CN108884336A

CN108884336A - 用于防止在与水性介质接触的材料上形成生物污垢的方法

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Publication number: CN108884336A
Application number: CN201680080923.XA
Authority: CN
Inventors: 玛丽安娜·加拉尔多; 斯蒂芬·莫雷尔; 迈利斯·帕莱; 安东尼·库尔图瓦; 伯特兰·托拉
Original assignee: Faneng Group
Current assignee: Faneng Group
Priority date: 2016-02-02
Filing date: 2016-02-02
Publication date: 2018-11-23
Anticipated expiration: 2036-02-02
Also published as: EP3411442B1; CN108884336B; EP3411442A1; LT3411442T; BR112018015777B1; ES2932990T3; WO2017134352A1; SA518392139B1; BR112018015777A2

Abstract

本申请涉及一种用于防止生物污垢在与水性介质或与相对湿度大于或等于90％的空气接触的材料表面上沉积的方法，包括用通过发酵来自非异型海洋环境的属副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)可获得的EPS处理此表面。

Description

用于防止在与水性介质接触的材料上形成生物污垢的方法

本发明涉及防止生物污垢在浸没的表面上或与水性介质接触的表面上的沉积。

当将材料置于潮湿条件下或浸入水性介质中时，观察到生物污垢在其表面上沉积。生物污垢的粘附发生在几个阶段。首先，在表面上形成由存在于介质中的有机物组成的称为“生物膜”的初级膜。然后该膜允许微生物(细菌、微观藻类)的粘附，即微生物污垢，然后是大型生物(macroorganism)(例如肉眼可见的藻类、藤壶、贻贝…)的粘附，称为宏观污垢(macrofouling)。

这种生物污垢的存在可能是麻烦的，不仅对于表面的美观，而且因为它可能妨碍使用所讨论的材料，例如通过阻碍水流体的流动、通过减少热交换、通过降低材料的光学或机械性能、通过加速材料的腐蚀或生物降解。例如，LNG终端或热电厂包括水在其中循环的许多管道，特别是用于加热或冷却设备的管道。生物污垢在这些管道内沉积可能减慢或阻止水的流动和/或减少循环水与待加热或冷却的设备之间的热交换，并因此损害设备的性能。

消除生物污垢沉积物和防止这种沉积通常通过阴极保护、使用超声、使用杀生物剂特别是通过氯化作用来进行。然而，杀生物剂对所处理的材料的环境具有负面影响。预计使用杀生物剂的新标准和指南将很快生效。因此寻求具有很少或不含杀生物剂的可选择的方法。

文献报道了使用能够在海洋环境中的材料表面上形成膜的某些胞外多糖(下文称为EPS)来防止这种生物污垢的粘附。

申请WO 2012/001164描述了使用EPS，优选通过发酵来自深层水热生态系统的细菌(包括可变单胞菌属(Alteromonas)或交替假单胞菌属(Pseudoalteromonas))获得的那些EPS，来防止微观生物膜的形成。

G.Raguenes等人(Applied and Environmental Microbiology 62(1),67-73,1996)建议使用由发酵来自深层水热生态系统的海洋细菌菌株ST 716、HYD 1545和HYD1644以及属Alteromonas macleodii产生的EPS用于生物脱氧(biodeoxification)和污水处理。

然而，从深层水热生态系统中取出细菌和生产EPS的发酵过程是复杂的并且因此是昂贵的。使用来自非异型环境的细菌将更简单和更经济。

申请EP 1 170 359和Hayase等人(Journal of Bioscience andBioengineering,95(1),72-76,2003)描述了如何将包含由可变单胞菌属的海洋细菌SHY1-1产生的多糖的生物凝胶应用于海洋结构，例如船或渔网，防止微生物和大型生物对结构的结垢。Hayase等人还分离出其他四种海洋细菌，但未能通过发酵产生EPS。

申请US 2004/0258655描述了由来自香港东部沿海水域的海洋细菌菌株DSM15590和属溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)或解蛋白弧菌(Vibrio proteolyticus)产生的剂作为针对结垢生物Hydroids elegans(tubula)、多室草苔虫(Bugula neritina)(Bryozoaire)和纹藤壶(Balanus amphitrite)(Bernacle)的抗结垢剂。

然而，难以预测哪些海洋细菌可以形成EPS，和其中哪些海洋细菌可以形成具有防止生物污垢特性而没有杀生物活性的EPS。确实，由海洋细菌发酵产生的所有EPS都不太可能阻止生物污垢的沉积。

需要开发用非杀生物剂防止生物污垢沉积的其他方法。

为此，本发明涉及一种用于防止生物污垢在与水性介质或与相对湿度大于或等于90％的空气接触的材料表面上沉积的方法，包括用通过发酵属副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)可获得的EPS处理此表面。

“生物污垢”是指生物膜，微生物(细菌、微观藻类)被称为微观污垢，且大型生物(肉眼可见的藻类、藤壶、贻贝…)被称为宏观污垢。

在根据本发明的方法中使用的EPS通过发酵属副溶血弧菌的细菌可获得。

一般而言，通过发酵使其可以产生EPS的细菌是来源于非异型海洋环境(non-atypical marine environment)的细菌。

非异型海洋环境是天然海洋环境，其温度、pH、盐度、压力和/或氧条件不是极端的。因此，深层水热生态系统不是非异型海洋环境。通常，在非异型海洋环境中：

-温度为从5至40℃，特别是从10至35℃，优选从15至35℃，和/或

-压力为从0.1至5巴，特别是从1至3巴，优选从1巴至2巴，和/或

-pH为从3至10，特别是从4至9，优选从5至8.5，和/或

-盐度为从10至75g/l，特别是从12至60g/l，优选从15g/l至52g/l，和/或

-溶解氧的分压大于或等于10％，通常大于或等于20％，特别是大于或等于35％，优选大于或等于50％。

溶解氧的分压通常由用于溶解氧的分压探针测量。盐度通常通过向发酵罐引入适当量的盐来调整。

非异型海洋环境可以暴露于光或可以不暴露于光。

通常，非异型介质是深度为0至40m的Breton海岸线，特别是0至20m，优选0至10m，例如在2m的深度。确实，潮汐现象可以极大增加给定位置的水柱的高度。

来自非异型海洋环境的细菌不是极端细菌(extremophilic)。这些包括例如中温细菌、需氧细菌、非嗜酸细菌和非嗜碱细菌或者非嗜盐细菌。

优选地，细菌选自由Polymaris Biotechnology,Center,29600Morlaix,France保藏于国家微生物保藏中心(Collection nationale de culturesde micro-organismes)(CNCM)的两种细菌：

-2015年12月23日，订货号为CNCM I-5036，标识号为ENGIE 1-5PB，或

-2015年12月23日，订货号为CNCM I-5037，标识号为ENGIE 1-12PB。

这两种细菌来自布列塔尼海岸并且可以根据取样时的潮汐在约2米深发现。

以下，将通过发酵订货号CNCM I-5036的细菌可获得的EPS命名为EPS F2，且将通过发酵订货号CNCM I-5037的细菌可获得的EPS命名为EPS F4。

在根据本发明的方法中使用的EPS可以例如通过遵循以下发酵方案来制备：

将细菌菌株在富含葡萄糖(30g/l)的2216E培养基(Oppenheimer,J.Mar.Res.,1952,11,10-18)上培养。生产在30℃并且在pH 7.4在包含3升2216E-葡萄糖培养基的5升发酵罐中进行，如P.Vincent等人在Appl.Environ.Microbioj,1994,60,4134-4141中描述的。培养约48小时后停止发酵。

EPS可以通过例如以下处理来回收：

用蒸馏水稀释一半后，通过在20,000g离心持续2小时将细菌从培养基分离。EPS与产生它的细菌没有化学相关性。因此，容易通过离心将其与细菌生物质分离。

来自离心的EPS可以不经进一步纯化而使用。优选地，通过对水进行超滤而从培养基纯化EPS。

因此，离心产生的上清液可以在具有给定截止阈值(例如150kDa)的膜上对水(例如蒸馏水)渗滤。渗滤可以通过电导分析法控制，特别是直到达到30微西门子的渗透传导。

然后可以将EPS储存在水性溶液中。由渗滤产生的产物也可以被冻干，以允许储存干燥形式的EPS。

在根据本发明的方法中，EPS可以以溶液的形式，通常为水性溶液或者以干燥形式使用。当以干燥形式使用时，该方法通常包括将EPS溶解在溶液(通常为水性溶液)中的步骤。正是这种包括EPS的溶液将被用于处理表面。这些EPS水溶液可以是“即用型”形式(优选具有如下所述的EPS浓度)或浓缩形式(优选具有大于以下描述的EPS浓度的EPS浓度)。在后一种情况下，方法通常包括将浓缩溶液(母液)溶解以获得所需浓度的EPS的溶液(子溶液)的步骤，和随后用该溶液处理材料的表面的步骤。

通常，在根据本发明的方法中，用于处理材料的表面的EPS溶液的EPS浓度为10^-7重量％至0.02重量％，特别是5×10^-7重量％，通常从10^-6重量％至5×10^-3重量％，优选从1×10^-6重量％至1×10^-3重量％，例如相对于溶液特别是水溶液的重量的5×10^-6重量％的量级。此外，如果EPS作为溶液使用，则用其处理表面的EPS溶液和/或被引入到与该溶液接触的水性介质中的EPS溶液优选具有这样的浓度。该浓度可以通过优化治疗频率来降低。如果将EPS作为粉末引入与材料接触的水性介质中，则选择引入的EPS的质量使得EPS在水性介质中的浓度如上文所定义。然后，包含EPS的水性介质对应于包含浓度相对于水性介质的重量为10^-7重量％至0.02重量％的EPS的水性溶液。

通常，在根据本发明的方法中使用的EPS具有通过空间排阻液相色谱测量的大于1,000,000Da的峰值分子量。因此，EPS具有通过空间排阻液相色谱法测量的大于1,000,000g/mol的峰值摩尔质量。分子量通常使用凝胶渗透柱和右旋糖酐标准评估通过尺寸排阻液相色谱(HPSEC)评估。峰值分子量表示为右旋糖酐当量。EPS F2和F4具有通过尺寸排阻液相色谱测量的超过1,000,000Da的分子量。

优选地，在根据本发明的方法中使用的EPS包含相对于EPS的干质量的小于5重量％、特别是小于1重量％的硫酸盐/酯(sulphate)。EPS可以不含硫酸根/硫酸酯基团(sulfate group)。硫酸盐/酯的质量比例可以例如通过比色分析通过按照文章(Craigie,J.S.,Wen Z.C.,Van der Meer J.P.(1984)Botanica Marina 55-61)中描述的方法确定。

优选地，在根据本发明的方法中使用的EPS包含(或甚至由以下组成)：N-乙酰基葡糖胺、半乳糖和葡萄糖单元。根据第二替代方案，在根据本发明的方法中使用的EPS包含(或甚至由以下组成)：N-乙酰基葡糖胺和半乳糖醛酸。例如，在EPS的甲醇分解作用(methanolysis)后，通过气相色谱法测定糖组成(osidic composition)。通过与在相同实验条件下处理的标准品比较来进行糖组成的分析。

EPS F2是包含相对于EPS F2的干质量的小于1重量％的硫酸盐/酯并且包含N-乙酰基葡糖胺、半乳糖、葡萄糖单元的聚合物。

EPS F4是包含相对于EPS F4的干质量的小于1重量％的硫酸盐/酯并且包含N-乙酰基葡糖胺和半乳糖醛酸单元的聚合物。

不希望囿于特定理论，第一个假设是EPS在表面上形成膜，其可以与在材料表面上形成的由存在于介质中的有机物质组成的初级膜(primary film)竞争。第二个假设是EPS干预处理过的水中存在的微生物的受体，并减少甚至阻止这些微生物在材料表面上的固定。当EPS在水性介质中以非常低的浓度引入时，尤其是在相对于溶液的重量的小于或等于0.0001重量％的浓度时，第二个假设是最可能的。这两种机制都可能存在。根据本发明的方法可以使为形成宏观污垢的起源的有害的生物膜不稳定。通过使这种生物膜不稳定，它阻止宏观污垢形成。

通常，用如上文所定义的EPS处理材料的表面不抑制表面上的细菌粘附。粘附在已用如上定义的EPS处理过的表面上的细菌的数量与未用这种EPS处理的表面上的细菌的数量具有相同的数量级。细菌粘附在形成的EPS膜上。然而，这些细菌处于“抗性”形式，例如处于有荚膜的或孢子形式，因为EPS膜使其发育不稳定。并且，不形成生物膜。由于不形成生物膜并且生物膜的存在对于微生物和大型生物的粘附是必需的，因此如上文所定义的EPS也阻止微生物和大型生物的稳定粘附。

另一方面，相对于未用这种EPS处理的表面，已经用如上文所定义的EPS处理的表面上的微生物多样性通常较低。确实，相对于未用这种EPS处理的表面，在已经用如上文所定义的EPS处理的表面上已经观察到微生物群体差异。似乎只有某些细菌可能粘附在覆盖表面的EPS膜上，但是那些设法粘附的细菌不会发育，因为通常没有观察到细菌增殖或不希望的生物膜形成。

因此，在根据本发明的方法中使用的EPS有利地是非杀生物的并且不具有抗微生物作用。

此外，在根据本发明的方法中使用的EPS有利地是生物可降解的。

方法包括用与上文所定义的EPS处理与水性介质或与具有大于或等于90％的相对湿度的空气接触的材料的表面。“接触的材料的表面”应理解为意指它可以是材料的表面的一部分或材料的整个表面。通常，用如上文所定义的EPS处理材料的表面包括使该表面与该EPS接触。

当材料与水性介质接触时，材料的表面通常用EPS处理：

-通过分离水性介质与材料的表面，然后将其用EPS(通常为溶液形式)处理，然后使表面与水性介质接触。

根据第一替代方案，可以将材料从与其接触的水性介质中取出，用EPS溶液处理其表面，并然后将材料放回到水性介质中。举例来说，如果表面是船体，可将其放入干燥船坞，用EPS的溶液处理其表面，然后将船放回水中。如果材料是泳池，则可以排空泳池，用EPS溶液处理其内壁(或者用EPS溶液填充池然后将其排空)，然后将池充满水。

根据第二替代方案，与材料接触的水性介质可以用EPS溶液代替，其中材料的表面用EPS处理，并且然后EPS溶液用水性介质代替。举例来说，如果材料的表面是管道，则可以停止水性介质在管道中的循环，将EPS的溶液注入管道，并然后使水性介质在管道中循环。

-或者通过将EPS引入水性介质中。当水性介质与材料的表面接触时，材料的表面用EPS处理。EPS可以以溶液形式(通常是水性的)或干燥形式引入水性介质中。将干燥形式的EPS引入水性介质需要考虑EPS的溶解和再水化时间。因此优选引入溶液形式。作为说明，如果材料的表面是水性介质在其中循环的通道，则可以将EPS引入水性介质中。如果材料是池，则EPS可以被引入池水中。

当然，可以在将表面与水性介质接触之前用EPS处理该材料的表面。作为说明，泳池的壁可以在其充满水之前用EPS处理，或者可以在水性介质在管道中循环之前将EPS溶液注入管道中。

通常，当材料的表面与相对湿度大于或等于90％的空气接触时，表面用溶液形式的EPS处理，通常为水溶液，优选地在如上文所定义的EPS的浓度。

用EPS处理表面可以通过任何方法进行，例如通过喷涂、辊涂、刷涂、将材料或材料的一部分浸入含有EPS的溶液中、将EPS溶液注入与表面接触的水性介质中…

优选地，用EPS处理的材料的表面的温度和/或在其中引入EPS的水性介质的温度为1至90℃，通常为2至45℃，尤其是5至35℃，特别是10至30℃。

用EPS对材料的表面进行的处理可以是一次性的或重复的。优选地，该处理是重复的，以使材料表面上随时间降解的EPS膜再生。EPS确实是生物可降解的。

当重复用EPS处理材料的表面时，两次处理之间的频率可以根据溶液中的EPS浓度和/或水性介质中或空气中存在的有机物质和微生物的浓度和/或水性介质的温度而变化。确实，通常，介质包含可能形成不想要的生物膜的有机材料和可能在该生物膜上沉积和发育的微生物越多，处理的频率就应该越高。同样地，通常，水性介质的温度越高，生物污垢的沉积变得越显著。因此，通常，水性介质的温度越高，处理的频率越高。

基于EPS的处理防止生物污垢在表面上沉积，并减少形成期间生物膜的形成。另一方面，EPS不能消除在EPS处理之前沉积的生物污垢(特别是生物膜)。换句话说，EPS不能完全处理已经被生物污垢污染的材料的表面。

而且，根据本发明的方法可以包括通过除EPS之外的剂部分或完全消除存在于材料的表面上的生物污垢。

此部分或完全消除可以用杀生物剂，例如通过氯化作用(通常用二氯或次氯酸盐，例如次氯酸钠，例如漂白剂)进行。杀生物剂的处理可以是一次性的或重复的。杀生物剂通常以溶液形式使用，优选水性溶液，例如在1×10^-5重量％至5×10^-3重量％，特别是1×10^-4重量％至1×10^-3重量％的浓度，例如，相对于溶液的重量，其量级为5×10^-4重量％。

这种部分或完全消除通常在用EPS处理表面之前或在重复处理时在两次连续处理之间进行。例如，当尽管用EPS处理表面，生物污垢还是沉积在表面上时(例如由于两次连续处理太耗时而不能完全防止生物污垢的沉积)，该方法可以包括将存在于材料的表面上的生物污垢部分或全部除去的步骤，然后用EPS进行表面处理。用EPS和用杀生物剂的组合处理使得可以减少EPS的量并因此降低成本，而且也减少了与仅使用杀生物剂的处理相比所使用的杀生物剂的量。

在一个实施方案中，该方法还包括：

-用EPS重复处理表面，EPS处理的频率从每小时一次到每周一次，优选每12小时一次至每三天一次，例如每天一次，和

-用杀生物剂重复处理表面，杀生物剂处理的频率从每小时一次至每周一次，优选每天一次至每五天一次，例如每两天一次。

这些频率设计为防止生物污垢沉积在表面上，即使用低EPS和/或杀生物剂浓度，例如用相对于溶液重量为1×10^-6重量％至1×10^-3重量％的EPS的浓度，和/或用相对于溶液重量为1×10^-5重量％至5×10^-3重量％的杀生物剂浓度。用这种少量的EPS和杀生物剂有效地防止沉积生物污垢是特别令人惊讶的。

此外，根据本发明的方法可以包括监测材料表面上生物污垢的沉积，特别是生物膜的形成。该监测对于确定用EPS进行表面处理的频率特别有用。

例如，监测可以通过目视或通过表面的物理和/或化学分析来完成。

当表面是导电的，通常是金属表面时，可以通过监测以下来执行监测：

-导电表面的电流密度随时间的演变，和/或

-相对于参考电极(例如饱和甘汞电极(ECS))导电表面的电化学电位随时间的演变。

确实，生物污垢在导电材料诸如不锈钢上沉积，特别是生物膜的形成，导致导电表面的电流密度和导电表面的电化学电位随时间的变化。例如，在天然海水中，生物膜在不锈钢表面上的发展：

-改变其开路到终点的电位差(相对于参考电极ECS，从约-100mV到约+300mV)，

-提高其阴极效率(尤其是溶解氧的阴极还原)，这促进腐蚀的引发和传播。随时间测量导电表面的电流密度使得可以量化导电材料的阴极效率。

该方法可以包括监测生物污垢在材料表面上的沉积，特别是生物膜的形成，然后在生物污垢沉积超过给定的阈值(或对于给定持续时间超过给定的变化百分比)时用如上文所定义的EPS处理表面。

例如，当表面是导电的，通常是金属表面时，方法可以包括：

-通过监测以下来监测生物污垢的沉积，特别是生物膜的形成：

o导电表面的电流密度随时间的演变，和/或

o相对于参考电极导电表面的电化学电位随时间的演变，然后

-当电流密度和/或电化学电位达到给定阈值时，用如上文所定义的EPS处理表面。

在根据本发明的方法中，用如上文所定义的EPS处理与水性介质或与相对湿度大于或等于90％的空气接触的材料的表面的至少一部分。

表面是有机材料或无机材料的表面，其性质可以变化，例如金属、聚合物、建筑材料。

优选的金属是铜、钛和钢，尤其是不锈钢，特别是316L不锈钢或2507不锈钢。优选的聚合物是聚乙烯，尤其是高密度聚乙烯(HDPE)。混凝土、砂浆、玻璃或木材是常见的建筑材料。

材料表面的至少一部分与水性介质接触，或者与相对湿度大于或等于90％，特别是大于或等于95％，优选等于100％的空气(被水饱和的空气)接触。空气的相对湿度(humidity)或湿度(hygrometric degree)，通常表示为φ，对应于空气中含有的水蒸气的分压与相同温度的饱和蒸气压(或蒸气压)之比。因此，它是空气的水蒸气含量与其在这些条件下容纳水蒸气的最大容量之间的比的量度。它使用湿度计(hygrometer)测量。

当材料的表面的至少一部分与水性介质接触时，该材料通常是水性介质的容器或容器的一部分，例如储水器、泳池、淡水或海水管，诸如LNG终端或热电站的管道，或者与水接触的材料例如船体或螺旋桨，或者基础设施的浸没部分，例如LNG终端或热电厂…然后可以将材料部分或全部浸入水性介质中。

水性介质可以是例如淡水或海水。水性介质可以是不流动的(例如停滞水)或移动的(例如搅拌的水或天然海洋环境)，特别是循环的(例如在管道中流动的水)。

根据以下实施例和附图说明本发明。

图1：在包括海水(对照)(ref)、对于EPS F2(F2)、对于EPS F4(F4)和对于EPS F5(对比)(F5)的罐中以ppm计的溶解氧的比例相对于以天计的时间(实施例1)。

图2：在包含海水(对照)(ref)、对于EPS F2(F2)、对于EPS F4(F4)和对于EPS F5(对比)(F5)的罐中以mV计的饱和甘汞电极的电位差相对于以天计的时间(实施例1)。

图3：通过落射荧光显微术对每个罐的细菌的计数：海水对照(ref)、EPS F2、F4或F5(对比)和对于每种混凝土材料(灰色直方图)、HDPE(黑色直方图)或316L不锈钢(白色直方图)(实施例1)。

图4：说明用于实施例2.1的实验系统的图。

图5：对于海水(对照)(ref)或海水中EPS F2(F2)，在生物膜传感器中测量的电流密度(A/m²)作为以天计的时间的函数(实施例2.1)。

图6：对于海水(对照)(ref)或海水中EPS F2(F2)，在生物膜传感器中测量的电位(V)作为以天计的时间函数(实施例2.1)。

图7：在由EPS F2处理的和仅包含海水(对照)的实验回路的316L不锈钢管上测量的电位上升的差异。横坐标上的黑色三角形对应于引入EPS(实施例2.1)。

图8：说明用于实施例2.2和实施例3的实验系统的图。

图9：在海水(对照)实验(ref)、在于海水中具有0.001％EPS F2溶液的实验(F2)、在于海水中具有5ppm次氯酸钠溶液的实验(Cl)中，存在于45L储液器中的316L不锈钢样品的电位(V)对以天计的时间。横轴上的黑色矩形对应于引入EPS(仅针对使用EPS F2溶液的实验)(实施例2.2)。

图10：在海水(对照)实验(ref)、在于海水中具有0.001％EPS F2溶液的实验(F2)、在于海水中具有5ppm次氯酸钠溶液的实验(Cl)中，环路C模块的316L不锈钢管的电位(V)对以天计的时间。横轴上的黑色矩形对应于引入EPS(仅针对使用EPS F2溶液的实验)(实施例2.2)。

图11：在海水(对照)实验(ref)和在于海水中具有EPS溶液F2/于海水中具有次氯酸钠的实验(F2-Cl)中，45L储液器中的316L不锈钢样品的电位(V)对以天计的时间。横轴上的黑色矩形对应于引入EPS且灰色星形对应于引入次氯酸钠(实施例3)。

图12：在海水(对照)实验(ref)和在于海水中具有溶液EPS F2/于海水中具有次氯酸钠的实验(F2-Cl)中，回路的模块B的316L不锈钢管的电位(V)作为以天计的时间的函数。横轴上的黑色矩形对应于引入EPS且灰色星形对应于引入次氯酸钠(实施例3)。

图13：在海水(对照)实验(ref)和在于海水中具有溶液EPS F2/于海水中具有次氯酸钠的实验(F2-Cl)中，回路的C模块的316L不锈钢管的电位(V)对以天计的时间。横轴上的黑色矩形对应于引入EPS且灰色星形对应于引入次氯酸钠(实施例3)。

图14：在海水(对照)实验(ref)和在于海水中具有EPS F2溶液/于海水中具有次氯酸钠的实验(F2-Cl)中，存在于模块D的150L储液器中的316L不锈钢样品的电位(V)对以天计的时间。横轴上的黑色矩形对应于引入EPS且灰色星形对应于引入次氯酸钠(实施例3)。

在下面的实施例中，使用通过如上文所定义的发酵方法从分别以订单号CNCM I-5036和CNCM I-5037保藏的细菌获得的EPS F2和F4。

作为对比，使用被称为EPS F5的EPS，其中它通过发酵(根据上文所述的方案)由Polymaris Biotechnology,Center,29600Morlaix,France在2015年12月23日以订单号CNCM I-5038、识别号ENGIE 2-68PB保藏于国家微生物保藏中心(CNCM)的属海科贝特氏菌(Cobetia Marina)的细菌产生。该EPS F5是以下聚合物：

-相对于EPS的总干质量，包含10重量％至20重量％的硫酸盐/酯(sulphate)，

-包含鼠李糖、半乳糖醛酸、半乳糖、葡萄糖和N-乙酰基葡糖胺单元，和

-通过尺寸排阻液相色谱测量的峰值分子量超过1,000,000Da。

测试的表面是HDPE(PE 80，SIMONA)、316L不锈钢和混凝土。

在对饱和甘汞参考电极进行测试之前，校正316L不锈钢相对于Ag/AgCl电极的电化学电位。通过来自NKE的EPC8采集系统确保了对电位的连续测量。

对于所有三种类型的表面，通过使用落射荧光技术的显微镜观察来评估细菌定殖。

实施例1：防止生物污垢在非循环海水中沉积

将三种EPS中的每一种以0.05重量％的浓度溶解在含有15升天然海水的罐中并搅拌(200rpm)。在实验期间，不更新来自罐的海水，同时保持搅拌。海水来自布雷斯特的港口，具有下表1所总结的特征：

温度	17±1℃
		pH	8.1±0.1
导电率	52±1mS/cm
		溶解氧	8.5±0.2ppm

表1：测试中使用的布雷斯特港的海水的特征

使用了4个罐：3个各自含有海水中的一种EPS的罐和1个仅含有海水的对照罐。在每个罐中，暴露了9个样品：3个不锈钢样品、3个混凝土样品和3个HDPE样品。每个样品的尺寸约为5cm×5cm。

为了防止HDPE样品漂浮在表面上，它们通过绳子钩到支撑物上。

通过钛丝悬挂连续监测的不锈钢样品，以提供电接触用于进行电化学电位测量。

·监测罐中的水的pH、温度和溶解氧水平

每天测量罐中水的pH、温度和溶解氧含量(通过连续浸没氧气探针)。

在测试的14天期间，罐中的温度在16至18℃之间。

含有EPS的罐的pH值在7.25和8.00之间整体变化，就像海水一样。测试在14天结束时，观察到含有EPS F5的介质的约pH 7.30的轻微酸化。

图1示出了测试的每个介质中溶解氧的释放的演变。

根据图1的结果，对于海水和对于介质F2和F4，溶解氧含量在整个测试期间保持恒定(接近饱和)。在F5介质中，观察到从第6天开始的溶解氧含量的降低，14天后达到3.5ppm。这种下降可能与观察到的环境的轻微酸化有关。

·不锈钢的电化学电位

对于所有材料，实验在取样之前持续了7天。

然而，三个不锈钢样品中的一个保持更长并且与在测试之前针对饱和甘汞参考电极(ECS)校准的Ag/AgCl电极相比测量其腐蚀电位14天。

生物膜在金属表面诸如316L不锈钢上的存在导致腐蚀电位根据可变动力学和介质的物理化学和微生物条件的函数演变。这种演变导致腐蚀的风险，特别是316L不锈钢上钝化膜的点蚀和破裂腐蚀。该生物膜的存在是沉积微观和宏观生物污垢的第一阶段。

通常，在浸没时，不锈钢在新鲜海水中的电位测量在-100和-200mV/ECS之间。根据温度或季节，它通常可以稳定3至15天，然后增加到+300mV/ECS左右的值。确实，在表面上形成不需要的生物膜会导致腐蚀电位的增加。在不锈钢上引发和传播局部腐蚀的风险变得更加显著。

图2示出了在整个测试期间不同介质中不锈钢的电化学电位的演变。

在图2中，在海水中，由于不希望的生物膜形成，在6天后发生电位从-100到+250mV的特征性增加。

在引入EPS的介质中，只有暴露在F5介质中的不锈钢样品在8天后显示出-50至+150mV的腐蚀电位增加。在F5曲线上观察到的电位的突然变化可能与腐蚀的开始相关，然后与表面的再钝化相关。

对于暴露在F2和F4介质中的样品，在14天测试期间，不锈钢的电位保持稳定在-100和-50mV/ECS之间。

在其中浸入了不同表面的罐中，对于EPS F2和F4观察到的电位的稳定性与EPS的存在有关。

·表面的目视评价

浸没7天后，进行样品的目视评价。

对于暴露在海水(对照)中的对照样品，无论是在不锈钢、混凝土还是HDPE上都没有观察到宏观沉积物。

对于浸入含有F2和F4的罐中的样品，在所有表面上，特别是在不锈钢和HDPE上观察到可能是EPS膜的非常薄的膜。与混凝土相比，这些表面具有相对低的粗糙度，这可以允许EPS更多的粘附。

对于暴露在含有F5的罐中的样品，大量粘性附聚物覆盖样品的大部分表面、罐的表面和测量电极。这些很可能是EPS附聚物。

·通过落射荧光显微术对表面进行微生物分析

将7天后取出的样品置于通过落射荧光显微术对其表面进行微生物分析。该技术允许通过添加荧光染料二氨基苯基吲哚(DAPI)来测量微生物环境。荧光染料标记微生物的DNA，然后发出蓝色荧光。在显微镜下观察样品后，对存在于样品表面上的细胞进行计数，并且基于细菌的形状和一般状态对其进行分析。

图3示出了每个海水(ref)、EPS F2、F4或F5对照罐的细菌计数结果。

在这些测试期间，置于所使用的罐中的溶液中的EPS不是杀细菌的。确实，在任何情况下，不同材料表面上的细菌数量都不会减少。

另外，对于同一个罐，细菌的数量随表面性质的变化很小。表面的性质对EPS活性影响很小或没有影响。

浸没于包含EPS F2和F4的罐中的各种材料的表面上的细菌定殖与海水对照的细菌定殖相同。

对于混凝土和HDPE材料，在含有EPS F5的罐中，表面的定殖与“海水”对照的表面定殖相同。然而，在316L不锈钢表面上的定殖更强：用EPS F5处理的316L不锈钢比浸入海水对照罐中的316L不锈钢被细菌更多地定殖2.5倍。

还研究了细菌的形态。

总体上，细菌群体中度多样化：注意到一些丝状形式；它们通常表现出更高程度的生物膜层级。

在用EPS F2或F4处理的不锈钢和混凝土表面上的定殖是稀疏的(对于与EPS F2接触的不锈钢和混凝土表面，具有一些网状丝状形状)。在用EPS F2或F4处理的塑料表面上，细菌表现得更不活泼，并且突出一些大型细菌：它可能是具荚膜的形式。

实施例2：防止生物污垢在循环海水中沉积

实施例2.1.：包含储液器和回路的实验系统

测试了4个实验系统：仅包括海水的对照、包括海水中的EPS F2的实验系统、包括海水中的EPS F4的实验系统、包括海水中的EPS F5的实验系统，其中每种EPS的浓度为0.01％(w/v)。

实验系统包括：

-配备用于搅拌的泵的150升的储液器，其中浸入参考电极和生物膜传感器，以及

-由40mm直径的PVC管制成的回路，由316L不锈钢管中断，其中管表面包括各自包含嵌入双组分环氧树脂(MécapreX IP)中并抛光的材料的部分。这些部分的不同材料是：316L不锈钢、2507不锈钢、HDPE(两个部分)、混凝土(两个部分)。回路配备有泵和阀门。

将316L不锈钢管和每个316L不锈钢部分连接到电位计以测量与参考电极的电位差。

使用的实验系统在图4中示意性地示出。

每个部分包括嵌入环氧树脂中的测试材料(不锈钢、HDPE或混凝土)，以使测试材料的表面与PVC管内表面的其余部分处于同一水平，即测试表面材料不会从PVC管的内表面的其余部分突出或凹陷。

生物膜传感器是传感器，包括电镀的锌合金阳极(来自BAC CorrosionControl A/S)、UNS S32750双相超合金阴极和锌伪参考电极(1型ASTM B418)。该生物膜传感器测量与生物膜形成相关的电位和量化生物膜活性的电流的减少。

回路中的循环速度为0.8m/s。

海水以1L/min的速度不断更新。

在每个实验系统中，测量了以下电位差：

-不锈钢部分316L与浸入储液器中的参考电极之间的电位差，

-不锈钢部分2507与浸入储液器中的参考电极之间的电位差，

-回路的不锈钢管与浸入储液器中的参考电极之间的电位差，

-由包含其自身ECS参考电极的生物膜传感器测量的电位差。

比较不锈钢部分(位于回路中)或回路的不锈钢管相对于浸入储液器中的参考电极之间的电位差，以及生物膜传感器(位于储液器中)测量的电位差允许比较在海水以0.8m/s的速度循环的回路中和储液器中生物膜的形成。

在含有海水(对照)的储液器中，我们观察到：

-由储液器中的生物膜传感器测量的电位差在第三天从-0.7V演变到0V，然后电位差向-0.25V稳定，并且

-在第4天，在回路的不锈钢管相对于浸没在储液器中的参考电极之间测量的电位差的演变，其中在实验开始时电位差改变了-0.25V，直到17天后+0.25V。

因此，不希望的生物膜的形成在储液器中比在回路中更快，可能是出于流体动力学的原因(储液器中的均匀搅动和环路中0.8m/s的循环)。

在包含海水中的EPS F2、F4或F5的三个储液器中，遵循以下实验方案。

每种EPS以0.01重量％的浓度的作为粉末引入，其频率如下：

-在t＝0(实验开始时)，引入EPS，然后搅拌12小时而不在回路中循环水(以使EPS复水)，然后打开回路，

-在t＝3.5天时，引入EPS，然后搅拌12小时而不在回路中循环水，然后打开回路，

-在t＝7天时，引入EPS，然后搅拌12小时而不在回路中循环水，然后打开回路，然后

-在t＝10.5天时，引入EPS，然后搅拌12小时而不在回路中循环水，然后打开回路。

图5和6分别表示位于包含海水(对照)(ref)或海水中的EPS F2的罐中的储液器中的生物膜传感器测量的电流密度和电位。

图5和6示出了注入EPS F2在第三天减缓了不希望的生物膜的形成。另一方面，观察到一旦形成不希望的生物膜，EPS F2的引入对其没有影响。EPS F2不会破坏已经形成的生物膜。

图7表示对于包含海水(对照)(ref)或者海水中的EPS F2的罐，在回路的不锈钢管316L相对于浸入在储液器中的参考电极DHW之间测量的电位差。

图7示出在电位上升之前(因此在形成不希望的生物膜之前)引入EPS F2阻止了生物膜的形成，导致完成(即获得天然海水中形成生物膜特征性大于200mV/ECS的电位)。

在实验结束时，回收并分析部分。

附着在包含EPS F2或F4的罐的部分上的细菌数量与海水对照罐的部分上的细菌数量具有相同的数量级。被最少定殖的表面是用EPS F2处理的那些表面，且被最多定殖的表面是用EPS F4处理的那些表面。尽管如此，在包含F2和F4的海水罐比在单独的海水中存在更多细菌。EPS限制细菌的生物膜形成，但由于它们不是杀生物的，它们不限制细菌的繁殖。因此，在使用EPS F2或F4的实验的部分表面上，不存在比与不含EPS的海水接触的部分的表面上显著更多的细菌。

与海水对照罐的部分相比，已经用EPS F2或F4处理的罐的部分的微生物多样性降低。与海水对照罐的部分相比，在用EPS F2或F4处理的罐的部分上观察到细菌群体的差异。

实施例2.2.：包含储液器和回路的实验系统

在具有接近LNG终端的冷却站的结构的另一个实验系统中进行实验。

此实验系统；在图8中例示，包括：

-提供有能够搅拌的泵并且其中浸入了ECS参考电极和生物膜传感器的150L的储液器(图8中的模块A)，其中此储液器用于更新海水，

-45L储液器，位于150L储液器和回路之间，并且包含316L不锈钢、2507不锈钢、HDPE、混凝土的样品和ECS参考电极，其中此储液器是向其中引入EPS和次氯酸钠的溶液的储液器，

-提供有泵和阀门的回路，其中回路由被以下中断的40mm直径PVC管制成：

o第一316L不锈钢管(图8中的模块B)，其中管的表面包括各自包含包埋于双组分环氧树脂(MécapreX IP)并抛光的材料的部分。这些部分的不同材料是：316L不锈钢、2507不锈钢、HDPE(3个部分)、混凝土(3个部分)和SVR树脂玻璃薄片制品(3个部分)，

o第二316L不锈钢管(图8中的模块C)，其表面与第一管的表面类似地装配，

-位于环的末端的150L储液器(图8中的模块D)，包括316L不锈钢、2507不锈钢和混凝土的样品以及ECS参考电极。

-实验回路的总体积是150升。

150L的储液器模拟海洋，而45L的储液器模拟向其中注入EPS的站区，并且回路模拟冷却站的管道。回路的总长度是30米。EPS被注入模块B。模块A从不与EPS接触。在不同模块A、B、C和D中监测生物膜形成。回路中的循环速度是0.4m/s.

平行且同时进行三个实验：

-其中相对于实验系统的海水总重量(即150kg)的0.001重量％的EPS F2(EPS作为海水中的溶液注入)被注入45L储液器持续12小时的实验(根据本发明的实施例)，其中注入每两天进行(即重复[12h注入EPS溶液，随后36h无注入])，

-其中不注入物品的实验(海水的循环)(对照)，

-其中5ppm次氯酸钠在海水中的溶液被持续注入45L储液器的实验(对比)

其中这些实验中的每一个用如上文定义的实验系统进行。

图9示出了相对于海水对照，当EPS被注入时，生物膜在45L罐中的形成偏移了一天。如预期的，当次氯酸钠被连续注入时，电化学电位保持恒定。

在模块C中，电化学电位的变化指示对于海水对照，4.5天后的生物膜形成。另一方面，当注入EPS或钠的次氯酸盐时，电化学电位保持稳定(图10)。

实施例3：通过EPS/氯冲击(chlorine shock)组合防止生物污垢在循环海水中沉积

通过将使用EPS溶液的处理与使用次氯酸钠(氯冲击)的处理结合进行实验。具体地，目标是通过进一步降低EPS的浓度来降低成本，同时将比通常用于在LNG终端的冷却站中防止生物膜形成的量少的量的次氯酸钠引入。

使用上文实施例2.2中描述的实验系统。回路中的循环速度为30L/min。

使用在海水中的50μg/L EPS F2的浓度。这些浓度非常低。在这样的浓度，认为EPS参与存在于所处理的水中的微生物的受体(处理水和它们包含的微生物)。在这样低的浓度在表面上形成EPS膜是不可能的。

平行且同时进行两个实验：

-以下的实验(根据本发明的实施例)，其中

o相对于在实验系统中循环的海水的体积的50μg/L EPS F2(即30L/min)(以海水中的溶液的形式)在1小时内被注入到45L储液器中，其中注入每两天进行(即重复[1小时EPS溶液注入，然后23小时无注入])，

o海水中的5ppm次氯酸钠溶液被注入45L储液器持续1小时，其中注入每两天或三天进行(即重复[1小时注入次氯酸钠溶液，然后47或71小时无注入])，

-其中海水连续注入45L储液器中的实验(对照)。

通过比较，在根据本发明的这个实验中使用的次氯酸钠的量比通常引入至在LNG终端的冷却站中的管道中循环的水中以防止形成生物膜的量低得多(通常连续注入2ppm的次氯酸钠)。

图11至14示出了电化学电位在其中使用了EPS/次氯酸钠组合的实验系统的45L储液器和模块B、C和D中不变化，这证明了生物膜不形成。作为比较，实验海水对照系统中的45L储液器和模块B、C和D的电化学电位在5天后升高。

实施例4EPS F2的生态毒理学分析

根据2004年11月23日的OECD准则202，在静态条件下在100mg/l的极限测试确定EPS F2对大型溞(Daphnia magna)移动能力的抑制。验证有效性标准，如表1所示。表2提供结果。

	根据OECD 202的值	测试的有效性标准
			在对照中被固定的溞	≤10％	可以(0％)
溶解氧浓度	>3mg/l	可以(8.7mg/l)

表1：用有效性标准验证依从性。

表2：在稀释水中和在包含100mg/l的EPS F2的样品中在24小时或

48小时固定的溞的百分比。

结论是在24小时(EC₅₀-24h)和48小时(EC₅₀-48h)后固定50％溞的浓度高于测试浓度，即100mg/l。

此外，EPS F2对单细胞绿藻近头状伪蹄形藻(Pseudokirchneriellasubcapitata)生长的影响根据2006年3月、2011年7月28日修订的OECD指令201在100mg/l的极限测试确定。

检查有效性标准，如表3所示。

	根据OECD 201的值	测试的有效性标准
			72h的生物质增加	因子为至少16	可以(396,3)
每日比生长速率(每部分)	<35％	可以(24.6％)
			72h的平均比生长速率	<7％	可以(0.4％)

表3：用有效性标准验证依从性。

估计的毒性是：

-对于平均比生长速率：ErC50(0-72h)>100mg

-对于产率：EyC50(0-72h)>100mg。

此外，EPS F2对斑马鱼(Danio rerio)的影响根据1992年7月17日的OECD指令203，在静态条件下限于100mg/l确定。针对100mg/l的测试浓度评价在24、28、72和96小时后杀死50％的鱼的EPS F2的浓度。这些浓度被定义为LC₅₀-24h、LC₅₀-48h、LC₅₀-72h和LC₅₀-96h致死浓度。

检查有效性标准，如表4所示。

	根据OECD 203的值	测试的有效性标准
			对照死亡率	≤1只鱼	可以(0％)
恒定状态	恒定状态	可以
			溶解氧浓度	>60％	可以(87％)

表4：用有效性标准验证依从性。

表5和表6提供了测试的结果。

以mg/L计的测试样品中的标称浓度	暴露的鱼的数目	在96h鱼的死亡率
			对照	7	0(0％)
100.0	7	0(0％)

表5：在对照和包含100的样品中鱼的死亡率

观察时间	24h	48h	72h	96h
					LC₅₀(mg/l)	>100.0	>100.0	>100.0	>100.0

表6：致死浓度LC₅₀-24h、LC₅₀-48h、LC₅₀-72h和LC₅₀-96h

结论是96小时的致死浓度大于100.0mg/l的测试浓度。

PCT/RO/134表

Claims

1.预防生物污垢在与水性介质或与相对湿度大于或等于90％的空气接触的材料的表面上沉积的方法，包括用胞外多糖处理表面，所述胞外多糖：

-包含通过尺寸排阻液相色谱测量的大于1 000 000Da的峰值分子量，

-包含相对于所述胞外多糖的干质量的少于5重量％，优选少于1重量％的硫酸盐/酯，

-通过发酵属副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的细菌可获得。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述属副溶血弧菌的细菌来源于非异型海洋环境，其中非异型海洋环境是以下的介质：

-温度是从5至40℃，和/或

-压力是从0.1至5巴，和/或

-pH是从3到10，和/或

-盐度是从10至75g/l，和/或

-溶解氧的分压大于或等于10％。

3.根据权利要求1至2中任一项所述的方法，其中所述胞外多糖包含N-乙酰基葡糖胺单元，并优选地包含：

-N-乙酰基葡糖胺单元、半乳糖和葡萄糖单元，

-或者N-乙酰基葡糖胺和半乳糖醛酸单元。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述胞外多糖通过发酵选自保藏于国家微生物保藏中心的两种细菌中的细菌可获得：

-2015年12月23日，订货号为CNCM I-5036，标识号为ENGIE 1-5 PB，或

-2015年12月23日，订货号为CNCM I-5037，标识号为ENGIE 1-12 PB。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述胞外多糖呈溶液形式，优选水性溶液，以相对于溶液的重量的10^-7重量％至0.02重量％的浓度。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中用所述胞外多糖对所述表面的处理是一次性的或重复的。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，包括部分或完全消除存在于所述材料的表面上的生物污垢，特别是通过杀生物剂，例如通过氯化作用。

8.根据权利要求7所述的方法，包括：

-用所述胞外多糖重复处理表面，胞外多糖处理频率为从每小时一次至每周一次，优选每12小时一次至每三天一次，例如每天一次，和

9.根据权利要求8所述的方法，其中：

-所述胞外多糖呈溶液的形式，优选地水性溶液，以相对于所述溶液的重量的1×10^-6重量％至1×10^-3重量％的浓度，和/或

-所述杀生物剂呈溶液的形式，优选地水性溶液，以相对于所述溶液的重量的1×10^-5重量％至5×10^-3重量％的浓度。

10.根据任一前述权利要求所述的方法，包括监测生物污垢在所述材料的表面上的沉积。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述表面是导电的，并且监测生物污垢的沉积通过监测以下进行：

-导电表面的电流密度随时间的演变，和/或

-相对于参考电极导电表面的电化学电位随时间的演变。

12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述材料是管道、LNG终端或火电厂的材料。