CN108875297B - 利用miRNA-gene共表达网络预测蒽环类药物心肌细胞间隙连接通讯异常的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用miRNA‑gene共表达网络预测蒽环类药物心肌细胞间隙连接通讯异常的方法，包括以下步骤：步骤1：实验分组；步骤2：RNA提取；步骤3：miRNA‑gene芯片数据差异性表达分析；步骤4：miRNA靶基因分析及调控网络构建。本发明利用miRNA‑gene共表达网络预测蒽环类药物心肌细胞间隙连接通讯异常的方法，通过miRNA‑gene共表达网络预测心肌细胞间隙连接通讯异常为发现蒽环类药物心脏毒性新的分子标志物提供了新途径，为预测其预后提供了参考依据。
Description
技术领域
本发明涉及miRNA-gene共表达网络，特别涉及一种利用miRNA-gene共表达网络预测蒽环类药物心肌细胞间隙连接通讯异常的方法。
背景技术
蒽环类药物，包括阿霉素(Doxorubicin,DOX)、表柔比星(Epirubicin,EPI)及吡柔比星(Pirarubicin,THP)等广泛地用于治疗血液系统恶性肿瘤和实体肿瘤，如乳腺癌、淋巴瘤、急性白血病等。以蒽环类药物为基础的联合治疗通常是一线治疗的标准方案，疗效确切，不可或缺，但其可引起脱发、骨髓抑制和心脏毒性等毒副反应。而心脏毒性(Anthracycline Induced Cardiotoxicity，AIC)是蒽环类药物最严重的毒副作用。Van等使用Meta分析显示，辅酶Q10、左卡尼汀、N-乙酰半胱氨酸、VC和VE等对于蒽环类化疗没有明显的心脏保护作用。
目前，仅有右丙亚胺在癌症患者接受蒽环类药物治疗过程中有心脏保护作用的药物，但有学者提出该药可能会降低蒽环类药抗癌药效。临床研究和实践观察都显示蒽环类药物导致的心脏毒性往往呈进展性和不可逆性，特别是初次使用蒽环类药物就可能造成心脏损伤。因此，迫切需要预防蒽环类心脏毒性的药物，积极预防蒽环类药物引起的心脏毒性显得尤为重要。
发明内容
本发明要解决现有技术中的技术问题，提供一种利用miRNA-gene共表达网络预测蒽环类药物心肌细胞间隙连接通讯异常的方法。
为了解决上述技术问题，本发明的技术方案具体如下：
一种利用miRNA-gene共表达网络预测蒽环类药物心肌细胞间隙连接通讯异常的方法，包括以下步骤：
步骤1：实验分组
用含有蒽环类药物方案化疗乳腺癌患者外周血，建立test组；
以未进行蒽环类药物处理的乳腺癌患者外周血，建立con组；
步骤2：RNA提取
提取test组和con组中外周血细胞的miRNA和靶基因；
步骤3：miRNA-gene芯片数据差异性表达分析
(1)导入每个miRNA探针的预设值；
(2)过滤掉在所有芯片的重复探针中Flag均为“-50”的miRNA探针；
(3)将每张芯片所含重复探针的荧光强度值取中位数；
(4)计算每张芯片中重复探针的变异系数值；
(5)芯片间采用Invariant set标准化法进行数据均一化，在同样本重复探针中取平均值；
(6)依据实验设计和分组情况对miRNA探针进行对比，计算|FC|>1.4差异倍数；
(7)差异基因列表：选取满足|FC|>1.4，P<0.05的基因为差异基因；
(8)主成分和聚类分析：芯片讯号值经数据log转换及平均数中心化后，依需求筛选出适当数目的差异基因以平均连接算法进行聚类分析；
步骤4：miRNA靶基因分析及调控网络构建
利用Targetscan数据库对miRNA靶基因进行初步预测；利用DAVID数据库将miRNA靶基因进行KEGG通路富集分析，筛选出P＜0.05的基因通路。
在上述技术方案中，步骤1中的分组具体为：
test组：乳腺癌患者化疗后外周血组，每组3个生物学重复；
con组：乳腺癌患者未化疗组外周血组，每组3个生物学重复。
在上述技术方案中，步骤2具体包括以下步骤：
(1)在离心收集的冰冻细胞悬液中加入0.5mL的Trizon溶液，充分振荡混匀后，在室温下放置8min，保证细胞的核蛋白与核酸能完全分离；
(2)然后在细胞的核蛋白与核酸完全分离后，加氯仿0.2mL，祸旋振荡30s，在室温下放置2-3min，设置为在4℃下，离心速度12 000rpm，离心时间10min；
(3)使用100μL的枪头小心吸取上层水相的RNA移至干净的离心管中，按比例加入无水乙醇并混匀，再将溶液和半透明纤维悬浮物全部加至吸附柱中，静置约2min后，以12000rpm的离心速度离心3min后倒掉废液；
(4)将吸附柱放回收集管中，按比例加入RPE溶液，静置约2min，以10 000rpm的离心速度离心30s，离心后倒掉废液，重复此步骤一次；
(5)将吸附柱放回收集管中，1000rpm离心2min；再将吸附柱放入干净的1.5mL离心管中，在吸附膜中央处，按比例加入无酶水，放置5min，以12 000rpm的离心速度离心2min，离心后将所得到的液体为RNA溶液，使用分光光度仪检测RNA的浓度，并置于-80℃冰箱保存。
在上述技术方案中，步骤4还包括以下步骤：
进一步筛选出与肿瘤相关通路，并按可被miRNA调控的数量进行排序；将进一步筛选的通路相关靶基因进行整合，得到蒽环类药物干预下的miRNA的靶基因及miRNA-gene共表达基因；
筛选差异表达的miRNA和gene，筛选条件为|FC|>1.4，score值>175，中心度＜-36，P<0.05。
本发明具有以下的有益效果：
本发明利用miRNA-gene共表达网络预测蒽环类药物心肌细胞间隙连接通讯异常的方法，通过miRNA-gene共表达网络预测心肌细胞间隙连接通讯异常为发现蒽环类药物心脏毒性新的分子标志物提供了新途径，为预测其预后提供了参考依据。
具体实施方式
间隙连接(Gap junction，GJ)，又称缝隙练级或平滑肌和神经细胞之间，可经此传递电冲动。心肌的同步收缩细胞间隙连接结构和功能的完整性。心肌细胞通过间隙连接传递离子、小分子代谢物质和次级信使等，为心肌细胞间提供了低电阻传导途径，其活动协调一致。由于间隙连接的种类、大小、在细胞表面分布模式不同，细胞之间连接通道的生物、物理特性也不同，表现为细胞之间的阻抗差异，兴奋的传播呈现不连续性。病理情况下，间隙连接基因的表达和功能会发生变化，导致细胞间电活动改变。本发明公开的技术方案有助于对间隙连接通讯与心肌损伤的关系和调控机制的了解，有助于发现新的靶点治疗蒽环类心脏毒性药物。
下面对本发明做以详细说明。
本发明的利用miRNA-gene共表达网络预测蒽环类药物心肌细胞间隙连接通讯异常的方法中的受试对象的选择标准以及外周静脉血采集的方法如下。
1.对象
2017年1月-2018年7月在某院肿瘤科收集应用化疗前且未出现心脏毒性乳腺癌患者及应用蒽环类药物后出现心脏毒性患者的血清标本各3例，2组研究对象间性别、年龄无统计学差异。所有的受试者均已签署实验知情同意书，同时经医学伦理委员会审核通过。
蒽环类药物心脏毒性评价标准：指具有下面的一项或多项表现，但不包含化疗/靶向药物使用早期发生的亚临床的心血管损伤：
(1)左心室射血分数(LVEF)降低的心肌病，表现为整体功能降低或室间隔运动明显降低；
(2)充血性心衰(CHF)相关的症状；
(3)CHF相关的体征，如第3心音奔马律、心动过速，或两者都有；
(4)LVEF较基线降低至少5％至绝对值＜55％，伴随CHF的症状或体征；或LVEF降低至少10％至绝对值＜55％，未伴有症状或体征[J Clin Oncol，2002，20:1215-1221.]。
2.外周静脉血采集
每天上午8-9点间使用EDTA抗凝管采集受试者10mL外周血，于10分钟之内送往实验室处理。
本发明的利用miRNA-gene共表达网络预测蒽环类药物心肌细胞间隙连接通讯异常的方法，包括以下步骤：
步骤1：实验分组
用含有蒽环类药物(THP或EPI)方案化疗乳腺癌患者外周血，建立test组；
以未进行蒽环类药物处理的乳腺癌患者外周血，建立con组；
其中，test组：乳腺癌患者化疗后外周血组，每组3个生物学重复；con组：乳腺癌患者未化疗组外周血组，每组3个生物学重复。
步骤2：RNA提取
按miRNeasy Mini Kit试剂盒说明书提取和纯化外周血单个核细胞RNA，并提取test组和con组中外周血细胞的miRNA和靶基因，具体包括以下步骤：
(1)在离心收集的冰冻细胞悬液中加入0.5mL的Trizon溶液，充分振荡混匀后，在室温下放置8min，保证细胞的核蛋白与核酸能完全分离；
(2)然后在细胞的核蛋白与核酸完全分离后，加氯仿0.2mL，祸旋振荡30s，在室温下放置2-3min，设置为在4℃下，离心速度12 000rpm，离心时间10min，离心后，这时标本会分成三层，RNA在上层水相中；
(3)使用100μL的枪头小心吸取上层水相的RNA移至干净的离心管中，注意在吸取上层RNA时尽量小心，尽量不吸取接近中间层物质的上层液，以免出DNA的污染，同时按比例加入无水乙醇，注意要混匀，再将溶液和半透明纤维悬浮物全部加至吸附柱中，静置约2min后，设置离心速度为12 000rpm，离心3min后，倒掉废液；
(4)将吸附柱放回收集管中，按比例加入RPE溶液，静置约2min，设置离心速度为10000rpm，离心时间30s，离心后倒掉废液，重复此步骤一次；
(5)将吸附柱放回收集管中，1000rpm离心2min；再将吸附柱放入干净的1.5mL离心管中，在吸附膜中央处，按比例加入无酶水，放置5min，设置离心速度为12 000rpm，离心时间2min，离心后将所得到的液体为RNA溶液，使用分光光度仪检测RNA的浓度，并置于-80℃冰箱保存用于后续实验。
步骤3：miRNA-gene芯片数据差异性表达分析
(1)导入每个miRNA探针的预设值；
(2)过滤掉在所有芯片的重复探针中Flag均为“-50”的miRNA探针；
(3)将每张芯片所含重复探针的荧光强度值取中位数；
(4)计算每张芯片中重复探针的变异系数值；
(5)芯片间采用Invariant set标准化法进行数据均一化，在同样本重复探针中取平均值；
(6)依据实验设计和分组情况对miRNA探针进行对比，计算|FC|>1.4差异倍数；
(7)差异基因列表：选取满足|FC|>1.4，P<0.05的基因为差异基因；
(8)主成分和聚类分析：芯片讯号值经数据log转换及平均数中心化后，依需求筛选出适当数目的差异基因以平均连接算法进行聚类分析；
步骤4：miRNA靶基因分析及调控网络构建
利用Targetscan数据库对miRNA靶基因进行初步预测；利用DAVID数据库将miRNA靶基因进行KEGG通路富集分析，筛选出P＜0.05的基因通路。
进一步筛选出与肿瘤相关通路，并按可被miRNA调控的数量进行排序；将进一步筛选的通路相关靶基因进行整合，得到蒽环类药物干预下的miRNA的靶基因及miRNA-gene共表达基因；筛选差异表达的miRNA和gene，筛选条件为|FC|>1.4，score值>175，中心度＜-36，P<0.05。
本发明利用miRNA-gene共表达网络预测蒽环类药物心肌细胞间隙连接通讯异常的方法，通过miRNA-gene共表达网络预测心肌细胞间隙连接通讯异常为发现蒽环类药物心脏毒性新的分子标志物提供了新途径，为预测其预后提供了参考依据。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (4)
1.一种利用miRNA-gene共表达网络预测蒽环类药物心肌细胞间隙连接通讯异常的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：实验分组
用含有蒽环类药物方案化疗乳腺癌患者外周血，建立test组；
以未进行蒽环类药物处理的乳腺癌患者外周血，建立con组；
步骤2：RNA提取
提取test组和con组中外周血细胞的miRNA和靶基因；
步骤3：miRNA-gene芯片数据差异性表达分析
(1)导入每个miRNA探针的预设值；
(2)过滤掉在所有芯片的重复探针中Flag均为“-50”的miRNA探针；
(3)将每张芯片所含重复探针的荧光强度值取中位数；
(4)计算每张芯片中重复探针的变异系数值；
(5)芯片间采用Invariant set标准化法进行数据均一化，在同样本重复探针中取平均值；
(6)依据实验设计和分组情况对miRNA探针进行对比，计算|FC|>1.4差异倍数；
(7)差异基因列表：选取满足|FC|>1.4，P<0.05的基因为差异基因；
(8)主成分和聚类分析：芯片讯号值经数据log转换及平均数中心化后，依需求筛选出适当数目的差异基因以平均连接算法进行聚类分析；
步骤4：miRNA靶基因分析及调控网络构建
利用Targetscan数据库对miRNA靶基因进行初步预测；利用DAVID数据库将miRNA靶基因进行KEGG通路富集分析，筛选出P＜0.05的基因通路。
2.根据权利要求1所述的利用miRNA-gene共表达网络预测蒽环类药物心肌细胞间隙连接通讯异常的方法，其特征在于，步骤1中的分组具体为：
test组：乳腺癌患者化疗后外周血组，每组3个生物学重复；
con组：乳腺癌患者未化疗组外周血组，每组3个生物学重复。
3.根据权利要求1所述的利用miRNA-gene共表达网络预测蒽环类药物心肌细胞间隙连接通讯异常的方法，其特征在于，步骤2具体包括以下步骤：
(1)在离心收集的冰冻细胞悬液中加入0.5mL的Trizon溶液，充分振荡混匀后，在室温下放置8min，保证细胞的核蛋白与核酸能完全分离；
(2)然后在细胞的核蛋白与核酸完全分离后，加氯仿0.2mL，祸旋振荡30s，在室温下放置2-3min，设置为在4℃下，离心速度12 000rpm，离心时间10min；
(3)使用100μL的枪头小心吸取上层水相的RNA移至干净的离心管中，按比例加入无水乙醇并混匀，再将溶液和半透明纤维悬浮物全部加至吸附柱中，静置约2min后，以12000rpm的离心速度离心3min后倒掉废液；
(4)将吸附柱放回收集管中，按比例加入RPE溶液，静置约2min，以10 000rpm的离心速度离心30s，离心后倒掉废液，重复此步骤一次；
(5)将吸附柱放回收集管中，1000rpm离心2min；再将吸附柱放入干净的1.5mL离心管中，在吸附膜中央处，按比例加入无酶水，放置5min，以12 000rpm的离心速度离心2min，离心后将所得到的液体为RNA溶液，使用分光光度仪检测RNA的浓度，并置于-80℃冰箱保存。
4.根据权利要求1所述的利用miRNA-gene共表达网络预测蒽环类药物心肌细胞间隙连接通讯异常的方法，其特征在于，步骤4还包括以下步骤：
进一步筛选出与肿瘤相关通路，并按可被miRNA调控的数量进行排序；将进一步筛选的通路相关靶基因进行整合，得到蒽环类药物干预下的miRNA的靶基因及miRNA-gene共表达基因；
筛选差异表达的miRNA和gene，筛选条件为|FC|>1.4，score值>175，中心度＜-36，P<0.05。
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