CN109010838A - 含n-氧化三级胺基团的化合物作为细胞线粒体靶向载体的应用 - Google Patents

含n-氧化三级胺基团的化合物作为细胞线粒体靶向载体的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种含N‑氧化三级胺基团的化合物作为细胞线粒体靶向载体的应用，所述的化合物含有一个或者多个N‑氧化三级胺结构单元，所述的N‑氧化三级胺结构单元包括如下氮氧化物结构单元中的至少一种：式(I)～(III)中，R1、R2为分别独立的烷基、取代烷基、芳香基、取代芳香基或聚合物主链；R3、R4为分别独立的氢、烷基、取代烷基、芳香基、取代芳香基或聚合物主链。该类化合物呈电中性，具有与聚乙烯醇(PEG)相似的水溶性、生物相容性和长血液循环时间，同时又具有快速的进入细胞、并在细胞线粒体中高选择性富集的能力。含N‑氧化三级胺基团的化合物修饰的药物或探针能够对线粒体特异性治疗或标记。

Description

含N-氧化三级胺基团的化合物作为细胞线粒体靶向载体的 应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种含N-氧化三级胺基团的化合物作为细胞线粒体靶向载体的应用。
背景技术
线粒体是人体组织细胞中的重要细胞器，参与多种代谢过程，其功能障碍与癌症、神经退行性疾病、肥胖和缺血再灌注损伤等难治愈疾病密切相关【潘凌立等，医学综述2015，21(1)37-38】。高效治疗线粒体类疾病的关键是使药物分子能够高效靶向线粒体。但是，药物分子的小分子特性和疏水性等导致它们在体内被迅速降解或清除，到达病灶部位并且入胞后进入线粒体的效率非常低。
利用特异性靶向线粒体的分子或大分子将药物输送到病灶部位、进入细胞后特异性地靶向线粒体，可提高药物生物利用率并提高线粒体类疾病的疗效。但是这种能够特异性靶向线粒体的分子或大分子并不多，最常用的线粒体靶向基团是电子离域亲脂阳离子型分子如三苯基磷基、地喹氯铵和特殊序列多肽。体外细胞水平研究表明，这些线粒体靶向分子能帮助高分子载体进入到细胞的线粒体中，从而实现将药物分子靶向输送到细胞线粒体的目的【齐雪静等，中国药学学报2015，50(9)741-744；Jean等， Accounts of ChemicalResearch 2016，49(9)1892-1902】。但是，此类分子都携带正电荷且具有很强的疏水性，以此为靶向基团修饰药物分子或高分子载体后，容易与免疫蛋白结合，因而静脉注射后会很快被清除而无法到达病灶部位，也就无从谈起进一步的细胞线粒体靶向输送；同时，这些分子本身也具有较大的毒副作用。
因此，亟需一种拥有良好的亲水性和生物相容性以具有很好的血液隐蔽能力，从而能在体内长时间循环，提高输送药物分子在体内的稳定性，又具有快速进入细胞并靶向细胞线粒体的能力的线粒体靶向分子，从而真正实现药物分子的体内靶向线粒体输送。
发明内容
本发明提供了含N-氧化三级胺基团的化合物，其可作为细胞线粒体的靶向载体，应用于药物输送或基因输送领域。该类化合物呈电中性，具有与聚乙烯醇(PEG)相似的水溶性、生物相容性和长血液循环时间，同时又具有快速的进入细胞、并在细胞线粒体中高选择性富集的能力。含 N-氧化三级胺基团的化合物修饰的药物或探针能够对线粒体特异性治疗或标记。
本发明还提供了含N-氧化三级胺基团的化合物作为细胞线粒体靶向载体的应用。
所述的含N-氧化三级胺基团的化合物含有一个或者多个N-氧化三级胺结构单元，所述的N-氧化三级胺结构单元包括如下氮氧化物结构单元中的至少一种：
式(I)～(III)中，R1、R2为分别独立的烷基、取代烷基、芳香基、取代芳香基或聚合物主链；R3、R4为分别独立的氢、烷基、取代烷基、芳香基、取代芳香基或聚合物主链。例如甲基、乙基、氯乙基或者羟乙基等烷基或者烷基衍生物；也可以为线性、支化或者树枝状高分子主链结构，如聚甲基丙烯酸酯主链结构，超支化聚乙烯亚胺(PEI)，支化聚乙烯亚胺(BPEI)，聚赖氨酸(PLL)等各种聚合物结构。
所述的含N-氧化三级胺基团的化合物可以为小分子结构，也可以为大分子聚合物。
所述的含N-氧化三级胺基团的化合物为小分子结构时，可以为N，N- 二甲基或二乙基胺基及吡啶基的氧化物，N上的另一取代基上含有羟基、氨基等基团用于与药物等功能分子的键合。
作为优选，所述的含N-氧化三级胺基团的化合物为三级胺、吡啶或咪唑的氮氧化物，其结构式如下：
所述的含N-氧化三级胺基团的化合物为大分子聚合物结构时，其为线性、支化或树枝状高分子结构，N-氧化三级胺结构单元可以存在于聚合物的主链、支链、分支或者末端位置。
N-氧化三级胺结构单元存在于聚合物的支链上时，作为优选，所述的化合物为侧链含N-氧化三级胺结构单元的聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酰胺、聚甲基丙烯酸酰胺、聚乙烯亚胺类、N-氧化聚乙烯基吡啶、 N-氧化聚乙烯基咪唑或聚(N，N-二甲基-赖氨酸)。
进一步优选的，所述化合物的结构式如下：
其中，聚合度n为1～500。
N-氧化三级胺结构单元存在于聚合物的支链上时，作为优选，所述的化合物为主链含有N-氧化三级胺结构单元的的线性聚合物或支化聚合物，其结构式如下：
其中，聚合度m1为1～500，聚合度m2为1～500，摩尔分数x为0～1。
上述含N-氧化三级胺基团的化合物具有细胞线粒体靶向功能，其重要应用之一是线粒体靶向药物输送。
本发明提供了上述含N-氧化三级胺基团的化合物作为药物分子的细胞线粒体靶向载体的应用。
所述的药物分子为抗癌药物分子或治疗线粒体相关疾病的药物分子。
所述抗癌药物分子为阿霉素、喜树碱衍生物、姜黄素、伊立替康、甲氨蝶呤、苦参碱、丹酚酸、紫杉醇和多肽中的一种或者多种。
与正常细胞相比，癌细胞代谢异常旺盛，线粒体含量高、活性高；将作用于线粒体的药物分子键合上述N-氧化三级胺基团的化合物，可以实现癌细胞线粒体靶向、提高抗肿瘤作用。
许多疾病与线粒体功能异常有密切的联系，例如帕金森症，急性脑缺血，所以可以通过将治疗线粒体相关疾病的药物分子(例如：丁苯酞)连接N-氧化三级胺基团的化合物，发挥线粒体相关疾病的治疗作用。
负载药物的方法可以通过共价键连接，也可以是本领域常用的其他相互作用例如疏水相互作用、静电相互作用等。
本发明的N-氧化三级胺基团的化合物作为药用载体材料的应用方法，与药物分子可以通过共价键、离子键、氢键或者分子间相互作用力连接、附着在载体分子上或者被载体分子包裹。
上述N-氧化三级胺基团的化合物连接药物分子的方法之一，可用含有N-氧化三级胺单元的单体与连接有药物分子的单体利用已知的聚合反应进行聚合来制备、或者利用大分子反应法将药物分子引入到含有N-氧化三级胺单元的聚合物上，也可先聚合反应制备同时含三级胺和药物分子的聚合物再对三级胺进行氧化来制备得到。
一种N-氧化三级胺基团的化合物连接药物分子的方法，包括：将N- 氧化三级胺基团的化合物单体与含药物分子的聚合物链进行嵌段共聚。
所述的N-氧化三级胺基团的化合物单体为甲基丙烯酸2-(N，N-二乙基氨基)乙基酯，所述的药物分子为SN38，制备得到的嵌段共聚物的结构式为：
其中，m＝1～200，n＝1～300。
具体的制备方法包括：
(1)SN38分子通过丁二酸酐与2-羟基乙基甲基丙烯酸酯连接，制备得到含SN38的聚合物链；
(2)在引发剂和/或催化剂存在条件下，甲基丙烯酸2-(N，N-二乙基氨基) 乙基酯与上述步骤(1)中含SN38的聚合物链进行嵌段共聚，然后进行氧化，得到上述结构的嵌段共聚物。
利用聚合物胶束常用的制备方法例如溶剂置换法，透析法，超声法以及液膜法将上述嵌段共聚物分子制成胶束型纳米颗粒溶液。
本发明还提供了上述含N-氧化三级胺基团的化合物与探针分子连接获得线粒体特异性探针。
得到的线粒体特异性探针具有细胞线粒体示踪功能或者线粒体相关疾病病灶示踪功能。
本发明还提供了含N-氧化三级胺基团的化合物作为DNA、RNA的细胞线粒体靶向载体，所述含N-氧化三级胺基团的化合物的结构式如下：
其中，n2为1～300。
所述的DNA、RNA为带有治疗效果的DNA、RNA。
本发明的N-氧化三级胺基团的化合物可以在水中溶解、形成乳液、纳米尺寸胶束或者囊泡，利用本领域常用的制备方法即可得到所需要的溶液分散形式。
本发明具有如下有益效果：
本发明将多种具有N-氧化三级胺官能团的化合物应用于线粒体靶向的药物分子或治疗基因输送领域。这种应用方法所得到的载药分子具有良好的水溶性与生物相容性，其生物相容性与本领域中的黄金标准PEG所制成的载药分子相当，在体内能长时间的循环，提高承载分子在体内的生物稳定性，减少了药物在正常组织中的富集，减少药物对正常组织的毒副作用，同时该系列载体分子能增强药物分子在细胞线粒体的富集，提高生物相容性的同时可以明显提高药物的药学作用。
进一步地，同PEG载体或者其他亲水性基团修饰的药物载体的应用方法相比，含N-氧化三级胺基团的化合物载药分子进入细胞的途径明显不同于其他普通药物载体体系，进入细胞后高度选择性的在细胞的线粒体中富集，提高了药物在细胞内的利用率。对线粒体异常引起的疾病的治疗具有重要的突破意义。
更进一步地，同PEG或者其他亲水性基团修饰的药物载体相比，由于肿瘤细胞线粒体代谢旺盛，数量远高于正常细胞，含N-氧化三级胺基团的化合物可携带药物进入肿瘤细胞中的线粒体，催化肿瘤细胞的能量供应，有效杀死肿瘤细胞，提高疗效，具有重要的突破意义。
本发明的N-氧化三级胺药物载体连接药物分子制备方法操作简单，采用本领域常用的合成方法即可。
N-氧化三级胺分子由相应的三级胺分子氧化来制备。
N-氧化三级胺聚合物可以由相应的含N-氧化三级胺的单体通过自由基等、缩合聚合等聚合方法制备，也可由相应的含三级胺的单体先聚合制备成相应的聚合物、然后进行氧化获得。当含N-氧化三级胺上的取代基不大时聚合物具有很好的水溶性，并且它能通过共价键连接药物分子，在水中溶解形成溶液；也可以通过调整亲水性，使其在水中形成纳米尺寸的胶束或者囊泡用来输送药物分子；亦可以在该载体上引入能输送基因的官能团，应用于治疗基因的输送。它既具有良好的水溶性与生物相容性，又能快速进入细胞线粒体，提高药物的利用率，实现线粒体相关的治疗效果。因此，这种将N-氧化三级胺聚合物应用于药物输送以及基因输送领域，可被视为一种优良的向线粒体输送药物的方法。
附图说明
图1为实施例1制备的ODEAEMA的NMR图谱；
图2为实施例2制备的P(DMAEMA/tBMA)的NMR图谱；
图3为实施例1制备的ODEAEMA-Cy5.5作为线粒体荧光探针与线粒体靶向染料在Hela细胞系中的分布对比图；
图4为实施例2制备的PODEAEMA-Cy5.5与线粒体靶向染料在 HepG2细胞系中的分布对比图；
图5为实施例2制备的PODEAEMA在不同pH条件下的HEPES溶液中的Zeta电势结果；
图6为实施例2制备的PODEAEMA对Bcap37细胞系的细胞毒性分析实验图；
图7为实施例3制备的PODEAEMA-b-poly-SN38与线粒体靶向染料在Hela细胞系中的分布对比图；
图8为实施例3制备的PODEAEMA-b-polySN38药物与对照药物 PEG-b-SN38对HepG2人肝癌细胞荷瘤裸鼠肿瘤的抑制实验中的肿瘤生长曲线图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细描述，需要指出的是，以下所述实施例旨在便于对本发明的理解，而对其不起任何限定作用。
实施例1：ODEAEMA-Cy5.5荧光探针合成
本申请的基于N-氧化三级胺分子作为线粒体荧光探针的应用，其一种实施方式为N-氧化-甲基丙烯酸2-(N，N-二乙基氨基)乙基酯(ODEAEMA) 分子连接荧光分子作为线粒体荧光探针。更具体地，在一种实施方式中，连接的荧光分子为Cy5.5，合成如下：
合成方法如下：
将甲基丙烯酸2-(N，N-二乙基氨基)乙基酯(DEAEMA，9.25g)溶于 20mL氯仿。将反应体系置于冰水浴中，向体系中缓慢滴加11.17g间氯过氧苯甲酸与100mL氯仿的混合溶液。反应体系在室温中搅拌12小时后，缓慢加入17g碳酸钾。搅拌10分钟后反应溶液使用硅藻土过滤，滤液浓缩后使用中性氧化铝进行柱层析分离，洗脱流动相为含有10％甲醇的二氯甲烷溶液。所得洗脱液旋干浓缩，置于真空箱中过夜，可以得到N-氧化- 甲基丙烯酸2-(N，N-二乙基氨基)乙基酯(ODEAEMA)产物，ODEAEMA 的NMR图谱如图1所示。
取1mg商品Cy5.5-NHS固体(Lumiprobe，Cat.#47020)溶于1mL DMSO溶液中，加入1mg/mL的半胱胺DMSO溶液169μL。该反应溶液在室温下搅拌2小时后，加入4.67mL DMSO稀释，即可得到浓度为200 μg/mL的Cy5.5-SH DMSO溶液。
取少量ODEAEMA产物称重后溶于DMSO中配制为2mg/mL溶液。取该溶液5μL，加入到1mL DMSO中。往该反应体系再加入50μL上述 Cy5.5-SH的DMSO溶液(Cy5.5-SH浓度为200μg/mL)。室温搅拌两小时后。即可得到ODEAEMA-Cy5.5荧光探针溶液。
实施例2：PODEAEMA靶向线粒体载体合成
本申请的基于N-氧化三级胺聚合物作为线粒体靶向载体的应用，其一种实施方式，包括连接荧光分子制备线粒体荧光探针型聚合物。更具体地，在一种实施方式中，负载的荧光分子为Cy5.5，合成如下：
其中摩尔分数x为0.8～0.95，n＝3～300。
合成方法如下：
(1)PODEAEMA-NHS的合成。
将甲基丙烯酸2-(N，N-二乙基氨基)乙基酯(DEAEMA，5.37g)与甲基丙烯酸叔丁酯(tBMA，0.37g)，2-异溴丁酸乙酯0.0041g，2，2’-联吡啶 0.085g，溴化亚铜0.038g及甲醇2mL投入到聚合瓶中之后，连续通入氮气30分钟去除氧气。然后密封30摄氏度反应6小时。反应结束后过三氧化二铝柱去除催化剂，所得溶液浓缩后加入到正己烷中沉淀，所得沉淀真空干燥得到共聚产物P(DMAEMA/tBMA)，NMR谱图如图2所示。
取1.21g共聚物产物加入到10mL 30％的过氧化氢水溶液中，室温下搅拌过夜。所得澄清溶液直接用透析膜透析，透析后所得溶液冷冻干燥。得到N-氧化的共聚物P(ODMAEMA/tBMA)，结构式如下所示：
得到上述产物直接加入二氯甲烷4mL，三氟乙酸2mL室温下搅拌3 小时。反应结束后反应液旋蒸去除大部分溶剂以及三氟乙酸后在甲醇溶液中透析，透析一天后在水中透析，所得澄清溶液冻干。得到产物羧酸功能化的N-氧化的共聚物P(ODMAEMA/MA)：
取上述产物0.82g，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC，0.2521g)，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，0.17g)，催化量4-二甲氨基吡啶(DMAP) 和0.3mL三乙胺加入到含有5mL DMSO的圆底烧瓶中，室温搅拌过夜。直接将反应溶液用水透析，所得透析液冷冻干燥，得到含有NHS活化酯的N-氧化的共聚物产物(PODEAEMA-NHS)：
所得的上述PODEAEMA-NHS分子可以通过高活性的NHS基团连接各种药物分子、探针分子，实现输送药物分子、探针分子到细胞线粒体的功能。在本实施例中，该载体分子连接的是Cy5.5-NH2荧光探针分子。具体连接方法为：
将20mg PODEAEMA-NHS分子溶于1mL DMSO中，随后加入160μL 5mg/mL Cy5.5-NH2(Lumiprobe，Cat.#170C0)DMSO溶液，室温搅拌3 小时。所得溶液在截流分子量为1000的透析膜中甲醇相透析4小时，随后在水相中透析4小时。透析后将溶液冻干即可得到PODEAEMA-Cy5.5 荧光探针分子。
实施例3：PODEAEMA-b-polySN38嵌段共聚物的制备
本申请的基于N-氧化三级胺聚合物作为药物载体的应用，其一种实施方式，是将N-氧化三级胺聚合物为亲水链，接到药物分子或其聚合物上，形成双亲性的键合化药物，通过其在水溶液中的组装形成纳米颗粒或胶束。更具体地，在一种实施方式中，负载的药物为7-乙基-10-羟基喜树碱(SN38)，合成如下：
其中，m＝1～200，n＝1～300。
合成方法如下：
将DMAEMA(240mg)，2-异溴丁酸乙酯(3.9mg)，五甲基二乙烯三胺(40mg)，溴化亚铜(10mg)，DMF1mL投入到聚合瓶中之后，连续通入氮气30分钟去除氧气。然后密封40摄氏度反应4小时。在氩气保护下，用注射器直接向密闭的反应体系中注射如上所示连接上SN38分子的单体SN38-MA 0.2g，保持密闭的条件下30摄氏度继续反应8小时。反应结束后用截留分子量分别为500、1000、3500、10000的透析膜在DMSO 中透析6小时随后立即在水相中透析6小时，所得溶液分别加入0.8g间氯过氧苯甲酸搅拌2小时，所得溶液浓缩后冷冻干燥得到嵌段共聚产物 PODEAEMA-b-polySN38，其结构式如下：
其中，m＝1～200，n＝1～300。
1H-NMR谱峰归属(d6-DMSO，ppm)：7.1-8.2(m，CHCHC(OH)CH， CHCHC(OH)CH， CHCHC(OH)CH，CONCCHC)，5.2-5.5(m，C(OH)COOCH2，CONCH2)，3.8-4.6( b，COOCH2CH2N，COOCH2CH2O，COOCH2CH2O)，3.0-3.6(b，CH2N(CH2CH3)2， CH2N(CH2CH3)2)，2.8-2.95(b，OCH2CH2COOC)，2.6-2.8(b， OCH2CH2COOC)，1.6-1.9(CH3C(COOCH2CH2O)CH2， CH3C(COOCH2CH2N)CH2，C(OH)CH2CH3)，1.0-1.4(m，CH3CCOOCH2CH2N， CH3CCOOCH2CH2O，CH2NCO，N(CH2CH3)2)，0.6-0.9(b，C(OH)CH2CH3)。
应用例1ODEAEMA-Cy5.5示踪细胞线粒体
(1)配制方法：
实施例1中所得ODEAEMA-Cy5.5溶液可以直接用于细胞实验中。
(2)ODEAEMA-Cy5.5示踪细胞线粒体成像
在激光共聚焦成像皿中铺入12万HepG2细胞，细胞贴壁培养一天后更换为新鲜培养基。加入0.2微升商业线粒体荧光染色剂MitoTracker green (ThermoFisher，Cat.#M7514)，孵育30分钟。随后加入细胞核荧光染色剂Hoechst后孵育15分钟。最后加入ODEAEMA-Cy5.5溶液，使培养基中ODEAEMA-Cy5.5终浓度为10微克/毫升。孵育60分钟后，利用激光共聚焦显微镜进行观察。成像结果如图3所示。线粒体染料与 ODEAEMA-Cy5.5在细胞内的分布几乎完全一致，这一分析结果表明ODEAEMA小分子的确对细胞线粒体具有高度选择性。说明氮氧化物结构是一种具有靶向线粒体的能力的功能性官能团。
应用例2：PODEAEMA-Cy5.5示踪细胞线粒体
(1)配制方法
将实施例2中得到的PODEAEMA-Cy5.5固体产物1mg溶于1mL PBS溶液中，即可得到PODEAEMA-Cy5.5示踪细胞线粒体工作液。
(2)PODEAEMA-Cy5.5示踪细胞线粒体成像
在激光共聚焦成像皿中铺入12万HepG2细胞，细胞贴壁培养一天后更换为新鲜培养基。加入0.2微升商业线粒体荧光染色剂MitoTracker green，孵育30分钟。随后加入细胞核荧光染色剂Hoechst后孵育15分钟。最后加入PODEAEMA-Cy5.5溶液，使培养基中PODEAEMA-Cy5.5终浓度为 50微克/毫升。孵育60分钟后，利用激光共聚焦显微镜进行观察。并利用图片处理软件Morph计算PODEAEMA-Cy5.5分子与细胞微粒体的重叠程度，计算重叠比例。成像结果如图4所示。将多个成像结果图片利用Morph 软件进行共定位分析。线粒体染料与PODEAEMA-Cy5.5共定位程度为 92.9％±1.8％，这一分析结果表明PODEAEMA聚合物对细胞线粒体也具有高度选择性。
(3)PODEAEMA聚合物电势测定
将实施例2中制备的PODEAEMA载体分子，溶于不同pH值条件的 HEPES缓冲溶液中，配制为2毫克/毫升的溶液，利用Zeta电位仪测定电势。结果如图5所示。该结果说明PODEAEMA聚合物在生理pH条件下呈现电中性，其电荷性质优于其他带正电荷的线粒体靶向分子如三苯基膦基线粒体靶向基团。
(4)PODEAEMA细胞毒性实验
在96孔板中，每个孔铺入100μL培养基、5000个Bcap37细胞。该96孔板置于细胞培育箱中孵育24小时使细胞贴壁。随后按照计算浓度，每孔加入相应浓度的含有PODEAEMA分子的培养基溶液100μL，使得各个孔中药物分子终浓度为实验设计值，其中空白对照组加入100 μL不含PODEAEMA分子的培养基溶液。随后该96孔板继续置于细胞培育箱中孵育48小时。到实验设计培养时间后，该96孔板置于离心机中以1100rpm速度离心6min，然后弃去每孔中的培养基溶液。每孔中加入 100μL含有MTT 0.75μg/mL的培养基溶液，然后继续培养4小时。其后 3300rpm离心5分钟，弃去每孔中的MTT培养基溶液，加入100μLDMSO。将96孔板震荡摇匀数分钟，使产生的紫色晶体充分溶解在DMSO中。使用酶标仪测定96孔板每孔在562nm和620nm处的吸光度。并与空白对照组进行对比，依此计算每孔中细胞比活率。
结果如图6所示，该结果表明，PODEAEMA分子在细胞水平没有显著毒性，具有良好的生物相容性，适宜用作药物输送载体分子。
应用例3：PODEAEMA-b-polySN38注射液抗肿瘤性能
(1)配制方法
将实施例3中得到的PODEAEMA-b-polySN38固体产物100mg溶解于5mL DMF之中，溶解至溶液澄清。随后在磁力搅拌的情况下，向该溶液中缓慢滴加纯水20mL，滴加完毕后，继续搅拌15分钟。随后该溶液使用3500拦截分子量的透析膜在水相中透析4小时。最终得到的水溶液旋蒸浓缩，所得的水溶液即为PODEAEMA-b-polySN38分子的纳米颗粒溶液。
上述方法制备的PODEAEMA-b-polySN38纳米颗粒水溶液根据给药量计算出的给药浓度，稀释于PBS水溶液或者生理盐水溶液中。轻微震荡摇匀，即配即用。
(2)考察PODEAEMA-b-polySN38分子在细胞内的分布
实施例3所得到PODEAEMA-b-polySN38与1％质量比Cy5.5-SH在 DMSO溶液中搅拌过夜后在DMSO中使用截流分子量为3500透析膜透析，冻干可以得到Cy5.5标记的PODEAEMA-b-polySN38聚合物。随后使用上述配制方法配制为纳米颗粒溶液。
在激光共聚焦成像皿中铺入12万HepG2细胞，细胞贴壁培养一天后更换为新鲜培养基。加入0.2微升商业线粒体荧光染色剂MitoTracker green，孵育30分钟。随后加入细胞核荧光染色剂Hoechst，孵育15分钟。最后加入Cy5.5标记的PODEAEMA-b-polySN38纳米颗粒溶液，使培养基中PODEAEMA-b-polySN38纳米颗粒终浓度为50微克/毫升。孵育60分钟后，利用激光共聚焦显微镜进行观察。成像结果如图7所示。结果表明，PODEAEMA-b-polySN38在肿瘤细胞的线粒体内也高度选择性的富集。
(3)抑瘤实验
考察PODEAEMA-b-polySN38对HepG2人肝癌细胞荷瘤裸鼠肿瘤的抑制作用。BALB/c裸鼠腋下移植1×106HepG2肿瘤细胞，待肿瘤长至约 80mm3后开始给药，每隔两天进行尾静脉注射。三组分别为本发明的 PODEAEMA-b-polySN38(实施例3)，PEG-b-SN38(PEG2Kda末端连接 SN38)，剂量为SN38-eq.10mg/kg，及PBS空白对照组。给药周期到期(12 天)后，继续观察裸鼠27天。结果如图8所示。
这一结果表明：同PEG组进行对比，PODEAEMA-b-polySN38治疗组的裸鼠肿瘤体积不但没有增长，反而体积减小至肉眼无法观察到的水平。停药后肿瘤没有观察到明显的复发现象。而PEG-b-SN38给药组的裸鼠肿瘤体积虽然生长受到明显的抑制，但是肿瘤体积仍然在缓慢增加，显著低于PODEAEMA-b-polySN38抑瘤效果，并且停药后肿瘤增长迅速。这一对比实验结果说明PODEAEMA作为药物载体，在连接药物分子后，制备成纳米颗粒溶液后不仅比PEG载体表现出更显著的抗癌活性，而且治疗后长时间内没有复发迹象，治疗效果在本领域中处于领先水平。说明具有线粒体靶向输送能力的药物输送载体PODEAEMA，载药后可以高效杀灭线粒体活动异常旺盛的肿瘤细胞，具有良好的应用前景。

Claims (9)

1.一种含N-氧化三级胺基团的化合物作为细胞线粒体靶向载体的应用，其特征在于，所述的化合物含有一个或者多个N-氧化三级胺结构单元，所述的N-氧化三级胺结构单元包括如下氮氧化物结构单元中的至少一种：
式(I)～(III)中，R1、R2为分别独立的烷基、取代烷基、芳香基、取代芳香基或聚合物主链；R3、R4为分别独立的氢、烷基、取代烷基、芳香基、取代芳香基或聚合物主链。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的化合物为三级胺、吡啶或咪唑的氮氧化物。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的化合物的结构式如下：
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的化合物为侧链含N-氧化三级胺结构单元的聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酰胺、聚甲基丙烯酸酰胺、聚乙烯亚胺类、N-氧化聚乙烯基吡啶、N-氧化聚乙烯基咪唑或聚(N，N-二甲基-赖氨酸)。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述化合物的结构式如下：
其中，聚合度n为1～500。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的化合物为主链含有N-氧化三级胺结构单元的线性聚合物或支化聚合物，其结构式如下：
其中，聚合度m1为1～500，聚合度m2为1～500，摩尔分数x为0～1。
7.根据权利要求1～6任一项所述的应用，其特征在于，含N-氧化三级胺基团的化合物作为药物分子的细胞线粒体靶向载体。
8.根据权利要求1～6任一项所述的应用，其特征在于，含N-氧化三级胺基团的化合物与探针分子连接获得线粒体特异性探针。
9.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，含N-氧化三级胺基团的化合物作为DNA、RNA的细胞线粒体靶向载体，所述含N-氧化三级胺基团的化合物的结构式如下：
其中，n2为1～300。
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