CN109010841B - 一种纳米药物及其合成方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种纳米药物及其合成方法，属于药物合成技术领域。纳米药物的合成方法包括如下步骤：(1)、2,2'‑二吡啶甲基胺和α,α'‑二氯对二甲苯反应得到单体。(2)、胱胺二盐酸盐和三乙胺反应得到胱胺后加入单体得到第一化合物。(3)、将透明质酸、1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐和N‑羟基琥珀酰亚胺反应后加入三乙胺和第一化合物的混合液然后反应得到第二聚合物。(4)、将第二聚合物溶于缓冲溶液后加入含Zn2+螯合剂反应得到第三聚合物，将第三聚合物与小片段干扰RNA混合并在55‑65℃的条件下孵育得到纳米药物。此合成方法得到的纳米药物对恶性胶质母细胞瘤的治疗效果更好。

Description

一种纳米药物及其合成方法
技术领域
本发明涉及药物合成技术领域，具体而言，涉及一种纳米药物及其合成方法。
背景技术
利用小分子干扰RNA抑制特定基因活性的RNA干扰(RNAi)是治疗癌症的一种新的治疗选择。然而，siRNA分子的递送仍然是新兴技术的临床和实际应用中的最大挑战之一。迄今为止，在癌症治疗策略中用于siRNAs的研究最多的递送系统包括阳离子聚合物，阳离子脂质和阳离子无机纳米粒子。这些阳离子材料能够通过电荷相互作用将阴离子siRNA缩合成纳米颗粒，并且在体内循环后保护siRNA免受RNase酶降解。
然而，由于颗粒表面的高正电荷，这些强阳离子载体通常会使细胞膜不稳定并对非癌组织产生严重的细胞毒性。这些副作用对在临床上使用的阳离子siRNA递送载体的安全性方面是非常重要的。特别地，位于中枢神经系统内的胶质母细胞瘤周围的正常细胞受到感染更加严重，因为正常的脑组织/细胞对阳离子载体的正电荷很敏感，这可能会引起意外的神经毒性。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种纳米药物的合成方法，能够的纳米药物对胶质母细胞瘤的治疗效果更好，且治疗过程中不会影响胶质母细胞瘤周围的正常组织。
本发明的第二目的在于提供一种上述纳米药物的合成方法得到的纳米药物，能够对胶质母细胞瘤的治疗效果更好，且治疗过程中不会影响胶质母细胞瘤周围的正常组织。
基于上述第一目的，本发明是采用以下技术方案实现的：
一种纳米药物的合成方法，包括如下步骤：
(1)、2,2'-二吡啶甲基胺和α,α'-二氯对二甲苯反应得到DxDPA单体；其中，DxDPA单体的结构式为：
Figure GDA0002442299460000021
(2)、胱胺二盐酸盐和三乙胺反应得到胱胺后加入DxDPA单体得到DxDPA-Cys化合物；其中，DxDPA-Cys化合物的结构式为：
Figure GDA0002442299460000022
(3)、将透明质酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺反应后加入三乙胺和DxDPA-Cys化合物的混合液然后反应得到HA-SS-DPA聚合物；其中，HA-SS-DPA聚合物的结构式为：
Figure GDA0002442299460000023
(4)、将HA-SS-DPA聚合物溶于缓冲溶液后加入含Zn2+的螯合剂反应得到HA-SS-DPA(Zn)聚合物，将HA-SS-DPA(Zn)聚合物与小片段干扰RNA混合并在55-65℃的条件下孵育得到HA-SS-DPA(Zn)/siRNA纳米药物。
进一步地，本发明的另一实施例中，上述步骤(2)中，先依次将胱胺二盐酸盐和三乙胺溶解于二甲基亚砜中在惰性气体条件下反应1.5h以上得到第一混合溶液，再将DxDPA单体溶解于二甲基亚砜中并加入至第一混合液内，在55-65℃条件下反应12-16h得到DxDPA-Cys化合物。
进一步地，本发明的另一实施例中，上述胱胺二盐酸盐与三乙胺的摩尔比为1：(2-4)；
胱胺二盐酸盐与DxDPA单体的摩尔比为1：(0.2-0.4)。
进一步地，本发明的另一实施例中，上述步骤(3)中，将透明质酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺均溶于水中在惰性气体条件下反应2-4h得到第二混合液，再将三乙胺和DxDPA-Cys化合物溶于二甲基亚砜中并在惰性气体条件下反应1.5h以上得到第三混合液，将第三混合液加入第二混合液内反应24-28h得到HA-SS-DPA聚合物。
进一步地，本发明的另一实施例中，上述透明质酸与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的摩尔比为1：(4-6)；
透明质酸与N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1：(4-6)；
透明质酸与DxDPA-Cys化合物的摩尔比为1：(0.4-0.8)。
进一步地，本发明的另一实施例中，上述步骤(4)中，螯合剂为Zn(NO3)2。
进一步地，本发明的另一实施例中，上述将HA-SS-DPA聚合物溶于HEPES缓冲溶液后加入Zn(NO3)2反应得到HA-SS-DPA(Zn)聚合物，将HA-SS-DPA(Zn)聚合物与小片段干扰RNA混合并在55-65℃的条件下孵育4-6h得到HA-SS-DPA(Zn)/siRNA纳米药物。
进一步地，本发明的另一实施例中，上述HA-SS-DPA(Zn)聚合物与小片段干扰RNA的体积比为1：(0.8-1.2)；
HA-SS-DPA(Zn)聚合物与小片段干扰RNA的质量比为(10-40)：1。
进一步地，本发明的另一实施例中，上述步骤(1)中，将2,2'-二吡啶甲基胺和α,α'-二氯对二甲苯均溶于氯甲烷中在惰性气体条件下反应24-28h得到DxDPA单体。
基于上述第二目的，本发明是采用以下技术方案实现的：
一种纳米药物，由上述纳米药物的合成方法制备得到。
与现有技术相比，本发明的较佳实施例提供的纳米药物及其合成方法的有益效果包括：
使用含Zn离子的HA-SS-DPA(Zn)聚合物作为小片段干扰RNA的载体，使小片段干扰RNA的半衰期延长，容易进入肿瘤细胞内，且避免癌细胞周围的正常组织病变，具有很强的还原响应性和生物相容性，对恶性胶质母细胞瘤的治疗效果更好。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图也属于本发明的保护范围。
图1为本发明实验例1中DxDPA单体的核磁共振图；
图2为本发明实验例1中DxDPA-Cys化合物的核磁共振图；
图3为本发明实验例1中HA-SS-DPA聚合物的核磁共振图；
图4为本发明实验例1中HA-SS-DPA/siRNA纳米药物的特征图；
图5为本发明实验例1中HA-SS-DPA/siRNA纳米药物的还原反应性的评价图；
图6为本发明实验例2中HA-SS-DPA/siRNA的实验数据图；
图7为本发明实验例3中HA-SS-DPA/siRNA的实验数据图；
图8为本发明实验例4的HA-SS-DPA/siRNA抑制肿瘤生长实验图；
图9为本发明实验例4的HA-SS-DPA/siRNA抑制肿瘤生长切片图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施例的纳米药物及其合成方法进行具体说明。
纳米药物的合成方法，包括如下步骤：
(1)、合成DxDPA单体
2,2'-二吡啶甲基胺和α,α'-二氯对二甲苯反应得到DxDPA单体。详细地，将2,2'-二吡啶甲基胺和α,α'-二氯对二甲苯均溶于氯甲烷中在惰性气体条件下反应24-28h得到DxDPA单体。
可选地，2,2'-二吡啶甲基胺和α,α'-二氯对二甲苯的摩尔比为1：(1.5-2.5)。
具体步骤如下：2,2'-二吡啶甲基胺(DPA)(8mmol)和α,α'-二氯对二甲苯(Dx)(16mmol)在二氯甲烷或三氯甲烷中溶解，然后加入无水K2CO3(40mmol)或者无水硫酸钠除水。并在室温及惰性气体(可选为氮气)条件下搅拌24h，得到DxDPA单体。
Figure GDA0002442299460000061
由于DxDPA单体溶液中含有一定的反应物和有机溶剂等杂质，所以，使用体积比为(20-30)：1的二氯甲烷和甲醇作为展开剂的硅胶柱来萃取样品，得到淡黄色的油状液体的纯DxDPA单体。
(2)、合成DxDPA-Cys化合物
胱胺二盐酸盐和三乙胺反应得到胱胺后加入单体得到DxDPA-Cys化合物。详细地，先依次将胱胺二盐酸盐和三乙胺溶解于二甲基亚砜中在惰性气体条件下反应1.5h以上得到第一混合溶液，再将DxDPA单体溶解于二甲基亚砜中并加入至第一混合液内，在55-65℃条件下反应12-16h得到DxDPA-Cys化合物。
可选地，胱胺二盐酸盐与三乙胺的摩尔比为1：(2-4)；胱胺二盐酸盐与DxDPA单体的摩尔比为1：(0.2-0.4)。
具体步骤如下：将固体胱胺二盐酸盐(Cys·2HCl)(10mmol)先溶解于二甲基亚砜溶液中，再加入三乙胺(30mmol)继续溶解，在室温及惰性气体(可选为氮气)条件下搅拌1.5h以上得到第一混合液，第一混合液中含有胱胺。
上述反应过程中胱胺二盐酸盐脱下的HCl会和三乙胺结合生成三乙胺盐酸盐。进一步地，将DxDPA单体(2.4mmol)溶解到少量二甲基亚砜溶解中，并逐滴滴加到除去水和HCl的第一混合液中，在温度为60℃的惰性气体(可选为氮气)条件下搅拌12h得到DxDPA-Cys化合物。上述反应过程中会产生HCl且溶剂中含有一定的水，所以，将无水K2CO3(12mmol)加入到反应溶液中除去水和HCl。
Figure GDA0002442299460000071
由于DxDPA-Cys化合物溶液中含有一定的胱胺、HCl，K2CO3、胱胺二盐酸盐、三乙胺盐酸盐和二甲基亚砜等杂质，所以，先用去离子水沉淀DxDPA-Cys化合物溶液，去除胱胺、HCl，K2CO3、胱胺二盐酸盐、三乙胺盐酸盐等。为了进一步净化，用二氯甲烷萃取水中的化合物，进一步去除胱胺，然后二氯甲烷被收集并加入过量的无水Na2SO4干燥过夜，除去水，最后使用用旋转蒸发仪将二氯甲烷去除，并真空干燥箱干燥24h，获得纯DxDPA-Cys化合物。
(3)、合成HA-SS-DPA聚合物
将透明质酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺反应后加入三乙胺和DxDPA-Cys化合物的混合液然后反应得到HA-SS-DPA聚合物。详细地，将透明质酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺均溶于水中在惰性气体条件下反应2-4h得到第二混合液，再将三乙胺和DxDPA-Cys化合物溶于二甲基亚砜中并在惰性气体条件下反应1.5h以上得到第三混合液，将第三混合液加入第二混合液内反应24-28h得到HA-SS-DPA聚合物。
可选地，透明质酸与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的摩尔比为1：(4-6)；透明质酸与N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1：(4-6)；透明质酸与DxDPA-Cys化合物的摩尔比为1：(0.4-0.8)。
具体步骤如下：透明质酸(HA)(0.79mmol羧基)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)(3.40mmol)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)(3.40mmol)溶于去离子(DI)水(8mL)中，在室温及惰性气体(可选为氮气)条件下搅拌2h得到第二混合液使透明质酸的羧基活化。
将三乙胺(0.48mmol)和DxDPA-Cys化合物(0.16mmol)加入到二甲基亚砜溶剂中，并在室温及惰性气体(可选为氮气)条件下反应1.5h以上得到第三混合液，然后将第三混合液逐滴加入到活化后的透明质酸溶液中，搅拌24h得到HA-SS-DPA聚合物。
Figure GDA0002442299460000081
HA-SS-DPA聚合物溶液用透析方法(MWCO＝14000Da)透析1天，然后冷冻干燥得到纯HA-SS-DPA聚合物。
(4)、合成HA-SS-DPA(Zn)/siRNA纳米药物
将HA-SS-DPA聚合物溶于缓冲溶液后加入含Zn2+的螯合剂反应得到聚合物HA-SS-DPA(Zn)，将聚合物HA-SS-DPA(Zn)与小片段干扰RNA(siRNA)混合并在55-65℃的条件下孵育得到纳米药物。可选地，螯合剂为Zn(NO3)2。详细地，将HA-SS-DPA聚合物溶于HEPES缓冲溶液后加入Zn(NO3)2反应得到聚合物HA-SS-DPA(Zn)，将聚合物HA-SS-DPA(Zn)与小片段干扰RNA混合并在55-65℃的条件下孵育4-6h得到HA-SS-DPA(Zn)/siRNA纳米药物。
可选地，聚合物HA-SS-DPA(Zn)与小片段干扰RNA的体积比为1：(0.8-1.2)；聚合物HA-SS-DPA(Zn)与小片段干扰RNA的质量比为(10-40)：1。
具体步骤如下：HA-SS-DPA聚合物溶于HEPES缓冲液(4mg/mL)，然后将Zn(NO3)2溶液(1.25mg/mL)加入HA-SS-DPA聚合物溶液(1mL)中在40℃条件下搅拌4h以制备得到HA-SS-DPA(Zn)，将HA-SS-DPA(Zn)与小片段干扰RNA(siRNA)(53μg/mL)以体积比为1：1，质量比为10:1或20:1或30:1或40:1的条件下在HEPES缓冲液中混合并在60℃下孵育4h来形成纳米药物混合物。
使用HA-SS-DPA(Zn)作为小片段干扰RNA的载体，使小片段干扰RNA的半衰期延长，容易进入肿瘤细胞内，且避免癌细胞周围的正常组织病变，具有很强的还原响应性和生物相容性，对胶质母细胞瘤的治疗效果更好。
实施例1
纳米药物的合成方法，包括如下步骤：
(1)、合成DxDPA单体：2,2'-二吡啶甲基胺和α,α'-二氯对二甲苯反应得到DxDPA单体。
(2)、合成DxDPA-Cys化合物：胱胺二盐酸盐和三乙胺反应得到胱胺后加入单体得到DxDPA-Cys化合物。
(3)、合成HA-SS-DPA聚合物：将透明质酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺反应后加入三乙胺和DxDPA-Cys化合物的混合液然后反应得到HA-SS-DPA聚合物。
(4)、合成HA-SS-DPA(Zn)/siRNA纳米药物：将HA-SS-DPA聚合物溶于缓冲溶液后加入螯合剂反应得到HA-SS-DPA(Zn)，将HA-SS-DPA(Zn)与小片段干扰RNA混合并在55-65℃的条件下孵育得到纳米药物。
实施例2
纳米药物的合成方法，包括如下步骤：
(1)、合成DxDPA单体：将摩尔比为1:1.5或1:2.5或1:2的2,2'-二吡啶甲基胺和α,α'-二氯对二甲苯均溶于氯甲烷中在惰性气体条件下反应24h或26h或28h得到DxDPA单体。
(2)、合成DxDPA-Cys化合物：先依次将摩尔比为1:2或1:4或1:3的胱胺二盐酸盐和三乙胺溶解于二甲基亚砜中在惰性气体条件下反应1.5h以上得到第一混合溶液，再将DxDPA单体溶解于二甲基亚砜中并加入至第一混合液内，在55℃或60℃或65℃条件下反应12h或14h或16h得到DxDPA-Cys化合物；其中，胱胺二盐酸盐与DxDPA单体的摩尔比为1：0.2或1:0.3或1:0.4。
(3)、合成HA-SS-DPA聚合物：将摩尔比为1:4:4或1:5:5或1:6:6的透明质酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺均溶于水中在惰性气体条件下反应2h或3h或4h得到第二混合液，再将三乙胺和DxDPA-Cys化合物溶于二甲基亚砜中并在惰性气体条件下反应1.5h以上得到第三混合液，将第三混合液加入第二混合液内反应24h或26h或28h得到HA-SS-DPA聚合物；其中，透明质酸与DxDPA-Cys化合物的摩尔比为1:0.4或1:0.6或1:0.8。
(4)、合成HA-SS-DPA(Zn)/siRNA纳米药物：将HA-SS-DPA聚合物溶于HEPES缓冲溶液后加入Zn(NO3)2反应得到HA-SS-DPA(Zn)，将HA-SS-DPA(Zn)与小片段干扰RNA混合并在55℃或60℃或65℃的条件下孵育4h或5h或6h得到纳米药物；其中，HA-SS-DPA(Zn)与小片段干扰RNA的体积比为1:0.8或1:1或1:1.2；HA-SS-DPA(Zn)与小片段干扰RNA的质量比为10:1或20:1或30:1或40:1。
实施例3
纳米药物的合成方法，包括如下步骤：
(1)、合成DxDPA单体
2,2'-二吡啶甲基胺(DPA)(8mmol)和α,α'-二氯对二甲苯(Dx)(16mmol)在二氯甲烷中溶解，然后加入无水K2CO3(40mmol)并在室温及氮气条件下搅拌24h，得到DxDPA单体溶液。使用体积比为20:1的二氯甲烷和甲醇作为展开剂的硅胶柱来萃取DxDPA单体溶液，得到淡黄色的油状液体的纯DxDPA单体。
(2)、合成DxDPA-Cys化合物
将固体胱胺二盐酸盐(Cys)(10mmol)先溶解于二甲基亚砜溶液中，再加入三乙胺(30mmol)继续溶解，在室温及氮气条件下搅拌1.5h以上得到第一混合液。将无水K2CO3(12mmol)加入到第一混合液中，将DxDPA单体(2.4mmol)溶解到少量二甲基亚砜溶解中，并逐滴滴加到加入了K2CO3的第一混合液中，在温度为60℃的氮气条件下搅拌12h得到DxDPA-Cys化合物溶液。
先用去离子水沉淀DxDPA-Cys化合物溶液，再用二氯甲烷萃取水中的化合物，然后二氯甲烷被收集并加入过量的无水Na2SO4干燥过夜，最后使用用旋转蒸发仪蒸干溶液，并真空干燥箱干燥24h，获得纯DxDPA-Cys化合物。
(3)、合成HA-SS-DPA聚合物
透明质酸(HA)(0.79mmol羧基)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)(3.40mmol)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)(3.40mmol)溶于去离子(DI)水(8mL)中，在室温及为氮气条件下搅拌2h得到第二混合液。
将三乙胺(0.48mmol)和DxDPA-Cys化合物(0.16mmol)加入到二甲基亚砜溶剂中，并在室温及氮气条件下反应1.5h以上得到第三混合液，然后将第三混合液逐滴加入到活化后的透明质酸溶液中，搅拌24h得到HA-SS-DPA聚合物。
HA-SS-DPA聚合物溶液用透析方法(MWCO＝14000Da)透析1天，然后冷冻干燥得到纯HA-SS-DPA聚合物。
(4)、合成HA-SS-DPA(Zn)/siRNA纳米药物
HA-SS-DPA聚合物溶于HEPES缓冲液(4mg/mL)，然后将Zn(NO3)2溶液(12.5mg/mL)加入HA-SS-DPA聚合物溶液(1mL)中在40℃条件下搅拌4h以制备得到HA-SS-DPA(Zn)，将HA-SS-DPA(Zn)与小片段干扰RNA(siRNA)(53μg/mL)以体积比为1：1，质量比为10:1条件下在HEPES缓冲液中混合并在60℃下孵育4h来形成纳米药物混合物。
实验例1
使用核磁共振仪检测实施例3得到的DxDPA单体得到图1，从图1可以看出，1H NMR表征显示除了DPA及Dx峰外，还有位移在δ3.62和δ4.64处的特征峰，通过积分可知，已经得到DxDPA单体。
检测实施例3得到的DxDPA-Cys化合物得到图2，从图2可以看出，1H NMR表征显示除了DxDPA及Cys峰外，位移在δ4.64的特征峰完全消失，还有位移在δ3.62和δ2.82-2.92处的特征峰，通过积分可知，已经得到DxDPA-Cys化合物。
检测实施例3得到的HA-SS-DPA聚合物得到图3，从图3可以看出，1H NMR表征显示除了DxDPA-Cys及HA的峰外，还有位移在δ2.82-2.92处的特征峰的减少，通过积分可知，已经得到HA-SS-DPA聚合物。
图4为HA-SS-DPA/siRNA纳米药物的特征。以透明质酸中100个羧基上结合二硫键的个数来定义取代度，其中，聚合物HA-SS-DPA(Zn)与siRNA的不同质量(w/w)比，分别为10，20，30，40。其中，(A)为跑胶图，可以看出，自由的siRNA由于带有负电会向正极移动，而形成的纳米药物由于siRNA被包裹到纳米粒子里面，所以不会向正极移动。从图中明显显示出随着质量比的增加siRNA被复合的越多。(B)为投射电镜图片，可以看出，纳米药物为清晰的球状结构。(C)为粒径图，可以看出，纳米药物的粒径随着质量比的增加在逐渐减小，并且纳米药物的粒径比较稳定。(D)为zeta电位图，可以看出，随着质量比的增加，电位也在逐渐增大，主要是由于Zn2+的浓度在逐渐变大。
图5为HA-SS-DPA/siRNA纳米药物的还原反应性的评价。其中，(A)为用10mM DTT处理24小时的HA-SS-DPA16(Zn)/siRNA的凝胶电泳测定。(B)HA-SS-DPA16(Zn)/siRNA的大小变化，响应于10mM DTT，重量比为40。当HA-SS-DPA(Zn)/siRNA时用10mM DTT处理的复合物，其模拟内部细胞的还原环境，siRNA纳米颗粒解散并释放螯合的siRNA，证实了HA-SS-DPA(Zn)/siRNA纳米药物的具有还原响应性。
实验例2
本实验例为实施例3得到的HA-SS-DPA/siRNA的细胞毒性实验、共聚焦显微镜(CLSM)实验、流式细胞仪实验和体外基因转染实验。图6为本实验例的HA-SS-DPA/siRNA的实验数据图。其中，(A)为细胞毒性实验图；(B)为共聚焦显微镜(CLSM)实验图；(C)为流式细胞仪实验图；(D)为体外基因转染实验图。
荧光素酶稳定表达的人脑胶质瘤细胞(U87-Luc)悬浮在含有10％的FBS，1％的双抗的DMEM培养基中值于96孔板(5×103细胞/孔)培养24h后，换上90μL新鲜培养基并加入10μL HA-SS-DPA/siRNA(聚合物/siRNA质量比为10/1，20/1，30/1，40/1)。孵育48h后，加入10μL MTT溶液(5mg/mL)在37℃下孵育4h。将培养基吸出加入150μL的DMSO，摇晃10min。细胞存活率由酶标仪在570nm检测计算(n＝3)，得到如图6中(A)图。
从图6(A)中可以看出，不同取代度以及不同质量比的纳米粒子细胞存活率都在90％以上，说明本发明实施例3制备的HA-SS-DPA/siRNA纳米药物不会伤害正常细胞组织。
CLSM实验过程具体如下：U87-Luc细胞在悬浮在含有10％的FBS，1％的双抗的DMEM培养基中铺于6孔板内(1×106细胞/孔)培养24h后，加入50μL HEPES的HA-SS-DPA/FAM-siRNA或自由FAM-siRNA(200nM FAM-siRNA)在37℃下孵育4h。移走培养基，用PBS清洗2次，用4％的多聚甲醛固定15min，DAPI染色10min，每个过程均用PBS清洗两遍，最后用甘油固定封片。荧光图片由共聚焦仪器拍摄，得到如图6中(B)图。
从图6(B)中可以看出，CLSM照片显示出，随着取代的增加，纳米粒子进入细胞就越多，说明本发明实施例3制备的HA-SS-DPA/siRNA纳米药物能够自主靶向至肿瘤细胞处。
流式细胞仪实验:U87-Luc细胞在悬浮在含有10％的FBS，1％的双抗的DMEM培养基中铺于6孔板内(1×106细胞/孔)培养24h后，加入50μL HEPES的HA-SS-DPA/Cy5-siRNA或者自由Cy5-siRNA(200nM Cy5-siRNA)在37℃下孵育4h。然后，细胞用胰酶消化并离心(1000×g)，由PBS清洗两次并再次分散在500μL PBS中待测。Cy5荧光强度由流式仪检测并分析，得到如图6中(C)图。
从图6(C)中可以看出，向U87-Luc细胞中加HA-SS-DPA(Zn)/siRNA孵育8小时后，用流式细胞仪测得纳米粒子的胞吞效果(siRNA：200nM)较好。说明本发明实施例3制备的HA-SS-DPA/siRNA纳米药物能够自主靶向至肿瘤细胞处。
体外基因转染实验：用U87-Luc细胞在悬浮在含有10％的FBS，1％的双抗的DMEM培养基中值于96孔板(5×103细胞/孔)培养24h后，换上90μL新鲜培养基并加入10μL HA-SS-DPA/siRNA(200nM的有沉默效果的GL-3siRNA和200nM无沉默效果的Scramble siRNA，聚合物和siRNA质量比为10/1，20/1，30/1，40/1)。孵育48h后，吸出培养基并加入100μL的细胞裂解液在0℃下裂解细胞2h，然后取出30μL裂解液并加入30μL荧光素酶检测试剂。荧光强度用酶标仪的荧光素酶检测系统测定，不加纳米药物的细胞作为标准(100％)得到相对的荧光素酶活性(n＝3)，得到如图6中(D)图。
从图6(D)中可以看出，GL-3siRNA可以沉默U87-Luc细胞中Luc基因的表达，而ScrsiRNA没有沉默效果，空白细胞作为(100％)，随着质量比的增大以及取代度的增加，GL-3siRNA沉默效果越来越好，最高可以达到48％。说明本发明实施例3制备的HA-SS-DPA/siRNA纳米药物对肿瘤细胞的治疗效果较好。
实验例3
本实验例为实施例3得到的HA-SS-DPA/siRNA的药代动力学实验、体内的基因沉默实验和生物分布实验。图7为本实验例的HA-SS-DPA/siRNA的实验数据图。其中，(A)为药代动力学实验图；(B)和(C)为体内的基因沉默实验图；(D)为生物分布实验图。
药代动力学实验：Balb/C小白鼠经尾静脉注射200μL HEPES的HA-SS-DPA/Cy5-siRNA和游离Cy5-siRNA(20μg Cy5-siRNA每只小鼠)。在预订时间点，从小鼠眼眶取血(约50μL血液)，并立即离心(14.8krpm,10min)后，上清液中Cy5的含量由稳态瞬态荧光光谱仪测其荧光，得到如图7中(A)图。
从图7(A)中可以看出，纳米粒子可以大大延长siRNA在体内的血液循环时间，增加了siRNA的半衰期。说明本发明实施例3制备的HA-SS-DPA/siRNA纳米药物对在肿瘤细胞处的作用时间延长，对肿瘤的治疗效果更好。
体内的基因沉默实验：在6周龄Balb/C裸鼠注射100μL悬浮于PBS(含1/4组织胶)的U87-Luc细胞来建立皮下肿瘤模型，观察肿瘤生长情况。约两周后，将荷瘤裸鼠随机分为两组，将荧光素酶靶向siRNA(siGL3)及对照siRNA(siScramble)包载进入HA-SS-DPA内(20μgsiRNA每只裸鼠)分别尾静脉注射到小鼠体内。分别在0h，24h及48h后用小动物成像仪检测小鼠肿瘤部位的荧光强度。小鼠腹腔注射100μL荧光素酶(150mg/kg)，约10分钟后麻醉小鼠，对肿瘤部位进行成像拍照，肿瘤光量子由活体成像软件定量分析图像，所有图像都在相同条件及比色刻度下进行设定，得到如图7中(B)图。
从图7(B)中可以看出，HA-SS-DPA/siRNA纳米粒子在注射后2小时在肿瘤中具有更多的siRNA，而与裸siRNA相比，显示在肺，肝和肾的靶向位点累积减少，这表明纳米制剂可以在注射后更有效地控制siRNA分布，从而有利于增强siRNA在靶肿瘤部位的积聚。说明本发明实施例3制备的HA-SS-DPA/siRNA纳米药物能够在肿瘤细胞处积聚，对肿瘤的治疗效果更好。
为了定量分析HA-SS-DPA/siRNA沉默效果，取出小鼠肿瘤，加500μL的细胞裂解液，用超声破碎仪将肿瘤粉碎(0℃，10min)，离心取上清(14.8k rpm,10min)。取30μL上清液并加入30μL荧光素酶检测试剂，荧光强度用酶标仪的荧光素酶检测系统测定(n＝3)，得到如图7中(C)图。
从图7(C)中可以看出，当用HA-SS-DPA(Zn)/siGL3处理，与HA-SS-DPA(Zn)/siScr相比，HA-SS-DPA(Zn)/siGL3处理的肿瘤的生物发光表达水平显着降低，肿瘤体积减小。说明本发明实施例3制备的HA-SS-DPA/siRNA纳米药物能够在肿瘤细胞处积聚，对肿瘤的治疗效果更好。
生物分布实验：将200μL的HA-SS-DPA/Cy5 siRNA，自由Cy5-siRNA(20μg/小鼠)的HEPES溶液和PBS缓冲液通过尾静脉注入到皮下肿瘤的裸鼠体内(n＝3)。为了定量Cy5-siRNA在肿瘤及其他器官的分布，荷瘤裸鼠被处死并收集包括心、肝、脾、肾及含肿瘤肺等主要器官、清洗、干燥并称重。肿瘤及其他组织中加入600μL 1％曲拉通在0℃下浸泡2h，然后用用超声破碎仪将肿瘤粉碎(0℃，10min)，离心取上清(14.8k rpm，10min)悬浮液中Cy5由荧光检测，由稳态瞬态荧光光谱仪测其荧光得到，最终表达为每克组织注射百分比(％ID/g)。得到如图7中(D)图。
从图7(D)中可以看出，直接注射siRNA的小鼠，其心、肝、脾、肺、肾等部位对siRNA的代谢能力很强，自主靶向至肿瘤细胞部位的siRNA很少。而注射HA-SS-DPA(Zn)/siRNA的小鼠的心、肝、脾、肺、肾等部位对siRNA的代谢能力不强，使HA-SS-DPA(Zn)/siRNA中的siRNA能够自主靶向至肿瘤细胞处。说明本发明实施例3制备的HA-SS-DPA/siRNA纳米药物能够自主靶向至肿瘤细胞处，对肿瘤的治疗效果更好。
实验例4
本实验例为实施例3得到的HA-SS-DPA/siRNA的抑制肿瘤生长实验。
用U87-Luc细胞来建立皮下肿瘤模型，在约10d后，观察肿瘤大小，开始给药，并将这天定义为0d。将裸鼠进行随机分配到3组中(每组3只)。再尾静脉给药前，先称量裸鼠体重，并用游标卡尺测量肿瘤大小，同时需要观察U87-Luc细胞，为了观察细胞，所以在成像前10min左右，腹腔注射100μL荧光素酶(150mg/kg)。经尾静脉将HA-SS-DxDA/siPLK1，HA-SS-DxDA/siScramble和PBS(20μg siRNA/裸鼠)注射进小鼠体内，每两天注射一次。小鼠的相对体重以它们初始体重为标准。
图8为本实验例的HA-SS-DPA/siRNA抑制肿瘤生长实验图。其中图8(A)为分别用HA-SS-DPA(Zn)/siPLK1，HA-SS-DPA(Zn)/siScr和PBS治疗后的皮下胶质母细胞瘤U87MG-Luc荷瘤裸鼠的发光光学图像。在第0天，第2天，第4天，第6天和第8天，以1mg siRNA当量/kg静脉注射小鼠剂量。与siScr或PBS对照相比，HA-SS-DPA(Zn)/siPLK1有效地导致生物发光输出的降低，表明肿瘤增殖减少，对肿瘤具有一定的治疗效果。说明本发明实施例3制备的HA-SS-DPA/siRNA纳米药物能够减少肿瘤细胞的数量，对肿瘤的治疗效果更好。
图8(B)为使用Lumina IVIS III系统测量肿瘤的定量发光水平。与siScr和PBS对照相比，定量生物发光分析进一步证实了siPLK1注射的小鼠中的肿瘤得到有效抑制。说明本发明实施例3制备的HA-SS-DPA/siRNA纳米药物能够减少肿瘤细胞的数量，对肿瘤的治疗效果较好。
图8(C)测量了肿瘤大小的增长以量化肿瘤抑制效率。说明本发明实施例3制备的HA-SS-DPA/siRNA纳米药物能够使肿瘤的体积减小，对肿瘤的治疗效果较好。
图8(D)测量了小鼠的体重。可以看出，小鼠的体重基本没有发生明显的变化与差距，说明本发明实施例3制备的HA-SS-DPA/siRNA纳米药物和siRNA的使用安全性，不会杀死正常细胞。
在第10天治疗终止，每组任意取一只小鼠处死，取出主要器官(心，肝，脾，肺，肾，肿瘤)清洗、浸泡在4％的福尔马林中，并石蜡包埋组织学分析。图9为本实验例的HA-SS-DPA/siRNA抑制肿瘤生长切片图。从图9可以看出，使用10倍物镜在Olympus BX41显微镜下获得图像。分析显示，HA-SS-DPA(Zn)/siPLK1引起广泛坏死的肿瘤组织，而对心脏，肝脏，脾脏，肺脏和肾脏的损伤很小，说明HA-SS-DPA(Zn)/siPLK1具有高肿瘤选择性和低副作用。相比之下，用HA-SS-DPA(Zn)/siScr和PBS处理的小鼠观察到很少的肿瘤细胞凋亡。这些结果突出显示HA-SS-DPA(Zn)/siPLK1是安全的，是用于治疗小鼠胶质母细胞瘤的高效RNAi治疗载体。
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

Claims (10)

1.一种纳米药物的合成方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)、2,2'-二吡啶甲基胺和α,α'-二氯对二甲苯反应得到DxDPA单体；其中，所述DxDPA单体的结构式为：
Figure FDA0002442299450000011
(2)、胱胺二盐酸盐和三乙胺反应得到胱胺后加入所述DxDPA单体得到DxDPA-Cys化合物；其中，所述DxDPA-Cys化合物的结构式为：
Figure FDA0002442299450000012
(3)、将透明质酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺反应后加入三乙胺和所述DxDPA-Cys化合物的混合液然后反应得到HA-SS-DPA聚合物；其中，所述HA-SS-DPA聚合物的结构式为：
Figure FDA0002442299450000013
(4)、将所述HA-SS-DPA聚合物溶于缓冲溶液后加入含Zn2+的螯合剂反应得到HA-SS-DPA(Zn)聚合物，将所述HA-SS-DPA(Zn)聚合物与小片段干扰RNA混合并在55-65℃的条件下孵育得到HA-SS-DPA(Zn)/siRNA纳米药物。
2.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述步骤(2)中，先依次将胱胺二盐酸盐和三乙胺溶解于二甲基亚砜中在惰性气体条件下反应1.5h以上得到第一混合溶液，再将所述DxDPA单体溶解于二甲基亚砜中并加入至所述第一混合液内，在55-65℃条件下反应12-16h得到所述DxDPA-Cys化合物。
3.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，所述胱胺二盐酸盐与所述三乙胺的摩尔比为1：(2-4)；
所述胱胺二盐酸盐与所述单体的摩尔比为1：(0.2-0.4)。
4.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述步骤(3)中，将所述透明质酸、所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和所述N-羟基琥珀酰亚胺均溶于水中在惰性气体条件下反应2-4h得到第二混合液，再将三乙胺和所述DxDPA-Cys化合物溶于二甲基亚砜中并在惰性气体条件下反应1.5h以上得到第三混合液，将所述第三混合液加入所述第二混合液内反应24-28h得到所述HA-SS-DPA聚合物。
5.根据权利要求4所述的合成方法，其特征在于，所述透明质酸与所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的摩尔比为1：(4-6)；
所述透明质酸与所述N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1：(4-6)；
所述透明质酸与所述DxDPA-Cys化合物的摩尔比为1：(0.5-2)。
6.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述步骤(4)中，所述螯合剂为Zn(NO3)2。
7.根据权利要求6所述的合成方法，其特征在于，将所述HA-SS-DPA聚合物溶于HEPES缓冲溶液后加入Zn(NO3)2反应得到HA-SS-DPA(Zn)聚合物，将所述HA-SS-DPA(Zn)聚合物与所述小片段干扰RNA混合并在55-65℃的条件下孵育4-6h得到所述HA-SS-DPA(Zn)/siRNA纳米药物。
8.根据权利要求7所述的合成方法，其特征在于，所述HA-SS-DPA(Zn)聚合物与所述小片段干扰RNA的体积比为1：(0.8-1.2)；
所述HA-SS-DPA(Zn)聚合物与所述小片段干扰RNA的质量比为(10-40)：1。
9.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述步骤(1)中，将所述2,2'-二吡啶甲基胺和所述α,α'-二氯对二甲苯均溶于氯甲烷中在惰性气体条件下反应24-28h得到所述DxDPA单体。
10.一种纳米药物，其特征在于，由权利要求1-9任一项所述的纳米药物的合成方法制备得到。
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