CN108645839A - 一种桃整果软化程度的细胞快速统计评价方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种桃整果软化程度的细胞快速统计评价方法，解决现有的桃果实软化程度研究方法成像时间长、效率低，导致成像面积小、仅停留在细胞水平，无法反应桃果实的整体软化程度的问题。本发明利用受激拉曼散射成像技术，采用切片分别采集的方式获得桃整果的赤道面细胞壁多糖、果胶和纤维素对应的各特征峰的灰度分布图，然后根据上述各要素对桃果实软化影响的权重，制定加权计算方式，获得各切片的加权灰度分布图，然后将各切片的加权灰度分布图拼合后，统计灰度值分布区间，进而评价桃整果软化程度。本发明可以对各个储藏期的桃果实进行评价，并提出指导性的储藏建议，合理规划储藏期，充分发挥桃果实的商品价值。

Description

一种桃整果软化程度的细胞快速统计评价方法

技术领域

本发明属于农产品检测领域，涉及一种显微成像技术在农产品检测上的应用，特别涉及一种桃整果软化程度的细胞快速统计评价方法。

背景技术

桃原产于我国，是蔷薇科桃属的核果类果树，桃果果肉细腻，风味芬芳，肉营养价值丰富，风味浓郁，因此广受消费者喜爱。桃果实为典型的呼吸跃变型果实，具有明显的呼吸高峰和乙烯释放高峰，在采后贮藏过程中，质地会发生明显的软化过程。桃果实的软化程度与桃果实的品质有明显的相关性。过于软化的的桃果实不仅会使果实外观形态皱缩，更会削减果实的口感和风味，严重影响果实经济价值。研究桃果实的软化机制，可以为桃品种的选育提供依据，为优化采后贮藏技术提供支持，为桃果实的贮藏期提供合理的预测，最大程度上减少桃果实采后的因贮藏技术和贮藏时间不当软化造成的经济损失。

细胞壁主要是由硬度较大的纤维素—半纤维素网络结构中嵌入果胶多糖和结构蛋白构成。研究发现，果实细胞壁结构和成分的变化是导致果实软化的主要原因。多糖是含有长而带分支的单糖链的高分子量的物质，是细胞壁的主要成分。果实在成熟过程中，虽然自由基参与下的一些非酶机制也有可能对果肉的软化起一定的作用，但目前通常认为，果实成熟过程中的软化是在多种细胞壁多糖降解酶的作用下，细胞壁多糖降解，胞壁结构分离造成的。

传统研究桃果实软化过程的方法主要有两大类：理化检测和显微检测。理化检测一般从组织水平上获得桃果实的生理指标，如：硬度测量、化学提取法、果肉组织染色法等。目前，化学提取法是最常用的细胞壁物质含量检测方法。例如，果胶和半纤维含量的测量需要先从果实中提取细胞壁物质，然后将细胞壁物质经过与一系列试剂的反应后、反复沉淀、离心和过滤，最后将纯化的物质与标准品进行对比，计算出果实组织水平上果胶和半纤维素的平均含量。整个测量过程往往需要数天完成。上述理化检测技术所获得的细胞壁物质含量信息是在组织层面上的果肉整体平均值。理化检测方法会导致细胞壁多糖原位微观空间分布信息遭到破坏，只能获得宏观的整体数值，无法在显微水平上具体对细胞壁的软化过程进行表达和研究。显微检测法是另一类常用方法，包括扫描电子显微镜(SEM)、透射电子显微镜(TEM)、共聚焦激光扫描电子显微镜(CLSM)法、原子力显微镜(AFM)、荧光显微镜(FM)等。相比于理化检测方法，显微检测法能够观测到桃果实细胞壁结构的空间信息，但上述显微方法往往需要复杂的样本制备和染色标记过程，无法同时对多种细胞壁多糖物质的原位分布信息进行同步检测，并且大多数显微成像技术虽然有着较高的空间分辨率(细胞或亚细胞水平)，但相应的成像区域(视场范围)较为狭小。例如光学显微镜一般在毫米级别，而电子显微镜在微米到纳米级别。若大面积进行成像(例如果实整体剖面一般在厘米级别)，则成像时间过长、效率低下，难以实现对整个果实剖面范围内的所有细胞进行软化过程的快速分析。

发明内容

本发明的目的在于解决现有的桃果实软化程度研究方法成像时间长、效率低，导致成像面积小、仅停留在少量细胞水平，无法反应桃果实整体即大量细胞水平的软化程度的问题，提供一种桃整果软化程度的细胞快速统计评价方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种桃整果软化程度的细胞快速统计评价方法，其特征在于：包括以下步骤：

a、挑选一个无病害、无机械损伤的桃果实；

b、沿着桃果实的赤道面剖开，在整个剖面上进行连续切片，每个切片的大小为1cm²，切片厚度约为150μm，将所有的切片按原位放置顺序，并依次编号为1～N，分别用盖玻片密封于各自的载玻片之上；

c、用受激拉曼散射成像技术(Stimulated Raman Scattering,SRS技术)对所有的切片按顺序进行快速显微拉曼成像，采集每个切片里所有细胞的所有像素点的细胞壁多糖、果胶和纤维素的特征峰对应的灰度分布图；

d、对每个切片各自所有特征峰对应的灰度分布图中所有细胞的各个像素点的灰度值进行加权计算，得到加权灰度分布图；

e、对所有切片的加权灰度分布图拼合成对应桃整果的整果加权灰度分布图，对整果加权灰度分布图中，各灰度值区间像素点的占比进行统计，并基于统计结果评价桃整果软化程度。

作为优选，步骤b中，密封时在桃果肉组织上滴一滴去离子水后用指甲油进行封片。

作为优选，步骤c中细胞壁多糖的特征峰在2900cm^-1，果胶的两个特征峰在1750cm^-1和854cm^-1，纤维素的六个特征峰分别在1480cm^-1、1381cm^-1、1154cm^-1、1124cm^-1、1098cm^-1和902cm^-1，对于第n个切片，1≤n≤N，采集以上九个特征峰对应的灰度分布图分别记为

作为优选，步骤d中，第n个切片的加权灰度分布图记为Tⁿ，Tⁿ中每个像素点的灰度值通过以下加权计算公式得到：

其中，Gray^x,y为Tⁿ中x，y坐标点的灰度值， 分别为 中x，y坐标点的灰度值。

作为优选，步骤e中，将所有N个切片的加权灰度分布图T¹至T^N拼合成对应桃整果的整果加权灰度分布图T，对整果加权灰度分布图T中灰度值范围区间0-10、11-20、21-30、31-40、41-60、61-100和101-255的像素点所占总像素点的百分比进行统计，依次记为P_0-10、P_11-20、P_21-30、P_31-40、P_41-60、P_61-100、P_101-255，令利用以下公式对桃整果软化值R进行加权计算：

R＝1*P_0-10+2*P_11-20+4*P_21-30+6*P_31-40+8*P_41-60+10*P_61-100+20*P_101-255，

当桃整果软化值R在5以上，桃果实质地较硬，为未达到商业成熟度，不易收获；当桃整果软化值R在3-5之间，桃果实达到8成熟，达到商业成熟度可以采摘；当桃整果软化值R在2-3时达到9成熟度，适宜食用；当桃整果软化值R在1.5-2时桃果实达到完熟，达到储藏后期，不易继续储藏；当桃整果软化值R在1-1.5时桃果实已经过于成熟，质地基本完全软化，易产生腐坏。根据实验发现，SRS图像中高亮信息很少，大量灰度信息集中在0-100的灰度值之间，在0-100的灰度值之间细分对提升评价准确性更为有利，即使更换不同的检验设备，当检测过程中设定的参数保持不变，多次检测之间获取的SRS图像灰度信息的差异很小，检测结果可以保持稳定。

受激拉曼散射成像技术，以下简称SRS技术，SRS技术使用的是大量重复频率的泵浦和斯托克斯脉冲，泵浦光中心波长调节为802nm。首先将这两种脉冲调至时间与空间上重合后，显微物镜调至聚焦于样品表面上，保证视野清晰，最后使用二维振镜对果实样本切片扫描收集样本信号，构建SRS技术高光谱图像。需要对泵浦光和斯托克斯光进行高重复的强度调制，再对其中另一光束应用锁相放大器进行提取即可采集得到信号。用SRS技术获取切片中数百个细胞的总细胞壁多糖的拉曼特征谱峰时，SRS技术的成像速度较快，一般一个400μm²面积的SRS成像用时约15s，相比常用的共聚焦显微拉曼成像技术采集一个400μm²面积时一般需要10h，SRS技术的成像速度是传统的共聚焦显微拉曼速度的2400倍，从而SRS技术可以实现整果赤道面切片上所有细胞的快速拉曼成像。测量期间只需放置样本阴凉处，便能避免样本因测量时间过长，样本失水导致的测量信号变化情况。

本发明利用受激拉曼散射成像技术，采用切片分别采集的方式获得桃整果的赤道面细胞壁多糖、果胶和纤维素对应的各特征峰的灰度分布图，然后根据上述各要素对桃果实软化影响的权重，制定加权计算方式，获得各切片的加权灰度分布图，然后将各切片的加权灰度分布图拼合后，统计灰度值分布区间，进而评价桃整果软化程度，可以对各个储藏期的桃果实进行评价，并提出指导性的储藏建议，合理规划储藏期，充分发挥桃果实的商品价值。

附图说明

下面结合附图对本发明作进一步的说明。

图1是本发明各储藏期的桃果实的局部SRS图像的加权灰度分布图。

具体实施方式

下面通过具体实施例并结合附图对本发明进一步说明。

实施例：一种桃整果软化程度的细胞快速统计评价方法，包括以下步骤：

a、挑选一个无病害、无机械损伤的桃果实；

b、沿着桃果实的赤道面剖开，在整个剖面上进行连续切片，每个切片的大小为1cm²，切片厚度约为150μm，将所有的切片按原位放置顺序，并依次编号为1～N，分别用盖玻片密封于各自的载玻片之上；密封时在桃果肉组织上滴一滴去离子水后用指甲油进行封片；

c、用受激拉曼散射成像技术对所有的切片按顺序进行快速显微拉曼成像，采集每个切片里所有细胞的所有像素点的细胞壁多糖、果胶和纤维素的特征峰对应的灰度分布图；细胞壁多糖的特征峰在2900cm^-1，果胶的两个特征峰在1750cm^-1和854cm^-1，纤维素的六个特征峰分别在1480cm^-1、1381cm^-1、1154cm^-1、1124cm^-1、1098cm^-1和902cm^-1，对于第n个切片，1≤n≤N，采集以上九个特征峰对应的灰度分布图分别记为

d、对每个切片各自所有特征峰对应的灰度分布图中所有细胞的各个像素点的灰度值进行加权计算，得到加权灰度分布图；第n个切片的加权灰度分布图记为Tⁿ，Tⁿ中每个像素点的灰度值通过以下加权计算公式得到：

其中，Gray^x,y为Tⁿ中x，y坐标点的灰度值， 分别为 中x，y坐标点的灰度值；

e、对所有切片的加权灰度分布图拼合成对应桃整果的整果加权灰度分布图，对整果加权灰度分布图中，各灰度值区间像素点的占比进行统计，并基于统计结果评价桃整果软化程度。将所有N个切片的加权灰度分布图T¹至T^N拼合成对应桃整果的整果加权灰度分布图T，对整果加权灰度分布图T中灰度值范围区间0-10、11-20、21-30、31-40、41-60、61-100和101-255的像素点所占总像素点的百分比进行统计，依次记为P_0-10、P_11-20、P_21-30、P_31-40、P_41-60、P_61-100、P_101-255，令P_0-10+P_11-20+P_21-30+P_31-40+P_41-60+P_61-100+P_101-255＝1，利用以下公式对桃整果软化值R进行加权计算：

R＝1*P_0-10+2*P_11-20+4*P_21-30+6*P_31-40+8*P_41-60+10*P_61-100+20*P_101-255，

当桃整果软化值R在5以上，桃果实质地较硬，为未达到商业成熟度，不易收获；当桃整果软化值R在3-5之间，桃果实达到8成熟，达到商业成熟度可以采摘；当桃整果软化值R在2-3时达到9成熟度，适宜食用；当桃整果软化值R在1.5-2时桃果实达到完熟，达到储藏后期，不易继续储藏；当桃整果软化值R在1-1.5时桃果实已经过于成熟，质地基本完全软化，易产生腐坏。

图1为各个储藏期的桃果实局部SRS图像加权灰度分布图，其中A是0℃储藏0天的桃果实局部SRS图像加权灰度分布图，根据图像中的灰度统计最终计算出的桃整果软化值R为4.042，桃果实达到商业成熟度，适宜采摘；B是0℃储藏25天的桃果实局部SRS图像加权灰度分布图，根据图像中的灰度统计最终计算出的桃整果软化值R为2.502，桃果实达到九成熟，适宜食用；C是0℃储藏50天的桃果实局部SRS图像加权灰度分布图，根据图像中的灰度统计最终计算出的桃整果软化值R为1.725，桃果实达到完熟，不宜继续储藏。

表1为各个储藏期的桃果实SRS图像加权灰度分布图经过统计分析的各个灰度区间的像素统计值，所占百分比，及对应的软化值R。

Claims (5)

1.一种桃整果软化程度的细胞快速统计评价方法，其特征在于：包括以下步骤：

a、挑选一个无病害、无机械损伤的桃果实；

b、沿着桃果实的赤道面剖开，在整个剖面上进行连续切片，每个切片的大小为1cm²，切片厚度约为150μm，将所有的切片按原位放置顺序，并依次编号为1～N，分别用盖玻片密封于各自的载玻片之上；

c、用受激拉曼散射成像技术对所有的切片按顺序进行快速显微拉曼成像，采集每个切片里所有细胞的所有像素点的细胞壁多糖、果胶和纤维素的特征峰对应的灰度分布图；

d、对每个切片各自所有特征峰对应的灰度分布图中所有细胞的各个像素点的灰度值进行加权计算，得到加权灰度分布图；

e、对所有切片的加权灰度分布图拼合成对应桃整果的整果加权灰度分布图，对整果加权灰度分布图中，各灰度值区间像素点的占比进行统计，并基于统计结果评价桃整果软化程度。

2.根据权利要求1所述的一种桃整果软化程度的细胞快速统计评价方法，其特征在于：步骤b中，密封时在桃果肉组织上滴一滴去离子水后用指甲油进行封片。

3.根据权利要求1所述的一种桃整果软化程度的细胞快速统计评价方法，其特征在于：步骤c中细胞壁多糖的特征峰在2900cm^-1，果胶的两个特征峰在1750cm^-1和854cm^-1，纤维素的六个特征峰分别在1480cm^-1、1381cm^-1、1154cm^-1、1124cm^-1、1098cm^-1和902cm^-1，对于第n个切片，1≤n≤N，采集以上九个特征峰对应的灰度分布图分别记为

4.根据权利要求3所述的一种桃整果软化程度的细胞快速统计评价方法，其特征在于：步骤d中，第n个切片的加权灰度分布图记为Tⁿ，Tⁿ中每个像素点的灰度值通过以下加权计算公式得到：

其中，Gray^x,y为Tⁿ中x，y坐标点的灰度值， 分别为 中x，y坐标点的灰度值。

5.根据权利要求4所述的一种桃整果软化程度的细胞快速统计评价方法，其特征在于：步骤e中，将所有N个切片的加权灰度分布图T¹至T^N拼合成对应桃整果的整果加权灰度分布图T，对整果加权灰度分布图T中灰度值范围区间0-10、11-20、21-30、31-40、41-60、61-100和101-255的像素点所占总像素点的百分比进行统计，依次记为P_0-10、P_11-20、P_21-30、P_31-40、P_41-60、P_61-100、P_101-255，令P_0-10+P_11-20+P_21-30+P_31-40+P_41-60+P_61-100+P_101-255＝1，利用以下公式对桃整果软化值R进行加权计算：

R＝1*P_0-10+2*P_11-20+4*P_21-30+6*P_31-40+8*P_41-60+10*P_61-100+20*P_101-255，

当桃整果软化值R在5以上，桃果实质地较硬，为未达到商业成熟度，不易收获；当桃整果软化值R在3-5之间，桃果实达到8成熟，达到商业成熟度可以采摘；当桃整果软化值R在2-3时达到9成熟度，适宜食用；当桃整果软化值R在1.5-2时桃果实达到完熟，达到储藏后期，不易继续储藏；当桃整果软化值R在1-1.5时桃果实已经过于成熟，质地基本完全软化，易产生腐坏。