CN108872174A - 一种快速观察翠竹胚囊结构的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速观察翠竹胚囊结构的方法，包括取样→染色→透明→观察等步骤。本发明利用整体染色透明激光共聚焦显微技术，快速观察翠竹胚囊发育，先将翠竹的子房在水杨酸甲酯中透明后，以便观察到包藏在其中的胚囊，再用激光扫描共聚焦显微镜对翠竹子房各层分别成像，获得胚囊内部清晰的荧光图像，建立胚囊整体结构概念，明确翠竹胚囊发育过程和发育类型，是一种方便快速的竹类植物胚囊结构观察技术，具有观察省时，操作简便，结构清晰等优势，有效解决了竹类植物子房胚囊在发育过程中难以观察到整体结构的问题，为建立和丰富完善竹类植物生殖生物学理论奠定基础。

Description

一种快速观察翠竹胚囊结构的方法

技术领域

本发明属于植物结构发育技术领域，具体涉及一种利用整体染色透明激光共聚焦显微技术快速观察翠竹胚囊结构的方法。

背景技术

翠竹(Pleioblastus pygmaeus)是禾本科(Poaceae)苦竹属(Pleioblastus)的优良地被类观赏植物，其抗逆性强，耐修剪，目前在园林绿化上的应用需求越来越大，其经济价值也越来越高[张春霞，骆仁祥，丁兴萃等.翠竹的组织培养和快速繁殖[J].植物生理学通讯，2010，46(5)：477-478]。翠竹原产日本，于20世纪80年代由南京古林苗圃引入南京林业大学，2015年3月首次在南京开花，5月果实成熟[林树燕，范婷婷，姜明云，等3种(品种)地被竹花器官形态特征及学名订正[J].南京林业大学学报(自然科学版)，2017，41(1)：189-193]。

对胚囊结构和功能的研究一直是植物生殖生物学一个重要的研究内容，但是因为胚囊处于胚珠组织的层层包裹之中，研究工作实施起来十分的困难。常规石蜡切片是研究胚囊的传统方法，但其制片过程复杂、工作量大。激光扫描共聚焦显微镜是近代发展起来用以研究细胞生物学的高科技产品，具有较高的分辨率，能深度识别生物标本中的细微结构，直接地进行形态学观察，对样品各层分别扫描成像，用计算机进行图像处理，建立样品的三维立体结构图。用激光共聚焦显微镜观察拟南芥(Arabidopsis thallana)胚珠的发育过程，取得了理想的效果；张华华[张华华，冯九焕，卢永根，等.利用激光扫描共聚焦显微镜观察水稻胚囊形成与发育的方法.电子显微学报，2003，22(5)：380-384.]及郭海滨[郭海滨，卢永根，冯九焕，等.利用激光扫描共聚焦显微术对同源四倍体水稻胚囊形成与发育的进一步观察.激光生物学报，2006，15(2)：111-117]等人已利用激光扫描共聚焦显微技术对同源四倍体水稻的胚囊进行比较研究，并且建立了整体染色透明激光扫描共聚焦显微术观察胚囊的方法。徐川梅等人[徐川梅，高欣，汤定钦.利用激光共聚焦显微镜研究孝顺竹花粉粒发育.林业科学，2010，46(11)：158-161]利用激光共聚焦显微镜研究了孝顺竹雄配子体发育过程，观察花粉内部的结构细节，建立了花粉粒三维立体图。目前还未检索到激光扫描共聚焦显微术在竹类植物胚囊结构观察中的应用。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种快速观察翠竹胚囊结构的方法，克服石蜡切片费事费力且不容易观察到目标结构等问题，具有快速、操作简便等优点。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

一种快速观察翠竹胚囊结构的方法，包括以下步骤：

1)取不同发育时期的小穗，固定后，转移至酒精中永久保存；

2)梯度复水后，曙红溶液染色，蒸馏水水洗，再以梯度酒精脱水，无水乙醇中重复数次；

3)将染色好的子房置于水杨酸甲酯和酒精的混合液中过渡，随后转移到纯水杨酸甲酯溶液中透明，最后将样品保存于纯水杨酸甲酯中；

4)将样品置于凹玻片之上，在凹玻片上加少许的水杨酸以及中性树脂，用以封片；在激光扫描共聚焦显微镜下进行分层扫描并获取图像，观察出翠竹胚囊结构。

步骤1)中，取从孢原细胞开始至成熟胚囊的不同发育时期的小花，固定于70％的FAA之中，体视镜下解剖前从FAA中取出，先用50％的酒精冲洗，随后转移至70％的酒精中备用；在体视镜下解剖分离出发育各阶段子房。

步骤2)中，经70％酒精-50％酒精-30％酒精一15％酒精-蒸馏水梯度复水，每级30min，随后在10mg/L的曙红染色12-15h；染色结束后用蒸馏水水洗5次；经梯度酒精脱水，每级30min。

步骤2)中，梯度酒精为：15％酒精-30％酒精-50％酒精-70％酒精-80％酒精-95％酒精-无水乙醇，无水乙醇中重复3次，每级30min。

步骤3)中，将染色好的样品于水杨酸甲酯和酒精的混合液中停留1h，随后转入纯水杨酸甲酯溶液中透明3次，每次2h，最后将样品保存于纯水杨酸甲酯中，置于4℃冰箱中备用。

所述的快速观察翠竹胚囊结构的方法，水杨酸甲酯和酒精的体积比为1∶1。

步骤4)中，在Leica SP2激光扫描共聚焦显微镜下用543nm的波长激发的荧光，用2μm的光切片厚度进行分层扫描并获取图像。

本发明是利用整体染色透明激光共聚焦显微技术快速观察翠竹胚囊发育的方法，针对常规石蜡切片耗时长、不易观察到胚囊中结构等问题，探索出一种快速且准确的，适用于翠竹激光共聚焦显微技术观察胚囊结构的方法。该方法主要包括取样→染色→透明→观察。按此方法进行翠竹雌蕊发育过程中胚囊结构的观察，省时，操作简便，结构清晰。本发明首次利用激光扫描共聚焦显微镜结合整体透明法研究翠竹的大孢子发生以及雌配子体的发育过程，虽然激光扫描共聚焦显微术在水稻、小麦等其他禾本植物的胚囊结构方面已经十分完善，但由于竹类植物极少开花，试验材料难以获取，因此本专利可为日后研究竹类植物有性生殖过程提供新的方法参考。

有益效果：与现有技术相比，本发明利用整体染色透明激光共聚焦显微技术，快速观察翠竹胚囊发育，先将翠竹的子房在水杨酸甲酯中透明后，以便观察到包藏在其中的胚囊，再用激光扫描共聚焦显微镜对翠竹子房各层分别成像，获得胚囊内部清晰的荧光图像，建立胚囊整体结构概念，明确翠竹胚囊发育过程和发育类型，是一种方便快速的竹类植物胚囊结构观察技术，有效解决了竹类植物子房胚囊在发育过程中难以观察到整体结构的问题为建立和丰富完善竹类植物生殖生物学理论奠定基础。

附图说明

图1是孢原细胞图；

图2是大孢子母细胞图；

图3是四分体图；

图4是功能大孢子图；

图5是二核胚囊图；

图6是成熟胚囊中的反足细胞图；

图7是成熟胚囊中的极核图；

图8是成熟胚囊中的卵器图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。

实施例1

一种快速观察翠竹胚囊发育的方法，包括以下步骤：

1)取固定于70％FAA中的不同发育时期(从孢原细胞开始至成熟胚囊)的小花，体视镜下解剖前从FAA中取出，先用50％的酒精冲洗，随后转移至70％的酒精中备用。在体视镜下解剖分离出发育各阶段子房。

2)70％酒精-50％酒精-30％酒精-15％酒精-蒸馏水(2次)梯度复水，每级30min，随后在10mg/L的曙红溶液(用4％的蔗糖溶液配置)染色12-15h。染色结束后，用蒸馏水水洗5次，再以梯度酒精脱水(15％酒精-30％酒精-50％酒精-70％酒精-80％酒精-95％酒精-无水乙醇)，无水乙醇中重复3次，每级30min。

3)先将染色好的子房置于水杨酸甲酯和酒精的混合液(体积比为1∶1)中过渡1h，随后转移到纯水杨酸甲酯溶液中透明3次，每次2h，最后将样品保存于纯水杨酸甲酯中备用。

4)准备凹玻片、短的盖玻片，中性树脂/透明指甲油，将制备好的样品置于凹玻片之上，注意子房的方向，尽量使子房最大面与凹玻片面平行，在凹玻片上加少许的水杨酸以及中性树脂，用以封片。加盖盖玻片时，注意不要挤压子房，以防变形。在Leica SP2激光扫描共聚焦显微镜下用543nm的波长激发的荧光，用2μm的光切片厚度进行分层扫描并获取图像。

结果如图1-8所示，其中，图1是孢原细胞图，图2是大孢子母细胞图，图3是四分体图，图4是功能大孢子图，图5是二核胚囊图，图6是成熟胚囊中的反足细胞图，图7是成熟胚囊中的极核图，图8是成熟胚囊中的卵器图；本发明首次利用激光共聚焦显微技术对竹类植物胚囊发育过程进行精准研究，能够迅速地对翠竹胚囊发育的各时期进行快速准确鉴定，并有利于明晰竹类植物胚囊发育类型，对于后续研究竹类植物胚囊发育机理提供了依据和坚实的基础。

本发明是利用整体染色透明激光共聚焦显微技术快速观察翠竹胚囊发育的方法，针对常规石蜡切片耗时长、不易观察到胚囊中结构等问题，探索出一种快速且准确的，适用于翠竹激光共聚焦显微技术观察胚囊结构的方法。该方法主要包括取样→染色→透明→观察。按此方法进行翠竹雌蕊发育过程中胚囊结构的观察，省时，操作简便，结构清晰。

Claims (7)

1.一种快速观察翠竹胚囊结构的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)取不同发育时期的小穗，固定后，转移至酒精中永久保存；

2)梯度复水后，曙红溶液染色，蒸馏水水洗，再以梯度酒精脱水，无水乙醇中重复数次；

3)将染色好的子房置于水杨酸甲酯和酒精的混合液中过渡，随后转移到纯水杨酸甲酯溶液中透明，最后将样品保存于纯水杨酸甲酯中；

4)将样品置于凹玻片之上，在凹玻片上加少许的水杨酸以及中性树脂，用以封片；在激光扫描共聚焦显微镜下进行分层扫描并获取图像，观察出翠竹胚囊结构。

2.根据权利要求1所述的快速观察翠竹胚囊结构的方法，其特征在于，步骤1)中，取从孢原细胞开始至成熟胚囊的不同发育时期的小花，固定于70％的FAA之中，体视镜下解剖前从FAA中取出，先用50％的酒精冲洗，随后转移至70％的酒精中备用；在体视镜下解剖分离出发育各阶段子房。

3.根据权利要求1所述的快速观察翠竹胚囊结构的方法，其特征在于，步骤2)中，经70％酒精-50％酒精-30％酒精-15％酒精-蒸馏水梯度复水，每级30min，随后在10mg/L的曙红染色12-15h；染色结束后用蒸馏水水洗5次；经梯度酒精脱水，每级30min。

4.根据权利要求3所述的快速观察翠竹胚囊结构的方法，其特征在于，步骤2)中，梯度酒精为：15％酒精-30％酒精一50％酒精-70％酒精-80％酒精-95％酒精-无水乙醇，无水乙醇中重复3次，每级30min。

5.根据权利要求1所述的快速观察翠竹胚囊结构的方法，其特征在于，步骤3)中，将染色好的样品于水杨酸甲酯和酒精的混合液中停留1h，随后转入纯水杨酸甲酯溶液中透明3次，每次2h，最后将样品保存于纯水杨酸甲酯中，置于4℃冰箱中备用。

6.根据权利要求5所述的快速观察翠竹胚囊结构的方法，其特征在于，水杨酸甲酯和酒精的体积比为1∶1。

7.根据权利要求1或4所述的快速观察翠竹胚囊结构的方法，其特征在于，步骤4)中，在Leica SP2激光扫描共聚焦显微镜下用543nm的波长激发的荧光，用2μm的光切片厚度进行分层扫描并获取图像。