CN109069547A - 黑唇鲍（澳大利亚黑鲍）提取物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供黑唇鲍(澳大利亚黑鲍(Haliotis rubra))加工废物的提取物和提取物级分。还描述了制备提取物及其级分的方法，以及提取物或级分作为原料、药物、膳食补充剂或营养制品的用途。

Description

黑唇鲍(澳大利亚黑鲍)提取物
技术领域
本发明涉及黑唇鲍(澳大利亚黑鲍(Haliotis rubra))加工废物的新的提取物和提取物级分。还描述了制备提取物及其级分的方法，以及提取物或级分作为原料、药物、膳食补充剂或营养制品的用途。
背景技术
仅在澳大利亚每年丢弃海鲜加工废物导致产生数千吨皮、壳和内脏(offal)。具体地，作为食品销售的鲍鱼的制备产生不成比例的加工废物量，大约仅三分之一的动物(即，足部肌肉)可作为鲍鱼肉销售。剩下的三分之二包括壳、碎肉(meat trimmings)和内脏(脏腑(viscera)、内脏器官(internal organs))，通常被丢弃。
鲍鱼的加工还需要洗涤步骤，其以废水流的形式产生废物，废水流通常也被丢弃。此外，待售的一些鲍鱼肉的制备产生额外的废物，因为它涉及以烹饪和包装(罐装或袋装)的形式保存，其中液体(或烹饪汁)被释放并且通常也被丢弃。加工废物还可包括在分级期间不合格的尺寸过小的整只鲍鱼。
丢弃的鲍鱼废物的运输是昂贵的，并且废物的处理是有问题的且难闻(unpleasant)的。此外，还存在与处理大量海鲜废物相关的潜在环境影响的额外问题。
需要鉴定鲍鱼加工废物的可行替代用途，以便为鲍鱼资源增加价值，降低废物处理并最大限度地减少对环境的影响。此外，需要鉴定废物加工流的可行替代用途，以增加价值并改善鲍鱼肉加工业的经济回报。
发明内容
本发明至少部分地基于以下发现：可以从来自黑唇鲍(blacklip abalone)(澳大利亚黑鲍(Haliotis rubra))肉生产的非壳加工废物中回收具有商业利益的生物活性成分。令人惊讶的是，发现加工黑唇鲍产生的非壳加工废物如内脏、碎肉、废水流和烹饪汁是抗炎和抗血栓形成剂的来源。具体地，获自黑唇鲍加工废物的提取物产生显著且一致的抗血栓形成和抗炎活性。
基于这些发现，本发明人开发了提取物、提取物级分、组合物和方法，用于治疗一系列病症，包括如下所述的炎性疾病和血栓形成性疾病。
因此，在第一方面，有利地，本发明提供了一种黑唇鲍(澳大利亚黑鲍)的提取物或其级分，其包含一种或多种生物活性成分，该提取物源自黑唇鲍加工废物。在一个实施方案中，加工废物是未加工的(或新鲜)加工废物。
在一些实施方案中，一种或多种生物活性成分选自抗血栓形成剂和抗炎剂。
在一些实施方案中，将提取物分级处理(fractionate)以产生富含蛋白成分的级分。在一些实施方案中，将提取物分级处理以产生富含阴离子多糖成分的级分。
在另一方面，本发明提供了根据本发明的提取物或其级分在制备或制造药物、膳食补充剂、营养制品、功能性食品或功能性食品原料中的用途。
在另一方面，本发明提供了一种药物、膳食补充剂、营养制品、功能性食品或功能性食品原料，其包含本发明的提取物或其级分。
在另一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含根据本发明的提取物或其级分，以及一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂。
在另一方面，本发明提供一种抗炎剂，其包含根据本发明的提取物或富含蛋白成分的级分。
在另一方面，本发明提供了一种治疗受试者中IL-6介导的病症的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的根据本发明的提取物或富含蛋白成分的级分。
在另一方面，本发明提供了一种治疗受试者中炎性病症的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的根据本发明的提取物或富含蛋白成分的级分。
在另一方面，本发明提供了一种治疗受试者中自身免疫病症的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的根据本发明的提取物或富含蛋白成分的级分。
在另一方面，本发明提供了根据本发明的提取物或富含蛋白成分的级分在制造用于治疗IL-6介导的病症、炎性病症或自身免疫病症的药物中的用途，例如，所述自身免疫病症是类风湿性关节炎。
本发明进一步提供了一种抗血栓形成剂或抗凝血剂，其包含有效量的根据本发明的提取物或富含阴离子多糖成分的级分。
在另一方面，本发明提供了一种在受试者中抑制血栓形成或抑制凝血酶活性的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的根据本发明的提取物或富含阴离子多糖成分的级分。
在另一方面，本发明提供了根据本发明的提取物或富含阴离子多糖成分的级分在制造用于抑制血栓形成或凝血酶活性的药物中的用途。
在另一个方面，本发明提供了一种制备根据本发明的提取物或其级分的方法，所述方法包括使用酶促或化学消化方法消化黑唇鲍加工废物，从经消化的废物中分离提取物。发明人已经发现，富集或增加某一成分或某些成分如阴离子多糖成分或蛋白成分的浓度可能是有利的。因此，制备根据本发明的级分的方法还可以包括分级处理提取物，优选增加阴离子多糖成分或蛋白成分的浓度。
附图说明
图1图示了对不同的鲍鱼加工废物提取物应答的体外抗炎活性。通过LPS刺激的小鼠巨噬细胞(RAW 264.7细胞)的一氧化氮产生降低指示抗炎活性。使用单因素ANOVA与Dunnett多重比较检验，以“*”指示的数据显示与分析阳性对照(槲皮素)的显著统计学差异(p<0.05)。
图2图示了对不同的鲍鱼加工废物提取物应答的体外凝血酶抑制活性。使用显色底物ChromozymTH，凝血酶活性降低指示凝血酶抑制活性。使用单因素ANOVA与Dunnett多重比较检验，以“*”指示的数据显示与分析阳性对照(0.0625mg/mL肝素)的显著统计学差异(p<0.05)。
图3A和图3B图示了不同的鲍鱼加工废物提取物的阴离子交换分离。使用阴离子交换色谱和线性NaCl梯度将鲍鱼提取物1-1(图3A)和提取物2-1(图3B)分离成30种级分。在级分中评估总蛋白(黑色)和硫酸多糖(灰色)。
图4图示了对获自不同的鲍鱼加工废物提取物的混合的阴离子交换色谱级分应答的体外抗炎活性。通过LPS刺激的小鼠巨噬细胞(RAW 264.7细胞)的一氧化氮产生降低指示抗炎活性。使用单因素ANOVA与Dunnett多重比较检验，以“*”指示的数据显示与分析阳性对照10μM槲皮素的显著统计学差异(p<0.05)。具有^的数据显示与分析阳性对照1μM槲皮素的显著统计学差异(p<0.05)。
图5图示了对获自不同的鲍鱼加工废物提取物的混合的阴离子交换色谱级分应答的体外肝素辅助因子II介导的凝血酶抑制。使用显色底物ChromozymTH，凝血酶活性降低指示凝血酶抑制活性。使用单因素ANOVA与Dunnett多重比较检验，以“*”指示的数据显示与分析阳性对照(0.0625mg/mL肝素)的显著统计学差异(p<0.05)。使用单因素ANOVA与Dunnett多重比较检验，以“^”指示的数据显示与分析阳性对照(0.001mg/mL肝素)的显著统计学差异(p<0.05)。
图6A和图6B图示了胶原II诱导关节炎(CIA)后小鼠的临床评分。小鼠口服施用对照饲料；预防性/治疗性鲍鱼剂量1；预防性/治疗性鲍鱼剂量2和治疗性泼尼松龙(prednisolone)。预防性治疗总结在图6A中。图6B总结了治疗性治疗。
图7图示了每个治疗组在第20天的个体临床评分，包括平均临床评分(具有数据范围)。
图8图示了CIA治疗组从症状发作(第6天)到第20天的临床评分的LSMEANS。如使用SAS的GLM程序分别评估CIA治疗(组)作用的最小二乘平均值(LSMEANS)所确定的，与对照饲料比较显示统计显著性：****(p<0.0001)；***(p<0.001)和*(p<0.05)。
图9图示了在第21天收集的血清中循环IL-6(细胞因子)水平的LSMEANS。如使用SAS的GLM程序分别评估治疗(组)的最小二乘平均值(LSMEANS)所确定的，与对照饲料+CIA比较显示统计学显著性：****(p<0.0001)；**(p<0.01)。
图10图示了在第21天收集的血清中的血清胶原II抗体水平。抗体水平表示为无CIA对照：对照饮食；鲍鱼剂量1；鲍鱼剂量2和泼尼松龙的比例。
图11图示了CIA和非CIA治疗组在第21天的LSMEANS总滑膜炎评分。如使用SAS的GLM程序分别评估治疗(组)作用的最小二乘平均值(LSMEANS)所确定的，与对照饲料+CIA比较显示统计学显著性：****(p<0.0001)；**(p<0.01)。
具体实施方式
定义
除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管与本文描述的那些类似或等同的任何方法和材料可用于本发明的实践或试验，但描述了优选的方法和材料。出于本发明的目的，以下术语定义如下。
本文使用的冠词“一”和“一个”是指该冠词的一个或多于一个(即，至少一个)语法对象。举例来说，“一个元素”表示一个元素或多于一个元素。
如本文所使用的，“和/或”是指并涵盖一个或多个相关所列项目的任何和所有可能组合，以及当解释为可选择(或)时，缺乏组合。
如本文所使用的，术语“约”是指，相比提及的数量、水平、浓度、数值、尺寸或量，数量、水平、浓度、值、尺寸或量变化多达10％或甚至多达9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％。
在本文中所使用的术语“试剂”表示化学化合物、化学化合物的混合物、生物大分子(如核酸、抗体、多糖或寡糖、蛋白或其部分，例如肽)、或由生物材料制成的提取物，如细菌、植物、真菌或动物(具体是哺乳动物)细胞或组织。这些试剂的活性可使其适合作为“治疗剂”，所述“治疗剂”是在受试者中局部或全身起作用的生物学、生理学或药理学一种或多种活性物质。
如本文所使用的，“自身免疫疾病”是指由针对身体自身成分如组织和其它成分的不适合的免疫应答所以引起的疾病或病症。在一些实施方案中，IL-6水平在自身免疫疾病中升高。可以采用本文所述的提取物治疗的非限制性示例性自身免疫疾病包括类风湿性关节炎、炎性肠病(尤其是溃疡性结肠炎和克罗恩病)、系统性红斑狼疮、全身性硬化症、多发性肌炎，包括巨细胞动脉炎的血管炎综合征、大动脉炎(takayasu aeteritis)、冷沉球蛋白血症、髓过氧化物酶-抗中性粒细胞胞浆、湿疹、银屑病、重症肌无力、抗体相关的新月体性肾小球肾炎、类风湿性血管炎、复发性多软骨炎，获得性血友病A和自身免疫性溶血性贫血。
贯穿本说明书，除非上下文另有要求，词语“包含”将被理解为暗示包括所述步骤或元素或者步骤或元素的组，但不排除任何其它步骤或元素或者步骤或元素的组。
当在本文中使用时，术语“黑唇鲍加工废物”等是指在加工黑唇鲍以产生用于消费的黑唇鲍(肌肉、足部)期间产生的废物。加工废物包括在加工动物以生产鲍鱼肉时丢弃的鲍鱼软组织的部分，包括碎肉和内脏器官以及在洗涤过程中产生的废液、烹饪汁和在分级期间不合格的尺寸过小的整只鲍鱼。加工废物可以是以例如固体、粉末、糊剂或液体的形式；它可以是未加工的、经过处理的或经烹饪的；并且可以是新鲜的，或者例如通过冷冻、装袋、装罐或干燥而保存的。
当在本文中使用时，术语“生物活性成分”或“生物活性分子”和类似术语是指当施用于动物或体外研究时具有生理作用的提取物的成分。
如本文所使用的，“癌症”是指涉及不受调节和异常细胞生长的疾病或病症。可以采用本文所述的提取物治疗的非限制性的癌症包括多发性骨髓瘤、白血病、胰腺癌、乳癌、结肠直肠癌、恶病质、黑素瘤、宫颈癌、卵巢癌、淋巴瘤、胃肠道癌、肺癌、前列腺癌、肾细胞癌、转移性肾癌、实体瘤、非小细胞肺癌、非霍奇金淋巴瘤、膀胱癌、口腔癌、骨髓增生性肿瘤、B细胞淋巴增生性疾病和浆细胞白血病。非限制性的示例性癌症相关病症包括非小细胞肺癌相关的疲劳和癌症相关的厌食症。
如本文所使用的，术语“富集”、“富集的”、“使富集”等是指增加组合物的成分(例如蛋白成分)浓度的方法。例如，组合物的蛋白成分可以通过色谱技术富集包括分级处理，使得组合物的蛋白成分增加约1.5倍、约2倍、约3倍、约5倍、约10倍、约15倍、约30倍、约50倍或约100倍。
如本文所使用的，“IL-6介导的疾病或病症”是指这样的疾病或病症，其中疾病或病症的至少一些症状和/或进展由IL-6介导的信号传导引起。非限制性的示例性IL-6介导的疾病或病症包括炎性疾病、恶性疾病(包括癌症和癌症相关病症)、感染和自身免疫疾病。进一步的非限制性的示例性IL-6介导的疾病包括但不限于巨淋巴结增生症(Castleman'sdisease)、强直性脊柱炎、冠心病、类风湿性关节炎的心血管疾病、肺动脉高血压、慢性阻塞性肺病(COPD)、特应性皮炎、银屑病、湿疹、坐骨神经痛、II型糖尿病、肥胖、巨细胞动脉炎，炎性肠病(尤其是溃疡性结肠炎和克罗恩病)、急性移植物抗宿主病(GVHD)、非ST段抬高心肌梗塞、抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)相关性血管炎、视神经脊髓炎、慢性肾小球肾炎、大动脉炎、移植物抗宿主病和移植排斥(包括肾移植)。
如本文所使用的，“感染”是指由病原体如细菌、病毒、真菌等引起的疾病或病症。可以采用本文所述的提取物治疗的非限制性的示例性感染包括人免疫缺陷病毒(HIV)、人T淋巴细胞病毒(HTLV)、脑型疟疾、尿路感染和脑膜炎球菌感染。
如本文所使用的，“炎性疾病”是指涉及炎性应答的疾病或病症。炎性应答可以是急性和/或慢性的。在一些实施方案中，慢性炎症涉及IL-6水平的增加。可以采用本文所述的提取物治疗的非限制性的炎性疾病包括类风湿性关节炎、幼年特发性关节炎、全身性发病的幼年特发性关节炎、骨关节炎、败血症、哮喘、间质性肺病、炎性肠病、全身性硬化症、眼内炎症、格雷夫斯病(Graves disease)、子宫内膜异位症、全身性硬化症、成人发病的still病(adult-onset still disease)、淀粉样蛋白A淀粉样变性、风湿性多肌痛、缓和的血清阴性的对称性滑膜炎伴凹陷性水肿、白塞氏病(Behcet's disease)、葡萄膜炎、移植物抗宿主病和TNFR相关周期综合征。
当在本文中使用时，术语“蛋白成分”包括多肽和寡肽。在一个方面，蛋白成分包含胶原。
如本文所使用的，术语“阴离子多糖”是指带负电荷的多糖，如硫酸多糖，并且包括糖胺聚糖多糖(GAG)和糖胺聚糖样多糖(GAG样)。
当在本文中使用时，术语“营养制品”是指源自食物来源的可食用产品。营养制品被认为可以提供健康益处，例如，可以形成功能性食品、食品原料、膳食补充剂、饮料和动物饲料的主要成分(basis)。
如本文所使用的，术语“抗血栓形成剂”是减少血凝块形成并可用于预防和治疗例如动脉和静脉血栓形成的试剂。抗血栓形成剂的示例包括抗凝血剂和抗血小板剂。抗血栓形成作用可以例如通过肝素辅助因子II或抗凝血酶(AT)介导。
如本文所使用的，术语“抗凝血剂”是用于减少血液凝固的试剂。抗凝血剂可用于预防和初步治疗静脉血栓栓塞，包括深静脉血栓形成(DVT)和肺栓塞(PE)。抗凝血剂还可用于预防缺血性并发症、治疗不稳定性心绞痛和治疗非Q波心肌梗塞。抗凝血剂可用于预防或治疗例如关节置换手术或腹部手术术后DVT。它们还可用于预防或治疗由于受伤或患病导致的活动受限而可能发生的DVT；或者可能是如癌症的恶性疾病的并发症的DVT。在存在DVT或肺栓塞的患者病史的情况下，抗凝血剂也可用作预防剂。抗凝血剂也可用于抑制经历外科手术的患者的血液凝固，例如血管内导管插入术或心脏手术。抗凝血剂的其它治疗用途包括治疗心房颤动、充血性心力衰竭、心肌梗塞和遗传或获得性血凝过快。
如本文所使用的，术语“抗血小板剂”或“抗凝聚剂(antiaggregant agent)”是用于减少血液中血小板聚集并因此抑制血栓形成的试剂。抗血小板剂在动脉循环中是有效的，在其中抗凝血剂可能不是非常有效。血小板聚集可导致例如心脏病发作、心绞痛或中风。抗血小板剂可用于预防或治疗血栓性脑血管疾病，如中风、小中风、缺血性中风或出血性中风；或心血管疾病，如高血压性心脏病、风湿性心脏病、心肌病、心房颤动、先天性心脏病、心内膜炎、主动脉瘤、外周动脉疾病、静脉血栓形成或冠状动脉疾病，例如心绞痛或心肌梗塞。
如本文所使用的，术语“血栓形成”是指在循环系统即心脏、动脉、静脉和毛细血管中，血液的血管内凝固。术语“凝血酶”是指作为血液凝固级联中几种转化的催化剂的酶。它还促进血小板活化和聚集。
术语“个体”、“患者”和“受试者”在本文中可互换使用，指人或其它动物来源的个体，并且包括期望使用本发明的方法检查或治疗的任何个体。然而，应该理解，这些术语并不暗示存在症状。落入本发明范围内的合适动物包括但不限于人、灵长类动物、家畜(例如，羊、牛、马、驴、猪)，实验室试验动物(例如，兔、小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠)、伴侣动物(例如，猫、狗)和圈养的野生动物(例如狐狸、鹿、澳洲野狗、鸟、爬行动物)。
如本文所使用的，“恶性疾病”包括癌症和癌症相关病症。
如本文所使用的，术语“治疗”等是指施用试剂以获得期望的药理学和/或生理学作用。就完全或部分预防疾病或其症状而言，该作用可以是预防性的，和/或就实现疾病和/或疾病症状的部分或完全治愈而言，该作用可以是治疗性的。就部分或完全治愈疾病或病症(例如，由IL-6介导的疾病或病症)和/或由疾病或病症引起的不良作用而言，该作用可以是治疗性的。这些术语还涵盖哺乳动物具体是人中的病症或疾病的任何治疗，并且包括：(a)在可能易患疾病或病症但尚未被诊断为患有该疾病或病症的受试者中，预防该疾病或病症或疾病或病症的症状发生(例如，包括可能与原发疾病或病症相关或由其引起的疾病或病症)；(b)抑制疾病或病症，即阻止其发展；(c)缓解疾病或病症，即引起疾病或病症的消退；(d)缓解疾病或病症的症状和/或(e)减少疾病或病症的症状的频率。
“药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂”是指可以安全地用于全身施用的固体或液体填充剂、稀释剂或包封物质。
黑唇鲍的提取物
本发明人已经发现，获自黑唇鲍加工废物的提取物或其级分包含具有抗血栓形成或抗炎活性的生物活性成分。
从加工用于消费的黑唇鲍肉获得的废物流制备提取物。使用涉及酶或化学消化、热灭活和澄清(clarification)步骤的方法从加工废物制备提取物。
因此，在第一方面，提供了黑唇鲍的提取物或其级分，其包含一种或多种生物活性成分，该提取物源自黑唇鲍加工废物。在一些实施方案中，提取物源自内脏。在一些实施方案中，加工废物是未加工的。在一些实施方案中，保留了加工废物。在一些实施方案中，加工废物是液体形式的。在一些实施方案中，加工废物是固体形式的，例如糊剂或粉末。在一些实施方案中，加工废物可以是罐装的、冷藏或冷冻的。在一些实施方案中，黑唇鲍是野生收获的鲍鱼。
在一些实施方案中，一种或多种生物活性成分选自阴离子多糖成分和蛋白成分。在一些实施方案中，蛋白成分包含胶原。在一些实施方案中，阴离子多糖成分包含一种或多种硫酸多糖成分。在一些实施方案中，阴离子多糖成分包含一种或多种糖胺聚糖样多糖。
在另一个方面，本发明提供了一种制备根据本发明的提取物的方法，所述方法包括使用酶促或化学消化方法消化黑唇鲍加工废物，从经消化的废物中分离提取物。在一些实施方案中，该方法包括酶促消化。用于酶促消化的示例性酶包括菠萝蛋白酶和/或木瓜蛋白酶。在一些实施方案中，加工废物样品被消化约16-18小时。在一些实施方案中，消化体积含有约10％w/v的加工废物。在一些实施方案中，消化体积含有约2％w/v的一种或多种酶，例如约1％w/v菠萝蛋白酶和约1％w/v木瓜蛋白酶。在一些实施方案中，将消化物在约95℃下热灭活约10分钟，之后冷却。在一些实施方案中，将消化物分级处理，以分离消化物的不同级分。在一些实施方案中，分级处理产生富含蛋白成分的级分。在一些实施方案中，分级处理产生富含阴离子多糖成分的级分。
可以使用任何合适的技术实现分级处理。合适的技术是技术人员公知的，并且说明性示例包括离心、萃取、连续液-液萃取、渗透蒸发、过滤包括膜过滤、萃取过滤和超滤膜分离、反渗透、电渗析、蒸馏、结晶、离子交换色谱、尺寸排阻色谱(凝胶过滤、凝胶渗透)和吸收色谱。
在一些实施方案中，该方法包括步骤：在消化酶存在下消化黑唇鲍加工废物以产生水性级分和沉淀物；将水性级分与沉淀物分离，从而产生提取物。在一些实施方案中，本发明的方法还包括过滤水性级分以产生滤液。在一些实施方案中，将滤液脱盐。在一些实施方案中，使用3kDa过滤器将滤液脱盐以产生作为3kDa截留物的提取物。
使用例如离子交换色谱和尺寸排阻色谱，可以将黑唇鲍提取物分离成级分。在一些实施方案中，该方法还包括将提取物分离成一种或多种富含蛋白成分或阴离子多糖成分的级分，优选使用离子交换色谱和/或尺寸排阻色谱。关于蛋白成分和阴离子多糖成分的量，本发明的提取物或提取物级分的组成，可通过本领域已知的方法容易地确定，如本文实施例中描述的那些。
因此，在另一方面，本发明提供了富含蛋白成分的黑唇鲍提取物或提取物级分。在一些实施方案中，蛋白成分包含蛋白胶原。
在另一方面，本发明提供了一种富含阴离子多糖成分的黑唇鲍提取物或提取物级分。在一些实施方案中，阴离子多糖成分包含一种或多种硫酸多糖。在一些实施方案中，阴离子多糖成分包含一种或多种糖胺聚糖样多糖成分。
在另一个方面，本发明提供了一种黑唇鲍提取物或提取物级分，其通过本发明的方法获得或是可获得的。
本发明的方法
本发明的提取物和提取物级分包含一种或多种生物活性成分。在一些实施方案中，一种或多种生物活性成分选自抗血栓形成剂和抗炎剂。在一些实施方案中，抗血栓形成剂包含一种或多种阴离子多糖成分。在一些实施方案中，抗血栓形成剂包含一种或多种糖胺聚糖样多糖成分。在一些实施方案中，一种或多种生物活性成分选自抗炎剂。在一些实施方案中，抗炎剂包含一种或多种蛋白成分。
根据本发明，已经发现获自黑唇鲍加工废物的提取物和级分产生显著且一致的体外抗血栓形成和抗炎活性。此外，还发现这些提取物和级分在类风湿性关节炎的小鼠模型中显著减少体内严重关节炎的症状。
特别值得注意的是，在类风湿性关节炎发作之前和期间喂食粉末状鲍鱼提取物的小鼠比喂食基础膳食的小鼠经历了更不严重的症状。
本发明人还发现，在临床、组织学和免疫学基础上，根据本发明的黑唇鲍加工废物提取物在类风湿性关节炎的小鼠模型中产生了积极和显著的结果。基于临床结果，从关节炎症状发作到临床试验结束，预防性施用鲍鱼提取物显著降低了脚趾、爪和腕的肿胀和畸形(图7和图8)。基于组织学，鲍鱼提取物的预防性和治疗性施用显著减少了在关节和爪中观察到的总滑膜炎(图11)。最后，基于免疫学，鲍鱼提取物的预防性施用和鲍鱼提取物的治疗性施用显著降低了IL-6的循环水平(图9)，这是一种在慢性炎症和类风湿性关节炎中起关键作用的细胞因子(Gabay C,Interleukin-6and chronic inflammation,ArthritisRes Ther.,2006；8Suppl2:S3；Hennigan S等人,Interleukin-6inhibitors in thetreatment of rheumatoid arthritis.Ther Clin Risk Manag,2008Aug；4(4):767-75)，这指示黑唇鲍提取物在治疗如类风湿性关节炎的炎性疾病中的显著潜力。
因此，本发明的提取物和级分被认为可用于治疗或预防例如以上所述的IL-6介导的疾病或病症。在一些实施方案中，该级分是富含蛋白成分的级分。在一些实施方案中，IL-6介导的疾病或病症是自身免疫疾病或病症，比如，但不限于类风湿性关节炎、炎性肠病(尤其是溃疡性结肠炎和克罗恩病)、湿疹、银屑病和重症肌无力、或移植排斥(包括肾移植)。
在一些实施方案中，本发明的提取物和级分用于治疗或预防类风湿性关节炎。
因此，本发明提供了一种治疗受试者中IL-6介导的病症的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的根据本发明的提取物，优选富含蛋白成分的级分。
本发明进一步提供一种治疗受试者中炎性病症的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的根据本发明的提取物，优选富含蛋白成分的级分。在一个实施方案中，炎性病症是自身免疫病症。
还提供了一种治疗受试者中自身免疫病症的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的根据本发明的提取物，优选富含蛋白成分的级分。
在另一方面，本发明提供了本发明的提取物、优选富含蛋白成分的级分在制造用于治疗IL-6介导的病症、炎性病症或自身免疫病症的药物中的用途。
在一些实施方案中，所述病症是类风湿性关节炎。
使用类风湿性关节炎小鼠模型的体内抗炎活性的进一步研究，用于评估低剂量和高剂量鲍鱼提取物的预防性和治疗性施用。口服施用显著降低关节炎症状，包括减少肿胀和畸形，同时保持动物体重。
因此，本发明还提供了本发明的提取物或级分作为药物的用途。在一些实施方案中，配制药物用于口服施用。还提供了本发明的提取物在制造膳食补充剂、营养制品、功能性食品或功能性食品原料中的用途。
本发明人还发现来自黑唇鲍加工废物的提取物和级分在体外产生显著的且一致的抗血栓形成活性。本发明的提取物或级分被认为具有抗血栓形成或抗凝血性质，因此被认为可用于治疗或预防血栓形成或抑制凝血酶活性。
因此，本发明还提供了一种抗血栓形成剂或抗凝血剂，其包含有效量的本发明提取物，优选富含阴离子多糖成分的级分。在一些实施方案中，抗血栓形成作用通过肝素辅助因子II或抗凝血酶介导。
在另一方面，本发明提供了一种在受试者中抑制血栓形成或抑制凝血酶活性的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的根据本发明的提取物，优选富含阴离子多糖成分的级分。
在另一方面，本发明提供了根据本发明的提取物、优选富含阴离子多糖成分的级分，在制造用于抑制血栓形成或凝血酶活性的药物中的用途。
待治疗的受试者、个体或患者是哺乳动物受试者，包括但不限于人、灵长类动物、家畜如羊、牛、猪、马、驴和山羊；实验室试验动物如小鼠、大鼠、兔和豚鼠；伴侣动物，如猫和狗，或者圈养的野生动物，如饲养在动物园的动物。在一个具体实施方案中，受试者是人。
“有效量”是指至少部分地获得期望应答、或延迟发作或抑制进展或完全停止待治疗的具体病症的发作或进展所必需的量。该量依据待治疗个体的健康和身体状态、待治疗个体的分类组、期望的保护程度、组合物的制剂、医学状况的评估和其它相关因素而变化。预计该量将落在可通过常规试验确定的相对宽的范围内。例如，涉及人患者的有效量可以在约0.1ng/kg体重/剂量至1g/kg体重/剂量的范围内。优选地，剂量在1μg至1g/kg体重/剂量的范围，如1mg至1g/kg体重/剂量的范围。在一个实施方案中，剂量为1mg至500mg/kg体重/剂量的范围。在另一个实施方案中，剂量为1mg至250mg/kg体重/剂量的范围。在另一个实施方案中，剂量为1mg至100mg/kg体重/剂量的范围，如至多50mg/kg体重/剂量。在另一个实施方案中，剂量为1μg至1mg/kg体重/剂量的范围。可以调整剂量方案以提供最佳治疗应答。例如，可以每天、每周、每月或其它合适的时间间隔施用几个分开的剂量，或者可以根据状况按比例减少剂量。
本文提及的“治疗”和“预防”被认为是其最广泛的含义。术语“治疗”不一定暗示治疗受试者直至完全康复。“治疗”还可以减少现有病症的严重程度。术语“预防”并不一定指受试者最终不会患有疾病病症。术语“预防”可以被认为包括延迟具体病症的发作。因此，治疗和预防包括改善具体病症的症状或预防或以其它方式减少发展具体病症的风险。
在一些实施方案中，本发明的提取物可以与另一种治疗一起施用。施用可以在单一组合物中或在分开的组合物中同时或相继进行，使得每种化合物或治疗在体内相同时间段内是有活性的。
本发明的提取物可以与一种或多种其它营养制品一起施用，例如Ω-3油(Omega-3oils)、葡萄糖胺或硫酸软骨素。提取物，具体是富含蛋白成分的提取物级分，也可以与抗炎剂一起施用，包括类固醇，如可的松、氢化可的松、泼尼松龙、甲基强的松龙、泼尼松、布地奈德、莫米松、曲安西龙和aclometasone，与非甾体抗炎药(NSAID)一起施用，如阿司匹林、二氟尼柳、双水杨酯、布洛芬、萘普生(napoxen)、非诺洛芬、酮洛芬、氟比洛芬、奥沙普秦、洛索洛芬、吲哚美辛、苏灵大、依托度酸、酮咯酸、双氯芬酸、萘丁美酮、吡罗昔康、美洛昔康、替诺昔康、屈恶昔康、氯诺昔康、甲芬那酸(metenamic acid)、甲氯芬那酸、氟芬那酸、托芬那酸、塞来昔布、罗非考昔、伐地考昔、帕瑞考昔、依托考昔和ferocoxib。
本发明的提取物和级分被认为是有益于健康和/或良好状态的，因此还提供了一种用于增强或维持受试者良好状态的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的本发明的提取物或级分。
本发明的组合物
本发明的提取物或级分可以单独作为纯提取物(neat extract)摄取。然而，在一些情况下，优选配制用于消费的提取物。例如，提取物可以配制成膳食补充剂、营养制品、功能性食品或功能性食品原料。
在另一方面，本发明还提供一种药物、膳食补充剂、营养制品、功能性食品或功能性食品原料，其包含根据本发明的提取物或级分。
可以将本发明的提取物或级分配制成食品或饮料产品。动物食品也被认为是本发明的一部分。
在一些实施方案中，膳食补充剂、营养制品、功能性食品或功能性食品原料还包含一种或多种可接受的赋形剂、填充剂或载体。在一些实施方案中，本发明的提取物或级分可以与一种或多种其它活性原料组合使用，所述其它活性原料选自例如营养制品、功能性食品或功能性食品原料。活性原料的含量比可以根据使用目的合适地确定。膳食补充剂、营养制品、功能性食品或功能性食品原料可根据常规方法合适地使用。一般地，当生产固体或液体食品时，本发明的提取物可以加入至多50％w/w，更优选加入至多30％、20％或10％w/w。一般地，当生产饮料时，本发明的提取物可以加入至多20％w/w，更优选至多15％、10％或5％w/v。
合适的赋形剂、填充剂或载体是本领域已知的，包括淀粉、糖、食用油、水、甘油、树胶、甲基纤维素等。
本发明的膳食补充剂、营养制品、功能性食品或功能性食品原料组合物还可包含额外的成分，比如调味剂、着色剂、甜味剂、增稠剂、pH调节剂、稳定剂或防腐剂。
本发明的膳食补充剂、营养制品、功能性食品或功能性食品原料组合物可进一步包含额外的活性原料，比如营养素，维生素或电解质。
营养制品、功能性食品或食品原料组合物可以配制成例如粉末、颗粒、液体、糊剂、油或凝胶。
膳食补充剂可以配制成例如丸剂、片剂、胶囊、软胶囊(softgels)、软明胶胶囊(gelcaps)、糊剂或粉末。膳食补充剂也可以配制成液体，比如溶液或悬浮液。
可以根据个体的具体需要确定根据本发明的提取物或级分的所需的每日剂量。典型的每日摄入量被认为是100mg至500mg/kg体重/天。在一个方面，级分的每日摄入量小于100mg/kg体重/天。
在一些实施方案中，本发明的提取物或级分可以掺入常规食物中。因此，本发明进一步提供了包含本发明的提取物的食物。
在本发明的另一个方面，提供了药物组合物，其包含根据本发明的提取物或级分，以及一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂。在一些实施方案中，所述组合物用于治疗或预防炎性疾病或病症。在一些实施方案中，所述组合物用于治疗自身免疫疾病或病症，比如类风湿性关节炎。在一些实施方案中，所述级分富含蛋白成分。在一些实施方案中，所述级分富含阴离子多糖成分。
虽然可以单独施用本发明的提取物或级分用于治疗，在一些实施方案中，活性提取物或级分以药物组合物的形式提供。
因此，在本发明的另一方面，提供了一种药物组合物，其包含本发明的提取物或级分，以及至少一种药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
可以使用本领域已知的方法配制和施用本发明的药物组合物或用于本发明方法的组合物。用于配制和施用的技术可以在Remington:The Science and Practice ofPharmacy,Loyd V.Allen,Jr(Ed),The Pharmaceutical Press,伦敦,2012年9月第22版中找到。
在与组合物的其它原料相容并且对其接受者无害的意义上，载体必须是“可接受的”。
药物组合物或制剂包括适合于口服、直肠、鼻、局部(包括口腔和舌下)、阴道或肠胃外(包括肌肉内、皮下和静脉内)施用的那些，或者以适合于通过吸入或吹入施用的形式。因此，本发明的化合物与常规佐剂、载体、赋形剂或稀释剂一起可以以药物组合物和其单位剂量的形式放置，并且这种形式可以以固体使用，比如片剂或填充胶囊，或者以液体使用，如溶液、悬浮液、乳剂、酏剂或填充有上述液体的胶囊，全部用于口服，以栓剂的形式用于直肠施用；或者以无菌注射溶液的形式用于肠胃外(包括皮下)使用。这样的药物组合物和其单位剂型可包含常规比例的常规原料，具有或不具有额外的活性化合物或原理，并且这样的单位剂型可含有任何合适的有效量的活性原料，其与预期待使用的每日剂量范围相当。因此，每片含有10毫克活性原料或更广泛地0.1至200毫克的制剂是合适的代表性的单位剂型。本发明化合物可以多种口服和肠胃外剂型施用。对本领域技术人员为常规的是，以下剂型可包含作为活性成分的本发明提取物。
为了从本发明的提取物或级分制备药物组合物，药学上可接受的载体可以是固体或液体。固体形式的制剂包括粉末、片剂、丸剂、胶囊、扁囊剂(cachets)、栓剂和可分散的颗粒。固体载体可以是一种或多种物质，它们也可以作为稀释剂、调味剂、增溶剂、润滑剂、悬浮剂、粘合剂、防腐剂、片剂崩解剂或包封材料。
在一个优选的方面，配制提取物或级分用于口服施用。合适地，将提取物或级分配制成粉末、片剂、丸剂、胶囊或可分散的颗粒。
在片剂中，将活性成分与具有必需结合能力的载体以合适的比例混合，并压制成期望的形状和尺寸。
优选地，粉末和片剂含有5-70％百分比的活性化合物。合适的载体是碳酸镁、硬脂酸镁、滑石、糖、乳糖、果胶、糊精、淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、低熔点蜡、可可脂等。术语“制剂”旨在包括活性化合物与作为载体以便提供胶囊的包封材料的制剂，其中活性成分(具有或不具有载体)被载体包围，因此与载体结合。
用于口服施用的液体形式制剂包括溶液、悬浮液和乳剂，例如水或水-丙二醇溶液。适合口服使用的水溶液可以通过将活性成分溶解在水中并如期望的加入合适的着色剂、调味剂、稳定剂和增稠剂来制备。适合于口服使用的水悬浮液可以通过将细碎的活性成分用粘性材料分散在水中来制备，所述粘性材料比如天然或合成树胶、树脂、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠或其它公知的悬浮剂。
还包括固体形式的制剂，其旨在使用前不久转化为用于口服施用的液体形式制剂。这种液体形式包括溶液、悬浮液和乳剂。除活性成分外，这些制剂可含有着色剂、调味剂、稳定剂、缓冲剂、人造和天然甜味剂、分散剂、增稠剂、增溶剂等。
或者，活性原料可以以干粉形式提供，例如化合物在合适的粉末基质中的粉末混合物，所述粉末基质比如乳糖、淀粉、淀粉衍生物如羟丙基甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。
当期望时，可以使用适于持续释放活性原料的制剂。
优选地，药物制剂为单位剂型。在这种形式中，制剂细分为含有适量活性成分的单位剂量。单位剂型可以是包装的制剂，该包装含有离散量的制剂，如泡罩包装片剂、胶囊以及在瓶或安瓿中的粉末。此外，单位剂型可以是胶囊、片剂、扁囊剂或锭剂本身，或者它可以是包装形式的任何这些中的合适的数量。
本领域技术人员将理解，许多变体和修改将是显而易见的。应该认为对于本领域技术人员来说显而易见的所有这些变体和修改都落入本发明之前广泛出现的精神和范围内。
为了使本发明易于理解并付诸实践，现在将通过以下非限制性实施例描述具体优选的实施方案。
实施例
使用以下黑唇鲍加工废物样品：
样品1：液体；经加工的和袋装的鲍鱼内脏；野生收获的鲍鱼
样品2：固体(糊剂)；经加工的和罐装的鲍鱼内脏；野生收获的鲍鱼
样品3：固体(粉末)；经加工的鲍鱼内脏；野生收获的鲍鱼
样品4：固体；未加工的(新鲜的)鲍鱼内脏；野生收获的鲍鱼
除粉末样品外，所有样品在4℃下新鲜运输或者在干冰上冷冻和运输，然后在-20℃下储存直至需要时。将粉末样品储存在室温(～21℃)。
提取物制备
使用包括消化、离心、过滤和脱盐的方法从加工废物制备提取物。使用两种食品级酶，菠萝蛋白酶和木瓜蛋白酶(可从例如Enzyme Solutions Pty Ltd，Vic 3136商业获得)，将所有加工废物样品在50℃下消化过夜(16-18小时)。将所有固体废物样品切成小块(1-2cm2)。消化体积范围为50-1000mL(在水中)，含有10-20％w/v加工废物(5-200g)和0.5-1％w/v加入的每种酶(0.25-10.0g)(Osborne SA等人,Glycobiology.2008Mar；18(3):225-34)。在过夜孵育后，将消化物在95℃热灭活10-20分钟，然后在冰上冷却，之后在5,940-50,000g离心10-30分钟以除去任何脂肪(顶部)层和未消化的沉淀物(沉淀)。保留水层(上清液)并使用2μm和1μm(Whatman玻璃微纤维)预过滤器依次过滤，然后用0.45μm(Millipore混合纤维素酯)过滤器进行最终过滤。然后使用3kDa(Amicon Ultra-15，Ultracel低结合再生纤维素膜)离心过滤装置将经过滤的样品脱盐，产生截留物(>3kDa且含有低盐/无盐)和滤液(<3kDa且含有盐)提取物样品。选择截留物样品用于进一步分析，因为盐在定量和生物活性分析中可能存在干扰。
除非另有说明，贯穿本说明书，术语“提取物”将指3kDa截留物样品。
总蛋白评估
根据制造商的说明，使用Pierce BCA(二喹啉甲酸)蛋白分析试剂盒(ThermoFisher Scientific,VIC,3179,澳大利亚)评估在提取物中的总蛋白含量。简言之，将25μl标准品(牛血清白蛋白)和提取物在水中稀释，并以一式三份加入96孔板(聚苯乙烯)中。制备200μl的BCA工作试剂(通过将试剂A与试剂B以50：1的比例混合)，并加入到每孔中。将板混合并在37℃下孵育30分钟，之后在562nm处读取板吸光度。构建线性标准曲线，并用于插入(interpolate)稀释的提取物中的总蛋白浓度。
总胶原评估
根据制造商的说明，使用QuickZyme Biosciences总胶原分析试剂盒(Bio-Scientific,Kirrawee,NSW,澳大利亚)评估在提取物中的总胶原含量。简言之，将125μl标准品(大鼠尾胶原)和提取物加入125μl 12M HCl中，并在95℃下在螺旋盖管中水解20小时。水解后，将35μl经水解的样品和标准品转移到提供的96孔板中，与75μl分析缓冲液混合，并在室温(～21℃)孵育20分钟。然后向每孔中加入75μl检测试剂，将所得溶液混合并在60℃下孵育30分钟。在570nm处读取板吸光度。构建线性标准曲线，并用于插入提取物中的总胶原浓度。所有分析均以一式两份或一式三份进行。
硫酸多糖评估
使用两种不同的分析评估硫酸多糖含量。
初步使用碱性1,9-二甲基亚甲基蓝分析(DMMB)来评估硫酸多糖含量，并使用Blyscan硫酸糖胺聚糖分析(Labtek Pty Ltd，QLD 4500，澳大利亚)确定更精确测量硫酸多糖含量所需的稀释度。
DMMB染料是一种异染色染料，其检测硫酸糖胺聚糖(Osborne SA等人,Glycobiology.2008Mar；18(3):225-34)以及许多其它类型的硫酸化和阴离子多糖(Cinelli LP等人,Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol.2009Sep；154(1):108-12；Keler T等人,Anal Biochem.1986Jul；156(1):189-93.19-20)。
Blyscan硫酸糖胺聚糖分析也基于DMMB染料。根据制造商的说明，在提取物中评估硫酸多糖浓度。简而之，将25μl标准品(来自牛软骨的硫酸软骨素)和样品以一式三份加入到V底聚丙烯板(PerkinElmer，墨尔本3150，澳大利亚)中。每孔加入250μl Blyscan染料试剂。然后将板置于定轨振荡器上在室温下30分钟，之后以2090g离心10分钟。除去上清液(液体)并替换为250μl Blyscan染料解离试剂。将板在定轨振荡器上混合30分钟，之后将200μl的每种标准品和样品转移到聚苯乙烯96孔板中，在656nm处读取吸光度。构建线性标准曲线，用于插入提取物中的硫酸多糖浓度。
体外抗炎活性
使用基于体外细胞的分析指示就抗炎活性方面而言的生物活性。细菌脂多糖(LPS)用于在鼠巨噬细胞系RAW 264.7中诱导炎性细胞状态(Sosroseno W等人,OralMicrobiol Immunol.2002Apr；17(2):72-8)。如使用Griess分析测量的，通过细胞产生的一氧化氮(NO)指示炎症。阳性对照或鲍鱼加工废物提取物所致的NO产生的降低，指示抗炎活性。
如前所述(Cho JY等人,Eur J Pharmacol.2000Jun 23；398(3):399-407；Kim AR等人,.Arch Pharm Res.2005Mar；28(3):297-304)，以对槲皮素阳性对照(Sigma AldrichCorporation)和提取物的应答测量抗炎活性，进行了一些微小的修改。RAW264.7细胞(美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)，www.ATCC.com)常规培养在RPMI-1640介质(Thermo Fisher Scientific,Vic 3179,澳大利亚)中，介质中补充有100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素(Life Technologies，Thermo Fisher Scientific，Vic 3179，澳大利亚)和10％v/v胎牛血清(体外)，在37℃和5％CO2，在湿润空气中生长。持续两天进行抗炎分析。在第一天，将细胞以6×104个细胞/孔的密度接种到96孔板中。将在培养介质中的300ng/mL的LPS加入具有阳性对照(使用0-100μM浓度范围的槲皮素的6个点的剂量应答)或提取物的细胞中。将细胞培养48小时，并且在第二天，通过Griess反应在细胞介质中测量由RAW 264.7细胞分泌的NO(将50μL细胞介质加入到50μL Griess试剂(Sigma AldrichCorporation)中。还采用亚硝酸钠(0-50μM)制备标准曲线，并用于插入细胞介质中的NO产生。所有分析一式三份进行(n＝3)。还根据制造商的说明，使用MTS CellTiterAQueous非放射性细胞增殖分析(Promega Corporation，VIC 3122，澳大利亚)测量对LPS、槲皮素和提取物应答的细胞活力。
体外凝血酶抑制
使用体外动力学分析测量就凝血酶抑制方面而言的生物活性，其采用显色底物Chromozym TH(CH-TH)(Dupouy D等人,Thromb Haemost.1988Oct31；60(2):236-9)。凝血酶是丝氨酸蛋白酶，其通过将可溶性纤维蛋白原转化为不溶性纤维蛋白链而参与血液凝固。CH-TH被凝血酶切割，产生黄色化合物(称为对硝基苯胺)。凝血酶可被肝素辅助因子II(HCII)和抗凝血酶(AT)通过不同的硫酸多糖抑制。对硝基苯胺的产生的降低指示抗血栓形成活性，这也可能导致抗凝固活性。
在96孔板中测量肝素辅助因子II(HCII)介导的凝血酶抑制(如前所述的聚苯乙烯动力学分析(Dupouy D等人,Thromb Haemost.1988Oct 31；60(2):236-9)，并进行修改(Osborne SA等人,Glycobiology.2008Mar；18(3):225-34)。简言之，HCII、分析缓冲液(0.02M Tris-HCl pH 7.4/0.15M NaCl/1mg/mL PEG)，以及提取物或商业标准品(来自Sigma Aldrich Corporation的猪肝素)混合并在室温下孵育2分钟，之后加入150nM凝血酶。将该溶液温和混合1分钟，然后加入100μM CH-TH。分析在37℃下孵育40分钟，间隔2分钟，在405nm处测量吸光度(SpectraMax PLUS 384酶标仪，Molecular Devices)。提取物或肝素标准品对HCII介导的凝血酶抑制表示为40分钟后凝血酶活性降低的百分比。每样品每次以一式三份(n＝3)分析，并表示为平均值、标准误差。
使用384孔格式的机器人辅助分析，测量在提取物和级分中抗凝血酶(AT)介导的凝血酶抑制。在该动力学分析中，凝血酶切割Chromozym TH，产生两种分子：残留肽和4-硝基苯胺，其可通过405nm处的吸光度变化来测量。分析标准品肝素(终浓度范围：0.016-1.04μg/mL)或样品中存在的分子与ATIII(0.2μg/mL)结合，与凝血酶(2.03ng/mL)形成的三元复合物，防止其切割chromozym TH并形成4-硝基苯胺。稀释肝素标准品，最终浓度为0.016-1.04μg/mL。提取物或肝素标准品对ATIII介导的凝血酶的抑制表示为40分钟后凝血酶活性降低的百分比。每样品每次以一式三份分析(n＝3)，并表示为平均值、标准误差。
体外血浆和血液凝固分析
凝血酶原时间(PT)分析
通过将100μL柠檬酸盐血浆加入玻璃凝固管中，并且在Hyland-Clotek凝固机器(Hyland，USA)的加热块上在37℃下孵育5分钟，以测量凝血酶原时间(PT)。机器以秒为单位测量时间，直到凝固形成。将50μL不同浓度的鲍鱼提取物加入管中，使用盐水作为空白。采用血浆将总体积调节至150μL，之后加入100μL的以开始凝固(Siemens，545477，USA)。
活化部分凝血活酶时间(aPTT)分析
通过将100μL柠檬酸盐血浆、100μL Triniclot(TriniCLOT aPTT,HS,Tcoag,Ireland Limited)和不同浓度的鲍鱼提取物加入凝固管中来确定活化部分凝血活酶时间(aPTT)。通过加入盐水将最终体积调节至250μL。将凝固管在Hyland-Clotek凝固机器的加热块中在37℃下孵育5分钟，之后加入50μL 50mM Ca+2以开始凝固。
离子交换色谱
为了分离生物活性分子并制备富含胶原或阴离子多糖的级分，使用阴离子交换色谱基于电荷分离生物活性分子。
使用填充有Q Sepharose Fast Flow或Q Sepharose Big Beads(GE Healthcare，Little Chalfont，UK)的柱子，对鲍鱼加工废物提取物进行阴离子分离。将提取物施加于缓冲液A(水)中的柱子，并使用线性梯度0-100％的缓冲液B，在缓冲液B(2M NaCl)中洗脱。施加样品以及在缓冲液A中洗涤后的流过物(即未结合的分子)，与梯度级分一起收集。
类风湿性关节炎的小鼠模型
使用已建立且经验证的类风湿性关节炎动物模型，即小鼠中的II型胶原诱导的关节炎(CIA)模型(van Duivenvoorde LM等人,Arthritis.Rheum.2004Oct；50(10):3354-64；Leung BP等人,J.Immunol.2004Jul 1；173(1):145-50；van Holten J等人,ArthritisRes.Ther.2004；6(3):R239-49)，研究了就体内抗炎活性方面而言的生物活性。将两种剂量鲍鱼提取物，100mg/kg体重/天和500mg/kg体重/天(分别为剂量1和剂量2)掺入颗粒饲料中，并在胶原II诱导的关节炎(CIA)之前和期间施用21天(预防剂量)，或者在诱导和CIA症状发作后(治疗剂量)施用21天。另外，将两种剂量鲍鱼提取物施用无CIA的小鼠以监测鲍鱼提取物的任何副作用。
具体地，称重108只雄性DBA-1小鼠(10-12周龄)并分成9组(n＝12只小鼠/组)。试验分两批54只小鼠(n＝6只小鼠/组)进行。通过采用异氟烷麻醉动物，之后在距离尾底部约1cm的两个位点皮内注射在弗氏完全佐剂(Sigma Aldrich Company)中的II型鸡胶原来实现CIA诱导。然后每3天监测动物并每周称重，之后在第一次注射后21天进行加强免疫(在距离尾底部约2cm的两个位点)。在加强免疫后，监测动物，每3天称重并对关节炎症状评分，总共3周。试验中还包括抗炎药泼尼松龙作为阳性处理对照。
所述组接受以下处理：
1.对照饲料；无CIA
2.剂量1；无CIA
3.剂量2；无CIA
4.对照饲料+CIA
5.剂量1(预防性)+CIA
6.剂量2(预防性)+CIA
7.剂量1(治疗性)+CIA
8.剂量2(治疗性)+CIA
9.泼尼松龙(治疗性+CIA)
试验时间线
使用标准关节炎评分系统确定临床评分，如下所述：
评分0：无关节炎
评分1：仅1-2只脚趾受影响
评分2：3或更多只脚趾和/或爪肿胀(掌/跖)
评分3：腕/踝肿胀
评分4：畸形伴有腕/踝关节僵硬。
在终止日，在安乐死之前，在麻醉下通过心脏穿刺收集血液样品。使血液样品在室温下凝固1小时，离心并收集血清。通过ELISA确定抗胶原II抗体和细胞因子。同样在终止日，从每只动物收获一膝关节和后爪，固定在10％中性缓冲福尔马林中，在10％甲酸、5％福尔马林中脱钙，以及石蜡包埋。膝的矢状切片采用苏木精和伊红、以及甲苯胺蓝和固绿染色。使用标准组织病理学分级系统对组织学切片进行评分。
统计学分析
除非另有说明，使用单因素ANVOA进行所有统计学分析，然后使用Tukey's或Dunnett's多重比较检验进行验后比较。P值小于0.05被认为是显著的。使用GraphPadPrism 6Software for Windows(GraphPad,圣地亚哥加利福尼亚USA,www.graphpad.com)进行这些计算。
总蛋白、胶原和硫酸多糖含量的评估
所制备的鲍鱼加工废物提取物中的总蛋白、胶原和硫酸多糖含量的评估在表1中详述。总共研究了四种不同类型的鲍鱼加工废物。
体外抗炎活性
对鲍鱼加工废物提取物、商业鲍鱼提取物和分析阳性对照(槲皮素)的应答测量的抗炎活性示于表2中。除非另有说明，在施加鲍鱼提取物或其它样品后，细胞活力保持在80％以上(或低于20％细胞死亡或毒性)。鉴于一氧化氮产生降低70％是阳性对照的最大作用，与这种降低相当的结果被认为是阳性的。所有鲍鱼提取物和商业鲍鱼提取物均产生阳性结果，使RAW 264.7细胞中一氧化氮的产生降低40-80％。具体地，样品2-2通过显著降低一氧化氮产生而显示出最大的抗炎活性，其高于分析阳性(槲皮素)对照(图1)。
体外凝血酶抑制
表3中显示了对鲍鱼加工废物提取物和分析阳性对照(肝素)的应答测量的肝素辅助因子II介导的凝血酶抑制。在这些分析中，分析未稀释的鲍鱼提取物以观察最大抗血栓形成潜力。
除样品3-1外的所有鲍鱼提取物均显示出与分析阳性对照(肝素)相当的凝血酶抑制(图2)。
表4中显示了对鲍鱼加工废物提取物和分析阳性对照(肝素)应答所测量的抗凝血酶和肝素辅助因子II介导的凝血酶抑制。在这些分析中，采用几种稀释度分析鲍鱼提取物，以观察完整的抗血栓形成潜力。
表1：鲍鱼加工废物样品中评估的总蛋白、胶原和硫酸多糖含量
表2：从鲍鱼加工制备的提取物的体外抗炎活性
表注释：(1)样品3-1(粉末)和商业鲍鱼提取物(粉末)以干重计加入分析中(mg粉末溶解于水中)；(2)施加样品4-1后观察到显著的细胞毒性；(3)以微摩尔(μM)计将槲皮素加入分析中。
表3：鲍鱼加工废物制备的提取物体外HCII介导的凝血酶抑制
表4：鲍鱼加工废物制备的提取物体外抗凝血酶(AT)和肝素辅助因子II(HCII)介导的凝血酶抑制
离子交换色谱
假设鲍鱼提取物中的硫酸多糖含量使鲍鱼提取物产生负电荷，选择阴离子交换色谱将鲍鱼提取物分级处理成不同的分子混合物(pool)。使用Pierce BCA总蛋白和DMMB分析在混合的级分中确定总蛋白含量和硫酸多糖的评估。鲍鱼提取物1-1和2-1的阴离子分离如图3所示。洗脱曲线指示与柱子弱结合的大部分蛋白，采用低NaCl浓度洗脱，然而硫酸碳水化合物与柱子的结合更强，需要更高浓度的NaCl以从柱子洗脱。为了收集类似电荷的分子组，收集流过物，并按照如下所述混合级分。在进一步分析之前，使用3kDa离心过滤装置(Amicon Ultra-15，Ultracel低结合再生纤维素膜)将所有阴离子交换样品脱盐，以除去通过线性盐梯度加入的NaCl。在加载样品之后并且在NaCl梯度开始之前，仅使用水进行洗涤步骤。还收集洗涤样品，分析并发现不含蛋白或硫酸化多糖。
1.流过物
2.混合物1：级分1-4
3.混合物2：级分5-18
4.混合物3：级分19-25
5.混合物4：级分26-30
体外抗炎活性
表5中显示了对鲍鱼阴离子交换色谱混合的级分和分析阳性对照(槲皮素)的应答测量的抗炎活性。在施加混合的级分和阳性对照后，细胞活力保持在80％以上(或低于20％细胞死亡或毒性)。
在阴离子交换流过物样品中(流过)保留了大部分抗炎活性，其使一氧化氮产生降低47-64％(图4)。对1-1、2-1和2-2流过样品应答的抗炎活性与最高阳性分析对照(10μM槲皮素)相当，或比其更高。来自1-2的流过样品显著低于最高分析阳性对照，但仍比最低阳性分析对照(槲皮素1μM)更具活性。混合的级分使一氧化氮的产生降低了23-38％。对所有混合的级分的抗炎应答与最低分析阳性对照相当或显著小于最低分析阳性对照，进一步证实了阴离子交换流过样品中抗炎活性的保留。
表5：从鲍鱼提取物获得的阴离子交换色谱级分的体外抗炎活性
体外凝血酶抑制
表6中显示了对鲍鱼阴离子交换色谱流过和混合的级分以及分析阳性对照(肝素)的应答测量的肝素辅助因子II介导的凝血酶抑制。在这些分析中，分析未稀释的鲍鱼提取物以观察最大抗血栓形成潜力。
表6：从鲍鱼提取物获得的阴离子交换色谱级分的体外肝素辅助因子II介导的凝血酶抑制
在阴离子交换样品的混合物2-4中保留了大部分凝血酶抑制。具体地，混合物3使凝血酶活性降低了50-93％(图5)。对混合物1-1、1-2和2-2的3样品的应答的凝血酶抑制与最高阳性分析对照(0.0625mg/mL肝素)相当。来自2-1的混合物3样品显著低于最高分析阳性对照，但仍比最低阳性分析对照(0.001mg/mL肝素)更具活性。混合物1和流过样品仅使凝血酶活性降低1-9％，显著低于最低分析阳性对照，并进一步证实阴离子交换样品的混合物2-4保留凝血酶抑制。
体内抗炎活性
使用胶原诱导的类风湿性关节炎(CIA)小鼠模型评估体内抗炎活性。将大规模的鲍鱼提取物(样品3-1)以两种剂量(100和500mg/kg体重/天)包括在基础膳食中，并在关节炎诱导之前和之后喂给小鼠。在诱导关节炎后，还将以1mg/kg体重/天的剂量的阳性药物对照泼尼松龙喂给小鼠。通过临床结果、疾病发病率、最终体重和循环胶原II抗体水平评估鲍鱼和泼尼松龙治疗对关节炎严重程度的作用。使用标准关节炎评分系统的临床结果显示出贯穿试验中广泛的症状严重程度(图6)。
在试验的最后一天(第20天)，在未诱导发展关节炎的小鼠中未观察到不良症状(图7)，指示口服鲍鱼不产生促炎症状。通过使用SAS的GLM程序(http://support.sas.com/en/support-home.html；https://support.sas.com/documentation/cdl/en/statug/63033/HTML/default/viewer.htm#glm_toc.htm)，比较从发作当天(第6天)到第20天的临床评分的最小二乘平均值，贯穿疾病进展对治疗组与CIA阴性对照进行比较(图8)。这些比较显示，采用鲍鱼提取物(剂量1和剂量2)预防性治疗使平均临床评分降低～50％(p<0.0001)和20％(p<0.05)。采用鲍鱼提取物剂量1的治疗性治疗使平均临床评分降低～30％(p<0.001)，然而采用鲍鱼提取物剂量2治疗性治疗使平均临床评分增加5％(不显著，p＝0.4374)。泼尼松龙的治疗性治疗显著降低临床评分～70％(p<0.0001)。
贯穿试验，收集动物体重，并且在CIA组中保持稳定，而无论治疗类型如何(数据未显示)。在第21天收集的血清样品中还测量了细胞因子(IL2、IL-6、IL-10、IFN-γ和TNF-α)和II型胶原抗体的循环水平。IL-2、IL-10、IFN-γ和TNF-α在所有治疗组中保持低水平(数据未显示)，然而在关节炎诱导后IL-6显著升高(图9)。在施用鲍鱼提取物和泼尼松龙之后，除了治疗性施用鲍鱼提取物剂量1之后以外，所有治疗组中IL-6的循环水平显著降低。在所有CIA组中循环II型胶原蛋白抗体水平保持高水平(图10)。组织学评分还显示预防性鲍鱼剂量2之后，总滑膜炎降低(图11)。
抗凝血活性
使用血液和血浆凝固分析凝血酶原时间(PT)和活化部分凝血活酶时间(aPTT)测量体外抗凝血活性。在两种分析中样品1-2和2-2以剂量依赖性方式延迟凝固时间(表7中显示)，指示鲍鱼提取物在血液和血浆中充当抗凝血分子。
测量了对从鲍鱼提取物制备的级分的应答的体外抗凝血活性。从样品2-2制备阴离子交换级分，并如表8中所述混合。含有最高量的硫酸碳水化合物和较低量蛋白的混合物在aPTT和PT分析中延迟凝固时间最多(表9中显示)，指示抗凝血活性与硫酸多糖含量一致，而非蛋白含量。
表7：对鲍鱼加工提取物应答的凝血酶原(PT)和活化部分凝血酶时间(aPTT)
表8：来自阴离子交换分离的鲍鱼加工废物提取物的混合样品的描述(样品2-2)
表9：对来自阴离子交换分离的鲍鱼加工废物提取物的混合样品的应答的凝血酶原(PT)和活化部分凝血酶时间(aPTT)(样品2-2)
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本文对任何参考文献的引用不应被解释为承认这样的参考文献可作为本申请的“现有技术”获得。
贯穿本说明书，目的是描述本发明的优选实施方案，而不是将本发明限制于任何一个实施方案或具体的特征集合。因此，本领域技术人员将理解，根据本公开，在不脱离本发明的范围的情况下，可以在示例的具体实施方案中进行不同的修改和改变。所有这些修改和改变都旨在包括在所附权利要求的范围内。

Claims (28)

1.一种黑唇鲍(澳大利亚黑鲍(Haliotis rubra))的提取物或其级分，其包含一种或多种生物活性成分，所述提取物源自黑唇鲍加工废物。
2.根据权利要求1所述的提取物或级分，其中所述提取物或级分源自未加工的加工废物。
3.根据权利要求1或2所述的提取物或级分，其中一种或多种生物活性成分选自抗血栓形成剂和抗炎剂。
4.根据权利要求1或2所述的提取物或级分，其中所述一种或多种生物活性成分选自蛋白和阴离子多糖。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的提取物级分，其富含蛋白成分。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的提取物级分，其富含阴离子多糖成分。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的提取物或级分作为药物、膳食补充剂、营养制品、功能性食品或功能性食品原料的用途。
8.一种药物、膳食补充剂、营养制品、功能性食品或功能性食品原料，其包含权利要求1至6中任一项所述的提取物或级分。
9.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至6中任一项所述的提取物或级分，以及一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂。
10.一种抗炎剂，其包含权利要求1至5中任一项所述的提取物或级分。
11.一种治疗受试者中IL-6介导的病症的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的根据权利要求1至5中任一项所述的提取物或级分。
12.一种治疗受试者中炎性病症的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的根据权利要求1至5中任一项所述的提取物或级分。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述炎性病症是自身免疫病症。
14.一种治疗受试者中自身免疫病症的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的根据权利要求1至5中任一项所述的提取物或级分。
15.权利要求1至5中任一项所述的提取物或级分在制造用于治疗IL-6介导的病症的药物中的用途。
16.权利要求1至5中任一项所述的提取物或级分在制造用于治疗炎性病症的药物中的用途。
17.权利要求1至5中任一项所述的提取物在制造用于治疗自身免疫病症的药物中的用途。
18.根据权利要求11-17中任一项所述的方法或用途，其中所述病症是类风湿性关节炎。
19.一种抗血栓形成剂或抗凝血剂，其包含权利要求1至4或权利要求6中任一项所述的提取物或级分。
20.根据权利要求19所述的抗血栓形成剂，其中所述抗血栓形成作用是通过肝素辅助因子II或抗凝血酶介导的。
21.一种抑制受试者中血栓形成的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的根据权利要求1至4或权利要求6中任一项所述的提取物或级分。
22.一种抑制受试者中凝血酶活性的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的根据权利要求1至4或权利要求6中任一项所述的提取物或级分。
23.权利要求1至4和权利要求6中任一项所述的提取物或级分在制造用于抑制血栓形成或凝血酶活性的药物中的用途。
24.一种用于制备权利要求1至6中任一项所述的提取物或级分的方法，所述方法包括使用酶促或化学消化方法消化黑唇鲍加工废物，从经消化的废物中分离所述提取物。
25.根据权利要求23所述的方法，其包括步骤：
在消化酶存在下，消化黑唇鲍加工废物，以产生水性级分和沉淀物；和
将水性级分与沉淀物分离，从而产生提取物。
26.根据权利要求24所述的方法，还包括过滤水性级分以产生滤液。
27.根据权利要求25所述的方法，还包括使滤液脱盐。
28.根据权利要求23-26中任一项所述的方法，还包括将提取物分离成一种或多种富含蛋白成分或阴离子多糖成分的级分。
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