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长余辉油溶胶及其制备方法、用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种长余辉油溶胶及其制备方法和用途，所述制备方法包括：将长余辉纳米颗粒溶于聚乳酸‑羟基乙酸共聚物和N‑甲基吡咯烷酮的混合溶液，制备长余辉油溶胶。所述长余辉油溶胶可用于作为制备体内光学成像、组织深部PDT和循环反复治疗癌症的试剂。本发明所提供的长余辉植入体材料，其余辉强度及其衰减时间均得到大幅度提高，并且可以作为肿瘤的内置光源激发光敏剂，不需要任何外界光刺激，从而实现组织深部光动力学治疗，因此在癌症的治疗领域将具有良好的应用前景。

Description

长余辉油溶胶及其制备方法、用途
技术领域
本发明涉及生物学材料领域，尤其涉及一种长余辉生物材料及其制备方法、用途。
背景技术
作为一种无创治疗手段，光动力学治疗(PDT)是利用特定波长激光照射肿瘤部位，激发光敏剂生成活性氧自由基(ROS)，选择性破坏肿瘤组织，避免损伤周围正常组织。随着纳米技术的飞速发展，PDT的激发光源从传统的紫外/可见光发展为近红外光和高能X射线，其组织穿透深度也从几毫米增加到几十厘米，组织深部PDT技术也由此应运而生。然而，近红外光和高能X射线照射分别容易造成热破坏和辐射损伤，所以急需发展清洁无害的内置激发光源来替代外界光源激发光敏剂，实现真正的组织深部PDT，无任何副作用。
长余辉材料在外界光激发时可以储存能量，在激发停止后仍可继续长时间发光。这种类似于“夜明珠”的神奇性能使得长余辉材料被广泛应用于光电器件、夜间照明以及军事等领域。特别是最近纳米级长余辉材料(即长余辉纳米颗粒(PLNPs))的出现，使其应用扩展到了生物医学领域。PLNPs的余辉可以用于早期肿瘤的高灵敏度光学影像检测，并且无组织自发荧光，检测的灵敏度更高。更为重要的是，PLNPs的余辉可以激发光敏剂产生单线态氧，无组织穿透深度限制，适用于治疗组织深部恶性肿瘤。但是要想实现高效的组织深部PDT，还需要克服以下两大技术瓶颈：一是提高PLNPs的长余辉发光强度并延长余辉衰减时间；二是尽量使PLNPs“固定”于肿瘤区，防止其渗透到周围正常组织，提高其在肿瘤区的富集浓度，有利于实现增强型PDT以及周期性循环反复治疗，从而大幅度增强对组织深部恶性肿瘤的杀伤效果。
发明内容
有鉴于此，有必要提供一种可植入人体的无渗透的长效发光材料及其制备方法。
本发明一方面提供一种长余辉油溶胶的制备方法，包括如下步骤：
将长余辉纳米颗粒溶于聚乳酸-羟基乙酸共聚物和N-甲基吡咯烷酮的混合溶液，制备长余辉油溶胶。
本发明另一方面提供一种采用上述方法制备的长余辉油溶胶，所述长余辉油溶胶中含有长余辉纳米颗粒1～20mg，聚乳酸-羟基乙酸共聚物0.2～0.8g，N-甲基吡咯烷酮1～2ml。
本发明再一方面还提供采用上述方法所制备的长余辉油溶胶作为制备体内光学成像、组织深部PDT和循环反复治疗的试剂的用途，所述长余辉油溶胶在人体内接触水后，变成凝固状长余辉植入材料。
本发明所提供的长余辉油溶胶可以用来激发光敏剂光克洛(HPPH)，产生单线态氧，杀死肿瘤细胞。所述长余辉植入体材料，其余辉强度及其衰减时间均得到大幅度提高，并且可以作为肿瘤的内置光源激发光敏剂，不需要任何外界光刺激，从而实现组织深部光动力学治疗，因此在癌症的治疗领域将具有良好的应用前景。
本发明的制备工艺简单，操作方便，不需要复杂昂贵的设备，易于实现工业化生产。
附图说明
图1是本发明实施例1中长余辉油溶胶的合成路线图。
图2a是本发明实施例1中长余辉纳米颗粒的余辉发光光谱与HPPH的吸收光谱。
图2b是本发明实施例1中长余辉纳米颗粒与HPPH加入SOSG后的荧光发射图谱。
图3是本发明实施例3中经过HPPH和经过2min LED光照的长余辉纳米颗粒处理后，肿瘤细胞存活率柱状图。
图4是本发明实施例4中HPPH和长余辉纳米颗粒经过一、二、三次循环2min LED光照后，肿瘤细胞存活率柱状图。
图5a是本发明实施例5中植入长余辉油溶胶和长余辉纳米颗粒在U87MG肿瘤中的余辉发光强度柱状图。
图5b是本发明实施例5中植入长余辉油溶胶和长余辉纳米颗粒在U87MG肿瘤中的余辉衰减线状图。
图6a是本发明实施例6中植入HPPH和长余辉油溶胶后的小鼠经LED光照，U87MG肿瘤体积增长曲线图。
图6b是本发明实施例6中植入HPPH和长余辉油溶胶后的小鼠经LED光照，荷瘤小鼠体重变化曲线图。
具体实施方式
本发明之构思可以利用不同形式之实施例表示，说明书所示附图与文中说明系为本发明之一实施范例，并非意图将本发明限制于所示附图及/或所描述之特定实施例中。
本发明一方面提供一种长余辉油溶胶的制备方法，包括如下步骤：
将长余辉纳米颗粒溶于聚乳酸-羟基乙酸共聚物和N-甲基吡咯烷酮的混合溶液，制备长余辉油溶胶。
根据本发明的具体实施例，所述长余辉纳米颗粒为ZnGa2O4，掺杂0～0.4mol％的Cr。
根据本发明的具体实施例，所述长余辉纳米颗粒采用水热合成法制备得到。
根据本发明的具体实施例，所述制备方法进一步包括如下步骤：
将Zn(NO3)2·6H2O、Ga(NO3)3·9H2O和Cr(NO3)3·9H2O，溶于水中，迅速滴加浓氨水，使反应体系的pH值保持在9～9.5之间；
上述混合液搅拌均匀后，高温加热至反应完成，冷却至室温；
离心收集产物，将所述产物溶于稀HCl中，去除ZnO杂质，得到长余辉纳米颗粒。
根据本发明的具体实施例，所述Zn(NO3)2·6H2O、Ga(NO3)3·9H2O和Cr(NO3)3·9H2O的质量比为590～600：510～520：1～2。优选的，质量比为594.96：511.48：1.6。
根据本发明的具体实施例，将0.2～0.8g聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶于1～2ml N-甲基吡咯烷酮制备混合溶液。
根据本发明的具体实施例，所述长余辉纳米颗粒的粒径为20～30nm。
本发明另一方面还提供一种采用上述方法所制备的长余辉油溶胶，所述长余辉油溶胶中含有长余辉纳米颗粒1～20mg，聚乳酸-羟基乙酸共聚物0.2～0.8g，N-甲基吡咯烷酮1～2ml。
本发明再一方面还提供一种采用上述方法所制备的长余辉油溶胶作为制备体内光学成像、组织深部PDT和循环反复治疗癌症的试剂的用途，所述长余辉油溶胶在人体内接触水后，变成凝固状长余辉植入材料。
根据本发明的具体实施例，所述长余辉油溶胶的用途还包括，将长余辉油溶胶作为制备治疗癌症的内置光源激发光敏试剂的用途。
实施例1
a)通过水热法合成长余辉纳米颗粒(ZGC PLNPs)：称取594.96mg Zn(NO3)2·6H2O、511.48mg Ga(NO3)3·9H2O和1.6mg Cr(NO3)3·9H2O(1.6mg,0.004mmol)，溶于15mL去离子水中，迅速滴加1mL浓氨水，使反应体系的pH值保持在9～9.5之间。上述混合液继续搅拌0.5h后，转移到25mL的水热釜中，220℃高温反应10h，然后冷却至室温。离心收集产物，分散于0.01mol/L的稀HCl中，去除ZnO杂质。所得到的ZGC PLNPs再经过丙酮反复清洗三遍后，冷冻干燥备用。
b)参见图1，制备长余辉油溶胶：0.25mg PLGA溶于1mL NMP中，搅拌12h，再加入10mg ZGC PLNPs，继续搅拌12h，制得长余辉油溶胶。所述长余辉油溶胶植入人体后遇水接触后发生液固相变，变成凝固状长余辉植入材料。
参见图2a，别在荧光发射光谱仪和紫外吸收光谱仪上测试ZGC PLNPs的余辉发光光谱和HPPH的吸收光谱。从图中可以看出，ZGC PLNPs的波峰在695nm处，而HPPH的吸收峰在660nm处。
利用荧光发射光谱仪检测单线态氧检测试剂SOSG在λ＝525nm处的发光强度。SOSG捕捉到单线态氧后，其在λ＝525nm处的发光强度会提高，利用这个原理观察ZGC PLNPs的余辉是否可以激发HPPH产生单线态氧。参见图2b，如果往SOSG指示剂中只加入HPPH或者HPPH和没有用LED光照的ZGC PLNPs，SOSG的λ＝525nm处的发光强度没有显著提高，说明没有单线态氧产生。但是加入HPPH和经过2min LED光照的ZGC PLNPs，SOSG的λ＝525nm处的发光强度提高了一倍，说明ZGC PLNPs的长余辉可以激发HPPH产生单线态氧。
实施例2
a)通过水热法合成长余辉纳米颗粒(ZGC PLNPs)：称取600mg Zn(NO3)2·6H2O、520mg Ga(NO3)3·9H2O和2mg Cr(NO3)3·9H2O(1.6mg,0.004mmol)，溶于15mL去离子水中，迅速滴加1mL浓氨水，使反应体系的pH值保持在9～9.5之间。上述混合液继续搅拌0.5h后，转移到25mL的水热釜中，220℃高温反应10h，然后冷却至室温。离心收集产物，分散于0.01mol/L的稀HCl中，去除ZnO杂质。所得到的ZGC PLNPs再经过丙酮反复清洗三遍后，冷冻干燥备用。
b)制备长余辉油溶胶：0.8mg PLGA溶于2mL NMP中，搅拌12h，再加入20mg ZGCPLNPs，继续搅拌12h，制得长余辉油溶胶。所述长余辉油溶胶植入人体后遇水接触后发生液固相变，变成凝固状长余辉植入材料。
实施例3
采用标准的MTT法，评价组织深部PDT对U87MG肿瘤细胞的杀伤效果。本发明所采用的MTT法采用本领域技术人员公知的技术及常规试剂。
U87MG细胞以每孔1×104密度接种到96孔板中，并置于37℃、5％CO2条件下培育24h。接着，吸出96孔板中的旧培养基，分别加入含有1μg/mL HPPH的培养基，继续培养4h后，加入不同浓度(25、50、100μg/mL)的ZGC PLNPs(经过LED光照2min后)的培养基。继续培养24h后，吸出96孔板中的旧培养基，在每个孔中加入100μL MTT的培养基溶液(0.8mg/mL)，继续培养4h。吸出96孔板中的残余培养基，在每个孔中加入100μL DMSO溶液，轻轻摇晃后，在Bio-Tel EL×800型酶标仪上检测每孔的OD值(检测波长为570nm)，用如下公式计算细胞存活率。细胞存活率(％)＝(样品的OD570值/空白OD570值)×100％。
参见图3，结果显示，经过HPPH和经过2min LED光照的ZGC PLNPs处理后，细胞存活率降低，说明ZGC PLNPs的长余辉可以激发HPPH产生单线态氧，从而杀死肿瘤细胞。
实施例4
采用标准的MTT法，评价循环反复治疗对U87MG肿瘤细胞的杀伤效果。
U87MG细胞以每孔1×104密度接种到96孔板中，并置于37℃、5％CO2条件下培育24h。接着，吸出96孔板中的旧培养基，分别加入含有1μg/mL HPPH的培养基，继续培养4h后，加入100μg/mL的ZGC PLNPs的培养基，分别进行三次LED反复光照2min。继续培养24h后，吸出96孔板中的旧培养基，在每个孔中加入100μL MTT的培养基溶液(0.8mg/mL)，继续培养4h。吸出96孔板中的残余培养基，在每个孔中加入100μL DMSO溶液，轻轻摇晃后，在Bio-TelEL×800型酶标仪上检测每孔的OD值(检测波长为570nm)，用如下公式计算细胞存活率。细胞存活率(％)＝(样品的OD570值/空白OD570值)×100％。
参见图4，结果显示，经过HPPH和ZGC PLNPs经过一、二、三次循环2min LED光照，细胞存活率逐渐降低，说明经过循环LED光照后，ZGC PLNPs的荧光激发HPPH产生的单线态氧逐渐增多，杀死肿瘤的数目也增多。
实施例5
建立动物模型。所有的实验操作均按照美国国立卫生研究院的临床中心动物保健和使用委员会通过的动物使用和保健制度。
雌性无胸腺裸鼠(六周,20-25g)，在裸鼠前腿皮下注射2×106U87MG肿瘤细胞的PBS溶液建立老鼠肿瘤模型。当肿瘤体积达60mm3时，将10mg/mL ZGC PLNPs和ZGC PLimplants，通过瘤内注射的方式，直接注入U87MG肿瘤。LED光照2min后，利用小动物IVIS荧光成像系统检测肿瘤区的长余辉发光强度及其衰减时间。
参见图5a和图5b，结果显示，LED光照肿瘤区2min后，ZGC PL implants的长余辉发光强度大概是ZGC PLNPs的五倍，余辉衰减时间也从10min提高到了25min。
实施例6
建立动物模型。所有的实验操作均按照美国国立卫生研究院的临床中心动物保健和使用委员会通过的动物使用和保健制度。
雌性无胸腺裸鼠(六周,20-25g)，在裸鼠前腿皮下注射2×106U87MG肿瘤细胞的PBS溶液建立老鼠肿瘤模型。当肿瘤体积达60mm3时，进行治疗实验。U87MG荷瘤小鼠随机分为五组：(1)空白组(对照)；(2)尾静脉注射HPPH组；(3)瘤内注射ZGC PL implants组；(4)尾静脉注射HPPH后LED光照15min组；(5)尾静脉注射HPPH并且瘤内注射ZGC PL implants后LED光照15min组(分别第1天和第8天处理两次)。治疗后的半个月内，每隔一天用游标卡尺测量肿瘤体积，称量荷瘤小鼠的体重。按照公式V＝AB2/2计算肿瘤体积，其中A是肿瘤的长径，B是肿瘤的短径(mm)。每次测量结果均通过处理前的起始肿瘤体积和小鼠体重归一化。
图6a显示，尾静脉注射HPPH后LED光照15min组，肿瘤生长抑制效果不好，而尾静脉注射HPPH并且瘤内注射ZGC PL implants后LED光照15min组，肿瘤在本个月内基本上体制生长，说明LED光照后，ZGC PL implants的发光可以激发HPPH产生大量的单线态氧，从而高效杀死肿瘤细胞，显著遏制肿瘤过快生长。图6b显示，每组小鼠的体重没有太大波动，说明小鼠经过治疗后，健康状况没受太大影响。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

Claims (9)

1.一种长余辉油溶胶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将长余辉纳米颗粒溶于聚乳酸-羟基乙酸共聚物和N-甲基吡咯烷酮的混合溶液，制备长余辉油溶胶。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述长余辉纳米颗粒采用水热合成法制备得到。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将Zn(NO3)2·6H2O、Ga(NO3)3·9H2O和Cr(NO3)3·9H2O，溶于水中，迅速滴加浓氨水，使反应体系的pH值保持在9～9.5之间；
上述混合液搅拌均匀后，高温加热至反应完成，冷却至室温；
离心收集产物，将所述产物溶于稀HCl中，去除ZnO杂质，得到长余辉纳米颗粒。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述Zn(NO3)2·6H2O、Ga(NO3)3·9H2O和Cr(NO3)3·9H2O的质量比为590～600：510～520：1～2。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，将0.2～0.8g聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶于1～2ml N-甲基吡咯烷酮制备混合溶液。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述长余辉纳米颗粒的粒径为20～30nm。
7.一种根据权利要求1～6任一项所制备的长余辉油溶胶，其特征在于，所述长余辉油溶胶中含有长余辉纳米颗粒1～20mg，聚乳酸-羟基乙酸共聚物0.2～0.8g，N-甲基吡咯烷酮1～2ml。
8.根据权利要求1～6任一项所制备的长余辉油溶胶作为制备体内光学成像、组织深部PDT和循环反复治疗癌症的试剂的用途，其特征在于，所述长余辉油溶胶在人体内接触水后，变成凝固状长余辉植入材料。
9.根据权利要求8所述长余辉油溶胶的用途，其特征在于，将所述长余辉油溶胶作为制备治疗癌症的内置光源激发光敏试剂的用途。
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