CN108578390B - 含有奥利司他的纳米微球在制备抗肿瘤药物中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及医药技术领域，特别涉及一种含有奥利司他的纳米微球在制备抗肿瘤药物中的用途。所述的纳米微球包含有奥利司他和选自维生素A甲基丙烯酸酯‑2‑甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱共聚物或维生素E甲基丙烯酸酯‑2‑甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱共聚物或维生素D2甲基丙烯酸酯‑2‑甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱共聚物中的一种共聚物。体外试验结果显示，本发明提供的纳米微球对人前列腺癌细胞DU145、人黑色素瘤细胞A375与人胰腺癌细胞株bxpc‑3的抗肿瘤活性显著高于单独给予奥利司他，并且比采用PMB30W作为载体制备的对照纳米微球以及含有奥利司他和聚乙二醇‑聚己内酯的纳米微球的抗肿瘤活性更佳。

Description

含有奥利司他的纳米微球在制备抗肿瘤药物中的用途
技术领域
本发明涉及医药技术领域，特别涉及一种含有奥利司他的纳米微球在制备抗肿瘤药物中的用途。
背景技术
脂肪酸合成酶(Fatty acid synthase，下文简称FAS)是脂肪酸合成的关键酶，该酶在正常细胞组织中处于低表达低活性状态，而在乳腺癌、前列腺癌、黑色素瘤、胰腺癌、视网膜母细胞瘤等肿瘤组织具有较高的表达水平，因此，当前FAS被广泛认为是一个较理想的抗肿瘤治疗靶点。
奥利司他(Orlistat)是上个世纪九十年代末在欧美上市、本世纪初在中国上市的脂肪酶抑制剂类减肥药，同时还具有脂肪酶抑制剂的活性，因此该药的抗肿瘤作用近年来越来越受关注。药理学试验显示，奥利司他可通过以下途径发挥其抗肿瘤作用：①直接作用于FAS；②抑制肿瘤细胞增殖，包括Ⅰ、干扰磷酯生物膜与新陈代谢，Ⅱ、诱导细胞周期阻滞；③诱导肿瘤细胞凋亡，包括Ⅰ、阻断细胞信号传导通路，Ⅱ、调控基因与相关蛋白；④抑制肿瘤的侵袭与转移，包括Ⅰ、抑制肿瘤血管形成，Ⅱ、细胞伪足，Ⅲ、调控黏附分子的表达；⑤逆转肿瘤细胞的耐药性。
奥利司他作用抗肿瘤药物的开发面临以下两个限制性问题：①常规口服制剂中的奥利司他生物利用度极低(<2％)，使其无法通过口服给药用于肿瘤的治疗；②奥利司他在水中的溶解度极低(<0.001g/100mL)，使其无法制成液体制剂通过注射给药用于肿瘤的治疗。
纳米技术(Nanotechnology)的定义为“生产或加工纳米级材料或操纵纳米级物体的能力”，自其兴起以来，就很快地被药学科技人员所关注，并应用于药物递送(DrugDelivery)领域，其中可用于口服与/或注射药物的纳米给药系统包括：脂质体、聚合物纳米球/纳米囊、固体脂质纳米粒、微乳、纳米乳、自乳化纳米乳、聚合物胶束、枝状共聚物、纳米药物晶体等。口服与或纳米给药系统具有以下特点：①载药微球的粒径在10～1000nm范围内，比表面积显着增大；②增加药物溶解度；③提高口服药物的溶出速率；④增强载药粒子(口服)的胃肠道黏膜黏附性；⑤增强口服药物的胃肠道稳定性；⑥增强载药粒子在起效部位或吸收部位的停留时间及面积；⑦增强药物的跨越黏膜屏障能力；⑧提高药物的口服生物利用度；⑨某些口服纳米给药系统还有缓释、控释、靶向功能等。
Andrej Dolenc等人(International Journal ofPharmaceutics,2010,(396)1～2:149～155)将奥利司他分散于吐温-80、聚维酮K-30、泊洛沙姆-188与十二烷基硫酸化等各种稳定剂的水溶液中，并通过熔融乳化法制备了纳米级别的奥利司他，所述纳米级别的奥利司他的体外溶出率显著高于原料药。
中国专利CN107412196A公开了一种由奥利司他与聚乙二醇-聚己内酯组成的纳米微球，该微球改变了奥利司他的疏水性质，并通过微球的缓释特征，可用于制备抗肿瘤药物。但该纳米微球对载体中聚乙二醇的含量要求比较严格，聚乙二醇含量高则无法得到稳定的微球，聚乙二醇含量低不利于药物的释放。
发明内容
现有技术披露2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱(MPC)与甲基丙烯酸丁酯(BMA)形成的共聚物(PMB)具有良好的生物兼容性与可降解性。本发明研究人员在前期试验中发现，当采用维生素A、D2与E替代丁醇与甲基丙烯酸成酯后再与MPC形成共聚物，再用该共聚物作为载体制备的奥利司他纳米微球的包封率、体内缓释效果与对相关肿瘤细胞株的抑制作用均有显着提高，这一发现令人惊讶，因为无法预测向该共聚物结构中引入何种基团能提高以该聚合物为载体的奥利司他纳米微球的包封率及相关的药理指标。
基于此，本发明的目的在于提供一种含有奥利司他的纳米微球在制备抗肿瘤药物中的用途。
首先，本发明根据下图所示的反应路线合成制备得到了共聚物1a～1c，并对共聚物1a～1c进行了结构确证。
为了实现以上的目的，首先，本发明根据下图所示的反应路线合成制备得到了共聚物1a～1c，并对共聚物1a～1c进行了结构确证。
上反应式中，化合物2为甲基丙烯酸，CAS号79-41-4，是常用的化工原料之一。
化合物4为2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱(MPC)，可以为市售产品，也可参考Ishihara K et al.(Polym J 1990；22:355–360.)与Ueda T etal.(Polym J 1992；24:1259–1269.)所披露的方法制备得到。
ROH为选自维生素A、维生素E或维生素D2中的一种脂溶性维生素。
上反应式中，化合物2和ROH进行酰化反应，分别生成化合物3a～3c。
所述步骤a的反应试剂、条件与操作方法为：N，N’-二环己基二亚胺(DCC)或4-二甲氨基吡啶(DMAP)，石油醚，50～60℃。该步骤为常规的酰化反应，其操作可根据但不限于闻韧主编的《药物合成反应》(化学工业出版社2017年4月出版)与刘祥洪等人发表的《一步法合成维生素A棕榈酸酯》(广州化工，2011年第39卷第14期，63～64)披露的方法进行。所述的甲基丙烯酸：ROH的摩尔比在1:1～2:1之间。
进一步地，化合物3a～3c与化合物4反应生成共聚物1a～1c。
所述步骤b的反应试剂、条件与操作方法为：偶氮二异丁腈(AIBN)，甲醇/四氢呋喃(MeOH/THF)。该步骤操作可根据Kazuhiko Ishihara et al.发表的Preparation ofPhospholipidPolymers and TheirProperties asPolymerHydrogelMembranes.(PolymerJournal，Volume 22，Issue 5，355～360)所披露的方法进行，并根据该文献披露的方法对制备得到的共聚物1a～1c进行结构确证。
具体地，上述步骤b中化合物3a～3c与化合物4的投料比确认方法为：以1：1作为化合物3a～3c中每一种化合物与化合物4的最低摩尔投料比，并以所得共聚物在水中的溶解度≥50mg/mL为指标，确定了化合物3a～3c中每一种化合物与化合物4的最大摩尔投料比，结果如表1所示。
表1步骤b中两种反应物的最大摩尔投料比
反应物 最大摩尔投料比
化合物3a：化合物4 4:1
化合物3b：化合物4 7:3
化合物3c：化合物4 6:4
具体地，上述反应式中共聚物1a～1c结构式中取代基R的定义，以及对应的制备原料、中间产物如下表2所示。
表2共聚物1a～1c结构式中取代基R的定义及对应的制备原料、中间产物
进一步地，本发明对共聚物1a～1c的结构进行确证，具体为如下：
(1)1H-NMR
本发明采用1H-NMR(400Hz，CDCl3)，对前述每一步反应的原料与产物进行了结构确证，并通过比较产品与原料1H-NMR图谱数据的异同，来断定反应的发生。
(2)共聚物1a～1c结构式中m:n比的计算
本发明通过计算共聚物1a～1c的1H-NMR图谱中-N+(CH3)3氢的特征峰的峰面积占总氢峰面积的比例，计算了共聚物1a～1c结构式中的m:n比。
(3)共聚物1a～1c的分子量测定
本发明采用本领域技术人员所熟知的凝胶渗透色谱法(GPC)，并以THF作为溶剂，以聚苯乙烯作为对照，测定了前述所得各种m:n比的共聚物1a～1c的分子量。
进一步地，所述的共聚物1a～1c的结构式如下图所示：
其中，若所述共聚物是共聚物1a，则其结构式中的m:n比在62:38～82:18之间，优选为82:18；
若所述共聚物是共聚物1b，则其结构式中的m:n比在62:38～76:24之间，优选为76:24；
若所述共聚物是共聚物1c，则其结构式中的m:n比在64:36～68:32之间，优选为68:32。
进一步地，为了验证共聚物1a～1c对奥利司他水溶性是否具有增强作用，本发明人进行了奥利司他在共聚物1a～1c水溶液中的溶解度测定，具体采用《中国药典》(2015版)中规定的方法测定了奥利司他在前述共聚物1a～1c的50mg/mL水溶液中的溶解度，特别的，本发明测定了奥利司他在最大与最小摩尔投料比下所得共聚物1a～1c的50mg/mL水溶液中的溶解度，从而验证了共聚物1a～1c对奥利司他水溶性的增强作用。
基于此，本发明提供了一种包含有奥利司他与共聚物1a或共聚物1b或共聚物1c的纳米微球，纳米微球的单个微球中的共聚物的重复单元与m:n比都是固定的。
进一步地，所述的奥利司他纳米微球通过溶剂挥发法制得，具体地，包括以下步骤：
(1)将奥利司他与前述共聚物1a或共聚物1b或共聚物1c溶于分散相中，超声波超声充分溶解制成油相；
(2)将步骤(1)所得的油相逐滴注射到表面活性剂中，搅拌形成第一次乳液；
(3)将步骤(2)所得的第一次乳液注射到表面乳化剂中，搅拌下直至有机溶剂挥发完全，形成第二次乳液；
(4)将步骤(3)所得的第二次乳液离心，再用去离子水洗涤，收集微球，干燥，密封保存。
其中，步骤(1)中所述分散相是选自乙醇、丙酮、甲氢呋喃、甲醇中的一种或多种的混合物；步骤(2)与步骤(3)中所述表面活性剂是选自聚乙烯、聚乙烯醇、吐湿-80、明胶、羟丙甲基纤维素、聚山梨酯中的一种。
进一步地，本发明以包封率为指标，优化了前述优选m:n比的各共聚物与奥利司他在纳米微球中的质量比，具体为如下：
对于含有奥利司他与前述m:n比为82:18的共聚物1a的纳米微球而言，其中，奥利司他与共聚物1a的质量比优选为1:3.6～1:1.8，更优选为1:3～1:2，最优选的质量比为1:2.6。
对于含有奥利司他与前述m:n比为76:24的共聚物1b的纳米微球而言，其中奥利司他与共聚物1b的质量比优选为1:4.4～2.6，更优选为1:4～1:2.8，最优选的质量比为1:3.4。
对于含有奥利司他与前述m:n比为68:32的共聚物1c的纳米微球而言，其中奥利司他与共聚物1c的质量比优选为1:3.8～1:2.2，更优选为1:3.2～1:2.6，最优选的质量比为1:3。
本发明人惊讶的发现，所制备得到的纳米微球1a-2Ⅱ、纳米微球1b-2Ⅱ、纳米微球1c-2Ⅱ对人前列腺癌细胞DU145、人黑色素瘤细胞A375、人胰腺癌细胞株bxpc-3均具有良好的抑制增殖效果，明显优于单独给予奥利司他的抑制增殖效果，并且比依据公开号为CN107412196A的中国专利申请提供的方法制得的含有奥利司他和聚乙二醇-聚己内酯的纳米微球和以PMB30W作为载体制备的对照纳米微球的抑制增殖效果佳，表明，本发明提供的奥利司他纳米微球可用于制备抗肿瘤的药物。
具体地，本发明提供的奥利司他纳米微球可用于制备用于治疗前列腺癌、黑色素瘤与胰腺癌的抗肿瘤药物，所述的抗肿瘤药物可口服给药，也可注射给药。
与现有技术相比，本发明的优势在于：
(1)本发明提供的纳米微球具有良好的包封率，而且包封率显着高于采用PMB30W作为载体所制备得到的纳米微球(即对照纳米微球)。
(2)动物试验结果显示，以表示血药浓度的峰面积为指标，本发明提供的最优选的奥利司他纳米微球口服给药后奥利司他的吸收良好，其吸收水平显著高于采用PMB30W作为载体所制备的对照纳米微球。
(3)体外试验结果显示，以半数抑制浓度(IC50)为指标，本发明提供的最优选的奥利司他纳米微球对人前列腺癌细胞DU145、人黑色素瘤细胞A375与人胰腺癌细胞株bxpc-3的抗肿瘤活性显著高于单独给予奥利司他，并且比采用PMB30W作为载体制备的对照纳米微球以及含有奥利司他和聚乙二醇-聚己内酯的纳米微球的抗肿瘤活性更佳。
附图说明
图1为含有奥利司他与共聚物1a-2的纳米微球的包封率与两种成分质量比的关系图。
图2为含有奥利司他与共聚物1b-2的纳米微球的包封率与两种成分质量比的关系图。
图3为含有奥利司他与共聚物1c-2的纳米微球的包封率与两种成分质量比的关系图。
图4为含有奥利司他与PBM30W的纳米微球的包封率与两种成分质量比的关系图。
图5为奥利司他与纳米微球在大鼠体内的血浆药物浓度的时间变化曲线图。
图6为阿霉素对人前列腺癌细胞DU145的抗肿瘤活性的浓度效应曲线图。
图7为奥利司他对人前列腺癌细胞DU145抗肿瘤活性的浓度效应曲线图。
图8为纳米微球1a-2Ⅱ对人前列腺癌细胞DU145抗肿瘤活性的浓度效应曲线图。
图9为纳米微球1b-2Ⅱ对人前列腺癌细胞DU145抗肿瘤活性的浓度效应曲线图。
图10为纳米微球1c-2Ⅱ对人前列腺癌细胞DU145的抗肿瘤活性的浓度效应曲线图。
图11为对照纳米微球对人前列腺癌细胞DU145的抗肿瘤活性的浓度效应曲线图。
图12为参考专利微球对人前列腺癌细胞DU145的抗肿瘤活性的浓度效应曲线图。
图13为阿霉素对人黑色素瘤细胞A375的抗肿瘤活性的浓度效应曲线图。
图14为奥利司他对人黑色素瘤细胞A375的抗肿瘤活性的浓度效应曲线图。
图15为纳米微球1a-2Ⅱ对人黑色素瘤细胞A375的抗肿瘤活性的浓度效应曲线图。
图16为纳米微球1b-2Ⅱ对人黑色素瘤细胞A375的抗肿瘤活性的浓度效应曲线图。
图17为纳米微球1c-2Ⅱ对人黑色素瘤细胞A375的抗肿瘤活性的浓度效应曲线图。
图18为对照纳米微球对人黑色素瘤细胞A375的抗肿瘤活性的浓度效应曲线图。
图19为参考专利微球对人黑色素瘤细胞A375的抗肿瘤活性的浓度效应曲线图。
图20为阿霉素对人胰腺癌细胞株bxpc-3的抗肿瘤活性的浓度效应曲线图。
图21为奥利司他对人胰腺癌细胞株bxpc-3的抗肿瘤活性的浓度效应曲线图。
图22为纳米微球1a-2Ⅱ对人胰腺癌细胞株bxpc-3的抗肿瘤活性的浓度效应曲线图。
图23为纳米微球1b-2Ⅱ对人胰腺癌细胞株bxpc-3的抗肿瘤活性的浓度效应曲线图。
图24为纳米微球1c-2Ⅱ对人胰腺癌细胞株bxpc-3的抗肿瘤活性的浓度效应曲线图。
图25为对照纳米微球对人胰腺癌细胞株bxpc-3的抗肿瘤活性的浓度效应曲线图。
图26为参考专利微球对人胰腺癌细胞株bxpc-3的抗肿瘤活性的浓度效应曲线图。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1维生素A甲基丙烯酸酯(化合物3a)的制备与结构确证
制备：取28.65g维生素A(0.100mol)，置于500mL三颈烧瓶中，搅拌下向其中加入石油醚，直至维生素A完全溶解，后向其中加入5mg DCC(N,N’-二环己基二亚胺)，再加入13.21g甲基丙烯酸(化合物2，0.15mol)的饱和石油醚溶液，搅拌下缓慢升温至50℃进行反应，并采用高效液相色谱法跟踪反应至终点。减压蒸馏除去石油醚，所得固体水洗后冷冻干燥，得淡黄色固体31.55g(0.089mol)，熔点51～52℃，产率89％。
结构确证：
化合物2：1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)：6.69(1H，s)，6.55(1H，s)，2.03(3H，s)。
维生素A：1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)：6.55(1H，d)，6.54(2H，d)，6.53(1H，dd)，6.26(1H，d)，5.66(1H，t)，4.16(2H，d)，2.16(3H，s)，2.14(3H，s)，1.93(2H，t)，1.80(3H，s)，1.77(2H，m)，1.46(2H，t)，1.08(6H，s)。
化合物3a：1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)：6.56(3H，d)，6.51(1H，dd)，6.46(1H，s)，6.38(1H，s)，6.27(1H，d)，5.66(1H，t)，4.75(2H，d)，2.15(3H，s)，2.14(3H，s)，2.02(3H，s)，1.94(2H，t)，1.80(3H，s)，1.78(2H，m)，1.46(2H，t)，1.09(6H，s)。
实施例2维生素E甲基丙烯酸酯(化合物3b)的制备与结构确证
制备：取43.72g维生素E(0.100mol)，置于500mL三颈烧瓶中，搅拌下向其中加入乙醚，直至维生素E完全溶解，后向其中加入5mg DMAP(4-二甲氨基吡啶)，再加入13.23g甲基丙烯酸(化合物2，0.16mol)的饱和乙醚溶液，搅拌下缓慢升温至50℃进行反应，并采用高效液相色谱法跟踪反应至终点。减压蒸馏除去乙醚，所得固体水洗后冷冻干燥，得灰白色固体45.39g(0.091mol)，熔点42～43℃，产率91％。
结构确证：
化合物2：1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)：6.69(1H，s)，6.55(1H，s)，2.03(3H，s)。
维生素E：1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)：2.74(2H，t)，2.12(3H，s)，2.11(3H，s)，2.11(3H，s)，1.72(2H，t)，1.58(3H，m)，1.46(3H，s)，1.40～1.16(18H，m)，0.94(3H，d)，0.93(3H，d)，0.92(3H，d)，0.90(3H，d)。
化合物3b：1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)：6.43(1H，s)，6.15(1H，s)，2.73(2H，t)，2.12(3H，s)，2.09(3H，s)，2.08(3H，s)，2.01(3H，s)，1.73(2H，t)，1.59(3H，m)，1.45(3H，s)，1.42～1.13(18H，m)，0.95(3H，d)，0.94(3H，d)，0.91(3H，d)，0.90(3H，d)。
实施例3维生素D2甲基丙烯酸酯(化合物3c)的制备与结构确证
制备：取36.69g维生素D2(0.101mol)，置于500mL三颈烧瓶中，搅拌下向其中加入乙醚，直至维生素E完全溶解，后向其中加入5mg DMAP(4-二甲氨基吡啶)，再加入13.22g甲基丙烯酸(化合物2，0.15mol)的饱和乙醚溶液，搅拌下缓慢升温至50℃进行反应，并采用高效液相色谱法跟踪反应至终点。减压蒸馏除去乙醚，所得固体水洗后冷冻干燥，得灰白色固体44.15g(0.095mol)，熔点85～87℃，产率95％。
结构确证：
化合物2：1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)：6.69(1H，s)，6.55(1H，s)，2.03(3H，s)。
维生素D2：1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)：6.43(1H，d)，6.23(1H，d)，5.48(2H，s)，5.21(1H，s)，5.17(1H，s)，3.53(1H，m)，2.35(2H，m)，2.10(2H，s)，2.08(2H，t)，1.99(1H，t)，1.85(4H，m)，1.63(1H，t)，1.50(2H，t)，1.44(2H，m)，1.30～1.24(3H，m)，1.18(2H，t)，1.15(3H，s)，0.88(12H，d)。
化合物3c：1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)：6.45(1H，s)，6.44(1H，d)，6.41(1H，s)，6.24(1H，d)，5.46(1H，s)，5.46(1H，s)，5.18(1H，s)，5.17(1H，s)，3.50(1H，m)，2.37(2H，m)，2.13(1H，t)，2.07(3H，m)，1.99(4H，m)，1.80(2H，m)，1.80(2H，t)，1.59(1H，t)，1.49～1.46(4H，m)，1.25～1.21(5H，m)，1.14(3H，s)，0.93(3H，d)，0.90(6H，d)，0.84(3H，d)。
实施例4 2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱(化合物4，MPC)的制备与结构确证
制备：
(1)取20g HEMA与15.6mg三乙胺，置于500mL三颈瓶中，再加入200mL无水四氢呋喃溶解上述固体。将所得溶液降温至-20℃后搅拌下滴21.9g COP的100mL无水甲氢呋喃溶液，1小时滴加完毕，再于-20℃～-30℃下反应3小时，过滤除去析出的氯化三乙铵固体，所得滤液减压蒸馏。向蒸馏后的残留物中加入50mL无水乙醚，过滤除去析出的少量氯化三乙铵，滤液减压蒸馏，即得呈无色液体状的中间体OPEMA32.6g。
(2)取5.0g OPEMA溶于30mL无水乙腈中后置于200mL玻璃耐压瓶中，降温至-20℃后向其中迅速加入2mL无水三甲胺。密封耐压瓶，升温至60℃反应16小时后，降温至-20℃，氩气氛下过滤析出的白色固体，而后减压干燥，即得MPC(化合物4，3.1g)。
结构确证：化合物4：1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)：6.10(1H，s)，5.60(1H，s)，4.26(4H，m)，4.05(2H，t，J＝6.1)，3.75(2H，t，J＝6.1)，3.32(9H，s)，1.90(3H，s)，与文献报道相一致。
实施例5维生素A甲基丙烯酸酯-2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱共聚物(共聚物1a)的制备
(1)制备：化合物3a与化合物4的摩尔投料比为1:1，产物编号为共聚物1a-1
取3.56g维生素A甲基丙烯酸酯(化合物3a)与2.64g2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱(化合物4，MPC)，加定量甲醇/四氢呋喃(25/75，v/v)的混合溶剂，配制成化合物3a的质量浓度(wt％)为20％的溶液。将所得溶液移至聚合反应管中后，向溶液中通入氩气以除去溶液中的氧气。密封反应管，并在60℃下震荡16小时后冷却，以中止聚合反应。将反应液倾倒至乙醚中，过滤收集析出的固体，真空下干燥，得固体4.25g。
(2)制备：化合物3a与化合物4的摩尔投料比为4:1，产物编号为共聚物1a-2
取3.56g维生素A甲基丙烯酸酯(化合物3a)与0.66g2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱(化合物4，MPC)，加定量甲醇/四氢呋喃(16/84，v/v)的混合溶剂，配制成化合物3a的质量浓度(wt％)为20％的溶液。将所得溶液移至聚合反应管中后，向溶液中通入氩气以除去溶液中的氧气。密封反应管，并在60℃下震荡16小时后冷却，以中止聚合反应。将反应液倾倒至正庚烷中，过滤收集析出的固体，真空下干燥，得固体3.99g。
实施例6维生素E甲基丙烯酸酯-2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱共聚物(共聚物1b)的制备
(1)制备：化合物3b与化合物4的摩尔投料比为1:1，产物编号为共聚物1b-1
取4.99g维生素E甲基丙烯酸酯(化合物3b)与2.64g 2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱(化合物4，MPC)，加定量甲醇/四氢呋喃(20/80，v/v)的混合溶剂，配制成化合物3b的质量浓度(wt％)为20％的溶液。将所得溶液移至聚合反应管中后，向溶液中通入氩气以除去溶液中的氧气。密封反应管，并在60℃下震荡16小时后冷却，以中止聚合反应。将反应液倾倒至乙醚中，过滤收集析出的固体，真空下干燥，得固体6.32g。
(2)制备：化合物3b与化合物4的摩尔投料比为7:3，产物编号为共聚物1b-2
取4.99g维生素E甲基丙烯酸酯(化合物3b)与1.31g 2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱(化合物4，MPC)，加定量甲醇/四氢呋喃(12/88，v/v)的混合溶剂，配制成化合物3b的质量浓度(wt％)为20％的溶液。将所得溶液移至聚合反应管中后，向溶液中通入氩气以除去溶液中的氧气。密封反应管，并在60℃下震荡16小时后冷却，以中止聚合反应。将反应液倾倒至正庚烷中，过滤收集析出的固体，真空下干燥，得固体5.45g。
实施例7维生素D2甲基丙烯酸酯-2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱共聚物(共聚物1c)的制备
(1)制备：化合物3c与化合物4的摩尔投料比为1:1，产物编号为共聚物1c-1
取4.64g维生素D2甲基丙烯酸酯(化合物3c)与2.64g 2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱(化合物4，MPC)，加定量甲醇/四氢呋喃(20/80，v/v)的混合溶剂，配制成化合物3c的质量浓度(wt％)为20％的溶液。将所得溶液移至聚合反应管中后，向溶液中通入氩气以除去溶液中的氧气。密封反应管，并在60℃下震荡16小时后冷却，以中止聚合反应。将反应液倾倒至乙醚中，过滤收集析出的固体，真空下干燥，得固体6.11g。
(2)制备：化合物3c与化合物4的摩尔投料比为6:4，产物编号为共聚物1c-2
取4.99g维生素D2甲基丙烯酸酯(化合物3c)与1.76g 2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱(化合物4，MPC)，加定量甲醇/四氢呋喃(14/86，v/v)的混合溶剂，配制成化合物3c的质量浓度(wt％)为20％的溶液。将所得溶液移至聚合反应管中后，向溶液中通入氩气以除去溶液中的氧气。密封反应管，并在60℃下震荡16小时后冷却，以中止聚合反应。将反应液倾倒至正庚烷中，过滤收集析出的固体，真空下干燥，得固体6.18g。
实施例8共聚物的结构确证
(1)1H-NMR(CDCl3)
①共聚物1a的δ：6.60(d)，6.54(m)，6.52(d)，6.23(d)，5.71(t)，4.79(d)，4.27(m)，4.04(t)，3.75(t)，3.28(s)，2.12(s)，2.18(s)，1.92(t)，1.84(s)，1.77(m)，1.48(t)，1.29(强峰，s)，1.05(s)。与化合物3a及化合物4相比，6.38(1H，s，化合物3a)、6.10(1H，s，化合物4)与5.60(1H，s，化合物4)处单峰的消失，以及1.29处强吸收单峰的出现，验证了聚合反应的发生。
②共聚物1b的δ：4.25(m)，4.00(t)，3.73(t)，3.32(s)，2.73(t)，2.11(s)，2.07(s)，2.04(s)，1.76(t)，1.61(t)，1.56(m)，1.45(m)，1.40(s)，1.35(m)，1.33(强峰，s)，1.30～1.26(m)，1.24(强峰，s)，1.22～1.15(m)，0.95(d)，0.90(d)，0.89(d)，0.87(d)。与化合物3b及化合物4相比，6.43(1H，s，化合物3b)、6.15(1H，s，化合物3b)、6.10(1H，s，化合物4)与5.60(1H，s，化合物4)处单峰的消失，以及1.33与1.24处强吸收单峰的出现，验证了聚合反应的发生。
③共聚物1c的δ：6.48(d)，6.28(d)，5.46(s)，5.44(s)，5.16(s)，4.27～4.07(m)，3.48(m)，3.32(s)，2.33～2.25(m)，2.15(t)，2.04(m)，1.98～1.82(m)，1.64(t)，1.47～1.44(m)，1.34(s)，1.24～1.17(m)，0.90(d)，0.88(d)，0.84(d)。与化合物3b及化合物4相比，6.45(1H，s，化合物3b)、6.41(1H，s，化合物3b)、6.10(1H，s，化合物4)及5.60(1H，s，化合物4)处单峰的消失，验证了聚合反应的发生。
(2)重均分子量(Mw)、数均分子量(Mn)测定与特征分子量分布(D)的测定
利用GPC/ALC 150C型凝胶色谱仪，在25℃下，以四氢呋喃为溶剂，以聚苯乙烯作为对照，测定了实施例5～7中所制备的共聚物的重均分子量(Mw)与数均分子量(Mn)，并以下式计算分子量分布(D)。
实施例5～7所制备的共聚物的分子量测定结果如表3所示。
表3共聚物分子量测定结果
(3)共聚单体含量的测定(m:n比的计算)
实施例5～7所制备的共聚物结构中的m:n比的计算公式与计算结果如表4所示。
表4共聚物结构中m:n的计算公式与计算结果
实施例9奥利司他在共聚物水溶液中溶解度的测定
称取实施例5～7所制备得到的共聚物适量，配制成5mL浓度为10mg/mL的水溶液，超声震荡下分次向上述水溶液中加入奥利司他(中山万汉制药有限公司提供，99.8％)，每次2mg，直至出现不溶解的固体，得样品溶液。采用气相色谱法测定样品溶液中的奥利司他浓度，色谱条件如下所示。
流动相：乙腈、磷酸与水(860:0.05:140)；
标准溶液：以流动相为溶剂的0.5mg/mL USP奥利司他RS。制备后立即进样或在5℃下贮存；
检测器：UV 195；
色谱柱：3.9-mm×15-cm，4-μm填料LI；
流速：1.0mL/min；
进样体积：20μL；
同时，采用前述的标准溶液评价了系统适用性，要求相对标准差≤2％。
根据下式计算奥利司他在共聚物1a～1c中50mg/mL水溶液中的溶解度(S)
上式中，A1代表样品溶液的峰面积；A2代表标准溶液的峰面积。
溶解度的测定结果如表5所示。
表5奥利司他在实施例5～7制备得到的共聚物50mg/mL水溶液中的溶解度
实施例10包含共聚物1a-2与奥利司他的纳米微球1a-2Ⅰ～Ⅲ的制备
(1)纳米微球1a-2Ⅰ的制备
精准称取1.20g奥利司他与3.60g共聚物1a-2溶于20mL乙醇中，超声波超声2分钟充分溶解制成油相；在25℃下将上述油相逐滴注射到浓度为5mg/mL的80mL聚乙烯醇水溶液中，2000rpm下搅拌2min，形成第一次乳液；再将第一次乳液注射到浓度为5mg/mL的120mL聚乙烯醇水溶液中，500rpm下搅拌5小时至有机溶剂挥发完全，形成第二次乳液；最后4000rpm下离心20分钟，用去离子水洗涤2次。收集微球，室温下真空干燥12小时，即得白色的纳米微球1a-2Ⅰ，5℃下密封避光保存，备用。
(2)纳米微球1a-2Ⅱ的制备
精准称取1.20g奥利司他与3.12g共聚物1a-2溶于20mL乙醇中，超声波超声2分钟充分溶解制成油相；在25℃下将上述油相逐滴注射到浓度为8mg/mL的80mL聚乙烯醇水溶液中，2000rpm下搅拌3min，形成第一次乳液；再将第一次乳液注射到浓度为8mg/mL的120mL聚乙烯醇水溶液中，500rpm下搅拌5小时至有机溶剂挥发完全，形成第二次乳液；最后4000rpm下离心20分钟，用去离子水洗涤2次。收集微球，室温下真空干燥12小时，即得白色的纳米微球1a-2Ⅱ，5℃下密封避光保存，备用。
(3)纳米微球1a-2Ⅲ的制备
精准称取1.20g奥利司他与2.40g共聚物1a-2溶于20mL乙醇中，超声波超声2分钟充分溶解制成油相；在25℃下将上述油相逐滴注射到浓度为10mg/mL的80mL聚乙烯醇水溶液中，2000rpm下搅拌5min，形成第一次乳液；再将第一次乳液注射到浓度为10mg/mL的120mL聚乙烯醇水溶液中，500rpm下搅拌5小时至有机溶剂挥发完全，形成第二次乳液；最后4000rpm下离心20分钟，用去离子水洗涤2次。收集微球，室温下真空干燥12小时，即得白色的纳米微球1a-2Ⅲ，5℃下密封避光保存，备用。
实施例11包含共聚物1b-2与奥利司他的纳米微球1b-2Ⅰ～Ⅲ的制备
(1)纳米微球1b-2Ⅰ的制备
精准称取1.20g奥利司他与4.80g共聚物1b-2溶于20mL丙酮中，超声波超声2分钟充分溶解制成油相；在25℃下将上述油相逐滴注射到浓度为2.55mg/mL的80mL吐湿-80水溶液中，2000rpm下搅拌2min，形成第一次乳液；再将第一次乳液注射到浓度为2.55mg/mL的120mL吐湿-80水溶液中，500rpm下搅拌5小时至有机溶剂挥发完全，形成第二次乳液；最后4000rpm下离心20分钟，用去离子水洗涤2次。收集微球，室温下真空干燥12小时，即得白色的纳米微球1b-2Ⅰ，5℃下密封避光保存，备用。
(2)纳米微球1b-2Ⅱ的制备
精准称取1.20g奥利司他与4.08g共聚物1b-2溶于20mL丙酮中，超声波超声2分钟充分溶解制成油相；在25℃下将上述油相逐滴注射到浓度为3.00mg/mL的80mL吐湿-80水溶液中，2000rpm下搅拌3min，形成第一次乳液；再将第一次乳液注射到浓度为3.00mg/mL的120mL吐湿-80水溶液中，500rpm下搅拌5小时至有机溶剂挥发完全，形成第二次乳液；最后4000rpm下离心20分钟，用去离子水洗涤2次。收集微球，室温下真空干燥12小时，即得白色的纳米微球1b-2Ⅱ，5℃下密封避光保存，备用。
(3)纳米微球1b-2Ⅲ的制备
精准称取1.20g奥利司他与3.36g共聚物1b-2溶于20mL丙酮中，超声波超声2分钟充分溶解制成油相；在25℃下将上述油相逐滴注射到浓度为4.00mg/mL的80mL吐湿-80水溶液中，2000rpm下搅拌5min，形成第一次乳液；再将第一次乳液注射到浓度为4.00mg/mL的120mL吐湿-80水溶液中，500rpm下搅拌5小时至有机溶剂挥发完全，形成第二次乳液；最后4000rpm下离心20分钟，用去离子水洗涤2次。收集微球，室温下真空干燥12小时，即得白色的纳米微球1b-2Ⅲ，5℃下密封避光保存，备用。
实施例12包含共聚物1c-2与奥利司他的纳米微球1c-2Ⅰ～Ⅲ的制备
(1)纳米微球1c-2Ⅰ的制备
精准称取1.20g奥利司他与3.84g共聚物1c-2溶于20mL四氢呋喃中，超声波超声2分钟充分溶解制成油相；在25℃下将上述油相逐滴注射到浓度为3.00mg/mL的80mL羟丙甲基纤维素水溶液中，2000rpm下搅拌2min，形成第一次乳液；再将第一次乳液注射到浓度为2.55mg/mL的120mL羟丙甲基纤维素水溶液中，500rpm下搅拌5小时至有机溶剂挥发完全，形成第二次乳液；最后4000rpm下离心20分钟，用去离子水洗涤2次。收集微球，室温下真空干燥12小时，即得白色的纳米微球1c-2Ⅰ，5℃下密封避光保存，备用。
(2)纳米微球1c-2Ⅱ的制备
精准称取1.20g奥利司他与3.60g共聚物1c-2溶于20mL四氢呋喃中，超声波超声2分钟充分溶解制成油相；在25℃下将上述油相逐滴注射到浓度为3.50mg/mL的80mL羟丙甲基纤维素水溶液中，2000rpm下搅拌3min，形成第一次乳液；再将第一次乳液注射到浓度为3.50mg/mL的120mL羟丙甲基纤维素水溶液中，500rpm下搅拌5小时至有机溶剂挥发完全，形成第二次乳液；最后4000rpm下离心20分钟，用去离子水洗涤2次。收集微球，室温下真空干燥12小时，即得白色的纳米微球1c-2Ⅱ，5℃下密封避光保存，备用。
(3)纳米微球1c-2Ⅲ的制备
精准称取1.20g奥利司他与3.12g共聚物1c-2溶于20mL四氢呋喃中，超声波超声2分钟充分溶解制成油相；在25℃下将上述油相逐滴注射到浓度为4.00mg/mL的80mL羟丙甲基纤维素水溶液中，2000rpm下搅拌5min，形成第一次乳液；再将第一次乳液注射到浓度为4.00mg/mL的120mL吐湿-80水溶液中，500rpm下搅拌5小时至有机溶剂挥发完全，形成第二次乳液；最后4000rpm下离心20分钟，用去离子水洗涤2次。收集微球，室温下真空干燥12小时，即得白色的纳米微球1c-2Ⅲ，5℃下密封避光保存，备用。
实施例13奥利司他与PMB30W的对照纳米微球的制备
PMB30W为2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱(MPC)与甲基丙烯酸丁酯(BMA)以7:3摩尔比形成的共聚物，制备方法参考Tomohiro Konno等人的研究(Journal ofBiomedicalMaterialResearch,2003,65A(2):209～214)。
精准称取1.20g奥利司他与1.20gPMB30W溶于20mL四氢呋喃中，超声波超声2分钟充分溶解制成油相；在25℃下将上述油相逐滴注射到浓度为4.00mg/mL的80mL羟丙甲基纤维素水溶液中，2000rpm下搅拌5min，形成第一次乳液；再将第一次乳液注射到浓度为4.00mg/mL的120mL吐湿-80水溶液中，500rpm下搅拌5小时至有机溶剂挥发完全，形成第二次乳液；最后4000rpm下离心20分钟，用去离子水洗涤2次。收集微球，室温下真空干燥12小时，即得白色的对照纳米微球，5℃下密封避光保存，备用。
试验例一、纳米微球的粒径及包封率评价
(1)粒径的测定
利用JSM-5600LV型扫描电子显微镜(SEM)测定了实施例10～13制备得到的纳米微球的粒径，结果如表6所示。
表6实施例10～13制备得到的纳米微球的粒径
(2)包封率的测定
本发明采用透析法，并根据下式计算了实施例10～13所制备得到的纳米微球的包封率，结果如表7所示。
表7实施例10～13制备得到的纳米微球的包封率
结果显示，本发明实施例10-12制得的奥利司他纳米微球的粒径明显小于实施例13制得的对照纳米微球，并且具有较佳的包封率，包封率在82.67％在93.83％之间，明显高于对照纳米微球的包封率73.21％。
试验例二、纳米微球口服生物利用度的测定
(1)试验目的
比较实施例10～13制备的各种奥利司他纳米微球与奥利司他口服给药后在大鼠体内的血药浓度(以峰面积表示)随时间的变化情况。
(2)试验材料
奥利司他胶囊(规格为0.12g)，中山万汉制药有限公司生产，临用前用0.5％的羧甲基纤维素钠(CMC-Na)配制成3g/L的灌胃液，按60mg/kg/d的剂量灌胃给药；
实施例10～12制备得到的纳米微球1a-2Ⅱ、纳米微球1b-2Ⅱ、纳米微球1c-2Ⅱ与实施例13制备得到的对照纳米微球，临用前分别用0.5％CMC-Na配制成奥利司他浓度为3g/L的灌胃液，按60mg/kg/d(依奥利司他计)的灌胃剂量给药；
SD大鼠，购自中山大学实验动物中心，50只，雌雄各半，体重75～85g。
(3)试验方法
Ⅰ、分组、给药、取样与样品处理
SD大鼠颈静脉插管后平均分为奥利司他组、纳米微球1a-2Ⅱ组、纳米微球1b-2Ⅱ组、纳米微球1c-2Ⅱ组与对照纳米微球组，每组10只，禁食情况下采用如前所述的剂量用对应的药物灌胃给药一次，并在给药10、30、60、90、120、180、240、360、480、720与1440分钟每个时间点从颈静脉管道中静脉取血400μL。
取上述血浆样品100μL，加入300μL乙酸乙酯，涡旋1分钟，13000r/分钟转速下离心10分钟后取上液注入置于另1个1.5mL EP(EppendorfTubes，离心管)管中，将残渣再加入300μL乙酸乙酯，重复涡旋、离心后取上清液。将两次上清液合并后45℃下用浓缩离心机吹干。吹干后的EP管用100μL甲醇复溶，涡旋1分钟，再取10μL上清液进样。
Ⅱ、色谱条件
方法：气相
流动相：乙腈、磷酸与水(860:0.05:140)
标准溶液：以流动相为溶剂的0.5mg/mL USP奥利司他RS。制备后立即进样或在5℃下贮存
检测器：UV 195
色谱柱：3.9-mm×15-cm，4-μm填料LI
流速：1.0mL/min
进样体积：20μL
(4)试验结果
以时间为横坐标，峰面积为纵坐标，绘得峰面积随时间的变化曲线，结果如附图5所示。
由附图5可以看出，各时间点所测得的本发明优选的纳米微球1a-2Ⅱ、1b-2Ⅱ与1c-2Ⅱ在大鼠体内的血浆药物浓度均显著高于采用PMB30W制备的奥利司他微球，而且具有良好的缓释作用。
试验例三、纳米微球的体外抗肿瘤生物学活性评价
(1)试验目的
通过体外细胞毒性试验，评价实施例10～13制备得到的奥利司他纳米微球1a-2Ⅱ、1b-2Ⅱ、1c-2Ⅱ以及对照纳米微球对人前列腺癌细胞、人黑色素瘤细胞、人胰腺癌细胞的抗肿瘤活性。
(2)试验材料
Ⅰ、药物
阳性对照药物，阿霉素。
奥利司他，由中山万汉制药有限公司提供，用无水乙醇配置成1000mM的储存液。
实施例10～13制备得到的纳米微球1a-2Ⅱ、1b-2Ⅱ、1c-2Ⅱ与对照纳米微球。
根据公开号为CN 107412196 A的中国专利申请提供的方法制得的含有奥利司他和聚乙二醇-聚己内酯的纳米微球。
Ⅱ、细胞
人前列腺癌细胞DU145、人黑色素瘤细胞A375、人胰腺癌细胞株bxpc-3，分别置于含有10％胎牛血清、10μg/mL青霉素、10μg/mL链霉素、0.2％NaHCO3的杜尔伯科改良的伊格尔培养基(DMEM培养基)中，再置于37℃、5％CO2培养箱中培养。
(3)试验方法
设试验组与对照组，每组3个复孔，选用阿霉素作为阳性对照药；试验组将奥利司他和实施例制备得到的纳米微球1a-2Ⅱ、1b-2Ⅱ、1c-2Ⅱ与对照纳米微球分别配制成10个不同的浓度梯度，包括：100、50、25、10、4、2、0.4、0.08、0.016和0μM(均按奥利司他计)，每个浓度设3个复孔。
细胞培养24小时后，将培养液换成不同浓度的奥利司他与纳米微球培养液，药物作用72小时后，采用CCK-8法测定药物对细胞的毒性作用。最后取各组各复孔平均光密度值(OD)，并根据如下所示的公式计算细胞增殖抑制率。
上式中，空白浓度组是各纳米微球试验组中0μM组；活性浓度组是各纳米微球试验组除0μM组以外的浓度组。
然后以药物浓度(μM)的对数值为横坐标、细胞增殖抑制率为纵坐标绘制浓度效应曲线，结果见图6～图23，并采用EXCEL求回归方程，得出72小时的50％抑制浓度，结果如表8所示。
表8IC50测定结果
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种含有奥利司他的纳米微球在制备抗肿瘤药物中的用途，其特征在于，所述的纳米微球包含下式1a～1c所示的共聚物和奥利司他
所述的式1a～1c所示的共聚物为维生素A甲基丙烯酸酯-2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱共聚物，所述共聚物的结构式如下式1a所示：
其中，式1a所示的共聚物结构式中m:n的比值为62:38～82:18；
所述的式1a～1c所示的共聚物为维生素E甲基丙烯酸酯-2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱共聚物，所述共聚物的结构式如下式1b所示：
其中，式1b所示的共聚物结构式中m:n的比值为62:38～76:24；
所述的式1a～1c所示的共聚物为维生素D2甲基丙烯酸酯-2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱共聚物，所述共聚物的结构式如下式1c所示：
其中，式1c所示的共聚物结构式中m:n的比值为64:36～68:32。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的式1a～1c所示的共聚物结构式中的取代基R为：
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述式1a所示的共聚物结构式中m:n的比值为82:18，所述的奥利司他与式1a所示的共聚物的质量比为1:3.6～1:1.8。
4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述式1b所示的共聚物结构式中m:n的比值为76:24，所述的奥利司他与共聚物1b的质量比为1:4.4～2.6。
5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述式1c所示的共聚物结构式中m:n的比值为68:32，所述的奥利司他与共聚物1c的质量比为1:3.8～1:2.2。
6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述式1a～1c所示的共聚物为2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱和选自维生素A甲基丙烯酸酯、维生素E甲基丙烯酸酯和维生素D2甲基丙烯酸酯中的任意一种甲基丙烯酸酯类进行反应制得。
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