CN108693099B - 用于流式细胞仪的全自动荧光补偿方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于流式细胞仪的全自动荧光补偿方法，包括以下步骤：步骤1)制备多色样品上机测试，得到原始荧光信号结果；步骤2)保持电压增益与步骤1)中的相同，各单色小球和空白小球按比例混合上机测试，得到各单色小球和空白小球的子集在各个检测通道的荧光信号原始输出值；步骤3)计算荧光泄漏矩阵K和自发荧光矩阵A；步骤4)计算荧光补偿矩阵K_C；步骤5)进行全自动荧光补偿，得到荧光补偿后的检测结果。本发明利用混合小球，只需测试一次即可得到补偿结果，而不需要多次测试阴性对照样本和各单阳性样本，简化了操作，缩短了时间，消除了实验间的误差；本发明还公开了荧光泄漏矩阵K的具体计算方法，本发明方法简便、效果显著。

Description

用于流式细胞仪的全自动荧光补偿方法

技术领域

本发明涉及流式数据分析领域，特别涉及一种用于流式细胞仪的全自动荧光补偿方法。

背景技术

在进行流式细胞分析的时候，待测样本通常携带两种或两种以上的荧光素，如藻红蛋白(PE)、异硫氰荧光素(FITC)、叶丝素蛋白(PerCP)等。荧光素经过激光激发以后发射出不同波长的荧光。理论上来讲，通过选择合适的分光组件可以将不同的荧光分开，使得每个探测器只接收一种荧光信号，而不会检测到其他的荧光信号。然而实际上，目前常用的荧光染料的激发波长或发射波长都是正态或者偏态分布，有很宽的范围，因此尽管他们的发射峰值各不一样，但是发射谱常有重叠，如图1所示，为FITC、PE的发射波长，可以看出两者的波谱有重叠的现象，因而PE探测器能检测到由FITC发射的525nm左右波长的光信号。同样，FITC探测器也能检测到PE的信号，只不过每种荧光探测器检测到的荧光信号以一种荧光素为主。这样就直接影响了检测结果的准确性，因此，多色分析时必须进行光谱重叠的校正，即进行荧光补偿。

现有流式细胞仪一般采用手动补偿的方法来实现。手动补偿对于两色和三色分析可以很好地完成补偿功能，但是对于四色及四色以上的分析操作难度太大而导致几乎不可能实现。而流式细胞仪提供的自动补偿方法需要制备阴性对照样本以及所有单阳性对照样本，对样品需求量大，样品制备繁琐，样品检测次数多，导致实施难度高。并且由于多次检测间的误差，导致补偿效果往往并不好。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种用于流式细胞仪的全自动荧光补偿方法。

本发明提供的方法，不需要制备大量的荧光补偿对照样本，且一次上样就可以得到补偿结果，方法简便有效。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种用于流式细胞仪的全自动荧光补偿方法，包括以下步骤：

步骤1)制备多色样品上机测试，得到理想的原始荧光信号结果；

步骤2)保持电压增益与步骤1)中的相同，各单色小球和空白小球按比例混合上机测试，得到各单色小球和空白小球的子集在各个检测通道的荧光信号原始输出值；

步骤3)根据步骤2)的检测结果，计算荧光泄漏矩阵K和自发荧光矩阵A；

步骤4)计算荧光补偿矩阵K_c；

步骤5)根据补偿公式S，进行全自动荧光补偿，得到荧光补偿后的检测结果。

优选的是，在所述步骤3)中，根据步骤2)所得的检测结果，设门得到空白小球以及各单色小球的子集；

通过计算各检测通道之间的泄漏系数k_ij，从而得到自发荧光矩阵A和泄漏矩阵K：

A＝[a₁ a₂ a₃ … a_n]^T；

其中，i＝1,…n；j＝1,…n；n为总检测通道数；

k_ij为理论上只能在第i个检测通道检测到的荧光泄漏到第j个检测通道的比例；

为第i个检测通道对应的荧光单色小球子集在第j个检测通道的荧光输出平均值；a_j为空白小球子集在第j个检测通道的自发荧光或者非特异性荧光信号平均值；

为第i个检测通道对应的荧光单色小球子集在第m个检测通道的荧光输出平均值；a_k为空白小球子集在第k个检测通道的自发荧光或者非特异性荧光信号平均值。

优选的是，所述步骤4)中，荧光补偿矩阵K_C为步骤3)中所得的泄漏矩阵K的转置矩阵的逆矩阵，即K_C＝(K^T)^-1。

优选的是，所述步骤5)中，根据补偿公式S＝K_c×[O-A]，对多色样品分析结果进行全自动荧光补偿，并最终得到荧光补偿后的检测结果，即为真实检测结果。

优选的是，自发荧光矩阵A由所述步骤3)所得，荧光补偿矩阵K_C由所述步骤4)中所得，补偿公式S＝K_c×[O-A]中，

O＝[o₁ o₂ o₃ … o_n]^T，o_j为第j个检测通道的原始输出信号；

S＝[s₁ s₂ s₃ … s_n]^T，s_j为第j个检测通道的理论输出信号，即最终的荧光补偿后的真实检测结果。

优选的是，所述步骤1)中还包括调整包含电压增益在内的参数至合适的范围，获得理想的原始荧光信号结果。

优选的是，在所述步骤2)中，各单色小球和空白小球按照等比例混合，以获得更好的统计结果。

其中，单色小球和空白小球按照其他任何比例混合也可以得到补偿矩阵。

其中，步骤3)、步骤4)以及步骤5)涉及大量的运算，一般由计算机完成。

其中，优先推荐上述的步骤顺序。但是也可以选择其他组合方式，其中步骤1)和步骤2)的顺序可以互换，但是要确保电压增益保持先执行的步骤中的数值。步骤3)、4)必须在步骤2)之后，且在步骤5)之前。

本发明的用于流式细胞仪的全自动荧光补偿方法，对于5色以内(包含5色)的荧光检测可以取得较好的效果。对于现有的流式细胞仪，单激光所包含的荧光通道数不会超过5色。而不同激光之间的荧光通道不会同时检测，因此不需要补偿。所以5色补偿能满足现有的所有商业流式细胞仪的需求。

本发明的有益效果是：本发明的用于流式细胞仪的全自动荧光补偿方法，利用混合小球，只需测试一次即可得到补偿结果，而不需要多次测试阴性对照样本和各单阳性样本，简化了操作，缩短了时间，消除了实验间的误差；本发明还公开了荧光泄漏矩阵K的具体计算方法，本发明增加了自发荧光，改善了补偿效果。本发明可以解决流式细胞仪多色分析过程中因为荧光光谱重叠造成的设门困难，统计不准确等问题，且不需要制备大量的荧光补偿对照样本，一次上样就可以得到补偿结果，方法简便、效果显著。

附图说明

图1为荧光光谱重叠的一个示例的示意图；

图2为本发明的用于流式细胞仪全自动荧光补偿方法的一种实施例的步骤示意图；

图3为本发明的一种实施例中的三色荧光补偿时混合小球的检测结果；

图4为本发明的一种实施例中的三色荧光检测时荧光泄漏的示意图；

图5为本发明的一种实施例中的荧光补偿前的示意图；

图6为本发明的一种实施例中的荧光补偿后的示意图；

图7为本发明的另一种实施例中的荧光补偿前的示意图；

图8为本发明的另一种实施例中的不增加自发荧光a时的荧光补偿后的示意图；

图9为本发明的另一种实施例中的增加自发荧光a时的荧光补偿后的示意图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

以下提供本发明的本实施例的用于流式细胞仪的全自动荧光补偿方法的具体实施例，以FITC、PE、PE-Cy5三色实验为例，参照图2，其包括以下步骤：

步骤S10：制备FITC、PE、PE-Cy5三色实验样品上样分析。调整好电压增益，以获得较理想的实验结果。

步骤S11：保持步骤S10中的电压增益不变，FITC、PE、PE-Cy5单色小球和空白小球等比例混合上机测试，得到各单色小球和空白小球的子集在各个检测通道的荧光信号原始输出值。获得如图3所示的测试结果。其中也可以选用商业的包含FITC、PE、PE-Cy5单色小球和空白小球的混合小球。

步骤S12：计算荧光泄漏矩阵K和自发荧光矩阵A。

根据荧光泄漏的原理，三色实验的荧光泄漏模型如图4所示。

k_ij为理论上应该只能在第i个通道检测到的荧光泄漏到第j个通道的比例；s_i为第i个通道的原始输入值，也是我们要求的真实荧光信号；o_i为第i个通道检测到的荧光值；a_i为第i个通道检测到的自发荧光或者非特异性荧光信号。

由图4所示的模型可以得到：

令O＝[o₁ o₂ o₃]^T，S＝[s₁ s₂ s₃]^T，A＝[a₁ a₂ a₃]^T，

则上式可以记为：O＝K^T×S+A

变换可得：S＝(K^T)^-1×[O-A]，将(K^T)^-1记为K_c，则S＝K_c×[O-A]。

具体地，根据步骤S11所得的检测结果，设门得到空白小球以及各单色小球的子集，如图3所示。计算各通道之间的泄漏系数k_ij，从而得到泄漏矩阵K。

假设

为第i个通道对应的荧光单色小球子集在第j个通道的荧光输出平均值；a_j为空白小球子集在第j个通道的自发荧光或者非特异性荧光信号平均值，则对于通道1对应的单色小球子集，s₂＝0，s₃＝0，因此可得：

且：k₁₁+k₁₂+k₁₃＝1，因此可得：

其他同理可得，因此：

其中：

其中，i＝1,…n；j＝1,…n；n为总检测通道数；

k_ij为理论上只能在第i个检测通道检测到的荧光泄漏到第j个检测通道的比例；

为第i个检测通道对应的荧光单色小球子集在第j个检测通道的荧光输出平均值；a_j为空白小球子集在第j个检测通道的自发荧光或者非特异性荧光信号平均值；

为第i个检测通道对应的荧光单色小球子集在第m个检测通道的荧光输出平均值；a_k为空白小球子集在第k个检测通道的自发荧光或者非特异性荧光信号平均值。

例如对于图3所示的实验：

步骤S13：计算荧光补偿矩阵K_c，K_c＝(K^T)^-1；。

步骤S14：进行全自动荧光补偿。

具体地，根据补偿公式S＝K_c×[O-A]对多色分析结果进行全自动荧光补偿。

其中，Kc、A为步骤S13、S12中所得。

O＝[o₁ o₂ o₃]^T，o_j为第j个通道的原始输出信号。

S＝[s₁ s₂ s₃]^T，s_j为第j个通道的理论输出信号，也就是我们需要的补偿后的结果。

图1是荧光光谱重叠的一个示例的示意图，其示出了FITC(异硫氰荧光素)与PE(藻红蛋白)发射波长的叠加情况。

图5、图6为本实验荧光补偿前后的对比图。可以看出，本发明能够有效解决流式细胞仪荧光检测中产生的荧光重叠问题，完成荧光补偿。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。

Claims (3)

1.一种用于流式细胞仪的全自动荧光补偿方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1)制备多色样品上机测试，得到原始荧光信号结果；

步骤2)保持电压增益与步骤1)中的相同，各单色小球和空白小球按比例混合上机测试，得到各单色小球和空白小球的子集在各个检测通道的荧光信号原始输出值；

步骤3)根据步骤2)的检测结果，计算荧光泄漏矩阵K和自发荧光矩阵A；

步骤4)计算荧光补偿矩阵K_c；

步骤5)根据补偿公式S，进行全自动荧光补偿，得到荧光补偿后的真实检测结果；

在所述步骤3)中，根据步骤2)所得的检测结果，设门得到空白小球以及各单色小球的子集；

通过计算各检测通道之间的泄漏系数k_ij，从而得到自发荧光矩阵A和泄漏矩阵K：

A＝[a₁ a₂ a₃ L a_n]^T；

其中，i＝1，...n；j＝1，...n；n为总检测通道数；

k_ij为理论上只能在第i个检测通道检测到的荧光泄漏到第j个检测通道的比例；

为第i个检测通道对应的荧光单色小球子集在第j个检测通道的荧光输出平均值；a_j为空白小球子集在第j个检测通道的自发荧光或者非特异性荧光信号平均值；

为第i个检测通道对应的荧光单色小球子集在第m个检测通道的荧光输出平均值；a_k为空白小球子集在第k个检测通道的自发荧光或者非特异性荧光信号平均值；

所述步骤4)中，荧光补偿矩阵K_C为步骤3)中所得的泄漏矩阵K的转置矩阵的逆矩阵，即K_C＝(K^T)^-1；

所述步骤5)中，根据补偿公式S＝K_c×[O-A]，对多色样品分析结果进行全自动荧光补偿，并最终得到荧光补偿后的荧光信号值，即为真实检测结果；

自发荧光矩阵A由所述步骤3)所得，荧光补偿矩阵K_C由所述步骤4)中所得，补偿公式S＝K_c×[O-A]中，

O＝[o₁ o₂ o₃ L o_n]^T，o_j为第j个检测通道的原始输出信号；

S＝[s₁ s₂ s₃ L s_n]^T，s_j为第j个检测通道的理论输出信号，即最终的荧光补偿后的真实检测结果。

2.如权利要求1所述的用于流式细胞仪的全自动荧光补偿方法，其特征在于，所述步骤1)中还包括调整包含电压增益在内的参数至合适的范围，获得理想的原始荧光信号结果。

3.如权利要求1所述的用于流式细胞仪的全自动荧光补偿方法，其特征在于，在所述步骤2)中，各单色小球和空白小球按照等比例混合。

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