CN108849960B - 抗甘薯长喙壳菌复方精油制剂、其制备方法及其在防治甘薯黑斑病中的应用 - Google Patents

抗甘薯长喙壳菌复方精油制剂、其制备方法及其在防治甘薯黑斑病中的应用 Download PDF

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Abstract

抗甘薯长喙壳菌复方精油制剂，主要包括丁香酚、α‑姜烯含量、香茅醛、桉油醇，其制备方法为：将丁香、姜黄和桉树叶以一定质量比混合后进行蒸馏提取，萃取，得目标产物。上述复方精油制剂在防治甘薯黑斑病中的应用，具体包括，将所述复方精油制剂溶解后喷洒在仓储期甘薯上。本发明的抗甘薯长喙壳菌复方精油制剂，安全性好，制备方法简单。本发明的抗甘薯长喙壳菌复方精油制剂的制备方法，生产原料常见易得，生产成本低，无污染。本发明的抗甘薯长喙壳菌复方精油制剂在防治甘薯黑斑病中的应用，防治方法简便，防治效果好，可直接控制甘薯长缘壳菌生长和孢子产生，在甘薯表面停留时间适当，适合短期仓储和运输使用。

Description

抗甘薯长喙壳菌复方精油制剂、其制备方法及其在防治甘薯 黑斑病中的应用
技术领域
本发明涉及化学合成、生物防治与生物农药，尤其涉及抗甘薯长喙壳菌复方精油制剂、其制备方法及其在防治甘薯黑斑病中的应用。
背景技术
甘薯是重要的经济粮食作物，但在仓储和运输期间极易受到甘薯长喙壳菌(Ceratocystis fimbriata)的侵染造成薯块的腐烂、带毒而无法食用。选育具有显著抗黑斑病菌的甘薯品种存在周期长，困难大，因此主要还是采用化学、物理和生物的方法进行控制甘薯仓储和运输期间黑斑病的爆发。化学方法是常用的方法，主要采用多菌灵、百菌清等化学农药进行喷洒，但存在食品安全隐患，对环境也存在不友好。因此，对环境友好、低毒抗菌剂的开发以及植物保护新技术的研究得到了广泛的关注。
植物精油是重要的天然抗菌物质，具有绿色、无毒、效果好等特点。目前植物精油对粮食作物防治已经在仓储病害上得到了充分的证明。而抗甘薯长喙壳菌复方精油制剂在病害防治方面尚未有文献报道。以植物精油为主的生防制剂最具吸引力的是其对哺乳动物的无毒或微毒，且喷洒在作物表面并不会对作物本身和其营养成分造成影响。且在一定的环境下精油会自行挥发，不会造成物质的残留。同时，植物精油在淡水中极易分解，在土壤等环境中也是非持久性的。在氧气存在的条件下，分解半衰期一般为72小时以内，完全降解在120小时以内。越来越多的实验表明，粮食作用中精油制剂残留的担忧是可以消除的，同时精油对人体的健康也是有益的。
发明内容
为了克服化学农药在防治甘薯黑斑病中存在的环境污染、农药残留及威胁人畜健康等问题，本发明提供了一种抗甘薯长喙壳菌复方精油制剂，此构成本发明的第一个方面。本发明的抗甘薯长喙壳菌复方精油制剂主要包括丁香酚、α-姜烯含量、香茅醛、桉油醇。
优选的，所述丁香酚的质量份为34.23％，所述α-姜烯的质量份为28.74％，所述香茅醛的质量份为19.54％，所述桉油醇质量份为12.29％。
本发明还提供了上述抗甘薯长喙壳菌复方精油制剂的制备方法，此构成本发明的第二个方面。本发明的抗甘薯长喙壳菌复方精油制剂的制备方法具体包括：将丁香、姜黄和桉树叶混合后进行蒸馏提取，得目标产物。
优选的，所述丁香、姜黄和桉树叶的质量比为2:1:3。
优选的，所述蒸馏提取之后还包括：使用有机溶剂对蒸馏后的水溶液进行萃取。
优选的，所述有机溶剂为含有2％体积份乙醇的乙醚溶液。
本发明还提供了上述抗甘薯长喙壳菌复方精油制剂在防治甘薯黑斑病中的应用，此构成本发明的第三个方面。抗甘薯长喙壳菌复方精油制剂在防治甘薯黑斑病中的应用具体包括，将所述抗甘薯长喙壳菌复方精油制剂溶解后喷洒在仓储期甘薯上。
本发明还提供了上述抗甘薯长喙壳菌复方精油制剂在制备抗甘薯仓储期黑斑病生物农药中的应用，此构成本发明的第四个方面。
优选的，所述生物农药为抑制甘薯长缘壳菌菌丝生长和/或分生孢子的生物农药。
本发明的有益效果：本发明的抗甘薯长喙壳菌复方精油制剂，安全性好，制备方法简单；本发明的抗甘薯长喙壳菌复方精油制剂的制备方法，生产原料常见易得，来源广泛，价格低廉生产成本低，无污染；本发明的抗甘薯长喙壳菌复方精油制剂在防治甘薯黑斑病中的应用，防治方法简便，防治效果好，不仅可以直接控制甘薯长缘壳菌生长和孢子产生，而且在甘薯表面停留时间适当，适合短期仓储和运输使用。
附图说明
图1本发明实施例1中的抗甘薯长喙壳菌复方精油制剂提取装置结构示意图；
图2本发明实施例2中的抗甘薯长喙壳菌复方精油制剂GC-MS图谱；
图3本发明实施例4中不同浓度抗甘薯长喙壳菌复方精油制剂抑制鲜切薯片毒素产生实验结果；
图4本发明实施例5中不同浓度抗甘薯长喙壳菌复方精油制剂抑制整薯毒素产生实验结果；
图5本发明实施例6中不同时间甘薯整薯块表面抗甘薯长喙壳菌复方精油制剂残留相对百分比；
具体实施方式：
实施例1：抗甘薯长喙壳菌复方精油制剂的制备
取干燥的丁香根、姜黄以及干燥的桉树叶叶片，按质量比2:1:3分别称取对应的材料。放入图1所示的精油提取装置中，水蒸气蒸馏，冷却收集馏分备用。将分析纯乙醇加入乙醚溶液中，乙醇终浓度为2％(体积比)。使用配制好得乙醚溶液萃取馏分，置于减压蒸馏装置中，在真空环境下，水浴30℃加热回收乙醚。将装置改成精馏装置，减压40℃精制，得抗甘薯长喙壳菌复方精油制剂。
实施例2：抗甘薯长喙壳菌复方精油制剂的成分鉴定
使用丙酮溶解抗甘薯长喙壳菌复方精油制剂，利用GC-MS(气相-质谱联动)仪器分析抗甘薯长喙壳菌复方精油制剂中的成分，仪器参数如下：
气相条件：进样口100℃，不分流进样，载气为高纯氦气，流速为1.0mL/min，隔垫吹扫5mL/min。采用程序升温模式，柱温箱起始温度为100℃，保持5min，以10℃/min速度升温至250℃，保持5min，再以2℃/min速度升温至280℃，保持15min结束。质谱条件：传输线温度280℃，离子源为EI离子源，温度为280℃，扫描范围35～650m/z。
GC-MS分析结果如附图2所示，结果列表1所示。
表1抗甘薯长喙壳菌复方精油制剂中活性成分及含量*
Figure BDA0001739067150000031
*根据相关文献查阅确定的活性成分
实施例3：抗甘薯长喙壳菌复方精油制剂对甘薯长缘壳菌菌丝生长和产孢子影响
配制PDA培养基，步骤如下：去皮土豆200g，葡萄糖25g，琼脂20g，蒸馏水1000mL,pH6.9,溶解后，115℃下灭菌30min，冷却到40℃时，按比例稀释加入抗甘薯长喙壳菌复方精油制剂，充分混匀得到精油终浓度为0.10、0.20和0.50mg/mL的培养基，倒入一次性培养皿中待用。使用打孔器(1cm)在培养约11天的甘薯长喙壳菌菌落边缘打孔获取菌饼，菌丝朝下接入上述不同浓度精油制剂的培养基中，置于25℃培养箱中进行离体培养实验，每个处理设3个重复。未加入抗甘薯长喙壳菌复方精油制剂的PDA平板和加入等量的橄榄油的PDA作为对照。培养10天后，用十字交叉法测定生长菌落直径。按照下列公式计算抑制率：
抑制率＝[(对照菌落直径-实验组菌落直径)/对照菌落直径]×100％
用相同体积的无菌水冲洗平板，使用血球计数法对产孢量进行计算。
结果如表2所示，抗甘薯长喙壳菌复方精油制剂对甘薯长缘壳菌菌丝具有明显的抑制生长作用。培养10天后，无菌水对照组和橄榄油对照组甘薯长缘壳菌菌落直径分别为48.22和53.09mm，抗甘薯长喙壳菌复方精油制剂处理组0.10、0.20和0.50g/mL浓度下菌落直径分别为35.25、15.25和6.84mm，结果表明抗甘薯长喙壳菌复方精油制剂对甘薯长缘壳菌抑制生长具有浓度依赖性，当浓度升高时对长缘壳菌的生长抑制能力越强。计算抑制率，分别对应为26.89％、68.37％和85.81％。通过血球计数法计算产孢量，结果为：无菌水对照组和橄榄油对照组长缘壳菌产孢量为8.45×106和9.02×106个/mL，抗甘薯长喙壳菌复方精油制剂处理组分别为6.93×105、3.76×105和6.33×104个/mL，随着抗甘薯长喙壳菌复方精油制剂浓度增加，长缘壳菌的产孢量逐渐降低。由结果可知，一定范围内，抗甘薯长喙壳菌复方精油制剂浓度越高其抑菌作用越强，对孢子的产生也具有明显的抑制作用。
表2不同浓度精油复方制剂对甘薯长缘壳菌菌丝生长和产孢量的影响
Figure BDA0001739067150000041
*同列中小写字母不同表示在p＜0.05水平上差异显著
实施例4：抗甘薯长喙壳菌复方精油制剂对鲜切甘薯片上黑斑病的防治
按照上述方法使用无水乙醇配制0.10、0.20和0.50g/mL抗甘薯长喙壳菌复方精油制剂，pH调整到6.8左右，设无菌水和无水乙醇对照组。
配制孢子悬浮液。在洁净操作台中取5mL的无菌水加入生长有甘薯长缘壳菌的培养皿中，用涂布棒将孢子洗下。经适当稀释后获得1.0×106个/mL的甘薯长缘壳菌孢子悬浮液，用50mL灭菌过的离心管盛放孢子悬浮液。
用无菌镊子夹取无菌滤纸，放置在无菌的一次性培养皿中，用移液枪移取1mL无菌水，浸湿滤纸待用。挑选表面无损伤和病害的甘薯，去皮切成若干4×4×0.5cm3的鲜切甘薯片。用无菌镊子夹取鲜切薯片放于有浸湿滤纸的培养皿终，加盖置于25℃培养箱中培养。每隔24h统计一次发病率，并选取样品使用甲醇提取，进液相-三重四级杆质谱测定毒素甘薯酮的含量，条件如下包括：液相条件：甲醇:水＝35:65，柱温35℃，色谱柱为C18反相柱(250mm×4.6mm，5μm)；质谱条件：ESI离子源，温度500℃，电压4500V，正离子模式，监控碎片质量236.2m/z。
结果如表3和图3所示，抗甘薯长喙壳菌复方精油制剂处理明显降低了鲜切甘薯片上黑斑病的发生。如表3所示，抗甘薯长喙壳菌复方精油制剂可以有效延迟鲜切薯片上长缘壳菌的生长，控制黑斑病的发生，并降低毒素的产生。0.10g/mL抗甘薯长喙壳菌复方精油制剂处理后，鲜切甘薯片在48h内不发病，毒素在96h内未检测到。0.20g/mL抗甘薯长喙壳菌复方精油制剂处理后，鲜切甘薯片在96h内不发病，毒素在120h内未检测到。0.50g/mL抗甘薯长喙壳菌复方精油制剂处理后，鲜切甘薯片在144h不发病，毒素并未检测到，明显低于对照组82.42％的发病。通过本实验表明本抗甘薯长喙壳菌复方精油制剂可以减轻甘薯的黑斑病发病情况。
表3不同浓度抗甘薯长喙壳菌复方精油制剂对鲜切甘薯薯片病情指数的影响
Figure BDA0001739067150000051
*同列中小写字母不同表示在p＜0.05水平上差异显著
实施例5：抗甘薯长喙壳菌复方精油制剂对甘薯整薯黑斑病的防治
选取若干健康甘薯，洗净，用无菌水冲洗，恒温烘箱内25℃烘干(约3h)。用无菌接种针在甘薯中间部位刺20个左右的伤口。将处理好的甘薯分别浸泡在0.10、0.20和0.50g/mL抗甘薯长喙壳菌复方精油制剂中10min，晾干。制备长缘壳菌孢子悬浮液(1×106个/mL)。将晾干后的甘薯浸泡在长缘壳菌孢子悬浮液中1min，恒温烘箱内25℃烘干，放入无菌保鲜盒中，25℃恒温保存20天。设置对照组和无水乙醇处理组。从第10天开始，每隔5天统计病情指数和测定毒素含量。
结果如表4和图4所示。20天后，对照组和无水乙醇发病甘薯率为67.40％和62.68％。0.10和0.20g/mL处理组发病率分别为14.81％和8.09，0.50g/mL处理组发病率为4.58％，远低于对照组和无水乙醇处理组的发病率。0.10g/mL和0.20g/mL处理组在15天内并未检测有毒素产生，0.50g/mL处理组在实验期内并未检测到毒素。
表4不同浓度抗甘薯长喙壳菌复方精油制剂对整薯黑斑病防治
Figure BDA0001739067150000061
*同列中小写字母不同表示在p＜0.05水平上差异显著
实施例6：抗甘薯长喙壳菌复方精油制剂在整薯上停留时间
选取若干健康甘薯，洗净，用无菌水冲洗，恒温烘箱内25℃烘干(约3h)。放入无水乙醇配制的精油制剂中(0.5g/mL)10min，15℃晾干(1小时)。模拟仓储温度(15℃)放置，每隔1天取样，使用丙酮低温浸泡提取，提取物低温真空浓缩，进GC-MS分析，采用离子筛选模式筛选表1中的物质，计算相对含量，结果如图5所示。从图5中可以看出，10天后甘薯表面精油成分含量开始降低，20天后甘薯表面不含有精油成分，对比整薯实验，结果表明抗甘薯长喙壳菌复方精油制剂在甘薯表面停留时间适当。

Claims (6)

1.抗甘薯长喙壳菌复方精油制剂的制备方法，其特征在于，将丁香、姜黄和桉树叶混合后进行蒸馏提取，使用有机溶剂对蒸馏后的水溶液进行萃取，得目标产物；丁香、姜黄和桉树叶的质量比为2:1:3；所述有机溶剂为含有2％体积份乙醇的乙醚溶液。
2.由权利要求1所述方法制备的抗甘薯长喙壳菌复方精油制剂。
3.权利要求2中的抗甘薯长喙壳菌复方精油制剂在防治甘薯黑斑病中的应用。
4.根据权利要求3所述的抗甘薯长喙壳菌复方精油制剂在防治甘薯黑斑病中的应用，其特征在于，所述应用具体包括，将所述抗甘薯长喙壳菌复方精油制剂溶解后喷洒在仓储期甘薯上。
5.权利要求2中的抗甘薯长喙壳菌复方精油制剂在制备抗甘薯仓储期黑斑病生物农药中的应用。
6.根据权利要求5所述的抗甘薯长喙壳菌复方精油制剂在制备抗甘薯仓储期黑斑病生物农药中的应用，其特征在于，所述生物农药为抑制甘薯长缘壳菌菌丝生长和/或分生孢子的生物农药。
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