CN108588212A

CN108588212A - 一种与子痫前期发生发展相关的基因及其应用

Info

Publication number: CN108588212A
Application number: CN201810407766.XA
Authority: CN
Inventors: 杨承刚; 孙耀兰
Original assignee: Beijing Medintell Bioinformatic Technology Co Ltd
Current assignee: Qingdao Yangshen Biomedical Co Ltd
Priority date: 2018-05-02
Filing date: 2018-05-02
Publication date: 2018-09-28
Anticipated expiration: 2038-05-02
Also published as: CN108588212B

Abstract

本发明公开了一种与子痫前期发生发展相关的基因及其应用，本发明通过高通量测序技术首次发现了AP4E1在子痫前期中显著上调，并通过大样本实验进一步验证了AP4E1的在子痫前期孕妇样本中存在显著性差异表达，沉默该基因的表达发现，不影响早孕绒毛滋养细胞的增殖，但是促进该细胞的侵袭，提示该基因可作为潜在的靶标应用于子痫前期的诊断和治疗。

Description

一种与子痫前期发生发展相关的基因及其应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种与子痫前期发生发展相关的基因及其应用，具体的涉及在子痫前期中显著上调的AP4E1基因。

背景技术

子痫前期，作为妊娠期高血压疾病的其中一个分类，是医学上最常见的妊娠合并症之一，在世界范围内对3％-5％的妊娠妇女造成危害(Ray,J.G.,et al.,Cardiovascularhealth after maternal placental syndromes(CHAMPS):population-basedretrospective cohort study.Lancet,2005.366(9499):p.1797-803.)。在亚洲和非洲，妊娠期高血压疾病占总死亡率的9％。研究表明，近些年来该疾病的发生率呈上升趋势(Berg,C.J.,et al.,Overview of maternal morbidity duringlabor and delivery in theUnited States:1993-1997and Gynecol,2009.113(5):p.1075-81.hospitalization for2001-2005.Obstet)。这种趋势的出现可能与慢性高血压、糖尿病、肥胖等疾病的增加有相关性。该病有种族易感性，且在低收入人群中有高发倾向(Silva,L.M.,et al.,Lowsocioeconomic status is a risk factor for preeclampsia:the Generation R Stu必.J Hypertens,2008.26(6):p.1200-8.)。此外，子痫前期(重度)是造成围生期危重疾病(如休克、肝衰竭)的主要原因(Steegers,E.A.,et al.,Pre-eclampsia.Lancet.376(9741):p.631-44.)。同时该病可能带来严重不良的围生期结局，如胎儿生长受限、早产等。尽管子痫前期在欧洲的发病率仅有2-3‰，但是在发展中国家该病的发病率为在欧洲的10～30倍。严重威胁孕产妇及新生儿的健康。

子痫前期的发病机制，至今尚不清楚。但是主要的几种假说大都将发病机制归结于妊娠早期胎盘形成过程中功能的受损(Pijnenborg,R.,L.Vercruysse,and M.Hanssens,The uterine spiral arteries infacts and controversies.Placenta,2006.27(9-10):p.939-58.)。多种研究表明，子痫前期患者胎盘螺旋动脉腔狭窄、闭锁，诱发大量毒性因子、炎症介质，以及胎盘微血栓的形成；最终导致胎盘血流灌注量的减少，引发一系列妊娠期高血压疾病的症状。

子痫前期疾病发生、发展过程复杂，它是一种多因素疾病，且该疾病变化迅速。国内外的专家学者对其病因和发病机制作了大量的研究工作，提出了许多学说，随着分子生物学研究技术的不断提高和创新，发现基因在子痫前期疾病的发展中起着重要的作用，但是仍缺乏有效的基因应用于子痫前期的诊断和治疗，对该病发病机制及相应治疗方案的研究，仍是目前妇产科领域内一大热点问题。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种与子痫前期发生发展相关的基因标志物，灵敏和特异性的实现子痫前期的诊断和治疗。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面提供了一种试剂，所述试剂能够检测AP4E1基因或其表达产物的水平。

进一步，所述试剂包括：

特异性识别AP4E1基因的探针；或

特异性扩增AP4E1基因的引物；或

特异性结合AP4E1基因编码的蛋白的抗体或配体。

进一步，特异性扩增AP4E1的引物序列如SEQ ID NO.1～2所示。

本发明的第二方面提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括本发明第一方面所述的试剂。

本发明的第三方面提供了一种芯片，所述芯片包括本发明第一方面所述的试剂。

本发明的第四方面提供了一种组合物，所述组合物包括AP4E1的抑制剂。

进一步，所述抑制剂为siRNA；优选的，siRNA的序列如SEQ ID NO.7～8所示。

进一步，所述组合物还包括与所述抑制剂配伍的其他药类以及药学上可接受的载体和/或辅料。

本发明的第五方面提供了一种筛选治疗子痫前期的候选药物的方法，所述方法包括：

用待筛选物质处理表达或含有AP4E1基因或其编码的蛋白的培养体系；和

检测所述体系中AP4E1基因或其编码的蛋白的表达或活性；

其中，若所述待筛选物质可以抑制AP4E1基因的水平或表达活性，则表明该待筛选物质是治疗子痫前期的候选药物。

在本发明中，所述体系包括(但不限于)：细胞体系、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。

在本发明中，所述的步骤还包括：对获得的候选药物进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以从候选药物中进一步选择可以治疗子痫前期的药物。

本发明的第六方面提供了如下任一项所述的应用：

本发明第一方面所述的试剂在制备早期诊断子痫前期的产品中的应用；

本发明第二方面所述的试剂盒在制备诊断子痫前期的产品中的应用；

本发明第三方面所述的芯片在制备诊断子痫前期的产品中的应用；

本发明第四方面所述的组合物在制备治疗子痫前期的药物中的应用；

本发明第五方面所述的方法在筛选治疗子痫前期的候选药物中的应用；

AP4E1在筛选治疗子痫前期的候选药物中的应用。

附图说明

图1是利用QPCR检测AP4E1基因在子痫前期患者中的表达情况；其中，A是胚胎组织中的表达水平，图B是血液中的表达水平；

图2是利用QPCR检测siRNA对AP4E1基因表达的影响图；

图3是利用QPCR检测siRNA对AP4E1蛋白表达的影响图；

图4显示MTT法检测AP4E1对细胞增殖活性的影响图；

图5显示利用transwell小室检测AP4E1基因对细胞侵袭的影响图。

具体的实施方式

本发明经过广泛而深入的研究，通过高通量测序技术，通过检测子痫前期患者和正常孕妇血液中的基因表达水平，发现其中具有明显差异的基因，探讨其与子痫前期的发生之间的关系，从而为子痫前期的早期检测及靶向治疗寻找更好的途径和方法。经过筛选本发明首次发现了AP4E1在子痫前期患者中表达上调，并进一步进行了验证。AP4E1可作为子痫前期的独立预测因子，也可以和其他的基因标志物联合应用。

AP4E1基因

AP4E1基因位于15号染色体长臂2区1带上，本发明中的AP4E1包括野生型、突变型或其片段。在本发明的具体实施例中，AP4E1具有如目前国际公共核酸数据库GeneBank中AP4E1基因(NM_001252127.1)所示的序列。本发明的AP4E1核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。

本发明可以利用本领域内已知的任何方法测定基因表达。本领域技术人员应当理解，测定基因表达的手段不是本发明的重要方面。可以在转录水平上检测生物标志物的表达水平。

检测技术

本发明的基因使用本领域普通技术人员已知的多种技术进行检测，这些技术包括但不限于：核酸测序、核酸杂交、核酸扩增技术、蛋白免疫技术。

核酸测序技术的示例性非限制性实例包括但不限于链终止子(Sanger)测序和染料终止子测序。本领域的普通技术人员将认识到，由于RNA在细胞中不太稳定并且在实验中更易受到核酸酶攻击，因此在测序前通常将RNA逆转录成DNA。

本发明可在检测前或与检测同时地对核酸(例如，ncRNA)进行扩增。核酸扩增技术的示例性非限制性实例包括但不限于：聚合酶链式反应(PCR)、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、转录介导的扩增(TMA)、连接酶链式反应(LCR)、链置换扩增(SDA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。本领域的普通技术人员将认识到，某些扩增技术(例如，PCR)需要在扩增前将RNA逆转录成DNA(例如，RT-PCR)，而其他扩增技术则直接扩增RNA(例如，TMA和NASBA)。

通常称为PCR的聚合酶链式反应使用变性、引物对与相反链的退火以及引物延伸的多个循环，以指数方式增加靶核酸序列的拷贝数；TMA的转录介导的扩增(在基本上恒定的温度、离子强度和pH的条件下自身催化地合成靶核酸序列的多个拷贝，其中靶序列的多个RNA拷贝自身催化地生成另外的拷贝；LCR的连接酶链式反应使用与靶核酸的相邻区域杂交的两组互补DNA寡核苷酸；其他扩增方法包括例如：通常称为NASBA的基于核酸序列的扩增；使用RNA复制酶(通常称为Qβ复制酶)扩增探针分子本身的扩增；基于转录的扩增方法；以及自我维持的序列扩增。

蛋白免疫技术包括(但不限于)夹心免疫测定，例如夹心ELISA，其中使用识别生物标志物上不同表位的两种抗体进行该生物标志物的检测；放射免疫测定(RIA)、直接、间接或对比酶联免疫吸附测定(ELISA)、酶免疫测定(EIA)、荧光免疫测定(FIA)、蛋白质印迹法、免疫沉淀法和基于任何颗粒的免疫测定(如使用金颗粒、银颗粒或乳胶颗粒、磁性颗粒或量子点)。可例如在微量滴定板或条的形式中实施免疫法。

芯片、试剂盒

本发明提供了检测中AP4E1基因的表达水平的产品，所述产品包括(但不限于)芯片或试剂盒。其中芯片包括：固相载体；以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针或抗体，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于AP4E1所示的部分或全部序列，所述抗体特异性的结合AP4E1蛋白。

所述固相载体包括无机载体和有机载体，所述无机载体包括但不限于有硅载体、玻璃载体、陶瓷载体等；所述有机载体包括聚丙烯薄膜、尼龙膜等。

术语“探针”指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分子。除非另有指出，术语“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸(往往称为“靶多核苷酸”)结合的多核苷酸探针。根据杂交条件的严格性，探针能和与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合。探针可作直接或间接的标记，其范围包括引物。杂交方式，包括，但不限于：溶液相、固相、混合相或原位杂交测定法。

本发明中的示例性探针包括PCR引物以及基因特异性DNA寡核苷酸探针，例如固定于微阵列基底上的微阵列探针、定量核酸酶保护检验探针、与分子条形码连接的探针、以及固定于珠上的探针。

这些探针具有与靶点基因的特定的碱基序列互补的碱基序列。这里，所谓“互补”，只要是杂交即可，可以不是完全互补。这些多核苷酸通常相对于该特定的碱基序列具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、特别优选100％的同源性。这些探针可以是DNA，也可以是RNA，另外，可以为在其一部分或全部中核苷酸通过PNA、LNA、ENA、GNA、TNA等人工核酸置换得到的多核苷酸。

本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒可用于检测AP4E1的表达。优选的，所述的制剂或试剂盒中还含有用于标记RNA样品的标记物，以及与所述标记物相对应的底物。此外，所述的试剂盒中还可包括用于提取RNA、PCR、杂交、显色等所需的各种试剂，包括但不限于：抽提液、扩增液、杂交液、酶、对照液、显色液、洗液等。此外，所述的试剂盒中还包括使用说明书和/或芯片图像分析软件。

抑制剂和药物组合物

基于本发明的发现，本发明提供了一种(药物)组合物，所述(药物)组合物包含AP4E1的抑制剂。在本发明中，组合物，药物组合物以及药物没有特殊说明，可以进行等同替代。

在本发明中，所述的AP4E1的抑制剂包括抑制AP4E1基因表达的物质、影响AP4E1基因表达产物稳定性的物质、和/或抑制AP4E1基因表达产物活性的物质，作为对于降低AP4E1基因的表达或活性有用的物质，从而可用于治疗子痫前期。举例来说，本发明的抑制剂可以是以AP4E1基因为靶序列、且能够抑制AP4E1基因的干扰分子，包括：shRNA(小发夹RNA)、小干扰RNA(siRNA)、dsRNA、微小RNA、反义核酸，或能表达或形成所述shRNA、小干扰RNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸的构建物。本发明的抑制剂也可以是以靶向AP4E1蛋白的物质，包括抗体、配体、多肽等。

作为本发明的一种优选方式，所述AP4E1的抑制剂是一种AP4E1特异性的小干扰RNA分子。如本文所用，所述的“小干扰RNA”是指一种短片段双链RNA分子，能够以同源互补序列的mRNA为靶目标降解特定的mRNA，这个过程就是RNA干扰(RNAinterference)过程。小干扰RNA可以制备成双链核酸的形式，它含有一个正义链和一个反义链，这两条链仅在杂交的条件下形成双链。一个双链RNA复合物可以由相互分离的正义链和反义链来制备。因此，举例来讲，互补的正义链和反义链是化学合成的，其后可通过退火杂交，产生合成的双链RNA复合物。

在筛选有效的siRNA序列时，本发明人通过大量的比对分析，从而找出最佳的有效片段。本发明人设计合成了多种siRNA序列，并将它们分别通过转染试剂转染人早孕绒毛滋养细胞系进行验证，选出干扰效果最佳的siRNA，进一步地在细胞水平实验，结果证明对于该siRNA在能有效的抑制细胞中AP4E1基因的表达水平，以促进妊娠滋养细胞的增殖。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如卡拉霉素、庆大霉素、潮霉素、氨苄青霉素抗性。

在本发明中，是本领域已知的各种载体，如市售的载体、包括质粒、粘粒、噬菌体、病毒等。表达载体向宿主细胞中的导入可以使用电穿孔法、磷酸钙法、脂质体法、DEAE葡聚糖法、显微注射、病毒感染、脂质体转染、与细胞膜透过性肽的结合等周知的方法。

术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如CHO细胞、COS细胞等。

在本发明中，药学上可接受的载体，所述载体包括但不限于粘合剂、增甜剂、崩解剂、稀释剂、调味剂、包衣剂、防腐剂、润滑剂和/或延时剂(timedelayagent)。合适的粘合剂包括阿拉伯胶、明胶、玉米淀粉、黄耆树胶、海藻酸钠、羧甲基纤维素或聚乙二醇。合适的增甜剂包括蔗糖、乳糖、葡萄糖、阿斯巴特或糖精。合适的崩解剂包括玉米淀粉、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、瓜尔胶、黄原胶、膨润土、藻酸或琼脂。合适的稀释剂包括乳糖、山梨醇、甘露醇、右旋糖、高岭土、纤维素、碳酸钙、硅酸钙或磷酸二钙。合适的调味剂包括薄荷油、冬青油、樱桃、柑橘或树莓调味剂。合适的包衣剂包括丙烯酸和/或甲基丙烯酸和/或它们的酯类的聚合物或共聚物、蜡、脂肪醇、玉米蛋白、虫胶或麸质。合适的防腐剂包括苯甲酸钠、维生素E、α-生育酚、抗坏血酸、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯或亚硫酸氢钠。合适的润滑剂包括硬脂酸镁、硬脂酸、油酸钠、氯化钠或滑石。合适的延时剂包括单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。本发明中的药物组合物还可以包括稳定剂、杀菌剂、缓冲剂、等渗剂、螯合剂、pH控制剂及表面活性剂等添加剂。

本发明的药物还可与其他治疗子痫前期的药物联用，其他治疗性化合物可以与主要的活性成分同时给药，甚至在同一组合物中同时给药。还可以以单独的组合物或与主要的活性成分不同的剂量形式单独给予其它治疗性化合物。主要成分的部分剂量可以与其它治疗性化合物同时给药，而其它剂量可以单独给药。在治疗过程中，可以根据症状的严重程度、复发的频率和治疗方案的生理应答，调整本发明药物组合物的剂量。

下面结合具体的实施例进一步说明本发明，本发明的实施例仅用于解释本发明，并不意味着限制本发明的保护范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1筛选与子痫前期相关的基因标志物

1、样品收集

1)血清标本的收集

各收集45例正常孕妇与未接受治疗的子痫前期患者的血液，EDTA抗凝管静置10min，离心分离血清，-20℃保存备用。

2)胎盘标本的收集

各收集45例子痫前期和正常孕妇的胎盘组织，生理盐水漂洗2次，去除水分后分装于冻存管内，-80℃保存备用。

两组均排除多胎妊娠、传染性疾病、化学药物依赖、孕妇吸烟、胎儿先天畸形及其他妊娠合并症及并发症，所有纳入的研究对象均于收集标本前签署知情同意书。上述所有标本的取得均通过组织伦理委员会的同意。每组各取5例标本进行基因表达谱的检测分析，进行差异表达基因的筛选，并在各组全部45例标本中进行验证实验。

2、RNA样品的制备

利用QIAGEN的组织RNA提取试剂盒提取胚胎组织中的总RNA，具体步骤参考说明书。

3、RNA样品的质量分析

将上述提取的RNA进行琼脂糖凝胶电泳，利用Nanodrop2000对所提RNA的浓度和纯度进行检测，琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，Agilent2100测定RIN值。单次建库要求RNA总量5μg，浓度≥200ng/μL，OD260/280介于1.8～2.2之间。

4、去除rRNA

使用Ribo-Zero试剂盒除去总RNA中的核糖体RNA。

5、构建cDNA文库

利用Illumina TruseqTM RNA sample Prep Kit进行cDNA文库的构建，具体操作按说明书进行。

6、上机测序

使用Illumina X-Ten测序平台对cDNA文库进行测序，具体操作按说明书进行。

7、高通量转录组测序数据分析

对测序结果进行生物信息学分析，利用TopHat v1.3.1进行RNA-seq读段定位，通过Cufflinks v1.0.3将RNA-seq片段数目进行标准化计算转录本的相对丰度，利用cuffdiff检测差异表达，当p值<0.05时，认为基因显著差异表达。

8、结果

RNA-seq结果显示，与正常孕妇的胚胎组织相比，AP4E1基因在子痫前期胎盘组织中的表达量显著上调。

实施例2 QPCR测序验证AP4E1基因的差异表达

1、对AP4E1基因差异表达进行大样本QPCR验证。

2、RNA提取

利用QIAGEN的组织RNA提取试剂盒提取胚胎组织中的总RNA，血液RNA提取试剂盒提取血清中的RNA，具体步骤参考说明书。

3、逆转录：

1)加入dNTP mixture1μl，Oligo dT primer 1μl，总RNA 2μg，加Rnase FreeddH₂O使总体积至10μl，在PCR仪上进行变性、退火反应，65℃，5min，反应完成后置于4℃。

2)构建20μl反应体系，继续加入5×Primer Script Buffer 4μl，RNaseInhibitor 0.5μl，Prime Script RTase 0.5μl，RNase Free ddH₂O 5.0μl，在PCR仪上按下列条件进行反转录反应：42℃15～30min，95℃5min，反应完成之后，置于冰上。

3)水浴锅中42℃加热15min，95℃加热3min，-20℃储存备用。

4、QPCR检测AP4E1的表达水平

1)引物设计

根据Genebank中AP4E1基因和GAPDH基因的编码序列设计QPCR扩增引物，由博迈德生物公司合成。具体引物序列如下：

AP4E1基因：

正向引物为5’-CACGATACAGGAGACAAG-3’(SEQ ID NO.1)；

反向引物为5’-AGACAGACTACAATATGAGAAT-3’(SEQ ID NO.2)。

管家基因GAPDH的引物序列为：

正向引物：5’-CTCTGGTAAAGTGGATATTGT-3’(SEQ ID NO.3)

反向引物：5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’(SEQ ID NO.4)

2)PCR反应体系：正向引物和反向引物各1μl，SYBR Green PCR master mix 10μl，cDNA 1μl，ddH₂O 7μl。

3)PCR反应条件：95℃10min，(95℃10s，60℃30s，72℃15s)×40个循环，65℃～95℃，温度升高速度0.5℃/5s。在Bio-Rad iQ5荧光定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。

5、统计学方法

以GAPDH为内参，计算子痫前期胎盘组织与正常胎盘组织，子痫前期患者血液与正常孕妇血液中AP4E1荧光定量RT-PCR的实验结果，采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析，两者之间的差异采用t检验，以P<0.05具有统计学差异。

6、结果

结果如图1所示，与正常孕妇相比，子痫前期孕妇中AP4E1基因表达显著上调，差异具有统计学意义(P<0.05)。

胚胎组织中的阳性检出率＝上调表达例数/总检测例数×100％＝43/45×100％＝95.6％，血液中的阳性检出率为41/45×100％＝91.1％，提示检测血液或胚胎组织中AP4E1的表达水平可以用于子痫前期的辅助诊断。

实施例3 AP4E1基因的沉默

1、细胞培养

人早孕绒毛滋养细胞株(HTR-8/SVneo)用含10％胎牛血清的RPIM-1640培养基在37℃、5％CO₂的培养箱中培养。2-3天换液1次，使用0.25％含EDTA的胰蛋白酶常规消化传代。

2、siRNA设计

针对AP4E1基因的siRNA序列：

阴性对照siRNA序列(siRNA-NC)：

正义链为5’-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3’(SEQ ID NO.5)，

反义链为5’-ACGUGACACGUUCGGAGAA-3’(SEQ ID NO.6)；

SIRNA1：

正义链为5’-UUCACAAUAUAUAAGUCUCAC-3’(SEQ ID NO.7)，

反义链为5’-GAGACUUAUAUAUUGUGAAAU-3’(SEQ ID NO.8)；

SIRNA2：

正义链为5’-UACUCUUUUUUCUAAGAGGUU-3’(SEQ ID NO.9)，

反义链为5’-CCUCUUAGAAAAAAGAGUAGG-3’(SEQ ID NO.10)；

SIRNA3：

正义链为5’-UAGCAUAUGUGACAUUGUGAU-3’(SEQ ID NO.11)，

反义链为5’-CACAAUGUCACAUAUGCUAUU-3’(SEQ ID NO.12)；

将细胞按1×10⁵/孔接种到六孔细胞培养板中，在37℃、5％CO₂培养箱中细胞培养24h，在无双抗、含10％FBS的RPIM-1640培养基中，转染按照脂质体转染试剂3000(购自于Invitrogen公司)的说明书转染。

将实验分为三组：对照组(HTR-8/SVneo)、阴性对照组(siRNA-NC)和实验组(siRNA1、siRNA2、siRNA3)，其中阴性对照组siRNA与AP4E1基因的序列无同源性，浓度为20nM/孔，同时分别进行转染。

3、QPCR检测AP4E1基因的转录水平

3.1细胞总RNA的提取

采用QIAGEN的细胞RNA提取试剂盒进行细胞总RNA的提取，具体步骤详见试剂盒说明书

3.2逆转录步骤同实施例2。

3.3 QPCR扩增步骤同实施例2。

4、统计学方法

实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析的，干扰AP4E1基因表达组与对照组之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

5、结果

结果如图2显示，相比对照组HTR-8/SVneo和转染空载siRNA-NC，实验组能够显著降低AP4E1基因的表达水平，而，其中siRNA1的效果最为显著，因此选择siRNA1进行后续的实验。

实施例4 ELISA检测HTR-8/SVneo细胞中AP4E1的蛋白表达

应用双抗体夹心酶标免疫(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA)分析法测定HTR-8/SVneo细胞上清中AP4E1蛋白水平。RNA干扰后第六天，分别收集三组HTR-8/SVneo细胞的上清液，按照ELISA试剂盒操作流程定量检测肿瘤细胞上清液中AP4E1的浓度。

1、配置浓度为70000pg/ml的标准品，10倍稀释后，再进行2倍倍比稀释，共有7个稀释度。

2、加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液50μl，余孔分别加不同浓度梯度的标准品和待测样品各50μl。轻轻晃动混匀，酶标板加上盖，37℃反应2h。

3、弃去液体，晾干。每孔加200μl VEGF-C结合物。37℃，120min后，弃去孔内液体，晾干，PBS洗板3次。

4、依序每孔加底物溶液200μl，37℃避光显色30min。

5、依序每孔加终止溶液50μl，终止反应。

6、用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度(OD值)。所有标准品和待测样品的OD值均需减去零孔的OD值以得到校正值。

7、计算样品的实际浓度。

8、结果如下图3所示，siRNA沉默HTR-8/SVneo细胞的AP4E1基因，AP4E1的蛋白含量也相应降低，说明沉默AP4E1基因可以抑制AP4E1蛋白的水平。

实施例5 MTT法检测HTR-8/SVneo细胞增殖活性

1、细胞转染后24h，,0.25％胰蛋白酶消化，培养基重悬后计数，稀释细

胞悬液，按每孔调整浓度控制在10⁴个/ml；

2、按每孔150μl将细胞接种至96孔板，复设5个平行孔；

3、分别于转染1～6天时，弃掉各孔培养基，加入MTT培养液100μl(0.5mg/ml)继续培养5h。弃去MTT培养液，每孔加入150μl DMSO溶解MTT还原物甲瓒，摇床上震荡10min，使结晶物充分溶解，酶联免疫仪检测490nm处吸光度值；

4、统计每天的细胞吸光度值，得到的数值用曲线图表示。

5、结果

结果如图4所示，对照与转染siRNA1组的细胞的增殖水平无明显的差异。

实施例7 Transwell细胞体外侵袭实验

RNA干扰后第六天收集不同组别的HTR-8/SVneo细胞，重悬于培养液中，使细胞终浓度为10⁶/ml，吸取100μl细胞悬液加入Transwell小室中。应用Transwell小室方法观察AP4E1基因沉默对HTR-8/SVneo细胞侵袭性的影响。

1、将Matrigel放入4℃融化，准备冰盒(冰浴环境)。Matrigel用RPIM-1640稀释后使用，终浓度为1mg/ml。

2、取出预冷的Transwell小室放入24孔板中，向每个Transwell小室膜上均匀加入稀释好的Matrigel胶50μ1，37℃，细胞培养箱放置3～4h使胶凝聚。

3、收集对数生长期的细胞，重悬于培养液中，终浓度为10⁶/ml，轻轻加100μ1细胞悬液入小室。

4、24孔板中加入600μ1含20％血清的培养基，37℃、5％CO₂孵箱内孵育36h。

5、棉签轻轻地擦净Transwell孔内Matrigel胶和细胞，用甲醛固定小室底端的细胞，室温放置25min，取出小室后晾干。

6、0.4％结晶紫染色10min，生理盐水快速洗涤三次，甩干后显微镜下观察，随机选择八个不同的视野照相并计数，统计结果并分析。

7、数据处理

用SPSS18.0软件对数据进行统计学分析。计量资料用均数±标准差表示。多个样本均数比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

8、结果

结果如图5所示，HTR-8/SVneo、siRNA1、siRNA-NC在Transwell小室中培养后，siRNA1组细胞膜下室面的细胞数增加，说明AP4E1基因影响早孕绒毛滋养细胞的浸润，提示AP4E1可作为潜在靶标应用于子痫前期孕妇的治疗。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 北京泱深生物信息技术有限公司

<120> 一种与子痫前期发生发展相关的基因及其应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cacgatacag gagacaag 18

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agacagacta caatatgaga at 22

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctctggtaaa gtggatattg t 21

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggtggaatca tattggaaca 20

<210> 5

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

uucuccgaac gugucacgu 19

<210> 6

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

acgugacacg uucggagaa 19

<210> 7

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

uucacaauau auaagucuca c 21

<210> 8

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gagacuuaua uauugugaaa u 21

<210> 9

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

uacucuuuuu ucuaagaggu u 21

<210> 10

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ccucuuagaa aaaagaguag g 21

<210> 11

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

uagcauaugu gacauuguga u 21

<210> 12

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cacaauguca cauaugcuau u 21

Claims

1.一种试剂，其特征在于，所述试剂能够检测AP4E1基因或其表达产物的水平。

2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，包括：

特异性识别AP4E1基因的探针；或

特异性扩增AP4E1基因的引物；或

特异性结合AP4E1基因编码的蛋白的抗体或配体。

3.根据权利要求2所述的试剂，其特征在于，特异性扩增AP4E1的引物序列如SEQ IDNO.1～2所示。

4.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-3任一项所述的试剂。

5.一种芯片，其特征在于，所述芯片包括权利要求1-3任一项所述的试剂。

6.一种组合物，其特征在于，所述组合物包括AP4E1的抑制剂。

7.根据权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述抑制剂为siRNA；优选的，siRNA的序列如SEQ ID NO.7～8所示。

8.根据权利要求6或7所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括与所述抑制剂配伍的其他药类以及药学上可接受的载体和/或辅料。

9.一种筛选治疗子痫前期的候选药物的方法，其特征在于，所述方法包括：

检测所述体系中AP4E1基因或其编码的蛋白的表达或活性；

10.如下任一项所述的应用：

a.权利要求1-3任一项所述的试剂在制备早期诊断子痫前期的产品中的应用；

b.权利要求4所述的试剂盒在制备诊断子痫前期的产品中的应用；

c.权利要求5所述的芯片在制备诊断子痫前期的产品中的应用；

d.权利要求6-8任一项所述的组合物在制备治疗子痫前期的药物中的应用；

e.权利要求9所述的方法在筛选治疗子痫前期的候选药物中的应用；

f.AP4E1在筛选治疗子痫前期的候选药物中的应用。