CN108732193A - 近生理状态生物大分子晶体的衍射方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种近生理状态生物大分子晶体的衍射方法，用于解决现有生物大分子晶体的衍射方法实时性差的技术问题。技术方案是利用薄膜夹层装置生长晶体，晶体生长完毕后，在室温条件下利用涡流管系统对衍射环境温度进行控制，对晶体进行原位衍射。本发明实现了蛋白质晶体的近生理状态衍射，获得了‑5℃～20℃范围内的最佳分辨率。由于在室温条件下对蛋白质晶体进行衍射，大幅节省了成本。另外，在当代光源条件，本发明方法实现了快速室温数据收集，相比于背景技术的弱衍射光源条件，利用毛细管进行室温数据收集的技术，大大缩短了衍射时间。

Description

近生理状态生物大分子晶体的衍射方法
技术领域
本发明涉及一种生物大分子晶体的衍射方法，特别是涉及一种近生理状态生物大分子晶体的衍射方法。
背景技术
晶体学为生物大分子结构解析工作做出了巨大贡献，目前在生物大分子结构解析领域，X射线衍射晶体成像法仍然是最主要的解析生物大分子结构的方法之一。早期的X射线衍射晶体成像法利用X射线管发射的X射线对晶体进行衍射成像，但收集完整的衍射数据所需时间较长。随着X射线光源强度的增加，获得完整蛋白质晶体结构信息所需的时间大大减少，但是更强的光源带来了严重的辐射损伤问题。为了防止辐射损伤带来的晶体损坏问题，目前X射线晶体学普遍采用低温X射线晶体衍射法。
文献“Cryocrystallography.Structure,1994,2:1135～1140.”报道了急速降温至100K的速冻技术在生物大分子X射线衍射中的应用。低温X射线晶体衍射法，一定程度上解决了辐射损伤问题，但也增加了防冻液的筛选的问题。此外，冷冻可能导致晶体质量变差或甚至不能衍射，而且对于某些晶体，冷冻状态下获得的结构信息并不能真实反映其在生理状态下的结构。因此寻找近生理状态下生物大分子晶体的衍射方法一直是一个在探讨的问题。
发明内容
为了克服现有生物大分子晶体的衍射方法实时性差的不足，本发明提供一种近生理状态生物大分子晶体的衍射方法。该方法利用薄膜夹层装置生长晶体，晶体生长完毕后，在室温条件下利用涡流管系统对衍射环境温度进行控制，对晶体进行原位衍射。本发明实现了蛋白质晶体的近生理状态衍射，获得了-5℃～20℃范围内的最佳分辨率。由于在室温条件下对蛋白质晶体进行衍射，大幅节省了成本。另外，在当代光源条件，本发明方法实现了快速室温数据收集，相比于背景技术的弱衍射光源条件，利用毛细管进行室温数据收集的技术，大大缩短了衍射时间。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种近生理状态生物大分子晶体的衍射方法，其特点是包括以下步骤：
第一步，将蛋白质溶解到缓冲液中，制得10～60mg/ml蛋白质溶液。
第二步，将等体积的结晶沉淀剂溶液与蛋白质溶液混合，获得蛋白质结晶混合液。
第三步，吸取2μL蛋白质结晶混合液加入到薄膜夹层装置中。
第四步，将以上含有蛋白质结晶混合液的薄膜夹层装置放入4～20℃控温箱中，结晶2～7天；
第五步，结晶完毕后，在显微镜下观察蛋白质晶体的形貌。
第六步，调节涡流管热流端的流量调节阀对出风口温度进行调节，同时使用热敏电偶对温度进行实时监测。
第七步，选取形貌良好的晶体，在-5℃～20℃温度范围内，在X射线单晶衍射仪或同步辐射衍射设施上对晶体进行原位衍射。
本发明的有益效果是：该方法利用薄膜夹层装置生长晶体，晶体生长完毕后，在室温条件下利用涡流管系统对衍射环境温度进行控制，对晶体进行原位衍射。本发明实现了蛋白质晶体的近生理状态衍射，获得了-5℃～20℃范围内的最佳分辨率。由于在室温条件下对蛋白质晶体进行衍射，大幅节省了成本。另外，在当代光源条件，本发明方法实现了快速室温数据收集，相比于背景技术的弱衍射光源条件，利用毛细管进行室温数据收集的技术，大大缩短了衍射时间。
下面结合具体实施方式对本发明作详细说明。
具体实施方式
本发明近生理状态生物大分子晶体的衍射方法具体步骤如下：
实施例1：近生理状态下不同衍射温度对溶菌酶晶体质量的影响。
第一步：称取溶菌酶蛋白溶解到缓冲液中，制得45mg/mL的溶菌酶溶液。
第二步：将等体积的溶菌酶溶液与溶菌酶结晶沉淀剂溶液混合，获得溶菌酶结晶混合液。
第三步：吸取2μL溶菌酶结晶混合液加入到薄膜夹层装置中。
第四步：将上述含有溶菌酶结晶混合液的薄膜夹层装置放入控温箱中，在8℃下结晶2天。
第五步：结晶完毕后，在显微镜下观察蛋白质晶体的形貌。
第六步：通过调节涡流管热流端的流量调节阀来调节衍射温度，利用热电偶对温度进行实时监测，待温度稳定后进行衍射实验。
第七步：将含有待衍射晶体的薄膜夹层装置置于同步辐射衍射设施中，分别在-5℃、0℃、5℃、10℃、15℃、20℃温度条件下对晶体进行原位衍射，收集衍射数据。
结果如下：不同温度下溶菌酶晶体的衍射质量不同，比较不同温度下的晶体衍射情况得到5℃条件下衍射质量最佳。
实施例2：近生理状态下不同衍射温度对甜味蛋白Thaumatin晶体质量的影响
第一步：称取甜味蛋白Thaumatin溶解到缓冲液中，最终形成30mg/mL的溶菌酶溶液。
第二步：将等体积的甜味蛋白Thaumatin溶液与甜味蛋白Thaumatin结晶沉淀剂溶液混合，获得甜味蛋白Thaumatin结晶混合液。
第三步：吸取2μL甜味蛋白Thaumatin结晶混合液加入到薄膜夹层装置中。
第四步：将上述含有甜味蛋白Thaumatin结晶混合液的薄膜夹层装置放入控温箱中，在12℃下结晶7天。
第五步：结晶完毕后，在显微镜下观察蛋白质晶体的形貌。
第六步：通过调节涡流管热流端的流量调节阀来调节衍射温度，利用热电偶对温度进行实时监测，待温度稳定后进行衍射实验。
第七步：将含有待衍射晶体的薄膜夹层装置置于同步辐射衍射设施中，分别在-5℃、0℃、5℃、10℃、15℃、20℃温度条件下对晶体进行原位衍射，收集衍射数据。
结果如下：在不同温度下甜味蛋白Thaumatin晶体的衍射质量不同，比较不同温度下的衍射情况得到0℃条件下衍射质量最佳。
实施例3：近生理状态下不同衍射温度对过氧化氢酶晶体质量的影响。
第一步：称取过氧化氢酶溶解到缓冲液中，最终形成20mg/mL的过氧化氢酶溶液。
第二步：将等体积的过氧化氢酶溶液与过氧化氢酶结晶沉淀剂溶液混合，获得过氧化氢酶结晶混合液。
第三步：吸取2μL过氧化氢酶结晶混合液加入到薄膜夹层装置中。
第四步：将上述含有过氧化氢酶结晶混合液的薄膜夹层装置放入控温箱中，在12℃下结晶7天。
第五步，结晶完毕后，在显微镜下观察蛋白质晶体的形貌。
第六步：通过调节涡流管热流端的流量调节阀来调节衍射温度，利用热电偶对温度进行实时监测，待温度稳定后进行衍射实验。
第七步：将含有待衍射晶体的薄膜夹层装置置于X射线单晶衍射设施中，分别在-5℃、0℃、5℃、10℃、15℃、20℃温度条件下对晶体进行原位衍射，收集衍射数据。
结果如下：在不同温度下过氧化氢酶晶体的衍射质量不同，比较不同温度下的衍射情况得到10℃条件下衍射质量最佳。
实施例4：近生理状态下不同衍射温度对热休克蛋白90N晶体质量的影响。
第一步：称取热休克蛋白90N溶解到缓冲液中，最终形成15mg/mL的热休克蛋白90N溶液。
第二步：将等体积的热休克蛋白90N溶液与热休克蛋白90N结晶沉淀剂溶液混合，获得热休克蛋白90N结晶混合液。
第三步：吸取2μL热休克蛋白90N结晶混合液加入到薄膜夹层装置中。
第四步：将上述含有热休克蛋白90N结晶混合液的薄膜夹层装置放入控温箱中，在4℃下结晶5天。
第五步：结晶完毕后，在显微镜下观察蛋白质晶体的形貌。
第六步：通过调节涡流管热流端的流量调节阀来调节衍射温度，利用热电偶对温度进行实时监测，待温度稳定后进行衍射实验。
第七步：将含有待衍射晶体的薄膜夹层装置置于X射线单晶衍射设施中，分别在-5℃、0℃、5℃、10℃、15℃、20℃温度下对晶体进行原位衍射，收集衍射数据。
结果如下：在不同温度下热休克蛋白90N晶体的衍射质量不同，比较不同温度下的衍射情况得到5℃下衍射质量最佳。
实施例5：近生理状态下不同衍射温度对蛋白酶K晶体质量的影响。
第一步：称取的蛋白酶K溶解到缓冲液中，最终形成60mg/mL的蛋白酶K溶液。
第二步：将等体积的蛋白酶K溶液与蛋白酶K结晶沉淀剂溶液混合，获得蛋白酶K结晶混合液。
第三步：吸取2μL蛋白酶K结晶混合液加入到薄膜夹层装置中。
第四步：将上述含有蛋白酶K结晶混合液的薄膜夹层装置放入控温箱中，在20℃下结晶3天。
第五步，结晶完毕后，在显微镜下观察蛋白质晶体的形貌。
第六步：通过调节涡流管热流端的流量调节阀来调节衍射温度，利用热电偶对温度进行实时监测，待温度稳定后进行衍射实验。
第七步：将含有待衍射晶体的薄膜夹层装置置于同步辐射衍射设施中，分别在-5℃、0℃、5℃、10℃、15℃、20℃温度条件下对晶体进行原位衍射，收集衍射数据。
结果如下：在不同温度下蛋白酶K晶体的衍射质量不同，比较不同温度下的衍射情况得到-5℃条件下衍射质量最佳。
实施例6：不同衍射温度对刀豆球蛋白晶体衍射质量的影响。
第一步：称取刀豆球蛋白溶解到缓冲液中，最终形成10mg/mL的刀豆球蛋白溶液。
第二步：将等体积的刀豆球蛋白溶液与刀豆球蛋白结晶沉淀剂溶液混合，获得刀豆球蛋白结晶混合液。
第三步：吸取2μL刀豆球蛋白结晶混合液加入到薄膜夹层装置中。
第四步：将上述含有刀豆球蛋白结晶混合液的薄膜夹层装置放入控温箱中，在16℃下结晶5天。
第五步，结晶完毕后，在显微镜下观察蛋白质晶体的形貌。
第二步：通过调节涡流管热流端的流量调节阀来调节衍射温度，利用热电偶对温度进行实时监测，待温度稳定后进行衍射实验。
第三步：将含有待衍射晶体的薄膜夹层装置置于自由电子激光衍射设施中，分别-5℃、0℃、5℃、10℃、15℃、20℃温度条件下对晶体进行原位衍射，收集衍射数据。
结果如下：在不同温度下刀豆球蛋白晶体的衍射质量不同，比较不同温度下的衍射情况得到10℃条件下衍射质量最佳。

Claims (1)

1.一种近生理状态生物大分子晶体的衍射方法，其特征在于包括以下步骤：
第一步，将蛋白质溶解到缓冲液中，制得10～60mg/ml蛋白质溶液；
第二步，将等体积的结晶沉淀剂溶液与蛋白质溶液混合，获得蛋白质结晶混合液；
第三步，吸取2μL蛋白质结晶混合液加入到薄膜夹层装置中；
第四步，将以上含有蛋白质结晶混合液的薄膜夹层装置放入4～20℃控温箱中，结晶2～7天；
第五步，结晶完毕后，在显微镜下观察蛋白质晶体的形貌；
第六步，调节涡流管热流端的流量调节阀对出风口温度进行调节，同时使用热敏电偶对温度进行实时监测；
第七步，选取形貌良好的晶体，在-5℃～20℃温度范围内，在X射线单晶衍射仪或同步辐射衍射设施上对晶体进行原位衍射。
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