CN108872047A - 一种微流控电阻抗检测区分微小粒子形状的系统及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公布一种基于微流控电阻抗检测区分微小粒子形状的系统及方法，微流控电阻抗检测区分微小粒子形状的系统包括微流控模块、阻抗检测模块、上位计算机及信号处理模块。基于微流控电阻抗检测区分微小粒子形状的方法通过微流控芯片管道设计和流速调节控制杆状粒子通过检测部位的姿态，采用电阻抗检测仪检测阻抗，让杆状粒子得到相对较宽的检测脉冲信号宽度，上位计算机及信号处理软件采集阻抗信号并处理得到脉冲信号高度、宽度和宽高比，以及它们的统计结果实现对杆状粒子和球状粒子单个或群体的区分。本发明采用电阻抗流式检测方法，通过管道设计和流速调节实现对粒子姿态的控制，实现不同形状粒子的区分，系统简单操作方便。

Description

一种微流控电阻抗检测区分微小粒子形状的系统及方法

技术领域

本发明涉及微流体技术与微生物检测领域，特别涉及一种微流控电阻抗检测区分微小粒子形状的系统及方法。

背景技术

微流控电阻抗检测技术是单细胞检测领域中比较常用的技术。微流控电阻抗检测系统及方法具有在检测过程中对细胞无标记、无损伤的优点，因此常用于细胞的计数与分类。微流控芯片由于体积小、集成度高、耗用试剂量小等优点成为近年来研究的热点。细胞形状是细胞基本生物特性一个重要参数，能提供细胞生理学、病理学相关信息。利用微流控电阻抗系统进行粒子形态分析鲜有研究，现有研究技术中主要方法有以下两类：

一是电阻抗芯片结合图像识别的方法区分形状。Niels提出一种将微流控阻抗细胞仪与高速相机相结合的实验系统，以实现对单个细胞的形状与介电性能的表征。通过图像推算细胞形状与体积，与阻抗数据相结合，实现对不同形状细胞进行区分。该方法检测系统复杂，操作难度大。

二是电阻抗芯片上集成介电泳技术实现粒子按设定的姿态流动，利用横向与纵向电信号的差异区分形状。该方法通过介电泳对粒子进行聚焦，使其以特定姿态通过检测区域，检测区域同时检测横向、纵向电信号，杆状粒子横、纵向电信号有明显差异，而球状粒子无差异，从而区分粒子形状。该方法检测系统相对简单，但其采用介电泳控制流动中粒子姿态的操作难度较大。

申请号为201610962524.8的专利申请中公开了一种“电阻抗流式检测微小颗粒、细胞的微流控芯片”，该微流控芯片由PDMS盖片与具有盖片形状和大小相适应的基片键合而成，基片上至少设置有一对微小电极，盖片上有微流控管道，基片上设置有微小电极的一面和与之形成接触的盖片上的微流控管道接触面对准键合，实现对微流控管道的封闭；微流控管道由进样口、一根主管道和出样口组成，主管道具有样品导入管道、收缩检测管道和最狭窄部位，收缩管道使得粒子在流动过程中在通过中央检测区域时获得较大的加速度，有利于粒子取向与流向对齐。

发明内容

本发明提供一种基于微流控电阻抗检测区分微小粒子形状的系统及方法，采用电阻抗流式单细胞无损检测方法，采用管道设计和流速调节实现对粒子姿态的控制，实现不同形状粒子的区分，系统简单、操作方便。

一种微流控电阻抗检测区分微小粒子形状的系统，其特征在于包括微流控模块(1)、阻抗检测模块(2)、上位计算机(3)及信号处理模块(4)，所述微流控模块中包含流速控制设备和微流控芯片，微流控芯片由盖片与相应大小的玻璃底片键合而成；盖片上印有浇筑而成的微流控直管道，玻璃底片上有电极。

作为本发明技术方案的进一步改进，所述微流控直管道由入口、出口、主管道组成；微流控直管道内有多级收缩区域，检测区域位于多级收缩区域的最窄部分，电极位于检测区域。

所述抗阻检测模块包含抗阻检测仪，所述信号处理模块包含信号处理软件。

本发明还提供一种微流控电阻抗检测区分微小粒子形状的方法，其特征在于包括以下步骤：

步骤一、微粒分散于缓冲液中，浓度小于10⁶mL^-1；

步骤二、微流流控模块中的微流控芯片与阻抗检测模块中的阻抗检测仪连接，将检测样本注入芯片入口池，使检测样本流过微流控直管道；

步骤三、设置激励信号的幅值、频率参数，将交流电信号施加到电极上，幅值的取值范围为0.01V－100V，频率的取值范围为0.01Hz－10GHz；

步骤四、使用流速控制设备控制流速使微粒在管道中心时按>100μm s^-1速度流动，逐个流经检测区域，保证杆状粒子以长轴与流线平行的姿态通过检测部位，且每一个微粒产生一个电脉冲信号；

步骤五、电阻抗检测仪以100Hz－1000MHz的采样率采集微粒通过检测电极时引起阻抗变化的信号，确保每个被测粒子的脉冲信号有不少于5个采样点，软件中显示该信号并将数据存储；

步骤六、使用信号处理模块中的信号处理软件对每个信号的脉冲高度和脉冲宽度被识别、储存，进行统计并绘制微粒通过检测区域时的脉冲宽度分布统计结果图；

步骤七、分析单个微粒的脉冲宽度，或大量微粒的脉冲宽度分布统计结果，区分单个微粒或微粒群体的形状。

作为本发明技术方案的进一步改进，所述步骤七分析单个微粒的脉冲宽度，或大量微粒的脉冲宽度分布直方图，区分单个微粒或微粒群体的形状，具体流程为：

对于单个同体积粒子之间的区分，将杆状和球状粒子通过检测电极时脉冲宽度分别计做W1、W2，高度分别记为H1、H2；杆状和球状粒子的脉冲高度相同，即H1＝H2，脉冲宽度W1>W2；

对于同体积粒子群体之间的区分，将采集的数据导入脉冲识别程序，计算出每个脉冲的高度H、脉冲宽度W，并储存；进行统计并以脉冲宽度作为横坐标，绘制微粒分布的统计结果图，根据杆状、球状两类粒子的统计结果分布范围，对两类粒子进行分群，其中杆状粒子脉冲宽度大，球状粒子脉冲宽度小。

作为本发明技术方案的进一步改进，所述步骤七分析单个微粒的脉冲宽度，或大量微粒的脉冲宽度分布统计结果，区分单个微粒或微粒群体的形状，具体方法为：采用脉冲宽度/高度参数进行区分，杆状粒子脉冲宽度/高度比值高，球状粒子脉冲宽度/高度比值低。

与现有技术相比，本发明的有益技术效果包括：

本发明避免了引进介电力实现对粒子的定向，在不引入其他辅助设备如光学设备的情况下，实现了杆状粒子与球状粒子的区分，方法简单易实现，操作方便。

附图说明

图1是本发明一种微流控电阻抗检测区分微小粒子形状的系统组成图；

图2是本发明流体控制杆状粒子流动姿态原理图；

图3是本发明一种微流控电阻抗检测区分微小粒子形状的方法流程图；

图4是本发明实施例高速CCD下拍摄杆状粒子姿态调整后通过检测区域的照片；

图5是本发明实施例检测典型杆状粒子和球形粒子的结果图；

图6是本发明实施例检测多个球形和杆状粒子脉冲统计结果图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明方案作进一步详细描述。以聚苯乙烯微球和某种体积接近的微杆检测为例(微杆长15μm，宽4μm，高4μm，体积240μm³；微球半径4微米，体积267μm³)来说明本发明的工作原理及流程。

一种微流控电阻抗检测区分微小粒子形状的系统及方法，如附图1所示，该系统包括微流控模块(1)、阻抗检模块(2)、上位计算机(3)及信号处理模块(4)，微流控模块包括微流控芯片，微流控芯片采用多级收缩管道结构，使得粒子在流动过程中受到限制和引导，其中杆状粒子受到流体的剪切力作用，姿态会倾向于保持长轴与流线方向一致，收缩管道加速流会加速粒子取向沿流线方向，使杆状粒子其长轴与管道平行流过检测区域。杆状粒子与球状粒子体积相似。微流控芯片的主管道宽度(100～500微米)通过不少于一级的过渡收缩缩窄到窄管道区域(检测区域)宽度(为被测粒子最大尺寸的1～10倍)，按>100μm s^-1速度流动，管道能够让杆状粒子的长轴与流线平行通过检测部位。

微流控芯片由PDMS材料浇筑而成的盖片与相应大小的底片键合而成。盖片上印有浇筑而成的微流控直管道，管道由入口、出口、主管道组成。管道采用收缩管道宽设计，管道入口处设有方形过滤柱，用于防止较大颗粒碎屑堵塞管道。检测电极采用光刻工艺，经涂胶、曝光、洗脱、蚀刻，去胶等步骤得到。电极采用单侧共面电极。每根电极宽度约为10－30μm，电极间宽度为10-30μm电极间沿着流动方向有一不小于检测粒子尺寸的间距，恰好与管道收缩处吻合，提升了检测信号的灵敏度。二者通过键合工艺固定。由于管道中不同部位流速不同，杆状粒子会受到流体剪切力作用，使得杆状粒子的长轴倾向于与流线方向一致。

对杆状粒子在流体中姿态控制的原理如下：如附图2所示。基于假设：液体是牛顿流体，符合管流的特征。由管流中液体流速在管截面不同部位不同，呈现一抛物线特征(图2a)，即管道中距离管中心r的部位流速v_r可以由下式表示：

其中，μ为粘滞系数，N为管长，Δp为管两端压力差，D为管直径。

管道截面积不变时，流线平行于管道中心线(附图2d)。当长度为L的杆状粒子进入管道后，一般性地假设初始姿态与流线呈θ角，粒子的头、尾不在同一流线上，则根据式(1)，不同部位的液体流速就有差异(图2a-b)，该差异将产生流体对粒子的剪切力F：

F＝κ·Δv (2)

剪切力与流速差成正比，κ为比例系数。

于是根据式(1)，在相距Δr的部位产生的流速差Δv为:

当粒子的流动速度与O点的液体流速一致时，头尾受到的剪切力为：

其中F₁、F₂分别是头、尾部受到的剪切力，F₁的方向与速度方向相同，F₂的方向与速度方向相反(因为Δv＜0，图2b)。于是，两个力一起就构成了一对使得杆状粒子逆时针旋转的力矩：

M₁＝F₁·l₀sinθ (6)

M₂＝F₂·(L-l₀)sinθ (7)

M₁、M₂分别是粒子头、尾部受到的力矩，方向与力方向相同。这两个力矩的存在，将导致粒子倾向于逆时针旋转到与管道中心线平行的姿态(亦即与流线方向一致)，从而F₁、F₂都缩小为零，达到稳态。如果粒子初始姿态就是杆的长轴与流线方向一致，则不存在旋转的问题。另一个特殊情形就是杆状粒子是结构高度对称的，进入管道时垂直于管道方向，且对称地位于管道中央，此时头尾部的液体流速一致，剪切力方向相同，不会发生旋转。此种情形必须满足前述所有条件，且管道形状不变，流速不发生扰动的理想状态下才可能维持稳定，只要有任何扰动，此一姿态即不可维持，将进入前述状态中。

因此，只要管道足够长，粒子最终会将姿态调整到长轴方向与流线方向一致。又因为管流的流速抛物线的顶点是最大流速，终点是管壁，流速为0，处于中间部位的流速差Δv必然会随着最大流速增大而增大，相应的剪切力和对粒子的旋转力矩也会增大。只要流速大到一定值，就可以保证流过一定距离后所有粒子长轴方向与流线一致，球状粒子则不管以何姿态通过检测部位都不影响其电阻抗信号，如图2c所示。

如附图2c所示，体积相近的粒子在脉冲信号上表现为相近的脉冲高度。对于球状粒子，通过检测电极时脉冲宽度计做W1；杆状粒子长轴与流向一致，通过检测电极时脉冲宽度计做W2；由于杆状粒子具有较长的轴距，通过检测电极的时间相比于球状粒子较长，在脉冲信号上则反应为脉冲宽度较大，即W1<W2,杆状与球状粒子分别通过检测电极时脉冲宽度具有显著性差异。

阻抗检测模块中包括阻抗检测仪器，阻抗检测仪器可以为商业化的仪器，也可以是自行研制或组装的，能够对管道中电极间的物质电阻抗性能(不少于一个频率的电阻抗幅值、相位、电容、电阻或者电导、电纳等参数)进行连续检测。

上位计算机主要完成数据的采集和处理。将阻抗检测仪器测量得到的连续阻抗信号进行存储，并识别被测粒子的脉冲信号，将信号的特征参数(如脉冲高度、宽度等)进行存储和分析。

信号处理模块包括信号处理软件，信号处理软件主要用于数据的分析，可以嵌入到前述软件中，也可以单独运行。主要通过特定的算法，对脉冲特征参数进行统计分析，绘制直方图、散点图等，据此进行分群，从而得到不同粒子的群体。

图3为检测流程，将检测所需微杆微球溶解于PBS缓冲液中，采用申请号为201610962524.8的专利申请中的微流控芯片，该芯片由PDMS制成的盖片与玻璃电极基底构成，盖片上有通过模板浇筑的微流控管道，管道主要由入口、出口、主管道、过滤柱组成。主管道采取三级收缩结构，三级收缩中一级收缩结构在出入口处，管道宽度为150μm，二级与三级收缩集中在中心检测区域附近，管道宽度分别为50μm、25μm。检测核心区域在三级管道收缩处，长度为10μm，宽度为25μm。三级收缩管道使得粒子在流动过程中在通过中央检测区域时获得较大的加速度，有利于粒子取向与流向对齐。该微流控芯片与阻抗检测仪连接，将20μl微粒分散于缓冲液的检测样本(浓度小于10⁶mL^-1)用移液枪吸取注入芯片入口池，使检测样本充满管道；然后微流流控模块中的微流控芯片与阻抗检测模块中的阻抗检测仪连接；设置激励信号的幅值、频率参数，将交流电信号施加到电极上，幅值的取值范围为0.01V－100V，频率的取值范围为0.01Hz－10GHz；将控制流速的抽气泵的气管连接在微流控芯片出口处，使得微粒在管道中心时按>100μm s^-1速度流动，逐个流经检测区域，保证杆状粒子以长轴与流线平行的姿态通过检测部位，且每一个微粒产生一个电脉冲信号；电阻抗检测仪以100Hz－1000MHz的采样率采集微粒通过检测电极时引起阻抗变化的信号，确保每个被测粒子的脉冲信号有不少于5个采样点，软件中显示该信号并将数据存储；使用信号处理模块中的信号处理软件对每个信号的脉冲高度和脉冲宽度被识别、储存，进行统计并绘制微粒通过检测区域时的脉冲宽度分布直方图；分析单个微粒的脉冲宽度，或大量微粒的脉冲宽度分布统计结果，区分单个微粒或微粒群体的形状。

附图4为高速CCD拍摄到的杆状粒子流经检测区域的连续照片，流动方向为从下往上流，粒子流经最窄部位的时间顺序为c－f。可以看到，在流体剪切力和管道结构双重作用下，杆状粒子调整姿态，最终以杆长轴与流体流线一致的姿态通过检测部位。充分证明了本发明方法对杆状粒子姿态控制的有效性。

附图5为利用数据处理算法提取的典型单个粒子电阻抗脉冲曲线，附图5a为微球的脉冲，附图5b为微杆的脉冲。从图中看出，附图5a波形相比于附图5b波形在脉冲高度上接近，证明两种粒子的体积近似相等，在脉冲宽度上，附图5a脉冲宽度小于附图5b脉冲宽度，从而确定第一个通过检测区域的为球形粒子，第二个为杆状粒子。

附图6为对体积接近的大量球形、杆状粒子宽度进行计数统计分析后的直方图结果，a为球形粒子，b为杆状粒子。从图中可以看出，球型和杆状粒子脉冲直方图中球型粒子的平均宽度为365个采样点；杆状粒子的平均宽度为478个采样点。二者的脉冲宽度具有显著差异，可以对两种不同的粒子进行区分。

本发明不仅适用于非生物粒子的检测，同样适用于对于不同形状的生物学粒子(如血细胞、酵母菌)的检测与分类。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种微流控电阻抗检测区分微小粒子形状的系统，其特征在于包括微流控模块(1)、阻抗检测模块(2)、上位计算机(3)及信号处理模块(4)，所述微流控模块中包含流速控制设备和微流控芯片，微流控芯片由盖片与相应大小的底片键合而成；盖片上印有浇筑而成的微流控直管道，底片上有电极。

2.如权利要求1所述的一种微流控电阻抗检测区分粒子形状的系统，其特征在于所述微流控直管道由入口、出口、主管道组成；微流控直管道内有多级收缩区域，检测区域位于多级收缩区域的最窄部分，电极位于检测区域。

3.基于权利要求1至2中任意一种微流控电阻抗检测区分微小粒子形状的系统的微流控电阻抗检测区分微小粒子形状的方法，其特征在于包括以下步骤：

步骤一、微粒分散于缓冲液中，浓度小于10⁶mL^-1；

步骤二、将微流控模块中的微流控芯片与阻抗检测模块中的阻抗检测仪连接，将检测样本注入芯片入口池，使检测样本流过微流控直管道；

步骤三、设置激励信号的幅值、频率参数，将交流电信号施加到电极上，幅值的取值范围为0.01V－100V，频率的取值范围为0.01Hz－10GHz；

步骤四、使用流速控制设备控制流速使微粒在管道中心时按>100μm s^-1速度流动，逐个流经检测区域，保证杆状粒子以长轴与流线平行的姿态通过检测部位，且每一个微粒产生一个电脉冲信号；

步骤五、阻抗检测模块中的电阻抗检测仪以100Hz-1000MHz的采样率采集微粒通过检测电极时引起阻抗变化的信号，确保每个被测粒子的脉冲信号有不少于5个采样点，软件中显示该信号并将数据存储；

步骤六、信号处理模块对每个信号的脉冲高度和脉冲宽度被识别、储存，进行统计并绘制微粒通过检测区域时的脉冲宽度分布统计结果图；

步骤七、分析单个微粒的脉冲宽度，或大量微粒的脉冲宽度分布统计结果，区分单个微粒或微粒群体的形状。

4.如权利要求3所述的一种微流控电阻抗检测区分微小粒子形状的方法，其特征在于步骤七分析单个微粒的脉冲宽度，或大量微粒的脉冲宽度分布统计结果，区分单个微粒或微粒群体的形状，具体流程为：

4.1对于单个同体积粒子之间的区分，信号处理模块将杆状和球状粒子通过检测电极时脉冲宽度分别计做W1、W2，高度分别记为H1、H2；杆状和球状粒子的脉冲高度相同，即H1＝H2，脉冲宽度W1>W2；

4.2对于同体积粒子群体之间的区分，信号处理模块将每个脉冲的高度H、脉冲宽度W信息提取并储存；进行统计并以脉冲宽度作为横坐标，绘制微粒分布统计结果图，根据杆状、球状两类粒子的统计结果的分布范围，对两类粒子进行分群，其中杆状粒子脉冲宽度大，球状粒子脉冲宽度小。

5.如权利要求3所述的一种微流控电阻抗检测区分微小粒子形状的方法，其特征在于步骤七分析单个微粒的脉冲宽度，或大量微粒的脉冲宽度分布统计结果，区分单个微粒或微粒群体的形状，具体方法为：采用脉冲宽度/高度参数进行区分，杆状粒子脉冲宽度/高度比值高，球状粒子脉冲宽度/高度比值低。