CN108929915A - 肺癌骨转移基因检测诊断试剂盒 - Google Patents

肺癌骨转移基因检测诊断试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及肺癌骨转移基因检测诊断试剂盒。虽然hsa‑miR‑6793‑5p、hsa‑miR‑591、hsa‑miR‑365a‑3p单独用于区分肺癌骨转移患者与肺癌未转移患者仅具有一定或较低的准确性，但是hsa‑miR‑6793‑5p、hsa‑miR‑591、hsa‑miR‑365a‑3p联合用于区分肺癌骨转移患者与肺癌未转移患者具有较高的准确性，准确率较高。因此，可以基于此制造用于诊断肺癌骨转移的基因检测试剂盒，该试剂盒中含有hsa‑miR‑6793‑5p、hsa‑miR‑591和hsa‑miR‑365a‑3p的实时荧光定量PCR引物(如表1)，还含有内参的实时荧光定量PCR引物，以及实时荧光定量PCR所需要的酶和试剂。

Description

肺癌骨转移基因检测诊断试剂盒
技术领域
本发明涉及肿瘤检测试剂盒，尤其涉及肺癌骨转移基因检测诊断试剂盒。
背景技术
肺癌是我国常见的恶性肿瘤之一，严重影响患者的生活质量和生命健康。骨转移是肺癌病情恶化的标志之一，若能够对患者是否发生骨转移进行准确的检测和诊断，对于临床给予对症治疗，改善治疗效果具有重要意义。肿瘤细胞在增殖过程中会主动释放或者合成部分肿瘤标志物，肿瘤细胞对宿主细胞的刺激也可致使宿主细胞产生肿瘤标志物。肿瘤标志物在辅助诊断肿瘤、检测患者病情变化和预后具有重要意义，但是肺癌患者的肿瘤标志物水平和骨转移之间的相关性研究较少，肺癌骨转移检测诊断试剂盒需求缺口很大。
发明内容
本发明的目的在于提供一种肺癌骨转移基因检测诊断试剂盒。
为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：
一种用于诊断肺癌患者骨转移的基因检测试剂盒，含有hsa-miR-6793-5p、hsa-miR-591和hsa-miR-365a-3p的实时荧光定量PCR引物；其中，hsa-miR-6793-5p的实时荧光定量PCR上游引物如Sequence NO.3所示，其实时荧光定量PCR下游引物如Sequence NO.4所示；hsa-miR-591的实时荧光定量PCR上游引物如Sequence NO.5所示，其实时荧光定量PCR下游引物如Sequence NO.6所示；hsa-miR-365a-3p的实时荧光定量PCR上游引物如Sequence NO.7所示，其实时荧光定量PCR下游引物如Sequence NO.8所示。
优选地，还含有内参GAPDH的实时荧光定量PCR引物，其实时荧光定量PCR上游引物如Sequence NO.1所示，其实时荧光定量PCR下游引物如Sequence NO.2所示。
优选地，还含有实时荧光定量PCR所需要的酶和试剂等。
虽然hsa-miR-6793-5p、hsa-miR-591、hsa-miR-365a-3p单独用于区分肺癌骨转移患者与肺癌未转移患者仅具有一定或较低的准确性，但是hsa-miR-6793-5p、hsa-miR-591、hsa-miR-365a-3p联合用于区分肺癌骨转移患者与肺癌未转移患者具有较高的准确性，准确率较高。因此，可以基于此制造用于诊断肺癌骨转移的基因检测试剂盒，该试剂盒中含有hsa-miR-6793-5p、hsa-miR-591和hsa-miR-365a-3p的实时荧光定量PCR引物(如表1)，还含有内参的实时荧光定量PCR引物，以及实时荧光定量PCR所需要的酶和试剂。
附图说明
图1是hsa-miR-6793-5p单独区分训练集骨转移组与训练集未转移组的ROC曲线。
图2是hsa-miR-591单独区分训练集骨转移组与训练集未转移组的ROC曲线。
图3是hsa-miR-365a-3p单独区分训练集骨转移组与训练集未转移组的ROC曲线。
图4是hsa-miR-6793-5p、hsa-miR-591、hsa-miR-365a-3p联合区分训练集骨转移组与训练集未转移组的ROC曲线。
图5是hsa_circ_0068527单独区分训练集骨转移组与训练集未转移组的ROC曲线。
图6是hsa_circ_0084169单独区分训练集骨转移组与训练集未转移组的ROC曲线。
图7是hsa_circ_0024887单独区分训练集骨转移组与训练集未转移组的ROC曲线。
图8是hsa_circ_0068527、hsa_circ_0084169、hsa_circ_0024887联合区分训练集骨转移组与训练集未转移组的ROC曲线。
图9是hsa_circ_0068527、hsa-miR-591、hsa-miR-365a-3p联合区分训练集骨转移组与训练集未转移组的ROC曲线。
具体实施方式
实施例1：基于微小RNA的试剂盒
一、实验样本
选择2014年6月至2018年6月在四川省肿瘤医院就诊的肺癌患者200例作为研究对象。纳入标准：①预计生存期≥3个月；②血小板＞8×1010/L；③停止放化疗＞1个月；④治疗前停止使用钙剂；排除标准：①严重心、肝、肾疾病；②有其他肿瘤性疾病；③有严重糖尿病；④有免疫系统疾病。根据临床、影像学、病理等确诊为骨转移患者作为骨转移组，未发生骨转移患者作为未转移组。骨转移组88例，未转移组112例。骨转移组中女性42例，年龄36-75岁，平均(52.15±5.25)岁；未转移组中女性58例，年龄38-72岁，平均(54.23±5.16)岁；骨转移组与未转移组性别比例、年龄无显著差异。
将骨转移组与未转移组进一步分别随机对半分为如下：
训练集骨转移组：44；验证集骨转移组：44；
训练集未转移组：56；验证集未转移组：56。
二、实验方法
1、外周血样品采集及保存
选用EDTA抗凝管采集患者清晨空腹外周血5mL，4℃条件下2000r/min离心10min，小心吸取上层清亮血浆液体于无菌冻干管中，标记后放入-80℃冰箱储存备用。
2、血浆总RNA提取及质量检测
参照TaKaRa RNAiso Blood试剂盒说明书操作，每份样品取血浆250μL，提取血浆样品中的总RNA。应用分光光度计测定总RNA的光密度D(260)和D(280)值，用D(260)值计算其浓度，并计算D(260)/D(280)值检测其纯度，D(260)/D(280)值范围在1.8～2.1认为合格。
3、实时荧光定量PCR检测目标微小RNA
按PrimeScript RTreagent Kit with gDNA Eraser试剂盒的说明书进行操作。目标微小RNA和内参GAPDH的实时荧光定量PCR引物由广州锐博生物设计合成，具体见表1。
表1实时荧光定量PCR引物
2.1去除基因组DNA
反应体系为：5×gDNA Eraser Buffer 2.0μL，gDNA Eraser 1.0μL，总RNA 2μg，RNase Free dH2O补至10μL。反应条件为：42℃2min，4℃。
2.2反转录反应
上一步实验的反应液：10.0μL，Prime Script RT Enzyme Mix Ⅰ 1.0μL，RTPrimer Mix 1.0μL，5×Prime Script Buffer 2 4.0μL，RNase Free dH2O 4.0μL，总共20μL。反应条件为：37℃15min，85℃5s，4℃。
2.3 RT-PCR反应
用Applied Biosystems Stepous荧光定量PCR测定仪进行反应，按下列组分配制PCR反应液：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 10μL，PCR上游引物(10μmol/L)0.8μL，PCR下游引物(10μmol/L)0.8μL，ROX Reference Dye 0.4μL，RT反应液(cDNA溶液)2.0μL，dH2O(灭菌蒸馏水)6μL，总共20μL。采用两步法PCR反应程序。反应结束后确认PCR的扩增曲线和融解曲线。应用2-ΔΔCt法计算目标微小RNA相对表达量。
3、统计学方法
数据采用SPSS 19.0进行分析。计量资料用均值±偏差表示，采用t检验，计数资料用百分率表示，采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义，并建立ROC曲线，计算曲线下面积(AUC)及95％可信区间。运用Logistic回归筛选变量，建立回归方程，产生一组新变量Y。对新变量及各单项指标进行ROC曲线分析。
三、实验结果
1、血浆总RNA质量检测
应用紫外分光光度计检测各样本总RNA的D(260)/D(280)值均在1.8～2.1之间，各样本总RNA均有较好质量，可以进行实时定量PCR检测。
2、训练集骨转移组与训练集未转移组目标微小RNA相对表达量比较
与未转移组相比，骨转移组目标微小RNA的相对表达量全部上调(P＜0.05)。
3、目标微小RNA单独区分训练集骨转移组与训练集未转移组的ROC曲线
ROC曲线指受试者工作特征曲线，是反映敏感性和特异性连续变量的综合指标，是用构图法揭示敏感性和特异性的相互关系，它通过将连续变量设定出多个不同的临界值，从而计算出一系列敏感性和特异性，再以敏感性为纵坐标、(1-特异性)为横坐标绘制成曲线，曲线下面积越大，诊断准确性越高。ROC曲线下的面积值在1.0和0.5之间。在AUC>0.5的情况下，AUC越接近于1，说明诊断效果越好。AUC在0.5～0.7时有较低准确性，AUC在0.7～0.9时有一定准确性，AUC在0.9以上时有较高准确性。
hsa-miR-6793-5p、hsa-miR-591、hsa-miR-365a-3p单独区分训练集骨转移组与训练集未转移组的ROC曲线分别如图1～3所示。hsa-miR-6793-5p区分训练集骨转移组与训练集未转移组的ROC曲线下面积为0.784，具有一定的准确性；hsa-miR-591、hsa-miR-365a-3p单独区分训练集骨转移组与训练集未转移组的ROC曲线下面积分别为0.632、0.641，准确性较低。
4、目标微小RNA联合区分训练集骨转移组与训练集未转移组的ROC曲线
首先采用SPSS软件获取hsa-miR-6793-5p、hsa-miR-591、hsa-miR-365a-3p联合区分训练集骨转移组与训练集未转移组的logistics回归模型，然后根据该logistics回归模型绘制hsa-miR-6793-5p、hsa-miR-591、hsa-miR-365a-3p联合区分训练集骨转移组与训练集未转移组的ROC曲线。具体操作方法如下：
以训练集骨转移组与训练集未转移组各患者血浆样本中hsa-miR-6793-5p、hsa-miR-591、hsa-miR-365a-3p的相对表达量作为自变量(设X1＝hsa-miR-6793-5p相对表达量，X2＝hsa-miR-591相对表达量，X3＝hsa-miR-365a-3p相对表达量)，以组别(骨转移、未转移)作为应变量，对hsa-miR-6793-5p、hsa-miR-591、hsa-miR-365a-3p在训练集骨转移组与训练集未转移组各患者血浆样本中的相对表达量进行二元逻辑回归，得到二元逻辑回归方程：Y＝-0.203+5.294X1+4.779X2+6.051X3；再将各患者血浆样本中hsa-miR-6793-5p、hsa-miR-591、hsa-miR-365a-3p的相对表达量代入该二元逻辑回归方程，即可得到各个样本的回归值Y，以可能的回归值Y作为诊断点，计算灵敏度和特异性，据此绘制ROC曲线(如图4所示)，AUC为0.953，具有较高的准确性。根据ROC曲线的坐标计算维登指数＝特异性+灵敏度-1，维登指数最大值时对应的Y值为能进行诊断区分训练集骨转移组与训练集未转移组患者的最佳cut-off值3.913，即诊断临界值。
5、目标微小RNA联合诊断区分骨转移与未转移的准确度验证
分别将验证集骨转移组与验证集未转移组患者血浆中的hsa-miR-6793-5p、hsa-miR-591、hsa-miR-365a-3p相对表达量分别代入到上述二元逻辑回归方程中，Y值高于诊断临界值的预测为骨转移，Y值低于诊断临界值的预测为未转移，统计预测正确的患者数，使用预测正确的患者数除以验证集骨转移组与验证集未转移组总患者数即得目标微小RNA联合诊断区分骨转移与未转移的准确率，准确率为93％(93例/100例)，准确率较高。
综上可见，虽然hsa-miR-6793-5p、hsa-miR-591、hsa-miR-365a-3p单独用于区分肺癌骨转移患者与肺癌未转移患者仅具有一定或较低的准确性，但是hsa-miR-6793-5p、hsa-miR-591、hsa-miR-365a-3p联合用于区分肺癌骨转移患者与肺癌未转移患者具有较高的准确性，准确率较高。因此，可以基于此制造用于诊断肺癌骨转移的基因检测试剂盒，该试剂盒中含有hsa-miR-6793-5p、hsa-miR-591和hsa-miR-365a-3p的实时荧光定量PCR引物(如表1)，还含有内参的实时荧光定量PCR引物，以及实时荧光定量PCR所需要的酶和试剂。
实施例2：基于环状RNA的试剂盒
一、实验样本
同实施例1。
二、实验方法
1、外周血样品采集及保存
同实施例1。
2、血浆总RNA提取及质量检测
同实施例1。
3、实时荧光定量PCR检测目标环状RNA
按PrimeScript RTreagent Kit with gDNA Eraser试剂盒的说明书进行操作。目标环状RNA和内参GAPDH的实时荧光定量PCR引物由广州锐博生物设计合成，具体见表2。
表2实时荧光定量PCR引物
2.1去除基因组DNA
反应体系为：5×gDNA Eraser Buffer 2.0μL，gDNA Eraser 1.0μL，总RNA 2μg，RNase Free dH2O补至10μL。反应条件为：42℃2min，4℃。
2.2反转录反应
上一步实验的反应液：10.0μL，Prime Script RT Enzyme Mix Ⅰ 1.0μL，RTPrimer Mix 1.0μL，5×Prime Script Buffer 2 4.0μL，RNase Free dH2O 4.0μL，总共20μL。反应条件为：37℃15min，85℃5s，4℃。
2.3 RT-PCR反应
用Applied Biosystems Stepous荧光定量PCR测定仪进行反应，按下列组分配制PCR反应液：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 10μL，PCR上游引物(10μmol/L)0.8μL，PCR下游引物(10μmol/L)0.8μL，ROX Reference Dye 0.4μL，RT反应液(cDNA溶液)2.0μL，dH2O(灭菌蒸馏水)6μL，总共20μL。采用两步法PCR反应程序。反应结束后确认PCR的扩增曲线和融解曲线。应用2-ΔΔCt法计算目标环状RNA相对表达量。
3、统计学方法
数据采用SPSS 19.0进行分析。计量资料用均值±偏差表示，采用t检验，计数资料用百分率表示，采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义，并建立ROC曲线，计算曲线下面积(AUC)及95％可信区间。运用Logistic回归筛选变量，建立回归方程，产生一组新变量Y。对新变量及各单项指标进行ROC曲线分析。
三、实验结果
1、血浆总RNA质量检测
应用紫外分光光度计检测各样本总RNA的D(260)/D(280)值均在1.8～2.1之间，各样本总RNA均有较好质量，可以进行实时定量PCR检测。
2、训练集骨转移组与训练集未转移组目标环状RNA相对表达量比较
与未转移组相比，骨转移组目标环状RNA的相对表达量全部上调(P＜0.05)。
3、目标环状RNA单独区分训练集骨转移组与训练集未转移组的ROC曲线
ROC曲线指受试者工作特征曲线，是反映敏感性和特异性连续变量的综合指标，是用构图法揭示敏感性和特异性的相互关系，它通过将连续变量设定出多个不同的临界值，从而计算出一系列敏感性和特异性，再以敏感性为纵坐标、(1-特异性)为横坐标绘制成曲线，曲线下面积越大，诊断准确性越高。ROC曲线下的面积值在1.0和0.5之间。在AUC>0.5的情况下，AUC越接近于1，说明诊断效果越好。AUC在0.5～0.7时有较低准确性，AUC在0.7～0.9时有一定准确性，AUC在0.9以上时有较高准确性。
hsa_circ_0068527、hsa_circ_0084169、hsa_circ_0024887单独区分训练集骨转移组与训练集未转移组的ROC曲线分别如图5～7所示。hsa_circ_0068527区分训练集骨转移组与训练集未转移组的ROC曲线下面积为0.775，具有一定的准确性；hsa_circ_0084169、hsa_circ_0024887单独区分训练集骨转移组与训练集未转移组的ROC曲线下面积分别为0.609、0.625，准确性较低。
4、目标环状RNA联合区分训练集骨转移组与训练集未转移组的ROC曲线
首先采用SPSS软件获取hsa_circ_0068527、hsa_circ_0084169、hsa_circ_0024887联合区分训练集骨转移组与训练集未转移组的logistics回归模型，然后根据该logistics回归模型绘制hsa_circ_0068527、hsa_circ_0084169、hsa_circ_0024887联合区分训练集骨转移组与训练集未转移组的ROC曲线。具体操作方法如下：
以训练集骨转移组与训练集未转移组各患者血浆样本中hsa_circ_0068527、hsa_circ_0084169、hsa_circ_0024887的相对表达量作为自变量(设X1＝hsa_circ_0068527相对表达量，X2＝hsa_circ_0084169相对表达量，X3＝hsa_circ_0024887相对表达量)，以组别(骨转移、未转移)作为应变量，对hsa_circ_0068527、hsa_circ_0084169、hsa_circ_0024887在训练集骨转移组与训练集未转移组各患者血浆样本中的相对表达量进行二元逻辑回归，得到二元逻辑回归方程：Y＝-0.282+7.106X1+5.223X2+5.155X3；再将各患者血浆样本中hsa_circ_0068527、hsa_circ_0084169、hsa_circ_0024887的相对表达量代入该二元逻辑回归方程，即可得到各个样本的回归值Y，以可能的回归值Y作为诊断点，计算灵敏度和特异性，据此绘制ROC曲线(如图8所示)，AUC为0.955，具有较高的准确性。根据ROC曲线的坐标计算维登指数＝特异性+灵敏度-1，维登指数最大值时对应的Y值为能进行诊断区分训练集骨转移组与训练集未转移组患者的最佳cut-off值3.775，即诊断临界值。
5、目标环状RNA联合诊断区分骨转移与未转移的准确度验证
分别将验证集骨转移组与验证集未转移组患者血浆中的hsa_circ_0068527、hsa_circ_0084169、hsa_circ_0024887相对表达量分别代入到上述二元逻辑回归方程中，Y值高于诊断临界值的预测为骨转移，Y值低于诊断临界值的预测为未转移，统计预测正确的患者数，使用预测正确的患者数除以验证集骨转移组与验证集未转移组总患者数即得目标环状RNA联合诊断区分骨转移与未转移的准确率，准确率为91％(91例/100例)，准确率较高。
综上可见，虽然hsa_circ_0068527、hsa_circ_0084169、hsa_circ_0024887单独用于区分肺癌骨转移患者与肺癌未转移患者仅具有一定或较低的准确性，但是hsa_circ_0068527、hsa_circ_0084169、hsa_circ_0024887联合用于区分肺癌骨转移患者与肺癌未转移患者具有较高的准确性，准确率较高。因此，可以基于此制造用于诊断肺癌骨转移的基因检测试剂盒，该试剂盒中含有hsa_circ_0068527、hsa_circ_0084169和hsa_circ_0024887的实时荧光定量PCR引物(如表2)，还含有内参的实时荧光定量PCR引物，以及实时荧光定量PCR所需要的酶和试剂。
实施例3：基于miRNA和环状RNA的试剂盒
一、实验样本
同实施例1。
二、实验方法
1、外周血样品采集及保存
同实施例1。
2、血浆总RNA提取及质量检测
同实施例1。
3、实时荧光定量PCR检测目标RNA
按PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒的说明书进行操作。目标RNA和内参GAPDH的实时荧光定量PCR引物由广州锐博生物设计合成，具体见表3。
表3实时荧光定量PCR引物
2.1去除基因组DNA
反应体系为：5×gDNA Eraser Buffer 2.0μL，gDNA Eraser 1.0μL，总RNA 2μg，RNase Free dH2O补至10μL。反应条件为：42℃2min，4℃。
2.2反转录反应
上一步实验的反应液：10.0μL，Prime Script RT Enzyme Mix Ⅰ 1.0μL，RTPrimer Mix 1.0μL，5×Prime Script Buffer 2 4.0μL，RNase Free dH2O 4.0μL，总共20μL。反应条件为：37℃15min，85℃5s，4℃。
2.3 RT-PCR反应
用Applied Biosystems Stepous荧光定量PCR测定仪进行反应，按下列组分配制PCR反应液：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 10μL，PCR上游引物(10μmol/L)0.8μL，PCR下游引物(10μmol/L)0.8μL，ROX Reference Dye 0.4μL，RT反应液(cDNA溶液)2.0μL，dH2O(灭菌蒸馏水)6μL，总共20μL。采用两步法PCR反应程序。反应结束后确认PCR的扩增曲线和融解曲线。应用2-ΔΔCt法计算目标RNA相对表达量。
3、统计学方法
数据采用SPSS 19.0进行分析。计量资料用均值±偏差表示，采用t检验，计数资料用百分率表示，采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义，并建立ROC曲线，计算曲线下面积(AUC)及95％可信区间。运用Logistic回归筛选变量，建立回归方程，产生一组新变量Y。对新变量及各单项指标进行ROC曲线分析。
三、实验结果
1、血浆总RNA质量检测
应用紫外分光光度计检测各样本总RNA的D(260)/D(280)值均在1.8～2.1之间，各样本总RNA均有较好质量，可以进行实时定量PCR检测。
2、训练集骨转移组与训练集未转移组目标RNA相对表达量比较
与未转移组相比，骨转移组目标RNA的相对表达量全部上调(P＜0.05)。
3、目标RNA单独区分训练集骨转移组与训练集未转移组的ROC曲线
ROC曲线指受试者工作特征曲线，是反映敏感性和特异性连续变量的综合指标，是用构图法揭示敏感性和特异性的相互关系，它通过将连续变量设定出多个不同的临界值，从而计算出一系列敏感性和特异性，再以敏感性为纵坐标、(1-特异性)为横坐标绘制成曲线，曲线下面积越大，诊断准确性越高。ROC曲线下的面积值在1.0和0.5之间。在AUC>0.5的情况下，AUC越接近于1，说明诊断效果越好。AUC在0.5～0.7时有较低准确性，AUC在0.7～0.9时有一定准确性，AUC在0.9以上时有较高准确性。
hsa_circ_0068527、hsa-miR-591、hsa-miR-365a-3p单独区分训练集骨转移组与训练集未转移组的ROC曲线分别如图5、图2、图3所示。hsa_circ_0068527区分训练集骨转移组与训练集未转移组的ROC曲线下面积为0.775，具有一定的准确性；hsa-miR-591、hsa-miR-365a-3p单独区分训练集骨转移组与训练集未转移组的ROC曲线下面积分别为0.632、0.641，准确性较低。
4、目标RNA联合区分训练集骨转移组与训练集未转移组的ROC曲线
首先采用SPSS软件获取hsa_circ_0068527、hsa-miR-591、hsa-miR-365a-3p联合区分训练集骨转移组与训练集未转移组的logistics回归模型，然后根据该logistics回归模型绘制hsa_circ_0068527、hsa-miR-591、hsa-miR-365a-3p联合区分训练集骨转移组与训练集未转移组的ROC曲线。具体操作方法如下：
以训练集骨转移组与训练集未转移组各患者血浆样本中hsa_circ_0068527、hsa-miR-591、hsa-miR-365a-3p的相对表达量作为自变量(设X1＝hsa_circ_0068527相对表达量，X2＝hsa-miR-591相对表达量，X3＝hsa-miR-365a-3p相对表达量)，以组别(骨转移、未转移)作为应变量，对hsa_circ_0068527、hsa-miR-591、hsa-miR-365a-3p在训练集骨转移组与训练集未转移组各患者血浆样本中的相对表达量进行二元逻辑回归，得到二元逻辑回归方程：Y＝-0.197+6.303X1+5.085X2+6.227X3；再将各患者血浆样本中hsa_circ_0068527、hsa-miR-591、hsa-miR-365a-3p的相对表达量代入该二元逻辑回归方程，即可得到各个样本的回归值Y，以可能的回归值Y作为诊断点，计算灵敏度和特异性，据此绘制ROC曲线(如图9所示)，AUC为0.949，具有较高的准确性。根据ROC曲线的坐标计算维登指数＝特异性+灵敏度-1，维登指数最大值时对应的Y值为能进行诊断区分训练集骨转移组与训练集未转移组患者的最佳cut-off值3.892，即诊断临界值。
5、目标RNA联合诊断区分骨转移与未转移的准确度验证
分别将验证集骨转移组与验证集未转移组患者血浆中的hsa_circ_0068527、hsa-miR-591、hsa-miR-365a-3p相对表达量分别代入到上述二元逻辑回归方程中，Y值高于诊断临界值的预测为骨转移，Y值低于诊断临界值的预测为未转移，统计预测正确的患者数，使用预测正确的患者数除以验证集骨转移组与验证集未转移组总患者数即得目标RNA联合诊断区分骨转移与未转移的准确率，准确率为94％(94例/100例)，准确率较高。
综上可见，虽然hsa_circ_0068527、hsa-miR-591、hsa-miR-365a-3p单独用于区分肺癌骨转移患者与肺癌未转移患者仅具有一定或较低的准确性，但是hsa_circ_0068527、hsa-miR-591、hsa-miR-365a-3p联合用于区分肺癌骨转移患者与肺癌未转移患者具有较高的准确性，准确率较高。因此，可以基于此制造用于诊断肺癌骨转移的基因检测试剂盒，该试剂盒中含有hsa_circ_0068527、hsa-miR-591和hsa-miR-365a-3p的实时荧光定量PCR引物(如表3)，还含有内参的实时荧光定量PCR引物，以及实时荧光定量PCR所需要的酶和试剂。
研究者还研究了hsa-miR-6793-5p、hsa_circ_0084169、hsa_circ_0024887联合区分训练集骨转移组与训练集未转移组的诊断效能，研究方法同上文，AUC为0.796，与hsa-miR-6793-5p单独区分训练集骨转移组与训练集未转移组的诊断效能并无显著差异，这是因为hsa_circ_0084169或hsa_circ_0024887对hsa-miR-6793-5p的诊断效能无明显补益作用。
序列表
<110> 青海七彩花生物科技有限公司
<120> 肺癌骨转移基因检测诊断试剂盒
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cgctctctgc tcctcctgtt c 21
<210> 2
<211> 22
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atccgttgac tccgaccttc ac 22
<210> 3
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gattgtgtga caatatatgt agg 23
<210> 4
<211> 24
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtggcagtga ctcgtggtat ttca 24
<210> 5
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tggccgtgga gacaatgtgc 20
<210> 6
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gctggtgcag ggtccgtcga g 21
<210> 7
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
agggcaccca atctttcagg 20
<210> 8
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gcaataactg ctctcggcct g 21
<210> 9
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tgcatgtaac acaccacggt aagtg 25
<210> 10
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tggttgttgg tcaacgacaa cctaa 25
<210> 11
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
agtgccagtg ttaaggatac t 21
<210> 12
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
agggttatgg tagccagcct 20
<210> 13
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cactctggca gccctgcttt a 21
<210> 14
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
aatgcgcttg ccacattgat 20

Claims (3)

1.一种用于诊断肺癌患者骨转移的基因检测试剂盒，其特征在于：含有hsa-miR-6793-5p、hsa-miR-591和hsa-miR-365a-3p的实时荧光定量PCR引物；其中，hsa-miR-6793-5p的实时荧光定量PCR上游引物如Sequence NO.3所示，其实时荧光定量PCR下游引物如SequenceNO.4所示；hsa-miR-591的实时荧光定量PCR上游引物如Sequence NO.5所示，其实时荧光定量PCR下游引物如Sequence NO.6所示；hsa-miR-365a-3p的实时荧光定量PCR上游引物如Sequence NO.7所示，其实时荧光定量PCR下游引物如Sequence NO.8所示。
2.根据权利要求1所述的基因检测试剂盒，其特征在于：还含有内参GAPDH的实时荧光定量PCR引物，其实时荧光定量PCR上游引物如Sequence NO.1所示，其实时荧光定量PCR下游引物如Sequence NO.2所示。
3.根据权利要求1或2所述的基因检测试剂盒，其特征在于：还含有实时荧光定量PCR所需要的酶和试剂等。
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