括：
f) 记录设备的多个所述微粒的聚焦位置和相应的双光子激发的荧光发射光子计数；
g) 通过采用所述记录的聚焦位置和所述相应的双光子激发的荧光发射光子计数来计算所述设备的校正矩阵，和
h) 通过采用所述校正矩阵校正来自所述设备的所述微粒的双光子激发的荧光发射光子计数，所述校正矩阵通过采用所述记录的聚焦位置和所述相应的双光子激发的荧光发射计数对于所述设备获得。
在本发明的最典型实施方案中，通过采用在所定义的在先时间段内记录的聚焦位置和相应的双光子激发的荧光发射光子计数，连续地或以预设的间隔或时间点重新计算校正矩阵。优选地，选择在先时间段，使得在计算设备的校正矩阵时采用最小数量的微粒的记录的聚焦位置和相应的双光子激发的荧光发射光子计数。
在本发明的一些优选实施方案中，通过采用来自至少一个阴性对照样品的微粒，即不包含该分析物的一个或多个样品的记录的聚焦位置和相应的双光子激发的荧光发射光子计数来计算校正矩阵。
在本发明的其它优选实施方案中，通过采用临床样品测量的记录的聚焦位置和相应的双光子激发的荧光发射光子计数和仅采用具有在分析物的阳性结果的截止值的预定裕度内的双光子激发的荧光发射光子计数的粒子来计算校正矩阵。
在本发明的许多优选实施方案中，来自单个微粒的双光子激发的荧光发射光子计数针对在单个孔的测量期间获得的荧光发射光子计数的中值进行归一化。
在本发明的许多实施方案中，通过计算校正因子的n×m矩阵来近似化校正矩阵，其中对于校正矩阵的每个位置，从来自所述微粒的双光子激发的荧光发射光子计数来计算近似校正值，所述微粒在距所述位置的设定半径内检测到。优选地，近似校正值是双光子激发的荧光发射光子计数的中值。
在本发明的一些优选实施方案中，应用校正矩阵的变化来确定设备的健康，即设备健康中的变化和/或设备维护需求。
在本发明的一些实施方案中，如果校正矩阵改变超过设定极限，则将设备退出使用直到维护。
在本发明的其它实施方案中，如果校正矩阵的变化速度超过设定极限，则将设备退出使用直到维护。
当考虑本说明书的公开内容时，本领域技术人员将理解，本发明的优选实施方案将包括具有所公开特征的任何组合的实施方案，除非本领域技术人员将理解这些特征将明显地彼此排除。
具体实施方案
在一个优选的实施方案中，将含有分析物4(参见图1)的生物流体或悬浮液的样品混合到缓冲流体溶液中，所述缓冲流体溶液包含涂覆有生物特异性第一试剂例如抗体2和双光子可激发荧光示踪剂，一种用荧光标记物标记的生物特异性第二试剂3的微粒1。在免疫复合物形成期间，分析物4、示踪剂3和生物特异性第一试剂2变得结合并从溶液中浓缩到微粒1上。在测量期间，用聚焦激光束寻找微粒1，并测量来自表面结合的示踪剂的双光子荧光。
当在溶液中扫描光束时，不断测量背散射光的量。如果超过阈值，则停止扫描仪并开始测量粒子。
定期混合溶液以使微粒保持在悬浮,液中并避免形成会减慢反应的浓度梯度。
背景荧光可以通过自由示踪剂3或通过其它荧光分子7、8在无分离测定中发射，所述荧光分子7、8被带到样品基质中的反应混合物中。图1未按比例绘制，且参与化合物的相对尺寸可以在数量级上不同，而不需要改变测量装置。结合的示踪剂6、其它荧光分子7、8和自由示踪剂3或这些的组合可以同时测量。这是测定的合乎需要的无分离特性的结果。
将样品溶液21(参见图2)移动到测试板上的比色皿或孔20中。物镜22通过窗口25将激光束聚焦到孔20中的点24。虚线23显示由物镜22产生的光锥的横截面，其焦点24位于其腰部。焦点处的箭头表示整个系统移动孔20中的焦点24的能力。
当焦点31(参见图3)扫描样品溶液时，其沿着表面32移动到各种位置，例如移动到位置33。虽然横截面32是弯曲的，实际表面可以是复杂的形状。由于光学系统的性质，焦点31、33处的照明强度可以不同。在优选实施方案中，焦点处的光强度太大以至于微粒被电磁场驱动并朝向焦点移动并通过它。这由表面32的图中的厚度表示。
图4显示光学装置的简化以显示扫描焦点处的强度变化的多个源。激光器40产生光束，该光束穿过透镜41并通过二向色镜42反射到第一扫描镜43，在那里它被反射到第二扫描镜44。然后光束被反射到物镜。光束的方向取决于镜43和44的配置，如实线和虚线45所示。
扫描镜43和44在垂直轴上旋转。透镜41的焦距用于控制光束的发散，使得物镜的入射光瞳正确地被光束填充。
当离开激光器时，光束通常具有高斯强度分布和椭圆形或准圆形横截面47。在从几个镜反射之后，光束的横截面如48所示变化。由于其高斯强度分布，即使在最佳情况下，光束在边缘处被切割，缺陷可能导致更严重和不对称的切割，如49所示。所有分布表示47、48和49显示恒定强度的边界。
然后改变扫描镜43和44的配置使焦点在样品溶液中移动。一些散射和双光子激发的荧光被物镜收集并反转光路。选择二向色镜42使得双光子激发的荧光通过它46。然后收集双光子激发的荧光并通过传感器(通常是光电倍增管)转换成电信号。
图5中的流程图500显示何时进行初始校准以及何时产生第一校正矩阵。(501)的设备制造包括物理实例的产生和嵌入式软件的安装。当测量设备包括多个单元(其中一些可以是现成的，例如PC)时，该阶段还可以包括安装其它软件部件。
工厂校准(510)可以包括几个不同的校准步骤，如通过校准过程步骤(515)所示。本发明的自适应校正需要测量多个粒子(511)。这里n可取决于若干因素，包括微球的空间分布，因为扫描表面的任何区域中的低密度可导致校正矩阵中的过度噪声。结果是粒子数据集(512)，其除了每个粒子的荧光值之外还可以包括可以用于例如向粒子添加加权因子的其它信息。
然后，步骤514产生可用于校正扫描区域的每个点处的粒子值的矩阵。根据应用，例如当用相同的物理设备测量几种不同的测定时，可以产生多维阵列。在那种情况下，不同的测定可以具有不同的校正矩阵以优化校准，例如当夹在中间的参与者(sandwichparticipant)在测定之间的大小改变时。然后将得到的阵列注入数据库(513)并结束工厂校准块。
当设备安装到客户房屋(520)时，可以执行另外的校准步骤以确保在运输和可能的存储期间没有发生变化。
在正常使用中，将样品(530)插入设备中且分析仪开始测量来自溶液的粒子(531)和背景信号。这产生再次注入数据库(533)的粒子数据(532)。在计算结果(535)中，该数据和从数据库(533)提取的校正矩阵(534)用于计算校正结果(535)。然后将结果显示给用户(540)或发送到设备外部。
在分析样品之后，系统检查是否是重新计算校正矩阵的时间(550)。当可用的计算能力有限时，该检查使得可以优化系统性能。如果否，则可以在可用时测量下一个样品。如果是，则进入自适应校正步骤(560)。这里形成粒子选择查询(561)并用于从数据库(562)中提取所选粒子数据(563)。该数据再次用于计算校正矩阵(564)，其被注入数据库(562)。
图6中的流程图6600显示自适应校正过程的细节。粒子选择查询(6610)包括多个子过程，其收集选择正确粒子所需的信息。日期和时间用于选择最近测量的样品，例如，可能只接受在上个月期间测量的粒子。这可能导致无法选择所需数量的粒子的情况，且可能需要中止校准。可替代且优选的解决方案是使用所需数量的最新粒子。
粒子可能具有附属于它们的错误状态，在一些情况下，从校正的角度来看，错误可能不相关，且仍可以使用粒子。因为校正最重要的是接近系统可能具有的任何判定阈值，例如定性结果的截止值，选择具有在距所述阈值的预定范围内的信号值的粒子是有利的。当数据库包括来自单独测试或多重测试的几种不同方法(分析物)的测量时，可以针对每种方法单独产生校正矩阵。
然后使用粒子选择查询(6610)从数据库(6620)中提取所选粒子数据(6630)。然后，计算校正矩阵步骤(6640)包括新校正矩阵的实际计算。计算离散矩阵需要网格大小(6641)。它的大小由计算校正时可接受的错误决定。如果网格只有几个点，即使在点之间使用插值，也可能出现大的错误。非常大的矩阵将需要更多的内存，这例如在嵌入式系统中是不太可能的。甚至可以使用相当小的矩阵，例如20×20。在每个网格点选择的粒子(6642)中，选择用于计算每个矩阵值的粒子。去除异常值步骤(6643)用于备选实施方案中。选择网格的每个点的粒子组的中值(6644)作为定义矩阵的该点的校正因子的相应值。
然后将得到的新矩阵和从数据库(6620)提取的旧矩阵(6650)进行比较(6660)。比较平均值和来自矩阵均值的点的平均绝对差之和(Mat 1)。然后针对极限评估这些比较结果；如果结果是可接受的，则将新矩阵注入到数据库(6620)以供使用。如果结果违反极限，则以软件或直接在物理设备上以警告灯或声音的形式引发异常(6680)。
在一个备选实施方案中，重复优选实施方案中采取的步骤，除非其中使用中值来计算校正矩阵的值。在备选实施方案中，可以使用对异常值具有稳健性的任何方法作为步骤6644，例如LOESS的稳健版本或单独去除异常值(6643)并使用任何合适的统计量来计算6644中的矩阵。
在本发明的另一个实施方案中，校正信息以函数的形式保留，该函数可以是连续的或分段连续的，且仅在需要时计算每个位置的校正值。
在一个备选实施方案中，数据库(6620)可以保存多个矩阵，用于评估校正矩阵变化历史，例如矩阵的变化速度的变化。
实施例
通过以下实施例说明本发明，然而，本发明提供优点的应用不限于这些实施例。
实施例1
定义n×m矩阵
其中i=0、…、n-1和j=0、...、m-1。
进一步对于矩形测量区域，其中XA < x < XB ⋀ YA < y < YB定义
和
假设粒子测量ξ是亮度和位置信息Jk、xk、yk的列表，其中k=1、…、p并用表示一组观测值Jk的中值，那么
其中h是满足选择条件σφ的k的亚组，即。
其中选择s(s ≤ k)最近邻的条件φs可以通过选择所有ξk来实施，其中
其中rkij是测量粒子距离点xi、yj的距离，且rs是第s个最近粒子距关注点的xi、yj的距离。
以类似的方式，可以通过选择所有ξk来定义选择条件φr，其中
其中r是距关注点xi、yj的距离，且
这里s和r用作平滑参数，且基于所讨论的系统的特定特性来选择。
将矩阵Mij外推到落在定义点之间的位置可以使用几种公知的方法中的任何一种例如最近邻、双线性或双三次来完成。
实施例2
从粒子数据计算校正矩阵
参考图6600，对数据库进行粒子选择查询以用以下参数检索粒子值：日期在2013-05-04 15:31:50 EEST和2013-07-13 09:11:06 EEST之间，测量类型是实际测量(即不是对照)，错误状态为没有错误，信号在0.08和2之间，且粒子数量为1500。这导致图7的直方图中显示的粒子组。信号值已经用任意常数归一化。
选择与点x1 = 0.55和y1 = 0.40最接近的六十个粒子导致中值为0.17且类似地选择位置x2 = 0.35和y2 = 0.85给出中值0.69。
当计算整个网格的值时，结果可以表示为等高线图。在图8中，为了将中值方法与更加计算密集的备选方法进行比较，使用来自R统计计算软件的适当命令直接从粒子数据计算等高线图。与上面给出的值存在合理的一致。
实施例3
校正矩阵随时间的变化
使用式可以表征校正表面与最佳校正表面的偏差，对于实施例1的情况，S的值= 120。图9示出校正表面如何随时间变化，右下对应于图8。相应的S值是：23、32、53、78、101和122。如果将设备的安全操作极限设置为S = 110，则在计算最后的校正矩阵时将停止设备操作(6670)。在测量例如前四个值之后，随着S的变化率清晰可见且稳定，还可以预测何时将近似地超过极限。

Claims (11)

1.一种用于定性和/或定量测定生物流体或悬浮液的样品中的分析物(4)的无分离的生物分析测定方法，所述方法包括以下步骤：
a) 使包含对所述分析物(4)生物特异性的第一试剂(2)所结合的微粒(1)的生物亲和性固相与所述样品和对用荧光标记物标记的所述分析物(4)生物特异性的第二试剂(3)在反应体积中同时接触，从而引发反应，
b) 使用光束偏转扫描仪和由光学移动微粒(1)的聚焦激光束产生的双光子激发体积扫描所述反应体积内的双光子激发焦点体积，
c) 当所述双光子激发体积接近随机位于反应体积中的微粒(1)时，暂时中断所述双光子激发焦点体积的扫描或降低所述双光子激发焦点体积的扫描速度，
d) 对所述微粒(1)施加光学力使得它移动到由所述激光束产生的双光子激发体积中并在其中移动，和
e) 检测来自所述微粒(1)的双光子激发的荧光发射光子计数；
其特征在于，所述方法还包括：
f) 记录设备的多个所述微粒(1)的聚焦位置和相应的双光子激发的荧光发射光子计数；
g) 通过采用所述记录的聚焦位置和所述相应的双光子激发的荧光发射光子计数来计算所述设备的校正矩阵，和
h) 通过采用所述校正矩阵校正来自所述设备的所述微粒(1)的双光子激发的荧光发射光子计数，所述校正矩阵通过采用所述记录的聚焦位置和所述相应的双光子激发的荧光发射计数对于所述设备获得。
2.权利要求1的方法，其特征在于，通过采用在所定义的在先时间段内记录的聚焦位置和相应的双光子激发的荧光发射光子计数，连续地或以预设的间隔或时间点重新计算校正矩阵。
3.权利要求2的方法，其特征在于，选择在先时间段，以便在计算所述设备的校正矩阵时采用最小数量的微粒(1)的记录的聚焦位置和相应的双光子激发的荧光发射光子计数。
4.前述权利要求中任一项的方法，其特征在于，通过采用来自至少一个阴性对照样品，即不含分析物(4)的一个或多个样品的微粒(1)的记录的聚焦位置和相应的双光子激发的荧光发射光子计数来计算校正矩阵。
5.权利要求1至3中任一项的方法，其特征在于，通过采用临床样品测量的记录的聚焦位置和相应的双光子激发的荧光发射光子计数和仅采用具有在分析物(4)的阳性结果的截止值的预定裕度内的双光子激发的荧光发射光子计数的粒子来计算校正矩阵。
6.前述权利要求中任一项的方法，其特征在于，来自单个粒子(1)的双光子激发的荧光发射光子计数针对在单个孔(20)的测量期间获得的荧光发射光子计数的中值进行归一化。
7.权利要求1至5中任一项的方法，其特征在于，通过计算校正因子的n×m矩阵来近似化校正矩阵，其中对于校正矩阵的每个位置，从来自所述微粒(1)的双光子激发的荧光发射光子计数来计算近似校正值，所述微粒在距所述位置的设定半径内检测到。
8.权利要求7的方法，其特征在于，所述近似校正值是双光子激发的荧光发射光子计数的中值。
9.前述权利要求中任一项的方法，其特征在于，应用校正矩阵中的变化来确定设备的健康，即设备健康中的变化和/或设备维护需求。
10.权利要求9的方法，其特征在于，如果所述校正矩阵变化超过设定极限，则将设备退出使用直到维护。
11.权利要求9的方法，其特征在于，如果所述校正矩阵的变化速度超过设定极限，则将设备退出使用直到维护。
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