CN108559085A - 一种双发射共轭聚合物乏氧探针的制备及应用 - Google Patents

一种双发射共轭聚合物乏氧探针的制备及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种双发射共轭聚合物乏氧探针的制备及应用，共轭聚电解质在溶液中与氧发生分子相互作用时，使得Pt配合物的红光发射淬灭，从而使所述共轭聚电解质在溶液中对氧气有很好的选择识别作用,且不会影响蓝色荧光的发射，使得所述共轭聚电解质能够采用磷光/荧光比率法和比色法来检测氧气，具有很高的检测灵敏度和准确性。本发明所述的共轭聚电解质中，可用作氧气荧光/磷光传感器，具有很好的传感性能。由于共轭聚电解质具有较好的生物相容性，共轭聚电解质可用于在细胞中对不同氧气浓度的检测。采用共轭聚电解质的溶液培养HeLa细胞，通入不同浓度氧气后，在共聚焦显微镜下观察，有明显的红光淬灭现象。而在蓝光区域，光强度则没有明显的变化。

Description

一种双发射共轭聚合物乏氧探针的制备及应用
技术领域
本发明涉及一种乏氧探针和共轭聚电解质技术领域，具体涉及一种可用于乏氧检测的共轭聚电解质，以及该共轭聚电解质的制备方法和其在肿瘤乏氧领域中的用途。
背景技术
氧气是生物体中最重要的分子之一，在许多生理过程中氧气都发挥着关键作用。氧气含量作为疾病早期诊断的一种重要的标志物已经被很多的科学家所关注。共轭聚合物电解质被广泛的应用在化学和生物传感上由于共轭聚合物放大猝灭荧光信号的特性。
基于铂炔的共轭聚合物引起人们极大兴趣由于它们在室温下磷光特性能够被应用在各个研究领域，因此，我们合成了基于线性膦铂配合物与芴单元为主链的双发射共轭聚合物，实现了对氧气的检测，利用氧气对长寿命铂的猝灭实现了磷光寿命成像。
本发明提供了一种共轭聚电解质，该共轭聚电解质能够用于乏氧检测，在低氧浓度下(5％-20％)聚合物寿命有明显变化(90μs-60μs),三线态激发态不会被猝灭，在550nm具有很强的磷光发射，因此能对细胞内乏氧环境进行高灵敏度检测。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明设计并合成了一种有较好生物相容性的检测氧气浓度的共轭聚电解质，所述共轭聚电解质制备过程简单，对氧气检测具有高灵敏度和高选择性，且能够能对细胞内乏氧环境进行高灵敏度检测。
技术方案如下：
本发明提供了一种用于乏氧检测的共轭聚电解质，其结构式为：
所述探针的制备方法，包含以下步骤：
第1步、铂配合物的合成
(1)采用去离子水和乙醇(v:v＝2:1)在室温条件下搅拌氯亚铂酸钾和三丁基磷得到顺式双氯双三丁基磷铂的配合物；
(2)采用180-200℃高温加热三小时，得到反式双氯双三丁基磷铂的配合物Pt1,铂的配合物的结构式：
第2步、炔单体的合成
(1)采用重蒸的二氯甲烷，在室温条件下搅拌三甘醇和三溴化磷24h,得到L1；
(2)采用70-90℃条件下，50％的KOH水溶液，2,7-二溴芴和四丁基溴化铵搅拌30分钟，得到化合物2；
(3)氮气保护条件下，将2、三甲基硅基乙炔、碘化亚酮、双三苯基磷二氯化钯、三苯基膦加入三乙胺中，70-90℃条件下反应十二小时，柱层析得到3；
(4)室温条件下，将3在饱和碳酸钾的四氢呋喃溶液中搅拌1.5h,柱层析得到炔单体M1，其结构式为：
第3步、聚合物的合成
在氮气保护条件下，将M1和Pt1置于重蒸的二氯甲烷和三乙胺溶液中，CuI做催化剂，密闭条件下反应30分钟，反应完成之后，先用二氯甲烷浓缩，在甲醇中沉降抽滤得到聚合物P1，聚合物P1在室温条件下，在四氢呋喃溶液中加入三甲胺，得到聚合物P2。
上述共轭聚电解质，具有双发射的性质。所述共轭聚电解质的吸收和发射光谱谱图如图1所示，在不同的氧气浓度条件下共轭聚电解质在光谱谱图中的波长为550nm处的发射强度不同，氧气浓度越小，发射强度越高。
本发明所述的共轭聚电解质在溶液中与氧发生分子相互作用时，使得Pt配合物的红光发射淬灭，从而使所述共轭聚电解质在溶液中对氧气有很好的选择识别作用。并且，上述结构的改变几乎不会影响蓝色荧光的发射。两种不同光学现象，使得所述共轭聚电解质能够采用磷光/荧光比率法和比色法来检测氧气，具有很高的检测灵敏度和准确性。
由上可知，本发明所述的共轭聚电解质中，可用作氧气荧光/磷光传感器，具有很好的传感性能。由于氧气分子和共轭聚电解质中铂的作用，使得波长为550nm的发射强度明显降低，宏观上表现为所述共轭聚电解质磷光发光强度的改变。
本发明所述的共轭聚电解质自水中或者PBS缓冲溶液中有良好的溶解性。因此，本发明所述的共轭聚电解质能够用于水溶液中对氧气的检测。
此外，由于本发明所述的共轭聚电解质具有较好的生物相容性，所述共轭聚电解质可用于在细胞中对不同氧气浓度的检测。采用所述共轭聚电解质的溶液培养HeLa细胞，通入不同浓度氧气后，在共聚焦显微镜下观察，有明显的红光淬灭现象。而在蓝光区域，光强度则没有明显的变化。明场观察可以看到很好的细胞形态，证明在整个实验过程中细胞活性良好。细胞成像实验表明，本发明所述的共轭聚电解质可以很好的穿透细胞膜，用作活细胞中不同氧气浓度的检测，这对生物化学、细胞生物学以及医学等都有着重大的意义。
与现有技术相比，本发明的具有如下有益效果：
1、本发明所述共轭聚电解质的制备及分离提纯过程较简单，产率相对较高。
2、本发明所述共轭聚电解质的作为氧气探针，可用于对氧气的高灵敏度检测。
3、本发明所述共轭聚电解质的作为氧气探针，可实现比率法的检测，消除了背景荧光的干扰，提高了检测的准确性。
4、本发明所述共轭聚电解质的作为氧气探针，有较好的水溶性和生物相容性，能够实现对氧气的高灵敏度检测，尤其是能够实现细胞内乏氧环境进行高灵敏度检测。
附图说明
图1为本发明所述共轭聚电解质的吸收谱图；
图2为本发明所述共轭聚电解质在氧气和氮气条件下的发射谱图；
图3为本发明所述共轭聚电解质在不同氧气浓度氧气条件下的发射谱图；
图4为本发明所述共轭聚电解质对细胞毒性的测试；
图5为本发明所述共轭聚电解质在细胞培养后通入不同氧气浓度的共聚焦成像图；
图6为本发明所述共轭聚电解质在细胞培养后通入不同氧气浓度的共聚焦寿命成像图。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1探针合成
第1步、铂配合物制备
化合物Pt1：反式双氯双三丁基磷铂的配合物的制备
在圆底烧瓶中加入500mg氯亚铂酸钾，加入20mL去离子水将其溶解，然后加入0.65mL三丁基磷，室温条件下搅拌24h,用二氯甲烷萃取后，浓缩至少量，180℃下搅拌3h,柱层析得到黄色油状液体456mg。
第2步、炔配合物制备
化合物1：单体L1的制备：
量筒量取13mL三甘醇加入圆底烧瓶中，加入20mL二氯甲烷溶解,恒压滴液漏斗滴加19mL三溴化磷于圆底烧瓶，室温条件下搅拌24h,柱层析得到黄色单体L1(23.1g,75％)。
化合物2：单体2的制备
在圆底烧瓶中加入3.2g 2,7-二溴芴，加入6.9g单体L1，加入50mL 50％的KOH水溶液，加入320mg四丁基溴化铵，75℃反应12h,柱层析得到黄色单体2(5.8g,81％)。
化合物3：单体3的制备
在圆底烧瓶中加入2.5g单体2，148mg双三苯基磷二氯化钯，110mg三苯基膦，67mg碘化亚酮，鼓氮除氧三次，加入重蒸三乙胺60mL,加入三甲基。硅基乙炔2.1g,氮气保护下反应8h,反应完成后，萃取，浓缩，柱层析分离，得单体3(1.1g,43％)。
化合物4：单体4的制备
在圆底烧瓶中加入898mg单体3,20mL甲醇溶解后，加入828mg碳酸钾，室温下反应1.5h。反应完成后，萃取，浓缩，柱层析分离，得单体4(664mg,92％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):7.63(d,J＝7.6Hz,2H),7.55(s,2H),7.50(d,J＝7.6Hz,2H),3.67(t,J＝6.4Hz,4H),3.39(t,J＝6.4Hz,8H),3.16(s,2H),3.19(d,J＝5.2Hz,4H),2.76(t,J＝6.8Hz,4H),2.37(t,J＝7.2Hz,4H)。
第3步、聚合物的制备
聚合物P1的制备:
在圆底烧瓶中加入302mg单体4，加入335mg配合物Pt1,加入10mg碘化亚酮，鼓氮除氧三次，加入20mL重蒸的二氯甲烷和20mL重蒸的三乙胺，氮气保护室温条件下反应1.5h。反应完成后，浓缩，在甲醇中沉降，过滤得到黄色固体P1(420mg,69％)。
聚合物P2的制备:
在圆底烧瓶中加入202mg聚合物P1,加入20mL四氢呋喃，注射器加入0.5mL三甲胺。反应完成后，浓缩，在甲醇中沉降，过滤得到黄色固体P2。
实施例1 P2吸收光谱测试
配置实施例1获得的P2的稀溶液，以水为溶剂，移取2.0mL溶液于荧光比色皿中，然后测试吸收光谱测试，如图1所示，共轭聚合物在紫外波段有很强的吸收，吸收归属于芴的吸收。
实施例2 P2发射光谱测试
配置实施例1获得的P2的稀溶液，以水为溶剂，移取2.0mL溶液于荧光比色皿中，然后37℃下使用不同氧气含量的发射光谱测试，如图2、3所示，氧气浓度分别为0％、2％、4％、6％、10％、20％、空气，测试数据表明在不同的氧气浓度条件下共轭聚电解质在光谱谱图中的波长为550nm处的发射强度不同，氧气浓度越小，发射强度越高。
实施例3聚合物探针在体外细胞毒性检测实验
体外细胞毒性检测实验证明在用不同浓度的聚合物培养Hela细胞后，活细胞的相对存活率为78％，说明该聚合物毒性较低、生物相容性较好，可以用作细胞成像实验。如图4所示，测试数据表明该探针具有良好的生物相容性。
实施例4聚合物探针在活细胞中检测不同氧气浓度的共聚焦成像实验，聚合物探针在活细胞中检测不同氧气浓度的寿命成像
本实施例采用的细胞为人宫颈癌HeLa细胞，在37℃，5％CO2的条件下继续培养24小时使之贴壁，加入聚合物探针(5μM),孵育一小时后进行共聚焦实验，用活细胞工作站控制不同氧气浓度。如图5所示，氮气条件下铂的发射强度有明显增强，说明该探针可以很好的检测活细胞的氧气浓度。如图6所示，乏氧条件下聚合物的寿命有明显增强，说明该氧气对长寿命铂的有猝灭作用，实现了磷光寿命成像。
本发明的基于线性膦铂配合物与芴单元为主链的双发射共轭聚合物，利用氧气对长寿命铂的猝灭实现了磷光寿命成像。此外该探针水溶性好，光物理性质优异，对氧气灵敏，用作活细胞中不同氧气浓度的检测，这对生物化学、细胞生物学以及医学等都有着重大的意义。

Claims (6)

1.一种双发射共轭聚合物乏氧探针，其特征在于，探针的结构通式如下：
2.如权利要求1所述探针的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：
第1步，铂配合物的合成：
1-1)采用去离子水和乙醇在室温条件下搅拌氯亚铂酸钾和三丁基磷得到顺式双氯双三丁基磷铂的配合物；
1-2)-采用高温180-200℃加热三小时，得到反式双氯双三丁基磷铂的配合物Pt1；
第2步，炔单体的合成：
2-1)采用重蒸的二氯甲烷，在室温条件下搅拌三甘醇和三溴化磷24h,得到L1；
2-2)采用75-80℃条件下，50％的KOH水溶液，2,7-二溴芴和四丁基溴化铵搅拌30分钟，得到化合物2；
2-3)氮气保护条件下，将2、三甲基硅基乙炔、碘化亚酮、双三苯基磷二氯化钯、三苯基膦加入三乙胺中，80-90℃条件下反应十二小时，柱层析得到3；
2-3)室温条件下，将3在饱和碳酸钾的四氢呋喃溶液中搅拌1.5h,柱层析得到炔单体M1；
第3步，聚合物的合成：
在氮气保护条件下，将M1和Pt1置于重蒸的二氯甲烷和三乙胺溶液中，CuI做催化剂，密闭条件下反应30分钟，反应完成之后，先用二氯甲烷浓缩，在甲醇中沉降抽滤得到聚合物P1，聚合物P1在室温条件下，在四氢呋喃溶液中加入三甲胺，得到聚合物P2。
3.如权利要求1所述探针的应用，其特征在于，用于对溶液、细胞内氧气浓度检测。
4.如权利要求1所述探针的应用，其特征在于，用于细胞成像、活体成像。
5.如权利要求1所述探针的应用，其特征在于，用于寿命成像。
6.如权利要求1所述探针的应用，其特征在于，用于通过时间分辨成像技术检测细胞内和活体内氧气浓度变化。
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