CN108785684B - 一种槲皮素修饰的纳米硫及其制备方法与在抗阿尔兹海默症药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于药物的制备技术领域，具体涉及一种槲皮素修饰的纳米硫及其制备方法与在抗阿尔兹海默症药物中的应用。该方法利用纳米硫的微小尺寸和高表面能效应，将槲皮素修饰在纳米硫上，既利用了槲皮素降低细胞内的内质网应激的作用，又增加了槲皮素的水溶性，由此得到兼具高度生物相容性和AD治疗效果的槲皮素修饰的纳米硫。采用一锅法将槲皮素修饰的纳米硫进一步嵌入α‑氰基丙烯酸丁酯形成的微泡外壳中，得到含有槲皮素修饰的纳米硫的药物制剂，其在超声作用下微泡可被破坏，产生声孔效应，使血脑屏障暂时打开，进而使槲皮素修饰的纳米硫能透过血脑屏障，进入脑部发挥治疗作用，因此具有高度脑靶向性。该药物制剂制备方法简单，产品便于保存和使用。

Description

一种槲皮素修饰的纳米硫及其制备方法与在抗阿尔兹海默症 药物中的应用
技术领域
本发明属于药物的制备技术领域，具体涉及一种槲皮素修饰的纳米硫及其制备方法与在抗阿尔兹海默症药物中的应用。
背景技术
阿尔兹海默病(AD)是一种常见的神经退行性疾病。由于其发病机制十分复杂，因此其治疗药物非常有限，治疗仍是难点。目前，公认的阿尔兹海默病的发病机制主要有两点。其一，淀粉样蛋白(Aβ)的异常聚集被认为与AD的发病密切相关。其二，内质网是一种重要的细胞器，负责对蛋白质的加工及折叠，如二硫键的形成以及蛋白质的糖基化。然而当细胞内外环境发生紊乱时，未折叠蛋白反应(UPR)或者错误折叠的蛋白会在内质网腔内蓄积，持续的UPR会进一步诱发内质网应激(ER strees)，促使神经元凋亡。大量的研究表明，持续激活的UPR或ER strees与AD的神经退变发生有关。
目前，未见针对抑制UPR或ER strees的抗AD药物。现有抗AD药物，如氯碘喹(CQ)及其一些衍生物，主要以抑制Aβ多肽聚集为靶点。该类药物可以有效地捕获Cu2+离子，从而抑制金属诱导的Aβ多肽聚集，在一定程度上提高了AD患者的认知能力。然而，该类药物大多不具有脑靶向性，不能特异性与脑实质细胞有效结合。这主要是因为血脑屏障(BBB)是神经性疾病中药物治疗的一大障碍。几乎所有的高分子量药物和超过98％的低分子量药物都不能穿过BBB。一般的AD治疗药物对血脑屏障(BBB)的渗透能力低，因此限制了其在患者脑部发挥作用，降低了药效。
发明内容
为克服现有技术的缺点和不足，本发明的首要目的在于提供一种槲皮素修饰的纳米硫的制备方法。
本发明的另一目的是提供由上述制备方法得到的槲皮素修饰的纳米硫。
本发明的再一目的是提供上述槲皮素修饰的纳米硫在抗阿尔兹海默症药物中的应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种槲皮素修饰的纳米硫的制备方法，包括以下步骤：将槲皮素水溶液与蛋氨酸水溶液混合，加入维生素C(Vc)水溶液，再加入硫代硫酸钠溶液，得到混合溶液，反应，离心得到沉淀，洗涤，得到所述的槲皮素修饰的纳米硫(Qc@SNPs)。
优选的，所述的槲皮素水溶液的浓度为3.2～5mM，更优选为4mM。
优选的，所述的蛋氨酸水溶液的浓度为50～180mM，更优选为100mM。
优选的，所述的维生素C水溶液的浓度为0.05～0.3M，更优选为0.1M。
优选的，所述的硫代硫酸钠溶液的浓度为6～15mM，更优选为10mM。
优选的，所述的混合溶液中，槲皮素与硫代硫酸钠的摩尔比为1:3.75～1:6，更优选为1:5。
优选的，所述的混合溶液中，维生素C与硫代硫酸钠的摩尔比为3:1～8:1，更优选为4:1。
优选的，所述的混合溶液中，蛋氨酸与硫代硫酸钠的摩尔比为4:1～6:1，更优选为5:1。
优选的，所述的反应在超声条件下进行。
优选的，所述的反应在混合溶液的颜色由透明变为浅白色后，再继续进行15～30min，更优选为20min。
优选的，所述的洗涤采用蒸馏水。
本发明进一步提供一种由上述制备方法得到的槲皮素修饰的纳米硫。
近年来，在神经变性疾病治疗中，硫化物纳米片已经被报道，其中的硫起关键作用，其参与Aβ结合，进而干扰Aβ聚集体中氢键的形成。然而，硫化物纳米片，大多数是硫与其他重金属的化合物，硫化物纳米片作为AD药物，治疗过程中会引入重金属离子，重金属离子积累则可能会产生毒副作用。相对而言，纳米硫主要组成为硫单质，是无毒材料，作为AD治疗药物具有天然优势。由于其微小尺寸效应和高表面能效应，因此纳米硫具有优异的生物活性，如去除重金属，清除自由基，抗氧化活性和抗菌活性。不同形貌和结构的硫纳米粒子表现出不同的化学性质以及生物活性。但目前尚没有采用纳米硫作为AD治疗剂的报道。
槲皮素(Quercetin，Qc)是分布最广的黄酮类化合物之一。许多研究表明，槲皮素具有抗氧化、抗炎、降血压、抗血小板聚集、抗癌、抗动脉粥样硬化等功能。有研究表明，槲皮素可以通过降低细胞内的内质网应激，减少活性氧的产生，保护神经细胞。然而，槲皮素作为一种天然药物，其水溶性差，因此限制了其在AD治疗中的应用。本发明通过将槲皮素修饰在纳米硫上，可增加其在水中的分散性，促进其作为AD药物的吸收。
本发明进一步提供上述槲皮素修饰的纳米硫在抗阿尔兹海默症药物中的应用。
一种含有槲皮素修饰的纳米硫的药物制剂，包含以下按摩尔份数计的原料：槲皮素修饰的纳米硫2×10-3份，α-氰基丙烯酸正丁酯1份和Triton X-100 100份；
所述的含有槲皮素修饰的纳米硫的药物制剂为微泡状，所述的槲皮素修饰的纳米硫嵌入在微泡的外壳中。
上述含有槲皮素修饰的纳米硫的药物制剂的制备方法，包括以下步骤：将聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)溶解在磷酸缓冲盐溶液(PBS)中，得到聚乙二醇辛基苯基醚溶液，加入槲皮素修饰的纳米硫水溶液，调节pH至2～3，加入α-氰基丙烯酸正丁酯(BCA)单体水溶液，得到混合溶液，搅拌均匀，离心，得到所述的含有槲皮素修饰的纳米硫的药物制剂(Qc@SNPs-MB)。
优选的，所述的槲皮素修饰的纳米硫水溶液的浓度为0.16～0.3mM，更优选为0.2mM。
优选的，所述的聚乙二醇辛基苯基醚溶液的浓度为1％(w/v)。
优选的，所述的α-氰基丙烯酸正丁酯单体水溶液的浓度为8～12M，更优选为10M。
优选的，所述的混合溶液中，槲皮素修饰的纳米硫与α-氰基丙烯酸正丁酯的摩尔比为2×10-3:1～2.5×10-3:1。
优选的，所述的调节pH采用浓度为1M的盐酸进行调节。
优选的，所述的调节pH至2.5。
优选的，所述的搅拌均匀的条件为在1000rpm下搅拌0.8～1.2h，更优选为1h。
本发明采用一锅法，将α-氰基丙烯酸丁酯(BCA)在酸性条件下聚合形成聚--氰基丙烯酸丁酯，同时形成微泡，所述的槲皮素修饰的纳米硫嵌入在微泡的外壳中。该微泡可在超声的条件下被破坏，产生声孔效应，使BBB暂时打开。因此本发明制备的含有槲皮素修饰的纳米硫的药物制剂在用药时结合超声，可显著提高药物对BBB的渗透能力，提高药效。
本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：
(1)本发明制备的槲皮素修饰的纳米硫可有效抑制神经元的内质网应激，降低由内质网应激带来的活性氧。其具有高度生物相容性、脑靶向性和血脑屏障渗透性。
(2)本发明制备的含有槲皮素修饰的纳米硫的药物制剂为微泡状，其在超声作用下可产生声孔效应，使血脑屏障暂时打开，进而使槲皮素修饰的纳米硫能透过血脑屏障，进入脑部发挥治疗作用。
(3)本发明中槲皮素修饰的纳米硫和含有槲皮素修饰的纳米硫的药物制剂的制备过程简单，所得产品便于保存和使用。
附图说明
图1为本发明中槲皮素修饰的纳米硫及含有槲皮素修饰的纳米硫的药物制剂的制备工艺流程图。
图2为实施例1中制备的槲皮素修饰的纳米硫的透射电子显微镜图。
图3为实施例1中制备的含有槲皮素修饰的纳米硫的药物制剂的扫描电子显微镜图。
图4为实施例2中细胞毒性试验中的不同Qc@SNPs浓度下的细胞存活率图。
图5为实施例2中细胞对Qc@SNPs的吸收实验中的细胞激光共聚焦图。
图6为实施例2中Qc@SNPs减少细胞凋亡实验中的细胞存活率图。
图7为实施例2中Qc@SNPs降低内质网应激实验中的细胞激光共聚焦图。
图8为实施例3中的小鼠荧光成像图。
图9中的图A为实施例4中小鼠的水迷宫路径图，图9中的图B为实施例4中小鼠的穿越平台次数图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步的详细说明，但本发明的实施方式不限于此。对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。
实施例1
本实施例提供一种槲皮素修饰的纳米硫及其制备方法，以及含有该槲皮素修饰的纳米硫的药物制剂及其制备方法。
一种槲皮素修饰的纳米硫及其制备方法：
将2.5mL浓度为4mM的槲皮素水溶液和2.5mL浓度为100mM的蛋氨酸水溶液混合，加入2mL浓度为0.1M的维生素C(Vc)水溶液，再在超声条件下下缓慢滴入5mL浓度为10mM的硫代硫酸钠溶液，得到混合溶液，反应，观察到溶液的颜色从透明变为浅白色，继续超声反应20min，离心得到沉淀，用蒸馏水洗涤三次，得到槲皮素修饰的纳米硫(Qc@SNPs)。
含有上述槲皮素修饰的纳米硫的药物制剂及其制备方法：
将30mL浓度为0.2mM的槲皮素修饰的纳米硫水溶液加至浓度为1％(w/v)的聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)溶液(溶剂为PBS)中，用浓度为1M的盐酸调节pH至2.5，然后边搅拌边缓慢滴加0.3mL浓度为10M的α-氰基丙烯酸正丁酯(BCA)单体水溶液，得到混合溶液，继续在1000rpm下搅拌1h，离心三次，得到所述含有槲皮素修饰的纳米硫的药物制剂(Qc@SNPs-MB)。
本实施例中槲皮素修饰的纳米硫及含有槲皮素修饰的纳米硫的药物制剂的制备工艺流程见图1。
采用透射电子显微镜观察得到的槲皮素修饰的纳米硫，结果如图2所示。
采用扫描电子显微镜观察得到的含有槲皮素修饰的纳米硫的药物制剂，结果如图3所示，可见制备的微泡壳体均匀地嵌入了槲皮素修饰的纳米硫。
实施例2
本实施例提供一种槲皮素修饰的纳米硫及其制备方法，以及含有该槲皮素修饰的纳米硫的药物制剂及其制备方法。
将2.5mL浓度为3.2mM的槲皮素水溶液和2.4mL浓度为50mM的蛋氨酸水溶液混合，加入1.8mL浓度为0.05M的维生素C(Vc)水溶液，再在超声条件下下缓慢滴入5mL浓度为6mM的硫代硫酸钠溶液，得到混合溶液，反应，观察到溶液的颜色从透明变为浅白色，继续超声反应15min，离心得到沉淀，用蒸馏水洗涤三次，得到槲皮素修饰的纳米硫(Qc@SNPs)。
含有上述槲皮素修饰的纳米硫的药物制剂及其制备方法：
将30mL浓度为0.16mM的槲皮素修饰的纳米硫水溶液加至浓度为1％(w/v)的聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)溶液(溶剂为PBS)中，用浓度为1M的盐酸调节pH至2，然后边搅拌边缓慢滴加0.3mL浓度为8M的α-氰基丙烯酸正丁酯(BCA)单体水溶液，得到混合溶液，继续在1000rpm下搅拌0.8h，离心三次，得到所述含有槲皮素修饰的纳米硫的药物制剂(Qc@SNPs-MB)。
实施例3
本实施例提供一种槲皮素修饰的纳米硫及其制备方法，以及含有该槲皮素修饰的纳米硫的药物制剂及其制备方法。
将2.5mL浓度为5mM的槲皮素水溶液和2.5mL浓度为180mM的蛋氨酸水溶液混合，加入2mL浓度为0.3M的维生素C(Vc)水溶液，再在超声条件下下缓慢滴入5mL浓度为15mM的硫代硫酸钠溶液，得到混合溶液，反应，观察到溶液的颜色从透明变为浅白色，继续超声反应30min，离心得到沉淀，用蒸馏水洗涤三次，得到槲皮素修饰的纳米硫(Qc@SNPs)。
含有上述槲皮素修饰的纳米硫的药物制剂及其制备方法：
将30mL浓度为0.3mM的槲皮素修饰的纳米硫水溶液加至浓度为1％(w/v)的聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)溶液(溶剂为PBS)中，用浓度为1M的盐酸调节pH至3，然后边搅拌边缓慢滴加0.3mL浓度为12M的α-氰基丙烯酸正丁酯(BCA)单体水溶液，得到混合溶液，继续在1000rpm下搅拌1.2h，离心三次，得到所述含有槲皮素修饰的纳米硫的药物制剂(Qc@SNPs-MB)。
实施例4
本实施例以实施例1为对照，提供一种没有槲皮素修饰的纳米硫(SNPs)及其制备方法，以及含有该纳米硫的药物制剂及其制备方法。
将5mL浓度50mM的蛋氨酸水溶液混合，加入2mL浓度为0.1M的维生素C(Vc)水溶液，再在超声条件下下缓慢滴入5mL浓度为10mM的硫代硫酸钠溶液，得到混合溶液，反应，观察到溶液的颜色从透明变为浅白色，继续超声反应20min，离心得到沉淀，用蒸馏水洗涤三次，得到SNPs。
含有上述纳米硫的药物制剂及其制备方法：
将30mL浓度为0.2mM纳米硫水溶液加至浓度为1％(w/v)的聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)溶液(溶剂为PBS)中，用浓度为1M的盐酸调节pH至2.5，然后边搅拌边缓慢滴加0.3mL浓度为10M的α-氰基丙烯酸正丁酯(BCA)单体水溶液，得到混合溶液，继续在1000rpm下搅拌1h，离心三次，得到所述含有槲皮素修饰的纳米硫的药物制剂(SNPs-MB)。
实施例5
本实施例提供实施例1中制备的含有槲皮素修饰的纳米硫的药物制剂(Qc@SNPs-MB)的体外生物性能试验结果。
本实施例中使用的人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y，小鼠脑微血管内皮细胞bEnd.3购自美国模式菌种收集中心(ATCC)。
(1)细胞毒性试验
将SH-SY5Y或bEnd.3细胞在96孔板中(密度为4×103/孔)培养24小时，然后加入Qc@SNPs浓度为5μg/mL到200μg/mL的Qc@SNPs(实施例1制备)水溶液，孵育48小时。将培养基除去，加入100μL浓度为0.5mg/mL的3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)，孵育4小时，将其除去后每孔再加入100μL的二甲基亚砜(DMSO)，最后在酶标仪580nm波长下检测。实验结果见图4。
实验结果：细胞存活率是检测纳米药物生物相容性的重要参数。SH-SY5Y细胞或者bEnd.3细胞与Qc@SNPs共同孵育后48小时，没有出现明显地细胞存活率下降，说明Qc@SNPs具有良好的生物相容性，具有作为AD药物的可能性。
(2)细胞对Qc@SNPs的吸收
首先，制备钌配合物标记的Qc@SNPs-MB。制备过程中，在槲皮素溶液与蛋氨酸水溶液的混合物中先加入100μg的钌配合物([Ru(phen)2(p-HPIP)]2+)，然后再加入维生素C水溶液，后续步骤与实施例1相同。该钌配合物将作为荧光探针修饰在Qc@SNPs表面。
取两组24孔板，按4×104/片的密度将SH-SY5Y细胞接种于24孔板中，在两组24孔板中分别加入Qc@SNPs浓度为10μg/mL的钌配合物标记的Qc@SNPs水溶液和钌配合物标记的Qc@SNPs-MB水溶液，其中Qc@SNPs-MB组加入超声脉冲，声压约为1000kPa，连续曝光5min。两组细胞继续培养12h后，细胞用PBS洗三次以去掉表面未被吸收的纳米粒子。用4％甲醛固定10min后使用DAPI对细胞核染色10min，在激发波长488nm下使用激光共聚焦显微镜观察细胞(Zeiss LSM meta 510)。
实验结果：如图5所示，明亮部分表示Qc@SNPs-MB在细胞中的位置(明亮部分来自钌配合物的荧光)，与直接孵育Qc@SNPs相比，Qc@SNPs-MB结合超声后可有效促进SH-SY5Y细胞对Qc@SNPs的吸收。
(3)Qc@SNPs减少细胞凋亡实验
空白对照例(Vehicle)：将50至500μg/mL的毒胡萝卜素(Thapsigargin，Tg)分别接种于24孔板内的盖玻片(直径10mm)上的SH-SY5Y细胞中，培养12h。将培养基除去，加入100μL浓度为0.5mg/mL 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)孵育4小时，将其除去后每孔再加入100μL的二甲基亚砜(DMSO)，最后在酶标仪580nm波长下检测。
加入Qc@SNPs-MB对照例：将50至500μg/mL的毒胡萝卜素(Thapsigargin，Tg)分别接种于24孔板内的盖玻片(直径10mm)上的SH-SY5Y细胞中，培养12h。加入Qc@SNPs浓度为10μg/mL的Qc@SNPs-MB(实施例1制备)水溶液，进行超声脉冲处理，声压约为1000kPa，连续曝光5min。然后在37℃中孵育2天。将培养基除去，加入100μL浓度为0.5mg/mL 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)孵育4小时，将其除去后每孔再加入100μL的二甲基亚砜(DMSO)，最后在酶标仪580nm波长下检测。
加入SNPs-MB对照例：将50至500μg/mL的毒胡萝卜素(Thapsigargin，Tg)分别接种于24孔板内的盖玻片(直径10mm)上的SH-SY5Y细胞中，培养12h。加入SNPs浓度为10μg/mL的SNPs-MB(实施例4制备)水溶液，进行超声脉冲处理，声压约为1000kPa，连续曝光5min。然后在37℃中孵育2天。将培养基除去，加入100μL浓度为0.5mg/mL 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)孵育4小时，将其除去后每孔再加入100μL的二甲基亚砜(DMSO)，最后在酶标仪580nm波长下检测。
加入槲皮素对照例：将50至500μg/mL的毒胡萝卜素(Thapsigargin，Tg)分别接种于24孔板内的盖玻片(直径10mm)上的SH-SY5Y细胞中，培养12h。加入浓度为10μg/mL的槲皮素水溶液。然后在37℃中孵育2天。将培养基除去，加入100μL浓度为0.5mg/mL 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)孵育4小时，将其除去后每孔再加入100μL的二甲基亚砜(DMSO)，最后在酶标仪580nm波长下检测。
实验结果：如图6所示，SH-SY5Y细胞的存活率随着Tg浓度的增大而下降，表明Tg可以引起细胞内严重的内质网应激，进而导致细胞凋亡。当加入Qc@SNPs-MB+超声后，SH-SY5Y细胞存活率明显提高，表明Qc@SNPs能有效抑制由内质网已经引起的细胞凋亡。单独的SNPS或者槲皮素可以在一定的程度上降少由内质网应激引发的细胞凋亡，但效果不如Qc@SNPs，表明SNPS与槲皮素两者之间存在协同效应。
(4)Qc@SNPs降低内质网应激实验
正常组：将SH-SY5Y细胞接种于24孔板内的盖玻片(直径10mm)上，培养12h。培养后，细胞用PBS洗涤两次后与5μM DCFH-DA孵育30min。用激光共聚焦显微镜观察。
毒胡萝卜素对照例：将500μg/mL的毒胡萝卜素(Thapsigargin，Tg)分别接种于24孔板内的盖玻片(直径10mm)上的SH-SY5Y细胞中，培养12h。培养后，细胞用PBS洗涤两次后与5μM DCFH-DA孵育30min。用激光共聚焦显微镜观察。
加入Qc@SNPs-MB对照例：将500μg/mL的毒胡萝卜素(Thapsigargin，Tg)分别接种于24孔板内的盖玻片(直径10mm)上的SH-SY5Y细胞中，培养12h。随后，加入Qc@SNPs浓度为10μg/mL的Qc@SNPs-MB(实施例1制备)水溶液，进行连续超声处理5min，继续培养48h。培养后，细胞用PBS洗涤两次后与5μM DCFH-DA孵育30min。用激光共聚焦显微镜观察。
加入SNPs-MB对照例：将500μg/mL的毒胡萝卜素(Thapsigargin，Tg)分别接种于24孔板内的盖玻片(直径10mm)上的SH-SY5Y细胞中，培养12h。随后，加入SNPs浓度为10μg/mL的SNPs-MB(实施例4制备)水溶液，进行连续超声处理5min，继续培养48h。培养后，细胞用PBS洗涤两次后与5μM DCFH-DA孵育30min。用激光共聚焦显微镜观察。
加入槲皮素对照例：将500μg/mL的毒胡萝卜素(Thapsigargin，Tg)分别接种于24孔板内的盖玻片(直径10mm)上的SH-SY5Y细胞中，培养12h。随后，加入浓度为10μg/mL的槲皮素水溶液，进行连续超声处理5min，继续培养48h。培养后，细胞用PBS洗涤两次后与5μMDCFH-DA孵育30min。用激光共聚焦显微镜观察。
实验结果：如图7所示，明亮部分表示在细胞中的活性氧(明亮部分来自活性氧探针DCFH-DA)。与正常组相比，Tg样品中出现明显的明亮部分，表明Tg引起了SH-SY5Y细胞内严重的内质网应激。当继续加入Qc@SNPs-MB+超声处理后，明亮部分明显减弱，表明Qc@SNPs能够有效降低由内质网应激引起的活性氧，保护神经元。单独的SNPS或者槲皮素可以在一定的程度上降少由内质网应激引发的活性氧，但效果不如Qc@SNPs。
实施例6
本实施例提供实施例5中的(2)制备的钌配合物标记的Qc@SNPs-MB在裸鼠中的生物成像实验，证明Qc@SNPs-MB结合超声的方法对血脑屏障的药物透过作用。
(1)静脉注射组：将钌配合物标记的Qc@SNPs-MB(纳米粒子浓度为10mg/kg)通过静脉注射到小鼠体内，待不同时间后，麻醉小鼠，放置暗室中用IVISLumina成像系统(Xenogen(Caliper Life Sciences)，Hopkinton，MA，USA)检测动物的荧光情况。
(2)静脉注射+超声组：将钌配合物标记的Qc@SNPs-MB(纳米粒子浓度为10mg/kg)通过静脉注射到小鼠体内，随后对其脑部进行连续超声处理10min，声压约为1000kPa。处理不同时间后，麻醉小鼠，放置暗室中用IVISLumina成像系统(Xenogen(Caliper LifeSciences)，Hopkinton，MA，USA)检测动物的荧光情况。
实验结果：如图8所示，静脉注射+超声组的小鼠脑部能检测到不同强度的荧光信号。而静脉注射组的小鼠脑部几乎没有检测到荧光信号。结果表明，Qc@SNPs-MB结合超声后能够有效地促进Qc@SNPs通过血脑屏障并且在脑部积累。
实施例7
本实施例提供实施例1中制备的Qc@SNPs-MB对转基因AD小鼠的治疗效果。
AD小鼠月龄大约保持在9个月。小鼠每三天称重以表明基本状态。在第三十周时，对小鼠进行给药治疗。将20只小鼠分为4组(每组5只小鼠)，分别通过静脉注射生理盐水、槲皮素、SNPs-MB(实施例4制备)以及Qc@SNPs-MB(实施例1制备)给药治疗(10mg/kg)，每次微泡注射后，对其脑部进行连续超声处理10min，声压约为1000kPa。每周注射药物两次(周一、周四)。持续给药5个星期后，通过水迷宫实验对AD小鼠的学习以及认知能力进行评估。经一系列基础训练后，除去平台。要求小鼠在水迷宫装置上搜索平台之前所在位置，期间，允许它们在水中自由游泳60s。记录到达小鼠路径图以及穿越平台所在位置次数。结果见图9。
实验结果：图9中的图A是正常小鼠，注射生理盐水的AD小鼠，以及SNPs-MB+超声和Qc@SNPs-MB+超声治疗的AD小鼠在水迷宫装置上搜索平台的路线图。可以看出经过Qc@SNPs-MB+超声治疗后，小鼠可以在有限的时间内寻找到平台。图9中的图B则是穿越平台次数。可以看出正常组的小鼠具有最佳表现效果。而Qc@SNPs-MB+超声治疗组与生理盐水注射组相比，小鼠能过多次穿越平台所在位置，说明Qc@SNPs可以有效的提高AD患病小鼠认知能力以及学习能力，其治疗效果比单独槲皮素或SNPs更佳。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种槲皮素修饰的纳米硫的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将槲皮素水溶液与蛋氨酸水溶液混合，加入维生素C水溶液，再加入硫代硫酸钠溶液，得到混合溶液，反应，离心得到沉淀，洗涤，得到所述的槲皮素修饰的纳米硫；
所述的混合溶液中，槲皮素与硫代硫酸钠的摩尔比为1:3.75～1:6；所述的维生素C与硫代硫酸钠的摩尔比为3:1～8:1；所述的蛋氨酸与硫代硫酸钠的摩尔比为4:1～6:1。
2.根据权利要求1所述的槲皮素修饰的纳米硫的制备方法，其特征在于：
所述的槲皮素水溶液的浓度为3.2～5mM；
所述的蛋氨酸水溶液的浓度为50～180mM；
所述的维生素C水溶液的浓度为0.05～0.3M；
所述的硫代硫酸钠溶液的浓度为6～15mM。
3.根据权利要求2所述的槲皮素修饰的纳米硫的制备方法，其特征在于：
所述的槲皮素水溶液的浓度为4mM；
所述的蛋氨酸水溶液的浓度为100mM；
所述的维生素C水溶液的浓度为0.1M；
所述的硫代硫酸钠溶液的浓度为10mM。
4.根据权利要求1所述的槲皮素修饰的纳米硫的制备方法，其特征在于：
所述的混合溶液中，槲皮素与硫代硫酸钠的摩尔比为1:5；
所述的维生素C与硫代硫酸钠的摩尔比为4:1；
所述的蛋氨酸与硫代硫酸钠的摩尔比为5:1。
5.一种槲皮素修饰的纳米硫，其特征在于：由权利要求1～4任一项所述的制备方法得到。
6.一种含有槲皮素修饰的纳米硫的药物制剂，其特征在于，包含以下按摩尔份数计的原料：权利要求5所述的槲皮素修饰的纳米硫2×10-3份，α-氰基丙烯酸正丁酯1份和TritonX-100 100份；
所述的含有槲皮素修饰的纳米硫的药物制剂为微泡状，权利要求5所述的槲皮素修饰的纳米硫嵌入在微泡的外壳中。
7.权利要求6所述的含有槲皮素修饰的纳米硫的药物制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将Triton X-100溶解在磷酸缓冲盐溶液中，得到Triton X-100溶液，加入槲皮素修饰的纳米硫水溶液，调节pH至2～3，加入α-氰基丙烯酸正丁酯单体水溶液，得到混合溶液，搅拌均匀，离心，得到所述的含有槲皮素修饰的纳米硫的药物制剂。
8.根据权利要求7所述的含有槲皮素修饰的纳米硫的药物制剂的制备方法，其特征在于：
所述的槲皮素修饰的纳米硫水溶液的浓度为0.16～0.3mM；
所述的Triton X-100溶液的浓度为1％(w/v)；
所述的α-氰基丙烯酸正丁酯单体水溶液的浓度为8～12M；
所述的混合溶液中，槲皮素修饰的纳米硫与α-氰基丙烯酸正丁酯的摩尔比为2×10-3:1～2.5×10-3:1；
所述的调节pH采用浓度为1M的盐酸进行调节；
所述的搅拌均匀的条件为在1000rpm下搅拌0.8～1.2h。
9.根据权利要求8所述的含有槲皮素修饰的纳米硫的药物制剂的制备方法，其特征在于：
所述的槲皮素修饰的纳米硫水溶液的浓度为0.2mM；
所述的α-氰基丙烯酸正丁酯单体水溶液的浓度为10M。
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