CN108865893A - 一种碱絮凝收获及循环培养微藻的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了碱絮凝收获及循环培养微藻的方法。本发明利用含有碳酸氢盐的培养基培养微藻，利用其高碱性，加入低浓度絮凝离子进行絮凝沉降，收获微藻。随后，向絮凝沉降后的上清液中鼓入CO₂，使其再次产生碳酸氢钠，再利用物理或化学方法处理上清液，用于微藻的循环培养，达到重复利用碳源、营养盐和水的目的。又节省了微藻的收获和培养成本，这对于微藻的大规模培养有重要的应用前景。本发明主要用于盐生杜氏藻的培养。

Description

一种碱絮凝收获及循环培养微藻的方法

技术领域

本发明涉及微藻生物技术领域，具体涉及一种碱絮凝收获及循环培养微藻的方法。

背景技术

微藻具有生长快、单位面积产率高的特性，在各领域都发挥着重要作用。包括保健食品、药物、精细化学品、水产饵料和生物能源等。同时，因其能够利用城市污水中的营养盐生长，还可高效地固定二氧化碳，因此能够减缓当前的水污染和碳排放问题。

二氧化碳作为微藻生长所需的原料，其供应是微藻生产的主要成本之一。在微藻培养中，大部分培养体系是以鼓泡通气的方式提供二氧化碳，但在实际应用中存在二氧化碳气体压缩能耗大、运输成本较高的问题，而且二氧化碳无法全部溶于水中，浪费严重。如果利用空气中的二氧化碳作为碳源，由于其浓度低，导致微藻生长缓慢，生产效率低。利用碳酸氢盐可以克服这些问题，但是碳酸氢盐本身成本较高，因此，需要进行循环利用。利用碳酸氢盐微藻培养过程中，pH上升，再生了碳酸盐，因此，培养结束后分离得到的上清液可以用来吸收二氧化碳，并循环利用进行微藻培养。

循环培养液也有利于解决用盐成本和用水成本过高的问题。以盐生杜氏藻为例，每次培养最多需用35％的NaCl，如果不能将其回收利用，培养成本会非常昂贵。但通常来说，微藻会分泌一些胞外产物，或在培养过程中有些细胞裂解，导致胞内物质泄漏，并产生细胞碎片，这些物质对微藻一般来说都有伤害，为循环利用培养基造成了挑战，因此，需要经过处理去除这些抑制物，否则不能保证循环培养的顺利进行。

微藻培养结束后，由于微藻细胞的特性，采收比较困难、其成本很高，占整个生产成本的20-30％。传统微藻生物质收获方法主要是离心、过滤、添加无机或有机絮凝剂进行絮凝等，在这些采收方式当中，离心采收耗能较大，对藻体有损伤，不适于大规模应用；过滤容易造成膜污染，降低采收效率；絮凝剂采收时，向水体中添加絮凝剂一方面会引入外来化合物造成水体污染，影响下游的操作造成再次分离困难，另一方面由于絮凝剂价格昂贵，使用絮凝剂会增加生产成本，在微藻大规模商业化生产中使用受到限制。

综上所述，利用方法进行微藻生产，存在培养成本高、收获成本高、循环利用培养液难的问题，目前急需一种可以综合考虑到这些问题，并将其一揽子解决的整体生产方案，而这正是本发明所要解决的技术问题。

发明内容

为解决现有的技术问题，本发明提供一种培养微藻、碱性絮凝收获微藻、处理上清液，并将其循环利用继续培养微藻方法，通过建立低成本的收获方法，并能回收培养基多次用于微藻的培养，达到同时降低微藻的培养和收获成本的目的。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

在微藻培养系统中利用碳酸氢盐培养微藻，并利用培养微藻后培养基所产生的高碱性环境，在其中加入低浓度Ca²⁺、Fe³⁺等絮凝离子，使其与碳酸根或氢氧根反应，从而促进微藻的沉降，达到降低微藻收获成本的目的，之后再利用上清液中的高碱性环境吸收CO₂，生成碳酸氢盐为微藻生长提供碳源，从而降低碳供应成本。除了碳之外，氮、磷和微量元素在培养过程中也会损失一部分，而在絮凝沉降过程中，Ca²⁺、Mg²⁺、Fe³⁺等会损失一部分，因此，要进行循环培养，需要将这些营养元素和离子补充至其在初始培养基中的浓度。之后，利用物理或化学方法去除循环培养液中的抑制物，这样才能保证循环培养得以实现。

该方法具体包括如下步骤：

(1)利用含有一定浓度碳酸氢盐的初始培养基培养微藻，培养结束后，收获部分或全部体积的微藻培养液(藻液)。例如，当收获时可以取50-90％体积的微藻培养液(藻液)进行絮凝沉降，将留下的10-50％体积藻液在微藻培养系统中，当做下一次培养的藻种。

(2)调节藻液中pH至10-12，加入一定浓度的Ca²⁺和/或Fe³⁺絮凝离子进行絮凝沉降，利用碳酸氢盐所产生的碳酸根离子或氢氧根离子结合絮凝收获微藻生物质。其中所述Ca²⁺来自可溶性钙盐，如CaCl₂、CaCl₂·6H₂O、CaCl₂·2H₂O等；所述Fe³⁺来自可溶性铁盐，如FeCl₃·6H₂O、Fe₂(SO₄)₃等。其中所述的沉降选用的没有加入额外的絮凝剂和后处理，不产生任何污染。利用碳酸氢盐系统培养微藻，其培养过程中pH会不断上升，只需加入很少的碱调节pH，就能利用其高碱性环境进行絮凝沉降，再添加很少量的絮凝离子就可以达到很好的效果，收获成本低、产业化效果好、降低采收难度。

(3)由于微藻消耗碳酸氢盐后产生碳酸盐，形成高碱性环境可吸收CO₂，生成碳酸氢盐，用于微藻的循环培养，所以向絮凝沉降后的上清液补充CO₂，在此过程中，pH会下降，这也有利于微藻的生长，在pH到8-9时，碳源得到充分补充，大部分碳酸盐转变为碳酸氢盐，此时，可以停止CO₂补充。

(4)微藻培养过程中，也会消耗培养基中其他营养盐，因此需要向循环液(上清液)中添加其他营养盐(各种营养元素)以维持微藻的正常生长，所以需要将其补充至其在初始培养基中的浓度，制成循环培养基；

(5)将循环培养基经水处理装置进行物理或化学方法处理，将处理好的循环培养液重新加入到微藻培养系统中，循环使用培养基培养微藻；

(6)重复上述步骤(1)-(5)实现碱絮凝收获及循环培养微藻。一个培养周期的结束也是下一个培养周期的开始，整个生产过程实现了循环连续进行，培养与采收同时完成，构成一个循环生产过程，这可以同时解决微藻培养中碳供应成本高和沉降收获成本高的问题，而且循环利用培养液，更是大大降低了培养基本身成本，例如，经过五次循环，培养基成本降至原来的20％，经过十次循环成本则降至原来的10％。

根据上文技术方案，所述碳酸氢盐优选为碳酸氢钠或碳酸氢钾，更优选为碳酸氢钠。

根据上文技术方案，所述初始培养基中碳酸氢盐浓度需根据各藻种特点确定，例如，盐生杜氏藻培养基中，碳酸氢盐浓度优选为0.07-0.3mol/L，更优选为0.1mol/L。

根据上文技术方案，所述步骤(1)中微藻培养结束时，pH为9.5-11.5。

根据上文技术方案，所述步骤(2)中pH用碱液(例如NaOH、KOH)进行调节至10-11，低于此pH范围时，难以形成碱絮凝沉淀，而高于此范围时，一方面会对细胞造成损失，另一方面也增加了用碱的成本，因此，优选pH范围为10-11。最优的pH范围随藻种不同而不同，例如，盐生杜氏藻的更优选pH为10.5。

根据上文技术方案，所述步骤(2)中加入的Ca²⁺的浓度为4-16mmol/L，低于此浓度范围，不能有效形成絮凝，而高于此范围，会造成浪费，也可能会由于沉降物过于蓬松而降低分离效果。更优Ca²⁺的浓度范围随藻种不同而不同，例如，盐生杜氏藻的更优Ca²⁺的浓度范围6-10mmol/L，最优为7mmol/L。

根据上文技术方案，所述步骤(2)中加入的Fe³⁺的浓度为80μmol/L以上，优选为160μmol/L以上，更优选为160μmol/L，低于此浓度范围，不能有效形成絮凝。

值得注意的是，不同絮凝离子之间具有协同作用，可以是Ca²⁺和Fe³⁺组合使用，例如，所述步骤(2)中加入的Ca²⁺的浓度为7mmol/L、Fe³⁺的浓度为160μmol/L时，其絮凝效果要优于单独添加。

根据上文技术方案，所述步骤(2)中沉降时间为0-36h，优选为12-36h，更优选为24h。

除了碳之外，氮、磷和微量元素在培养过程中也会损失一部分，而在絮凝沉降过程中，Ca²⁺、Mg²⁺、Fe³⁺等会损失一部分，因此，要进行循环培养，需要将这些营养元素和离子补充至其在初始培养基中的浓度。以盐生杜氏藻(Dunaliella salina)为例，其初始培养基的配方如下：

其中，A5微量元素成分如下为：

而盐生杜氏藻的初始培养基配方的优选为：

根据上文技术方案，在步骤(3)中补充完CO₂之后，需在上表培养基成分中添加除了氯化钠和碳酸氢盐之外的成分，补充至其在初始培养基中浓度，这包括：KNO₃，0.003-0.005mol/L；KH₂PO₄·3H₂O，0.0002-0.00035mol/L；MgCl₂·6H₂O，0.0006-0.0008mol/L；CaCl₂，0.0005-0.0008mol/L；FeCl₃·6H₂O，0.00002-0.00003mol/L；MgSO₄，0.0001-0.0003mol/L；Na₂EDTA，1.0-3.0×10^-3mol/L；A5微量元素，1mL/L。所述的其他成分的种类和添加量进一步优选为：KNO₃，0.005mol/L；KH₂PO₄·3H₂O，0.000237mol/L；MgCl₂·6H₂O，0.00072mol/L；CaCl₂，0.00057mol/L；FeCl₃·6H₂O，0.00002mol/L；MgSO₄，0.00015mol/L；Na₂EDTA，0.002mol/L；A5微量元素1mL/L。

一般来说，不经过处理的循环培养基中含有上次培养过程中细胞分泌出的胞外多糖、蛋白、小分子化合物等物质，这些物质会对细胞生长产生抑制，因此需要利用物理或化学的办法进行去除。本发明中公布的技术方案中，所述步骤(5)中物理或化学处理方法为滤膜，所述滤膜为水系滤膜，孔径为0.001-0.5μm，滤膜可以去除胞外分泌物，也可以去除细胞破碎泄漏出来的一些大分子和细胞碎片，经过此处理可以保证循环培养的顺利进行。

根据上文技术方案，所述步骤(5)中物理或化学处理方法为活性炭，所述活性炭为粉末活性炭或颗粒活性炭，浓度为0.5-5g/L。

根据上文技术方案，所述步骤(5)中物理或化学处理方法为氧化剂，所述氧化剂为次氯酸钠、臭氧、二氯异氰尿酸钠或过氧化氢，浓度为0.1-0.5mmol/L。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明综合考虑了微藻培养过程中碳供应成本高、收获成本高的问题，不仅利用碳酸氢盐供应二氧化碳，而且充分利用了其培养结束后pH上升的特点，只添加少量的钙、铁离子，就实现了微藻的沉降收获，这解决了传统絮凝过程絮凝剂成本昂贵的问题，大大降低了收获成本，而且不存在其它絮凝收获过程中存在的絮凝剂污染问题。

2、本发明解决了用过的培养液由于存在抑制物而难以循环利用的问题，利用物理或化学方法进行处理，有效去除了这些抑制物，实现了循环利用，大大降低了微藻培养基的成本。而且，解决了微藻培养废水和废物排放的问题。以此过程生产微藻，所投入的所有原料都转化成了微藻生物质，不存在废物排放。

3、本发明实现了培养过程和收获过程的有机结合，利用碱絮凝收获微藻后的上清液中絮凝离子浓度和营养物浓度均低于初始培养基中浓度的事实，在循环培养之前进行补充，添加其浓度至初始培养基中浓度，实现了收获和循环培养的完美匹配。

附图说明

图1本发明的循环培养微藻工艺流程；

图2实施例2循环培养盐生杜氏藻的干重(0.22μm滤膜过滤循环液)；

图3实施例3循环培养盐生杜氏藻的干重(活性炭处理循环液)；

图4实施例4循环培养盐生杜氏藻的干重(NaClO处理循环液)；

图5实施例5盐生杜氏藻在两种pH条件、不同Ca²⁺浓度的两种新鲜培养基中沉降24小时的沉降效率；

图6实施例5盐生杜氏藻在两种pH条件、不同Mg²⁺浓度的两种新鲜培养基中沉降24小时的沉降效率；

图7实施例5盐生杜氏藻在两种pH条件、不同Fe³⁺浓度的两种新鲜培养基中沉降24小时的沉降效率；

图8实施例5盐生杜氏藻在三种培养基中沉降24小时的沉降效率；

图9实施例6循环培养盐生杜氏藻的干重；

图10实施例6循环培养基碱絮凝收获效率。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明做进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

下述实施中所使用的测干重方法如下(三个重复)：

准确量取藻液40mL，10000rpm离心5分钟收集藻细胞，用0.5mol/L的碳酸氢铵水溶液清洗收集的藻细胞，重复两次。最后收集的藻细胞加入3—5mL上述的碳酸氢铵水溶液中，于105℃下烘干至重量恒定，用精密分析天平称量藻细胞干重，并计算微藻的干重。

实施例1循环培养系统

一种碱絮凝收获及循环培养微藻的方法，整个工艺流程如图1所示，该方法包括如下步骤：

(1)所述微藻培养系统为基于碳酸氢盐的碳捕获及微藻培养系统(BICCAPS)，利用含有一定浓度碳酸氢盐的培养基培养微藻，所培养微藻为盐生杜氏藻，培养基配方如表1、2所示，培养体系为1L锥形瓶，作为光生物反应器，培养体积为300mL，接种密度为0.1g/L，光照强度为4000Lux，温度为25℃，初始pH值为8.5，培养结束后pH值为10.3；微藻培养至可以采收(0.8g/L)时，将锥形瓶中50％体积的藻液取出；

(2)用NaOH调节藻液中pH至10.5，加入浓度为7mmol/L的Ca²⁺(CaCl₂)和浓度为160μmol/L的Fe³⁺(FeCl₃·6H₂O)，静置沉降24小时，絮凝沉降收获微藻，由于培养基加入的Ca²⁺、Fe³⁺与本身含有的Mg²⁺絮凝离子絮凝并结合微藻进行沉降，高效快速收获微藻生物质。

(3)向絮凝沉降后的上清液中补充CO₂至pH为8.5，使碳源得到充分补充。

(4)微藻培养过程中，也会消耗培养基中其他营养盐，向上清液中再添加其他营养盐(氯化钠和碳酸氢钠除外)至初始培养基浓度，具体添加量分别为：KNO₃，0.005mol/L；KH₂PO₄·3H₂O，0.000237mol/L；MgCl₂·6H₂O，0.00072mol/L；CaCl₂，0.00057mol/L；FeCl₃·6H₂O，0.00002mol/L；MgSO₄，0.00015mol/L；Na₂EDTA，0.002mol/L；A5微量元素1mL/L，制成循环培养基。

(5)将循环培养基经过水处理装置进行物理或化学方法处理，重新加入到锥形瓶中，重新接种按照上述步骤(1)的微藻培养条件继续培养微藻。其中水处理装置分别为用0.22μm滤膜、0.5g/L的活性炭、0.5mmol/L的NaClO三种方式处理水的装置。

(6)重复上述步骤(1)到(5)五次。

当微藻收获时需留取50％体积的生物质在反应器中，当做下一次培养的藻种。

一个培养周期的结束也是下一个培养周期的开始，整个生产过程实现了循环连续进行，培养与采收同时完成，构成一个循环生产过程。

表1盐生杜氏藻培养基

表2 A5微量元素成分

实施例2：滤膜处理循环液的循环培养系统

不进行处理的循环液不能再次用于培养微藻。本实施例采用实施例1半连续式微藻循环培养系统培养盐生杜氏藻，培养基配方如表1、表2所示，循环培养时间为18天，光照强度为3000Lux，初始接种量为0.1g/L，温度为25℃，初始pH值为8.5，培养结束后pH值为10.37。将循环培养基(实验组)与新鲜培养基(对照组)进行比较，即培养基进行循环时加入相同体积的新鲜培养基。接种后三天取出50％培养基进行循环，取出的循环培养基鼓入CO₂，将pH降至8.50，添加其他营养盐(氯化钠和碳酸氢钠除外)至初始培养基浓度，具体添加量分别为：KNO₃，0.005mol/L；KH₂PO₄·3H₂O，0.000237mol/L；MgCl₂·6H₂O，0.00072mol/L；CaCl₂，0.00057mol/L；FeCl₃·6H₂O，0.00002mol/L；MgSO₄，0.00015mol/L；Na₂EDTA，0.002mol/L；A5微量元素1mL/L。用0.22μm滤膜过滤，处理后的培养基重新作为循环培养基补充进系统。由图2可以看出，此微藻循环培养系统中没有抑制剂积累，藻体生长状况良好。在经过5次循环培养之后，微藻生物量浓度能达到0.47±0.05g/L，对照组为0.46±0.09g/L，这说明循环培养基与新鲜培养基之间的生物量浓度没有显著性差异。

实施例3：活性炭处理循环液的循环培养

本实施例采用实施例1半连续式微藻循环培养系统培养盐生杜氏藻，培养基配方如表1、表2所示，循环培养时间为18天，光照强度为3000Lux，初始接种量为0.1g/L，温度为25℃，初始pH值为8.5，培养结束后pH值为10.3。循环培养基在每次循环后，取50％体积的循环液，分别用0.5和5g/L的活性炭处理24h，再通过离心去除，之后循环液鼓入CO₂，将pH降至8.5，添加其他营养盐(氯化钠和碳酸氢钠除外)至初始培养基浓度，具体添加量分别为：KNO₃，0.005mol/L；KH₂PO₄·3H₂O，0.000237mol/L；MgCl₂·6H₂O，0.00072mol/L；CaCl₂，0.00057mol/L；FeCl₃·6H₂O，0.00002mol/L；MgSO₄，0.00015mol/L；Na₂EDTA，0.002mol/L；A5微量元素1mL/L。再把循环液加入到原藻液中。另外，为确定此方法本身对盐生杜氏藻的生长是否有影响，在每次循环置换50％体积的新鲜培养基前，分别用0.5和5g/L的活性炭处理24h，再通过离心去除。

如图3所示，用活性炭处理循环液，能完成3次循环培养。第四和五次循环中，循环组干重普遍降低，用0.5和5g/L活性炭处理循环液的循环培养基的干重显著低于新鲜培养基(P<0.05，*)，但显著高于未处理的循环培养基(P<0.05)，说明活性炭能够在一定程度上改善培养基环境，但仍有抑制物抑制盐生杜氏藻的生长。因此，可以认为用活性炭对循环液进行处理对盐生杜氏藻的生长有一定的改善作用，能完成3次循环培养。

实施例4：NaClO处理循环液的循环培养

本实施例采用实施例1半连续式微藻循环培养系统培养盐生杜氏藻，培养基配方如表1、表2所示，循环培养时间为18天，光照强度为3000Lux，初始接种量为0.1g/L，温度为25℃，初始pH值为8.5，培养结束后pH值为10.3。循环培养基在每次循环后，取50％体积的循环液，分别用0.5和5mmol/L的NaClO溶液对循环培养基处理24h，再加入对应浓度的Na₂S₂O₃溶液进行中和。之后循环液鼓入CO₂，将pH降至8.5，添加其他营养盐(氯化钠和碳酸氢钠除外)至初始培养基浓度，具体添加量分别为：KNO₃，0.005mol/L；KH₂PO₄·3H₂O，0.000237mol/L；MgCl₂·6H₂O，0.00072mol/L；CaCl₂，0.00057mol/L；FeCl₃·6H₂O，0.00002mol/L；MgSO₄，0.00015mol/L；Na₂EDTA，0.002mol/L；A5微量元素1mL/L。再把循环液加入到原藻液中。另外，为确定此种处理方法本身对盐生杜氏藻的生长是否有影响，在每次循环置换50％体积的新鲜培养基前，分别用0.5和5mmol/L的NaClO溶液处理24h，再加入对应浓度的Na₂S₂O₃溶液进行中和。

如图4所示，用0.5mmol/L NaClO溶液处理循环液的循环培养能完成3次，用0.5mmol/LNaClO溶液处理循环液的循环培养能完成2次。第四和五次循环时，循环培养基中盐藻的干重显著低于新鲜培养基(P<0.01，**)，用NaClO处理循环液的循环培养基中盐藻干重显著低于未处理的循环培养基(P<0.05，*)。这说明NaClO处理循环液影响了盐藻的生长，且浓度越高，抑制作用越大。因此，用NaClO处理的循环液能够循环的次数与NaClO的浓度有关。

实施例5：碱絮凝收获微藻生物质

选择对数生长期的盐生杜氏藻，细胞密度约为0.3g/L，用1.5mol/L的NaCl溶液对藻种进行多次洗涤，除去Ca²⁺、Mg²⁺、Fe³⁺，置于初始培养基中。在250mL锥形瓶中加入40mL藻液，用5mol/L的NaOH溶液调节pH到指定值(指定值分别为10.5、11.0)，然后将锥形瓶置于搅拌器上，以1000rpm转速搅拌藻液，将不同浓度的CaCl₂、MgCl₂·6H₂O、FeCl₃·6H₂O缓慢加入培养基，搅拌10分钟，再以250rpm的转速搅拌20分钟，静置沉降24小时。

实验1：

设置Ca²⁺浓度梯度为0、0.5、1、2、4、8和16mmol/L，探讨其对盐生杜氏藻絮凝沉降的影响。设置两组培养基，一组不加入任何絮凝离子，一组加入与人工海水培养基浓度相同的Mg²⁺(3mmol/L)和Fe³⁺(20μmol/L)，以此讨论实际工程培养的情况。如图5所示，盐藻的沉降效率随Ca²⁺浓度升高而升高，且加入Mg²⁺和Fe³⁺的培养基中的沉降效率高于无Mg²⁺和Fe³⁺的培养基，因加入浓度为16mmol/L的Ca²⁺会损害盐藻细胞活性，故选择最优Ca²⁺浓度为8mmol/L。

实验2：

设置Mg²⁺浓度梯度为0、1.5、3、6、12、24和48mmol/L，探讨其对盐生杜氏藻絮凝沉降的影响。设置两组培养基，一组不加入絮凝离子，一组加入选定的最优浓度Ca²⁺(8mmol/L)和与人工海水培养基浓度相同的Fe³⁺(20μmol/L)，以此讨论实际工程收获的情况。如图6所示，盐藻的沉降效率基本不受Mg²⁺浓度的影响，且加入Mg²⁺和Fe³⁺的培养基中的沉降效率高于无Ca²⁺和Fe³⁺的培养基。故选择培养基中Mg²⁺浓度(3mmol/L)为最优浓度。

实验3：

设置Fe³⁺浓度梯度为0、20、40、80、160、320和640μM/L，探讨其对盐生杜氏藻絮凝沉降的影响。设置两组培养基，一组不加入任何絮凝离子，一组加入选定的最优浓度Ca²⁺(8mmol/L)和Mg²⁺(3mmol/L)，以此讨论实际工程收获的情况。如图7所示，盐藻的沉降效率随Fe³⁺浓度升高而升高，且加入Ca²⁺和Mg²⁺的培养基中的沉降效率高于无Ca²⁺和Mg²⁺的培养基。在加入浓度为160μmol/L的Fe³⁺就可以得到很好的沉降效率，故选择最优Fe³⁺浓度为160μmol/L。最终得到最优絮凝条件：pH＝10.5，c(Ca²⁺)＝8mmol/L，c(Mg²⁺)＝3mmol/L，c(Fe³⁺)＝160μmol/L。Ca²⁺、Mg²⁺和Fe³⁺在培养基中的残余率分别为4.1％、64.3％和0，残留浓度低于初始培养基，因此可以重复利用培养基。

实验4：

检测盐生杜氏藻在不同培养基中的絮凝沉降效果。设置三组实验，一组为新鲜培养基，将盐藻离心重悬，置于新鲜培养基中，调节至最优絮凝条件进行沉降；一组为已用培养基，将藻液直接进行沉降；一组为最优絮凝条件的已用培养基，此阶段下藻液调节至最优絮凝条件进行沉降。如图8所示，盐藻在新鲜培养基中沉降效率为98.95±0.5％，用最优絮凝条件在已用培养基中沉降的效率为82.0±2.5％，直接在已用培养基中沉降的效率为65.08±1.28％。说明最优絮凝条件在已用培养基中也有很好的沉降效率，显著高于直接在已用培养基中沉降的效率。

实施例6：碱絮凝收获与循环培养匹配

本实施例采用实施例1半连续式微藻循环培养系统培养盐生杜氏藻，用0.22μm滤膜处理循环液的循环培养与碱絮凝沉降进行结合培养盐生杜氏藻。培养基配方如表1、表2所示，循环培养时间为18天，光照强度为3000Lux，初始接种量为0.1g/L，温度为25℃，初始pH值为8.5，培养结束后pH值为10.35。将循环培养基与新鲜培养基进行比较，即培养基进行循环时加入相同体积的新鲜培养基。接种后三天取出50％培养基进行循环，取出的循环培养基鼓入CO₂，将pH降至8.50，添加其他营养盐(氯化钠和碳酸氢钠除外)至初始培养基浓度，具体添加量分别为：KNO₃，0.005mol/L；KH₂PO₄·3H₂O，0.000237mol/L；MgCl₂·6H₂O，0.00072mol/L；CaCl₂，0.00057mol/L；FeCl₃·6H₂O，0.00002mol/L；MgSO₄，0.00015mol/L；Na₂EDTA，0.002mol/L；A5微量元素1mL/L。用0.22μm滤膜过滤，处理后的培养基重新作为循环培养基补充进系统。沉降前、沉降后及需补充的絮凝离子浓度如表3所示。

如图9所示，盐生杜氏藻能在循环培养基中正常生长，与新鲜培养基中盐藻的生物指标无显著性差异，说明碱絮凝收获后的培养基能够实现循环培养。如图10所示，盐生杜氏藻的24小时的收获效率维持在80％—82％，说明碱絮凝收获不会受到循环培养基的影响。这说明絮凝沉降与循环培养成功实现匹配。

表3盐生杜氏藻的循环培养中絮凝离子浓度

最后需要强调的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或同等替换，而不脱离技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (11)

1.一种碱絮凝收获及循环培养微藻的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)利用含有碳酸氢盐的初始培养基培养微藻，培养结束后，收获部分或全部藻液；

(2)调节步骤(1)收获的藻液中pH至10-12，并加入一定浓度的Ca²⁺和/或Fe³⁺进行絮凝沉降，收获微藻；

(3)向步骤(2)中絮凝沉降得到的上清液中补充CO₂至pH 8-9；

(4)向步骤(3)中得到的上清液中添加各种营养元素至其在初始培养基中的浓度，制成循环培养基；

(5)将步骤(4)中得到的循环培养基进行物理或化学方法处理，并循环使用培养微藻；

(6)重复上述步骤(1)到(5)。

2.根据权利要求1所述的方法，根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微藻为盐生杜氏藻。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述盐生杜氏藻初始培养基的配方为：

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中微藻培养结束时，pH为9.5-11.5。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中加入的Ca²⁺浓度为4-16mmol/L。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中加入的Fe³⁺浓度为80μmol/L以上。

7.根据权利要求1、5、6中任意一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中加入的Ca²⁺和Fe³⁺组合使用。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(5)中物理或化学方法为滤膜，所述滤膜的孔径为0.001-0.5μm。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(5)中物理或化学方法为活性炭，所述活性炭的浓度为0.5-5g/L。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(5)中物理或化学方法为氧化剂。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述氧化剂为次氯酸钠、臭氧、二氯异氰尿酸钠或过氧化氢，浓度为0.1-0.5mmol/L。