CN108680533A - 利用共振瑞利散射光谱法测定表皮生长因子受体浓度方法 - Google Patents

利用共振瑞利散射光谱法测定表皮生长因子受体浓度方法 Download PDF

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李俊波
王静华
张鑫鑫
常宏宏
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    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
    • G01N21/47—Scattering, i.e. diffuse reflection

Abstract

本发明涉及表皮生长因子受体检测领域。利用共振瑞利散射光谱法测定表皮生长因子受体浓度方法，通过多次试验数据，建立共振瑞利散射峰强度值差ΔI为纵坐标，表皮生长因子受体EGFR浓度c为横坐标关系图，利用线性回归法获得表皮生长因子受体EGFR共振瑞利散射峰强度值差ΔI和表皮生长因子受体EGFR浓度c的线性方程ΔI=11.87c+586.2，测定待测表皮生长因子受体的共振瑞利散射峰强度值差ΔI样=I样‑I0，代入线性方程ΔI样=11.87c样+586.2中，获得待测表皮生长因子受体EGFR浓度c样。

Description

利用共振瑞利散射光谱法测定表皮生长因子受体浓度方法
技术领域
本发明涉及表皮生长因子受体检测领域。
背景技术
表皮生长因子受体（Epidermal growth factor receptor EGFR）是一种跨膜糖蛋白，在细胞的增值、分化、凋亡及血管再生等过程中具有重要作用。已有的研究表明，大约三分之一的上皮恶性肿瘤中存在EGFR的过度表达，而且高水平的EGFR表达往往预示着疾病的恶化及不良的预后。因此，EGFR被认为是重要的肿瘤标志物，评价EGFR的表达水平及并监测其变化，对于相关疾病的诊断、治疗和预后判断具有重要意义。
经典的EGFR检测方法包括酶联免疫检测、蛋白质印迹法和免疫组织化学法。但是这些方法通常需要使用昂贵的生物试剂盒或酶标记，并且对操作人员及实验条件有很高的要求，分析时间也很长。即便如此，上述方法大多只能做到半定量，而且过分依赖操作者的经验，容易导致结果误差偏大，重现性低。近年来有一些关于EGFR测定新方法的报道，包括电化学法、表面等离子体散射法、微流控免疫传感器、石英晶体微量天平和基于氧化锌薄膜晶体管的免疫传感器等。然而，存在测定体系复杂、设备昂贵、线性范围窄和灵敏度低等问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：如何提供一种高选择性和灵敏度且简便、快速、准确的测定EGFR含量的的方法。
本发明所采用的技术方案是：利用共振瑞利散射光谱法测定表皮生长因子受体浓度方法，按照如下的步骤进行
步骤一、通过多次试验数据，建立共振瑞利散射峰强度值差ΔI为纵坐标，表皮生长因子受体EGFR浓度c为横坐标关系图，利用线性回归法获得表皮生长因子受体EGFR共振瑞利散射峰强度值差ΔI和表皮生长因子受体EGFR浓度c的线性方程ΔI=11.87c+586.2；
步骤二、将待测表皮生长因子受体1mL加入到第一试管中，然后在第一试管中加入0.11nmol/L Apt-AuNP-Ab溶液1.0mL，最后用pH7.4 磷酸盐缓冲溶液定容第一试管至5.0mL，混匀，静置20min，将第一试管的的溶液置于比色皿中，在荧光分光光度计上，同步扫描激发波长和发射波长，获得体系的共振瑞利散射光谱，测定体系最大散射波长312nm处待测表皮生长因子受体的共振瑞利散射峰强度值I样，将0.11nmol/L Apt-AuNP-Ab溶液1.0mL加入到第二试管中，然后用pH7.4 磷酸盐缓冲溶液定容第一试管至5.0mL，混匀，静置20min，将第一试管的的溶液置于比色皿中，在荧光分光光度计上，同步扫描激发波长和发射波长，获得体系的共振瑞利散射光谱，测定体系最大散射波长312nm处空白对照溶液的共振瑞利散射峰强度值I0，待测表皮生长因子受体EGFR共振瑞利散射峰强度值差ΔI样=I样-I0，代入线性方程ΔI样=11.87c样+586.2中，获得待测表皮生长因子受体EGFR浓度c样。
作为一种优选方式：Apt-AuNP-Ab溶液的制备过程为，将400μL的 213nmol/L的胱胺盐酸盐溶液加入到40 mL的1.40mmol/L的氯金酸溶液中，室温下搅拌20min，加入10 μL的10mmol/L的硼氢化钠溶液，室温下避光搅拌30min，待溶液变为酒红色后，继续搅拌1h，得到浓度为0.11nmol/L的(+)AuNPs；取(+)AuNPs溶液10mL，与10μL 的50μmol/L的5’端巯基修饰的Apt混合，在室温下反应12h，16000转离心15min除去未结合的Apt，用pH7.4的磷酸盐缓冲溶液洗涤沉淀物，再次离心，并将所得沉淀用10mL的pH7.4磷酸盐缓冲溶液重新分散，得到Apt修饰的Apt-AuNP；取Apt修饰的Apt-AuNP溶液10mL，与5mL的质量百分5%的戊二醛溶液反应1h，16000转离心并用5mL的pH7.4磷酸盐缓冲液重新分散，随后将其与50μL的5mg/mL的Ab混合，4 ℃下反应12h，16000转离心15min除去未结合的Ab，用pH7.4的磷酸盐缓冲溶液洗涤沉淀物，16000转再次离心15min，最后将所得沉淀用5mL的 pH7.4磷酸盐缓冲溶液重新分散，得到Apt和Ab复合修饰的Apt-AuNP-Ab探针，4 ℃冰箱保存备用。
本发明的有益效果是：采用抗体和核酸适配体同时修饰金纳米粒子，由于抗体和适配体对于目标蛋白的双重靶向作用，即便在很低的目标蛋白浓度下也能得到理想的共振瑞利散射信号强度，使得方法具有很高的灵敏度和极低的检测限，可以实现对痕量EGFR蛋白的定量测定。由于抗体及核酸适配体与EGFR蛋白的特异性结合，使得本方法具有很高的选择性。本方法在常用的荧光分光光度计上就可以实现，操作简便，分析时间短。
附图说明
图1是表皮生长因子受体EGFR的共振瑞利散射光谱图；
其中，1、空白对照溶液体系，2、加入10μL的10μg/mL的EGFR蛋白质标准溶液的体系，3、加入20μL的10μg/mL的EGFR蛋白质标准溶液的体系，4、加入30μL的10μg/mL的EGFR蛋白质标准溶液的体系，5、加入40μL的10μg/mL的EGFR蛋白质标准溶液的体系，6、加入50μL的10μg/mL的EGFR蛋白质标准溶液的体系。
具体实施方式
制备表皮生长因子受体EGFR（本说明书中简称EGFR）标准溶液体系：取刻度试管，分别移取10μL, 20μL, 30μL, 40μL, 50μL的10μg/mL的EGFR蛋白质标准溶液加入到不同试管中，再在试管中分别加入1.0mL的0.11nmol/L Apt-AuNP-Ab溶液，用pH7.4 磷酸盐缓冲溶液定容至5.0mL，混匀，静置20min，制成多个EGFR标准溶液体系；
制备空白对照溶液体系：取刻度试管，在试管中加入1.0mL的0.11nmol/L Apt-AuNP-Ab溶液，用pH7.4 磷酸盐缓冲溶液定容至5.0mL，混匀，静置20min，制成空白对照溶液体系；
分别取制备的EGFR标准溶液体系和空白溶液体系适量，置于比色皿中，在荧光分光光度计上，同步扫描激发波长和发射波长，获得体系的共振瑞利散射光谱，测定体系最大散射波长312nm处EGFR标准溶液的共振瑞利散射峰强度值I，以及测定空白对照溶液体系的共振瑞利散射峰强度值I0，计算ΔI=I-I0；以ΔI为纵坐标，EGFR的浓度为横坐标，通过线性回归得到工作曲线，ΔI=11.87c+586.2，其中c代表EGFR的浓度，本方法测定EGFR含量的线性范围为20~100ng/mL，检出限为0.1ng/mL，如图1所示。
被测物样品测定：由于癌症患者血清中含有一定量的EGFR蛋白，因此，以癌症患者血清为被测样品，运用本方法测定其中的EGFR含量。具体方法为：取某医院癌症患者血清样本5份作为待测样品，每份移取1mL分别加入到5支刻度试管中，再在每支试管中加入1.0mL的0.11nmol/L Apt-AuNP-Ab溶液，最后用pH7.4 磷酸盐缓冲溶液定容至5.0mL，混匀，静置20min，得到待测样品溶液。在试管中加入1.0mL的 0.11nmol/L 的Apt-AuNP-Ab溶液，用pH7.4 磷酸盐缓冲溶液定容至5.0mL，混匀，静置20min得到空白对照溶液。在荧光分光光度计上，同步扫描激发波长和发射波长，分别在312nm处测定待测样品的共振瑞利散射峰强度值I样和空白对照溶液的共振瑞利散射峰强度值I0，算出被测物的ΔI样= I样- I0。
根据样品测得的ΔI 样代入工作曲线，计算出被测物中EGFR的含量分别为81.3ng/mL，60.1ng/mL，79.4ng/mL，88.3ng/mL，47.9ng/mL．
Apt-AuNP-Ab溶液的制备过程为，将400μL的 213nmol/L的胱胺盐酸盐溶液加入到40mL的1.40mmol/L的氯金酸溶液中，室温下搅拌20min，加入10 μL的10mmol/L的硼氢化钠溶液，室温下避光搅拌30min，待溶液变为酒红色后，继续搅拌1h，得到浓度为0.11nmol/L的(+)AuNPs；取(+)AuNPs溶液10mL，与10μL 的50μmol/L的5’端巯基修饰的Apt混合，在室温下反应12h，16000转离心15min除去未结合的Apt，用pH7.4的磷酸盐缓冲溶液洗涤沉淀物，再次离心，并将所得沉淀用10mL的pH7.4磷酸盐缓冲溶液重新分散，得到Apt修饰的Apt-AuNP；取Apt修饰的Apt-AuNP溶液10mL，与5mL的质量百分5%的戊二醛溶液反应1h，16000转离心并用5mL的pH7.4磷酸盐缓冲液重新分散，随后将其与50μL的5mg/mL的Ab混合，4 ℃下反应12h，16000转离心15min除去未结合的Ab，用pH7.4的磷酸盐缓冲溶液洗涤沉淀物，16000转再次离心15min，最后将所得沉淀用5mL的 pH7.4磷酸盐缓冲溶液重新分散，得到Apt和Ab复合修饰的Apt-AuNP-Ab探针，4 ℃冰箱保存备用。
表1 样品测定结果比较
表2 回收率实验结果
本方法与目前常用的ELISA方法测定结果对照，结果见表1。由于采用了两种不同的分析方法，为判断两种方法对同一样品得出的分析结果是否具有显著性差异，通常需要进行显著性检验。t检验是分析化学中常用的显著性检验方法，若通过测定结果计算得到的t测小于规定值t表则可认为两种分析方法得到的结果不存在显著性差异。本法测定结果与ELISA测定结果通过t检验分析表明无显著性差异（t测＜2.31）。同时，取健康人血清样本1份，平行分为3组，进行加标回收率试验，结果见表2，平均回收率为98.7％～101.9％，相对标准偏差为0.4％～0.9％。可见提供的利用共振瑞利散射法测定EGFR含量的方法用于实际样品的测定，准确度高，重现性好。

Claims (2)

1.利用共振瑞利散射光谱法测定表皮生长因子受体浓度方法，其特征在于：按照如下的步骤进行
步骤一、通过多次试验数据，建立共振瑞利散射峰强度值差ΔI为纵坐标，表皮生长因子受体EGFR浓度c为横坐标关系图，利用线性回归法获得表皮生长因子受体EGFR共振瑞利散射峰强度值差ΔI和表皮生长因子受体EGFR浓度c的线性方程ΔI=11.87c+586.2；
步骤二、将待测表皮生长因子受体1mL加入到第一试管中，然后在第一试管中加入0.11nmol/L Apt-AuNP-Ab溶液1.0mL，最后用pH7.4 磷酸盐缓冲溶液定容第一试管至5.0mL，混匀，静置20min，将第一试管的的溶液置于比色皿中，在荧光分光光度计上，同步扫描激发波长和发射波长，获得体系的共振瑞利散射光谱，测定体系最大散射波长312nm处待测表皮生长因子受体的共振瑞利散射峰强度值I样，将0.11nmol/L Apt-AuNP-Ab溶液1.0mL加入到第二试管中，然后用pH7.4 磷酸盐缓冲溶液定容第一试管至5.0mL，混匀，静置20min，将第一试管的的溶液置于比色皿中，在荧光分光光度计上，同步扫描激发波长和发射波长，获得体系的共振瑞利散射光谱，测定体系最大散射波长312nm处空白对照溶液的共振瑞利散射峰强度值I0，待测表皮生长因子受体EGFR共振瑞利散射峰强度值差ΔI样=I样-I0，代入线性方程ΔI样=11.87c样+586.2中，获得待测表皮生长因子受体EGFR浓度c样。
2.根据权利要求1所述的利用共振瑞利散射光谱法测定表皮生长因子受体浓度方法，其特征在于：Apt-AuNP-Ab溶液的制备过程为，将400μL的 213nmol/L的胱胺盐酸盐溶液加入到40 mL的1.40mmol/L的氯金酸溶液中，室温下搅拌20min，加入10 μL的10mmol/L的硼氢化钠溶液，室温下避光搅拌30min，待溶液变为酒红色后，继续搅拌1h，得到浓度为0.11nmol/L的(+)AuNPs；取(+)AuNPs溶液10mL，与10μL 的50μmol/L的5’端巯基修饰的Apt混合，在室温下反应12h，16000转离心15min除去未结合的Apt，用pH7.4的磷酸盐缓冲溶液洗涤沉淀物，再次离心，并将所得沉淀用10mL的pH7.4磷酸盐缓冲溶液重新分散，得到Apt修饰的Apt-AuNP；取Apt修饰的Apt-AuNP溶液10mL，与5mL的质量百分5%的戊二醛溶液反应1h，16000转离心并用5mL的pH7.4磷酸盐缓冲液重新分散，随后将其与50μL的5mg/mL的Ab混合，4 ℃下反应12h，16000转离心15min除去未结合的Ab，用pH7.4的磷酸盐缓冲溶液洗涤沉淀物，16000转再次离心15min，最后将所得沉淀用5mL的 pH7.4磷酸盐缓冲溶液重新分散，得到Apt和Ab复合修饰的Apt-AuNP-Ab探针，4 ℃冰箱保存备用。
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