CN108828110A - 一种鸡脂肪中苯并咪唑类药物残留量的测定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明首次提供了采用高效液相色谱法同时测定鸡脂肪中九种苯并咪唑类药物残留标示物的残留量，填补了本领域的技术空白。样品的前处理技术具有独创性，解决了两大难题：一是首次同时测定九种苯并咪唑类药物的残留标示物；二是解决了抗氧化的问题。该方法定量科学准确，抗干扰能力强，能够满足我国相关监管部门的最新技术要求。本发明回归方程相关系数达到0.999以上，测定低限为50μg/kg，在不同添加浓度水平上的回收率为80％～110％，实验室内相对标准偏差≤15％。

Description

一种鸡脂肪中苯并咪唑类药物残留量的测定方法
技术领域
本发明属于食品中兽药残留的检测技术领域，具体涉及鸡脂肪中苯并咪唑类药物残留量的测定方法。
背景技术
我国最新出台的《食品安全国家标准动物性食品中兽药最大残留限量》(征求意见稿)中规定了苯并咪唑类药物，包括非班太尔、芬苯达唑、奥芬达唑、奥苯达唑、噻苯达唑、三氯苯达唑、阿苯达唑、氟苯达唑和甲苯达唑的残留标示物。与之前的农业部235号公告中的规定有很多不同，首先是药物的种类增加了，并且规范了名称，其次对残留标示物也作了很大的修改。非班太尔/芬苯达唑/奥芬达唑的残留标示物为芬苯达唑、奥芬达唑和奥芬达唑2-氨基砜的总和；奥苯达唑的残留标示物为奥苯达唑；噻苯达唑的残留标示物为噻苯达唑和5-羟基噻苯达唑；三氯苯达唑的残留标示物为三氯苯达唑酮；阿苯达唑的残留标示物为阿苯达唑-2-氨基砜；氟苯达唑的残留标示物为氟苯达唑；甲苯达唑的残留标示物为2-氨基-5-苯甲酰基苯并咪唑和5-羟基甲苯达唑。修改后的内容与食品法典委员会(CAC)和欧盟的苯并咪唑类药物最大残留限量要求基本一致。
脂肪中的残留检测一直困扰着残留检测工作者，不是提取非常困难，就是净化效果不佳，目前不管是已颁布的标准，还是发表的文献，几乎所有动物源食品中的残留检测基质都未包含脂肪。针对这九种苯并咪唑类药物的残留标示物在脂肪样品的检测过程，还存在一个比较棘手的问题，就是该类化合物不太稳定，前处理过程易发生降解，特别是5-羟基噻苯达唑，若不采取抗氧化等措施，前处理后的样品将完全检测不到5-羟基噻苯达唑，可能是由于脂肪样品中含有较多氧化能力较强的化合物。
发明内容
鉴于现有兽药检测的技术问题，本发明提出一种将快速准确测定鸡脂肪中苯并咪唑类药物残留量的测定方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下。
一种鸡脂肪中苯并咪唑类药物残留量的测定方法，具体步骤为：
试样经均质制备，然后采用乙腈+0.1mol/L盐酸溶液，体积比1:1提取，提取中加入10％没食子酸丙酯甲醇溶液作为抗氧化剂，所得提取液经MCX固相萃取小柱净化，所得净化液在38℃水浴下减压旋转蒸发至约500μL，加0.1mol/L盐酸溶液定容至1mL，涡旋2min，溶液以10 000r/min离心5min，然后采用高效液相色谱仪检测，外标法定量；所述净化方法为：取所述提取液5ml，加2.5mL 0.1mol/L盐酸溶液，混匀，加3mL正己烷，涡旋振荡2min，10000r/min离心5min，弃去上层正己烷，下层清液加10％没食子酸丙酯甲醇溶液0.1mL，混匀，转入经过预处理的MCX固相萃取柱中，以小于1mL/min的流速使样品溶液全部通过，弃去流出液，依次用3mL体积比为2:1的0.1mol/L盐酸溶液+甲醇、4mL 5％氨水溶液淋洗，淋洗液全部通过小柱，弃去淋洗液，最后用4mL 5％氨甲醇洗脱，洗脱液以0.5mL/min的流速全部通过小柱，并收集于具刻度的浓缩瓶中，即得；所述固相萃取小柱为：Oasis MCX，60mg，3cc；所述预处理方法为；使用前依次用3mL甲醇和3mL水活化。
进一步地，所述提取方法为：称取2g所述试样，于50mL离心管中，加入5mL正己烷，涡旋振荡5min，充分溶解脂肪，加入10mL体积比为1:1的0.1mol/L盐酸溶液+乙腈，再加10％没食子酸丙酯甲醇溶液0.1mL，涡旋2min，置超声波水浴中超声5min，涡旋振荡15min，4000r/min离心5min，取下层清液5mL于15mL离心管中，待净化。
进一步地，所述苯并咪唑类药物包括：非班太尔、芬苯达唑、奥芬达唑、奥苯达唑、噻苯达唑、三氯苯达唑、阿苯达唑、氟苯达唑和甲苯达唑。
所述苯并咪唑类药物的残留标示物包括：奥芬达唑、芬苯达唑、奥芬达唑-2-氨基砜、阿苯达唑-2-氨基砜、噻苯达唑、5-羟基噻苯达唑、2-氨基-5-苯甲酰基苯并咪唑、5-羟基甲苯达唑、氟苯达唑、奥苯达唑和三氯苯达唑酮。
进一步地，所述外标法的标准储备溶液的配制方法为：准确称取按其纯度折算为100％质量的奥芬达唑、芬苯达唑、奥芬达唑-2-氨基砜、阿苯达唑-2-氨基砜、噻苯达唑、5-羟基噻苯达唑、2-氨基-5-苯甲酰基苯并咪唑、5-羟基甲苯达唑、氟苯达唑、奥苯达唑和三氯苯达唑酮标准品各20mg，分别先用5mLN,N-二甲基甲酰胺溶解，再用甲醇溶解并定容至200mL，配成标准储备溶液浓度为200mg/L；所述外标法的混合标准工作液的配制方法为：分别量取5mL所述标准储备溶液于100mL容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，配制成浓度为10mg/L的混合标准工作液。
进一步地，如权利要求5所述的测定方法，其特征在于，所述试样均质制备的方法为：取所述鸡脂肪空白或供试可食性组织，绞碎，并使均质；取均质后的供试样品，作为供试试样；取均质后的空白样品，作为空白试样；取均质后的空白样品，添加所述混合标准工作液，作为空白添加试样；所述试样在－18℃以下保存。
进一步地，所述外标法测定的标准曲线制备方法为：精密量取所述混合标准工作液适量，用甲醇-1％乙酸溶液，30:70，v/v，稀释，配制成浓度为0、0.025、0.05、0.1、0.2和0.5mg/L的系列标准溶液，供高效液相色谱测定；以测得色谱峰面积为纵坐标，对应的标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线，求回归方程和相关系数；所述的液相色谱条件为：色谱柱：Atlantis T3，4.6mm×250mm，粒径5μm；流动相：A：甲醇；B：1％乙酸溶液，洗脱梯度见表1，梯度均为线性变化；流速：1.0mL/min；检测波长：292nm；柱温：40℃；进样量：40μL。
进一步地，所述测定方法为：取所述试样溶液和相应的所述混合标准工作液，作单点或标准曲线校准，按外标法，以峰面积计算；所述标准溶液及试样溶液中所述苯并咪唑类药物的残留标示物的响应值均应在仪器检测的线性范围之内。
进一步地，所述测定的结果计算和表述方法为：试样中所述苯并咪唑类药物的残留标示物的残留量按式(1)计算：
式中：
X————供试试样中待测物的残留量，单位为微克每千克(μg/kg)；
A————试样溶液中待测物的峰面积；
cs————标准溶液中待测物的浓度，单位为微克每升(μg/L)；
V————试样溶液的定容体积，单位为毫升(mL)；
As————标准溶液中待测物的峰面积；
m----试样溶液所代表的试样质量，单位为克(g)。
进一步地，所述测定方法的灵敏度确认方法为：定量限的确定，是根据信噪比S/N的值来确定的。在空白鸡脂肪中分别添加50μg/kg的所述苯并咪唑类药物残留标示物混合标准工作液，测定其信号与噪声的比值，当S/N≥10时且回收率和相对标准偏差均符合残留检测方法要求时的浓度为定量限；实验结果：本方法的定量限为50μg/kg；所述测定方法的准确度确认方法为：准确称取2.0g所述空白试样于50mL离心管中，加入己知浓度的所述系列标准工作液，制成含有所述苯并咪唑类药物残留标示物浓度分别为50、100、200μg/kg的组织样品，每个浓度做6个平行，按样品前处理过程处理后测定，计算加标回收率；实验结果：本方法在50μg/kg～200μg/kg添加浓度水平上的回收率为80％～110％；所述测定方法的精密度确认方法为：准确称取2.0g所述空白试样于50mL离心管中，加入己知浓度的系列标准工作液，制成含有所述苯并咪唑类药物残留标示物浓度分别为50、100、200μg/kg的组织样品，每个浓度做6个平行，按样品前处理过程处理后测定，计算室内相对标准偏差；实验结果：本方法的实验室内相对标准偏差≤15％。
本发明具有如下有益效果：
本发明首次提供了采用高效液相色谱法同时测定鸡脂肪中九种苯并咪唑类药物残留标示物的残留量，填补了本领域的技术空白。样品的前处理技术具有独创性，解决了两大难题：一是首次同时测定九种苯并咪唑类药物的残留标示物；二是解决了抗氧化的问题。创造性地采用一根固相萃取小柱上将两类不同性质的化合物应用两种不同的保留机理，达到了理想的净化效果。对于化合物三氯苯达唑酮而言，固相萃取小柱填料中的N-乙烯基吡咯烷酮-二乙烯苯共聚物起到了反相吸附剂的作用；对于其余十种化合物而言，固相萃取小柱填料中的N-乙烯基吡咯烷酮-二乙烯苯共聚物基质-SO3H主要起到了离子交换作用。虽然与国标GB/T 21324-2007《食用动物肌肉和肝脏中苯并咪唑类药物残留量检测方法》用的是相同的固相萃取小柱，但过柱的每个步骤均不相同，如果照搬国标的过柱方法，其中一个待测化合物三氯苯达唑酮在淋洗过程便已从小柱上洗脱下来，回收率为零，无法满足同时检测这十一种残留标志物的要求。本发明采用的抗氧化剂没食子酸丙酯(PG)与国标GB/T21324-2007《食用动物肌肉和肝脏中苯并咪唑类药物残留量检测方法》中采用的二丁基羟基甲苯(BHT)相比，对易氧化的5-羟基噻苯达唑具有更强的保护作用，水溶性好，而BHT容易析出，易引起液相色谱系统堵塞，另外BHT不能保护三氯苯达唑酮，甚至有轻微降解作用，导致三氯苯达唑酮回收率达不到要求，而PG则有明显的保护作用，可将三氯苯达唑酮的回收率提高15％-20％。该方法定量科学准确，抗干扰能力强，能够满足我国相关监管部门的最新技术要求。本发明回归方程相关系数达到0.999以上，测定低限为50μg/kg，在不同添加浓度水平上的回收率为80％～110％，实验室内相对标准偏差≤15％。
附图说明
图1标准溶液色谱图(100μg/L)
图2鸡脂肪空白试样的高效液相色谱图
图3鸡脂肪空白添加试样的高效液相色谱图(100μg/L)
具体实施方式
为了更清楚说明本发明的技术方案，下面将结合具体实施例和附图对本发明进行详细的说明，其中提到的附图仅仅适用下述实施例，对于本领域普通技术员，还可以根据本发明中提到的方法获得其他附图。但是本发明的保护范围并不限于下述实施例。
实施例1：建立方法
1.试剂和材料
以下所用的试剂，除特别注明外均为分析纯试剂；水为符合GB/T 6682规定的一级水。
标准品：奥芬达唑(Oxfendazole，CAS号：53716-50-0)、芬苯达唑(Fenbendazole，CAS号：43210-67-9)、奥芬达唑-2-氨基砜(Oxfendazole sulphone，CAS号：54029-20-8)、阿苯达唑-2-氨基砜(Albendazole-2-aminosulfone，CAS号：80983-34-2)、噻苯达唑(Thiabendazole，CAS号：148-79-8)、5-羟基噻苯达唑(5-hydroxythiabendazole，CAS号：948-71-0)、2-氨基-5-苯甲酰基苯并咪唑(Mebendazole-amine，CAS号：52329-60-9)、5-羟基甲苯达唑(5-Hydroxymebendazole，CAS号：60254-95-7)、氟苯达唑(Flubendazole，CAS号31430-15-6)、奥苯达唑(Oxibendazole，CAS号：20559-55-1)和三氯苯达唑酮(Ketotriclabendazole，CAS号：1201920-88-8)，含量均在97％以上。
乙腈：色谱纯；甲醇：色谱纯；乙酸：色谱纯；盐酸；25％氨水。
没食子酸丙酯：(Propyl gallate Gallussaure-propylester，CAS号：121-79-9)，以下简称为PG。
0.1mol/L盐酸溶液：量取浓盐酸8.3mL，加水稀释至1 000mL。
0.1mol/L盐酸溶液+乙腈(1+1，，v/v)：分别量取100mL 0.1mol/L盐酸溶液和100mL乙腈，混匀。
10％PG甲醇溶液：称取1g PG，加10mL甲醇溶解，临用前配制。
0.1mol/L盐酸溶液+甲醇(2+1，，v/v)：分别量取200mL 0.1mol/L盐酸溶液和100mL甲醇，混匀。
5％氨水溶液：量取5mL 25％氨水，用水稀释至100mL，临用前配制。
5％氨甲醇溶液：量取5mL 25％氨水，用甲醇稀释至100mL，临用前配制。
1％乙酸溶液：量取10mL乙酸，用水稀释至1000mL，临用前配制。
固相萃取柱：Oasis MCX，60mg，3mL。使用前依次用3mL甲醇和3mL水活化。
标准储备溶液的配制：准确称取按其纯度折算为100％质量的奥芬达唑、芬苯达唑、奥芬达唑-2-氨基砜、阿苯达唑-2-氨基砜、噻苯达唑、5-羟基噻苯达唑、2-氨基-5-苯甲酰基苯并咪唑、5-羟基甲苯达唑、氟苯达唑、奥苯达唑和三氯苯达唑酮标准品各20mg，分别先用5mLN,N-二甲基甲酰胺溶解，在甲醇溶解并定容至200mL，配成标准储备溶液浓度为200mg/L。
混合标准工作液的配制：分别量取5mL标准储备溶液于100mL容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，配制成浓度为10mg/L混合标准工作液。
2.设备和仪器
高效液相色谱仪：LC-20AD，配自动进样器、柱温箱、紫外检测器和二极管阵列检测器，岛津公司。
分析天平：感量0.000 01g，Sartorius公司。
天平：感量0.01g，Sartorius公司。
肉类组织捣碎机：GM 200型，Retsch公司。
旋涡振荡器：MS 3basic，IKA公司。
超声波水浴：SW 30H，SONO SWISS公司。
离心机：3-30K，SIGMA公司。
减压旋转蒸发仪：IKA公司。
3.试样的制备与保存
3.1试样的制备
取鸡脂肪空白或供试可食性组织，绞碎，并使均质。
————取均质后的供试样品，作为供试试样。
————取均质后的空白样品，作为空白试样。
————取均质后的空白样品，添加适宜浓度的标准工作液，作为空白添加试样。
3.2试样的保存
－18℃以下保存。
4测定步骤
4.1提取
称取2g试样(准确至0.01g)，于50mL离心管中，加入5mL正己烷，涡旋振荡5min，充分溶解脂肪，加入10mL 0.1mol/L盐酸溶液+乙腈(1+1，v/v)溶液，加10％PG甲醇溶液0.1mL，涡旋2min，置超声波水浴中超声5min，涡旋振荡15min，4 000r/min离心5min，取下层清液5mL于15mL离心管中，待净化。
4.2净化
上述待净化液，加2.5mL 0.1mol/L盐酸溶液，混匀，加3mL正己烷，涡旋振荡2min，10 000r/min离心5min，弃去上层正己烷，下层清液加10％PG甲醇溶液0.1mL，混匀，转入经过预处理的MCX固相萃取柱中，以小于1mL/min的流速使样品溶液全部通过，弃去流出液。依次用3mL 0.1mol/L盐酸溶液+甲醇(2+1，v/v)、4mL 5％氨水溶液淋洗，淋洗液全部通过小柱，弃去淋洗液。最后用4mL 5％氨甲醇洗脱，洗脱液以0.5mL/min的流速全部通过小柱，并收集于具刻度的浓缩瓶，38℃水浴下减压旋转蒸发至约500μL，加0.1mol/L盐酸溶液定容至1mL，涡旋2min，溶液以10 000r/min离心5min，供测定。
4.3标准曲线的制备
精密量取混合标准工作液适量，用甲醇-1％乙酸溶液(30+70，v/v)稀释，配制成浓度为0、0.025、0.05、0.1、0.2和0.5mg/L的系列标准溶液，供高效液相色谱测定。以测得色谱峰面积为纵坐标，对应的标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线，求回归方程和相关系数。
4.4测定
4.4.1液相色谱条件
色谱柱：Atlantis T3(4.6mm×250mm，粒径5μm)。
流动相：A：甲醇；B：1％乙酸溶液，洗脱梯度见表1，梯度均为线性变化。
表1梯度洗脱程序
流速：1.0mL/min；检测波长：292nm；柱温：40℃；进样量：40μL。
4.4.2测定法
取试样溶液和相应的标准溶液，作单点或标准曲线校准，按外标法，以峰面积计算。标准溶液及试样溶液中苯并咪唑类药物残留标示物的响应值均应在仪器检测的线性范围之内。在上述色谱条件下，标准溶液、空白试样和添加试样的高效液相色谱图见附图。
4.5空白试验
除不加试样外，采用完全相同的步骤进行平行操作。
4.6结果计算和表述
试样中苯并咪唑类药物残留标示物的残留量按式(1)计算：
式中：
X————供试试样中待测物的残留量，单位为微克每千克(μg/kg)；
A————试样溶液中待测物的峰面积；
cs————标准溶液中待测物的浓度，单位为微克每升(μg/L)；
V————试样溶液的定容体积，单位为毫升(mL)；
As————标准溶液中待测物的峰面积；
m————试样溶液所代表的试样质量，单位为克(g)。
4.7方法灵敏度、准确度和精密度
4.7.1灵敏度
定量限的确定，是根据信噪比(S/N)的值来确定的。在空白鸡脂肪中分别添加50μg/kg的苯并咪唑类药物残留标示物标准溶液，测定其信号与噪声的比值，当S/N≥10时且回收率和相对标准偏差均符合残留检测方法要求时的浓度为定量限。
实验结果：本方法的定量限为50μg/kg。
4.7.2准确度
准确称取2.0g空白试样于50mL离心管中，加入己知浓度的系列标准工作液，制成含苯并咪唑类药物残留标示物浓度分别为50、100、200μg/kg的组织样品，每个浓度做6个平行，按样品前处理过程处理后测定，计算加标回收率。
实验结果：本方法在50μg/kg～200μg/kg添加浓度水平上的回收率为80％～110％。
4.7.3精密度
准确称取2.0g空白试样于50mL离心管中，加入己知浓度的系列标准工作液，制成含苯并咪唑类药物残留标示物浓度分别为50、100、200μg/kg的组织样品，每个浓度做6个平行，按样品前处理过程处理后测定，计算室内相对标准偏差。
实验结果：本方法的实验室内相对标准偏差≤15％。
5实例
本方法用于日常检测，已检测鸡脂肪样品共25个，尚未有检出的样品。
实施例2：净化条件的选择
本方法采用MCX固相萃取小柱，对于三氯苯达唑酮而言，填料中的N-乙烯基吡咯烷酮-二乙烯苯共聚物起到了反相吸附剂的作用；对于其余十种化合物而言，填料中的N-乙烯基吡咯烷酮-二乙烯苯共聚物基质-SO3H主要起到了离子交换作用。将两者结合在一起，对于上样溶液，淋洗溶液以及洗脱溶液都会有更多的条件限制，溶液的酸碱性和溶液中有机溶剂所占的百分比，两者均要兼顾。按照GB/T 21324-2007《食用动物肌肉和肝脏中苯并咪唑类药物残留量检测方法》中所用过柱条件处理加标样品，三氯苯达唑酮会在用甲醇淋洗那一步洗脱下来，最终的洗脱液中几乎不含三氯苯达唑酮。本方法的上柱溶液中乙腈与0.1mol/L盐酸溶液的比例为1:2，若比例为1:1，三氯苯达唑酮会损失大半，不被小柱保留；淋洗溶液0.1mol/L盐酸溶液+甲醇中甲醇的比例不宜超过50％，另一淋洗溶液5％氨水溶液能去除奥芬达唑-2-氨基砜和5-羟基噻苯达唑两个峰之间的杂质，采用0.1mol/L盐酸溶液则不能去除该杂质；洗脱液用5％氨甲醇比GB/T 21324-2007所采用的10％氨乙腈更为合适，若用氨乙腈洗脱，其中氨的比例对2-氨基-5-苯甲酰基苯并咪唑的洗脱能力影响很大，5％氨乙腈只能洗脱下来50％左右，10％氨乙腈易挥发，氨的减少会直接影响2-氨基-5-苯甲酰基苯并咪唑的回收率，导致方法的重现性不好，我们选择的氨甲醇则比较稳定，而且氨甲醇浓缩也更为容易。
实施例3：抗氧化剂的选择
脂肪中含有某些氧化能力很强的化合物，对待测化合物5-羟基噻苯达唑有明显的降解破坏作用，前处理过程如果不加抗氧化剂，加标样品中5-羟基噻苯达唑的色谱峰将完全消失。我们比较了GB/T 21324-2007《食用动物肌肉和肝脏中苯并咪唑类药物残留量检测方法》中采用的二丁基羟基甲苯(BHT)以及其他三种抗氧化剂，丁基羟基茴香醚(BHA)、特丁基对苯二酚(TBHQ)和没食子酸丙酯(PG)。BHA和TBHQ抗氧化效果不佳，而且在本方法色谱条件下对待测化合物存在干扰，不可采用；BHT虽然不存在干扰待测化合物的物质，但抗氧化效果不佳，且水溶性差，洗脱液在旋转蒸发时，BHT容易析出，由于滤膜会吸附三氯苯达唑酮等化合物，最终定容液不可过滤，BHT的加入易造成上机样液浑浊，从而导致液相色谱系统堵塞，另外BHT对三氯苯达唑酮有轻微降解作用，致使其回收率在70％以下，显然BHT也不是合适的抗氧化剂；PG的抗氧化效果良好，虽然也存在一些干扰物，但都能与待测化合物的色谱峰基本分离，不影响测定，PG的水溶性较好，上机溶液澄清，若只在提取步骤或过柱前加一次PG抗氧化，5-羟基噻苯达唑还是会有部分氧化，回收率达不到80％，提取和过柱前两次加入才能确保5-羟基噻苯达唑不被氧化，另外PG对三氯苯达唑酮也有保护作用，可将其回收率提高15％-20％，最终选择PG作为抗氧化剂。

Claims (10)

1.一种鸡脂肪中苯并咪唑类药物残留量的测定方法，其特征在于，具体步骤为：试样经均质制备，然后采用乙腈+0.1mol/L盐酸溶液，体积比1:1提取，提取中加入10％没食子酸丙酯甲醇溶液作为抗氧化剂，所得提取液经MCX固相萃取小柱净化，所得净化液在38℃水浴下减压旋转蒸发至约500μL，加0.1mol/L盐酸溶液定容至1mL，涡旋2min，溶液以10 000r/min离心5min，然后采用高效液相色谱仪检测，外标法定量；所述净化方法为：取所述提取液5ml，加2.5mL 0.1mol/L盐酸溶液，混匀，加3mL正己烷，涡旋振荡2min，10000r/min离心5min，弃去上层正己烷，下层清液加10％没食子酸丙酯甲醇溶液0.1mL，混匀，转入经过预处理的MCX固相萃取柱中，以小于1mL/min的流速使样品溶液全部通过，弃去流出液，依次用3mL体积比为2:1的0.1mol/L盐酸溶液+甲醇、4mL 5％氨水溶液淋洗，淋洗液全部通过小柱，弃去淋洗液，最后用4mL 5％氨甲醇洗脱，洗脱液以0.5mL/min的流速全部通过小柱，并收集于具刻度的浓缩瓶中，即得；所述固相萃取小柱为：Oasis MCX，60mg，3cc；所述预处理方法为；使用前依次用3mL甲醇和3mL水活化。
2.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述提取方法为：称取2g所述试样，于50mL离心管中，加入5mL正己烷，涡旋振荡5min，充分溶解脂肪，加入10mL体积比为1:1的0.1mol/L盐酸溶液+乙腈，再加10％没食子酸丙酯甲醇溶液0.1mL，涡旋2min，置超声波水浴中超声5min，涡旋振荡15min，4 000r/min离心5min，取下层清液5mL于15mL离心管中，待净化。
3.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述苯并咪唑类药物包括：非班太尔、芬苯达唑、奥芬达唑、奥苯达唑、噻苯达唑、三氯苯达唑、阿苯达唑、氟苯达唑和甲苯达唑。
4.如权利要求3所述的测定方法，其特征在于，所述苯并咪唑类药物的残留标示物包括：奥芬达唑、芬苯达唑、奥芬达唑-2-氨基砜、阿苯达唑-2-氨基砜、噻苯达唑、5-羟基噻苯达唑、2-氨基-5-苯甲酰基苯并咪唑、5-羟基甲苯达唑、氟苯达唑、奥苯达唑和三氯苯达唑酮。
5.如权利要求4所述的测定方法，其特征在于，所述外标法的标准储备溶液的配制方法为：准确称取按其纯度折算为100％质量的奥芬达唑、芬苯达唑、奥芬达唑-2-氨基砜、阿苯达唑-2-氨基砜、噻苯达唑、5-羟基噻苯达唑、2-氨基-5-苯甲酰基苯并咪唑、5-羟基甲苯达唑、氟苯达唑、奥苯达唑和三氯苯达唑酮标准品各20mg，分别先用5mLN,N-二甲基甲酰胺溶解，再用甲醇溶解并定容至200mL，配成标准储备溶液浓度为200mg/L；所述外标法的混合标准工作液的配制方法为：分别量取5mL所述标准储备溶液于100mL容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，配制成浓度为10mg/L的混合标准工作液。
6.如权利要求5所述的测定方法，其特征在于，所述试样均质制备的方法为：取所述鸡脂肪空白或供试可食性组织，绞碎，并使均质；取均质后的供试样品，作为供试试样；取均质后的空白样品，作为空白试样；取均质后的空白样品，添加所述混合标准工作液，作为空白添加试样；所述试样在－18℃以下保存。
7.如权利要求5所述的测定方法，其特征在于，所述外标法测定的标准曲线制备方法为：精密量取所述混合标准工作液适量，用甲醇-1％乙酸溶液，30:70，v/v，稀释，配制成浓度为0、0.025、0.05、0.1、0.2和0.5mg/L的系列标准溶液，供高效液相色谱测定；以测得色谱峰面积为纵坐标，对应的标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线，求回归方程和相关系数；所述的液相色谱条件为：色谱柱：Atlantis T3，4.6mm×250mm，粒径5μm；流动相：A：甲醇；B：1％乙酸溶液，洗脱梯度见表1，梯度均为线性变化；
表1梯度洗脱程序
流速：1.0mL/min；检测波长：292nm；柱温：40℃；进样量：40μL。
8.如权利要求7所述的测定方法，其特征在于，所述测定方法为：取所述试样溶液和相应的所述混合标准工作液，作单点或标准曲线校准，按外标法，以峰面积计算；所述混合标准工作液及试样溶液中所述苯并咪唑类药物的残留标示物的响应值均应在仪器检测的线性范围之内。
9.如权利要求8所述的测定方法，其特征在于，所述测定的结果计算和表述方法为：试样中所述苯并咪唑类药物的残留标示物的残留量按式(1)计算：
式中：
X————供试试样中待测物的残留量，单位为微克每千克(μg/kg)；
A————试样溶液中待测物的峰面积；
cs————标准溶液中待测物的浓度，单位为微克每升(μg/L)；
V————试样溶液的定容体积，单位为毫升(mL)；
As————标准溶液中待测物的峰面积；
m————试样溶液所代表的试样质量，单位为克(g)。
10.如权利要求9所述的测定方法，其特征在于，所述测定方法的灵敏度确认方法为：定量限的确定，是根据信噪比S/N的值来确定的。在空白鸡脂肪中分别添加50μg/kg的所述苯并咪唑类药物残留标示物混合标准工作液，测定其信号与噪声的比值，当S/N≥10时且回收率和相对标准偏差均符合残留检测方法要求时的浓度为定量限；实验结果：本方法的定量限为50μg/kg；所述测定方法的准确度确认方法为：准确称取2.0g所述空白试样于50mL离心管中，加入己知浓度的所述系列标准工作液，制成含有所述苯并咪唑类药物残留标示物浓度分别为50、100、200μg/kg的组织样品，每个浓度做6个平行，按样品前处理过程处理后测定，计算加标回收率；实验结果：本方法在50μg/kg～200μg/kg添加浓度水平上的回收率为80％～110％；所述测定方法的精密度确认方法为：准确称取2.0g所述空白试样于50mL离心管中，加入己知浓度的系列标准工作液，制成含有所述苯并咪唑类药物残留标示物浓度分别为50、100、200μg/kg的组织样品，每个浓度做6个平行，按样品前处理过程处理后测定，计算室内相对标准偏差；实验结果：本方法的实验室内相对标准偏差≤15％。
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