CN108645821A

CN108645821A - 一种微生物浓度测量方法

Info

Publication number: CN108645821A
Application number: CN201810438778.9A
Authority: CN
Inventors: 贾东芬
Original assignee: Beijing Liujiaoti Science & Technology Development Co Ltd
Current assignee: Beijing Liujiaoti Science & Technology Development Co Ltd
Priority date: 2018-05-09
Filing date: 2018-05-09
Publication date: 2018-10-12

Abstract

本发明公开了一种微生物浓度测量方法，包括：（1）配置样品标液，设备初始化，标液加热，恒温36℃；（2）测量不同波长LED不同浓度样品透过率随时间的变化曲线；（3）选择合适波长，使不同浓度的样品标液的透过率随时间变化有明显差异；（4）利用（3）选择波长的LED重新测试样品标液，得到不同浓度的样品透过率随时间的变化曲线；（5）建立样品初始浓度随时间的变化曲线；（6）取被测样品测试透过率，带入（5）所得曲线得该样品的浓度，上传结果。本发明选择合适波长的LED，使不同浓度的微生物样品标液的透过率随时间变化有明显差异，提高了浓度测量分辨率；利用微生物分析系统，测量准确，易于分析数据。

Description

一种微生物浓度测量方法

技术领域

本发明涉及微生物检测领域，尤其涉及一种微生物浓度测量方法。

背景技术

目前，微生物测量领域多采用分光光度法作为分析微生物含量的工具。分光光度法是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸光度或发光强度，对该物质进行定性和定量分析的方法。

当一束强度为的单色光垂直照射某物质的溶液后,由于一部分光被体系吸收,因此透射光的强度降至I,则溶液的透光率T为:

根据朗伯(Lambert)-比尔(Beer)定律:

式中A为吸光度，b为溶液层厚度（cm），c为溶液的浓度（g/dm^3)，a为吸光系数。其中吸光系数与溶液的本性、温度以及波长等因素有关。溶液中其他组分（如溶剂等）对光的吸收可用空白液扣除。

由上式可知，当溶液层厚度b和吸光系数a固定时，吸光度A与溶液的浓度成线性关系。在定量分析时，首先需要测定溶液对不同波长光的吸收情况（吸收光谱），从中确定最大吸收波长然后以此波长的光为光源，测定一系列已知浓度c溶液的吸光度A，作出A和c的工作曲线。在分析未知溶液时，根据测量的吸光度A，查工作曲线即可确定出相应的浓度。

该方法测量微生物浓度，测量数据多，工作量大，而且需要被测样品需在恒温状态下培养与测量，处理困难。

发明内容

本发明针对以上问题，提供了一种微生物浓度测量方法，包括以下步骤：

步骤一：配置不同浓度的微生物样品标液，微生物分析系统进行系统初始化和模块信息获取，并通过微生物分析系统控制微生物分析系统对微生物样品标液进行加热，使微生物样品标液恒温在36℃；

步骤二：使用不同波长的LED在恒温36℃条件下对不同浓度的微生物样品标液进行透过率测试，每5分钟测试一次透过率，共测试5个小时，得到不同浓度下微生物样品透过率随时间的变化曲线；

步骤三：通过得到的透过率曲线，选择合适波长的LED，在该波长下，不同浓度的微生物样品标液的透过率随时间变化有明显差异；

步骤四：利用步骤三中选择的波长的LED重新测试微生物样品标液，每隔5分钟测试一次透过率，测试8个小时后得到该波长下恒温36℃时不同浓度的微生物透过率随时间的变化曲线；

步骤五：取不同浓度下微生物透过率变化超过30%（当前测得的透过率和初始透过率的差占初始透过率的百分比为30%）时所用的时间作为X轴，该时间对应的微生物初始浓度作为Y轴，建立微生物初始浓度随培养时间的变化曲线；

步骤六：取未知浓度的微生物样品液加入培养基后放入微生物分析系统下位机中培养，取透过率变化超过30%的时间带入步骤五中建立的微生物初始浓度随培养时间的变化曲线，可以得出该微生物样品液的浓度，并将测量数据发送到上位机，上位机直接显示测试结果。

本发明选择合适波长的LED，使不同浓度的微生物样品标液的透过率随时间变化有明显差异，提高了浓度测量的分辨率，可对微生物进行定量测量；操作简单明了，无需专业技能也可以熟练使用；显示结果简单明了，警报系统提示是否合格。

附图说明

图1是微生物分析系统总体结构框图；

图2是微生物分析系统电路部分模块框图；

图3是微生物分析系统光路部分示意图；

图4是微生物分析系统下位机工作流程图；

图5是微生物分析系统上位机工作流程图；

图6是利用本发明方法步骤示意图；

图7是利用本发明方法测量大肠杆菌初始浓度与培养时间的变化曲线图；

附图中附图标记所指代的部位名称如下：1—LED、2—毛玻璃、3—被测样品容器、4—传感器一、5—传感器二。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步说明。

本发明的微生物浓度测量方法采用的微生物分析系统，结构框图如图1所示，包括平板电脑、仪器外壳、支架、电源、电路部分和光路部分。电路部分模块框图如图2所示，包括主MCU、从MCU单元、温度获取单元、透过率测量单元、加热模块及打印机；主MCU分别与打印机输入端、加热模块输入端、从MCU单元输入端相连，与透过率测量单元输出端、温度获取单元输出端相连；从MCU单元分别与温度获取单元输入端和透过率测量单元输入端相连。

主MCU采用STM32F103C8T6芯片，负责控制仪器内部的模块以及和平板电脑通信。该产品采用高性能ARM Cortex™-M3 32位RISC内核，工作频率为72 MHz，高速嵌入式存储器（高达128 KB的闪存和高达20 KB的SRAM）以及连接到两个APB总线的广泛的增强型I / O和外设。所有器件提供两个12位ADC，三个通用16位定时器和一个PWM定时器以及标准和高级通信接口：最多两个I2C和SPI，三个USART，USB和CAN。

主MCU通过串口控制四个从MCU，每个从MCU可以实现实时温度获取、透过率测量等功能。

温度获取功能我们使用的是DS18B20这款温度传感器，具有体积小、适用电压宽、性价比高等特点，更宽的电压适用范围，适合于构建自己的经济的测温系统。

加热模块包括加热片、隔热层、导热层。

透过率测量功能使用了LED、TM1926、CD4051、TLV2254、ADS1115等器件组成了信号发射和采集系统，在经过MCU的数据处理得出透过率的值。

TM1926是十二通道LED固定恒流驱动控制专用电路，内部集成有MCU单线数字接口、数据锁存器、LED固定恒流驱动，PWM辉度控制等电路。此芯片可通过单线数字接口（DI、DO）级联，外部控制器只需单线就可控制该芯片和与其级联的后续芯片。TM1926输出端口的PWM辉度可单独通过外部控制器设置。VDD引脚内部集成5V稳压管，外围器件少。此产品性能优良，质量可靠，而且一个芯片只需要一个I/O口就可以控制12通道LED，非常适合微生物分析系统这样使用了大量LED的便携设备。

CD4051是单8通道数字控制模拟电子开关，有三个二进控制输入端A、B、C和INH输入，具有低导通阻抗和很低的截止漏电流。幅值为4.5～20V的数字信号可控制峰值至20V的模拟信号。例如，若VDD＝+5V，VSS＝0，VEE＝-13.5V，则0～5V的数字信号可控制-13.5～4.5V的模拟信号。这些开关电路在整个VDD-VSS和VDD-VEE电源范围内具有极低的静态功耗，与控制信号的逻辑状态无关。当INH输入端＝“1”时，所有的通道截止。三位二进制信号选通8通道中的一通道，可连接该输入端至输出。

TLV2254是德州仪器的四倍低压运算放大器，轨到轨输出性能，可提高单电源或分电源应用中的动态范围。每通道仅消耗34μA的电源电流。这种微功率操作使其成为电池供电应用的良好选择。该系列具有3 V和5 V全功能特性，可针对低电压应用进行优化。噪声性能已经比以前的几代CMOS放大器大大提高。 TLV225x在1kHz时具有19nV / Hz的噪声电平，比竞争性微功率解决方案低四倍。具有高输入阻抗和低噪声的TLV225x非常适用于高阻抗源（如压电换能器）的小信号调理。由于微功耗级别与3 V操作相结合，这些器件在手持式监控和遥感应用中工作良好。此外，轨到轨输出功能具有单个或分离电源，使得该系列成为与模数转换器（ADC）接口的绝佳选择。对于精密应用，TLV225xA系列可用，最大输入失调电压为850μV。

ADS1115是具有16位分辨率的高精度模数转换器 (ADC)。ADS1115具有一个板上基准和振荡器。数据通过一个I2C兼容型串行接口进行传输；可以选择4个I2C从地址。ADS1115能够以高达每秒860个采样数据(SPS)的速率执行转换操作。ADS1115具有一个板上可编程增益放大器(PGA)，该PGA可提供从电源电压到低至±256mV 的输入范围，因而使得能够以高分辨率来测量大信号和小信号。另外，ADS1115还具有一个输入多路复用器 (MUX)，可提供2个差分输入或4个单端输入。ADS1115可工作于连续转换模式或单触发模式，后者在一个转换完成之后将自动断电，从而极大地降低了空闲状态下的电流消耗。

光路部分示意图如图3所示，采用LED作为光源，LED具有工作电压很低、抗冲击和抗震性能好、可靠性高、寿命长等优点，通过调制通过的电流强弱可以方便地调制发光的强弱，传感器一4和传感器二5采用硅光电池。在LED的前方使用一个毛玻璃使LED发出的光均匀，光通过被测样品后在由一个硅光电池接收，在LED的正下方也有一个硅光电池来接收LED直接发出来的光。通过两个光电池来测量同一时刻的LED发出的光并将光信号转变成电信号，可以去除因光源的变化而导致的透过率的变化的因素，大大增加了仪器的稳定性。

根据微生物分析系统的功能需求，微生物分析系统下位机软件工作流程图如图4所示，实现了模块的信息获取功能，当模块没有正确安装或者没有安装时，软件会自动检测并提醒用户模块没有安装正确。

为了可以实现恒温培养的功能，我们加入了对加热片的电源控制以及对模块的温度获取功能，实现一键自动控制温度，无需用户多次操作。

实现对校准数据的存储功能，校准一次可以使用一天，无需用户重复校准，节省了大量的时间和步骤。

上位机是直接和用户交流的工具，工作流程如图5所示，需要有良好的人机交互，具有以下功能：

(1)校准功能：可以保证仪器的准确性。

(2)项目设置：在项目设置中，可以对项目的合格标准、发光波长、曲线建立、测量方式进行设置，满足不同客户、不同样品、不同测试条件的需求。

(3)通道选择：可以选择需要的通道来进行测量。

(4)测量按钮：建立好项目之后，只需要选择需要测量的通道。

(5)加热功能：给微生物提供适合其生长的环境温度，极大的缩短了检测所用的时间。

(6)计时功能：需要定时提醒。

(7)绘图功能：根据检测结果，绘制出透过率随时间的变化曲线。

(8)结果显示：当测试完成后，检测结果直接生成显示。

(9)打印功能：直接打印检测结果。

利用微生物分析系统，测量大肠杆菌样品浓度，如图6所示，步骤如下：

1、分别使用5种波长的LED（460、515、525、595、625nm），对8种不同浓度（0、10、10^2、10^3、10^4、10^5、10^6、10^7cfu/ml）的大肠杆菌被测样品在恒温36℃下进行测试，每5分钟测试一次透过率，共测试5个小时。得到分别在460nm,515nm，525nm,595nm，625nm共计5种波长下不同浓度的大肠杆菌透过率随时间的变化曲线。

2、大肠杆菌初始浓度和透过率之间的建模可以采用如下流程进行：

1)首先我们配制已知浓度（0、10、10^2、10^3、10^4、10^5、10^6、10^7cfu/ml）的大肠杆菌标液，然后将这8种浓度的大肠杆菌溶液加入培养基后，放入微生物分析系统恒温36℃培养，使用525nm波长的光每隔5分钟测试一次透过率，测试8个小时后得到波长525nm下恒温36℃时8种不同浓度的大肠杆菌透过率随时间的变化曲线。

2)然后取不同浓度下大肠杆菌透过率变化超过30%（当前测得的透过率和初始透过率的差占初始透过率的百分比为30%）时所用的时间作为X轴，该时间对应的大肠杆菌初始浓度作为Y轴，建立大肠杆菌初始浓度与培养时间的变化曲线。

3)最后取未知浓度的大肠杆菌样品液加入培养基后放入微生物分析系统中培养，取透过率变化超过30%的时间带入上述2)中建立的大肠杆菌初始浓度与培养时间的变化曲线，可以得出该大肠杆菌样品液的浓度。

大肠杆菌的初始浓度分别为0、10、10^2、10^3、10^4、10^5、10^6、10^7cfu/ml时，放入微生物分析系统中恒温36℃培养，透过率变化超过30%所用的时间分别为496、496、72、384、288、200、128min，得到培养时间和大肠杆菌初始浓度如表1所示。

表1大肠杆菌透过率变化达到30%所用的时间和初始浓度的数值

时间t(min)	浓度c(cfu/ml)
		72	1.00E+07
128	1.00E+06
		200	1.00E+05
288	1.00E+04
		384	1.00E+03
496	1.00E+02
		496	1.00E+01

采用最小二乘法对该数据进行拟合，可以得到大肠杆菌初始浓度随培养时间的变化曲线如图7所示。

Claims

1.一种微生物浓度测量方法，利用微生物分析系统测量微生物浓度，其特征在于：包括以下步骤：

步骤六：取未知浓度的微生物样品液加入培养基后放入微生物分析系统中培养，取透过率变化超过30%的时间带入步骤五中建立的微生物初始浓度随培养时间的变化曲线，可以得出该微生物样品液的浓度，并将测量数据发送到上位机，上位机直接显示测试结果。