CN108553637A - 具有hgf的治疗lpar6基因高表达肝癌患者的药物及用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有HGF的治疗LPAR6基因高表达肝癌患者的药物及用途，解决了现有技术中并没有发现能够有效抑制LPAR6基因高表达且安全性高、副作用低、不易产生肿瘤耐药的物质和方法的问题。本发明包括HGF或/和其变构体作为治疗LPAR6基因高表达肝癌患者药物的应用，以及HGF或/和其变构体联合抗血管生成药物作为治疗LPAR6基因高表达肝癌患者药物的应用。本发明中含有HGF或其变构体的药物能够在体外和体内调控LPAR6的表达，得到良好的抗肿瘤活性，且安全性高、副作用低、不易产生肿瘤耐药。

Description

具有HGF的治疗LPAR6基因高表达肝癌患者的药物及用途

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及具有HGF的治疗LPAR6基因高表达肝癌患者的药物及用途。

背景技术

肝癌死亡率在全球肿瘤领域里排名第二，中国每年占据了一半以上的新发病例，其发病率和致死率都高居我国第三，2017年全球新发肝癌病例数超85万，且这一数字仍然在持续增长。

研究表明非酒精性因数导致的肝癌与肥胖紧密相关，体重超标的人群患肝癌的概率比正常体重人群高1.68～4倍。我国肥胖人群近1.3亿，全球肥胖人群已超过6亿，这将进一步加重肝癌的发病率。遗憾的是，目前治疗肝癌的一线药物只有一种，并且用药一段时期后很容易出现肿瘤耐药。肝癌病人的二线治疗药物，国内也只有一种，治疗肝癌的药物种类严重不足。与此同时，肝癌在亚洲，美国和非洲中部发病率很高，其它地方发病率较低，导致了西方外企对该领域药物研发不重视，加重了该领域治疗药物的严重缺乏。在肝癌药物开发的过去8年中，很多基于不同靶点的药物都在Phase III trails中失败。索拉菲尼(Sorafenib)是目前肝癌药物治疗的主力，但该药物的有效响应率低，副作用大，给病人在治疗过程中带来了额外的严重生理和心理伤害，并且用药一段时间后很容易出现耐药。

因而发现新的靶点、开发出特异强、副作用低的药物来治疗肝癌是国家医疗发展非常迫切的问题。

LPAR6是近几年新被鉴定出来的LPA受体家族成员，和P2RY4的同源性很高。研究表明LPAR6可以通过Gα13-Rho信号通路介导cAMP的聚集以及Rho依赖的细胞形态学改变。LPAR6在上皮细胞中表达很高，目前已发现该基因中的一些突变会导致秃顶。另外一方面，有两篇文献报道，敲低LPAR6基因可以抑制肝癌细胞的增殖。同时，免疫组化显示LPAR6基因高表达的肿瘤样本，肿瘤细胞的增殖活性更高。

通过TCGA数据库和临床病理标本分析表明，LPAR6特异性的在肝癌患者中高表达，提示该基因可能是一个潜在的靶点。在细胞水平上，敲低LPAR6基因，肝癌细胞的增殖受到明显抑制，而过表达LPAR6则能促进肝癌细胞的生长。但现有技术中并没有发现能够有效抑制LPAR6基因高表达且安全性高、副作用低、不易产生肿瘤耐药的物质和方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：现有技术中并没有发现能够有效抑制LPAR6基因高表达且安全性高、副作用低、不易产生肿瘤耐药的物质和方法的问题，目的在于提供具有HGF的治疗LPAR6基因高表达肝癌患者的药物及用途。

本发明通过下述技术方案实现：

HGF或/和其变构体作为治疗LPAR6基因高表达肝癌患者药物的应用。

HGF是由间质细胞所分泌的多功能细胞因子，主要作用于上皮来源的细胞。它可以结合于c-Met受体激活酪氨酸激酶通路来调节细胞的生长、运动及形态学的发生，它能够促进肝脏、皮肤以及上皮类器官的修复。研究表明，Met受体突变所介导的异常HGF/SF–MET信号，Crosstalk of Met with EGFR，ERBB2，IGF1R and TGFβ或是GF/SF–MET具有促进血管形成的功能，导致了HGF能够促进多种肿瘤的发生发展。

但是，通过本发明的研究表明，在一些肝癌肿瘤组织中HGF的表达水平却比癌旁组织中的表达量低。申请人通过临床病理标本分析和TCGA肝癌数据的分析，评估了LPAR6在肝癌发展过程中的作用以及HGF靶向作用于LPAR6来治疗肝癌的潜力。在体外实验中可以明显观察到HGF通过下调LPAR6基因的表达，特异性的抑制肝癌细胞HepG2的增殖；HGF处理过的HepG2细胞异位种植在裸鼠体内成瘤，与对照组模型比较，HGF处理组生长缓慢，肿瘤体积较小。研究结果表明：LPAR6是治疗肝癌的一个潜在靶点，而HGF能够调控LPAR6的转录来抑止肝癌细胞的生长。

综上，发明人结合数据库和临床样本分析，通过体内体外实验测试发现：HGF能够有效的抑止LPAR6基因高表达导致的肝脏肿瘤的发生发展，或者其他诱导肝癌发生发展因子合并LPAR6基因高表达导致的肝脏肿瘤的发生发展。因而，HGF或/和其变构体可用于治疗LPAR6基因高表达肝癌患者药物的应用中。

并且，HGF来源于正常人体细胞分泌的因子，具有副作用低、安全性高的特点。而在国外，HGF用于治疗ALS已完成了临床二期试验，进一步证明了HGF对人体的安全性极高。同时，本申请中HGF治疗LPAR6高表达的肝癌患者的项目已经等效于进入了临床一期。因而，本发明将为药物极度匮乏的肝癌治疗领域提供一种副作用低、特异性强、安全性高的治疗药物。

进一步，HGF或/和其变构体联合抗血管生成药物作为治疗LPAR6基因高表达肝癌患者药物的应用。

一种具有HGF的治疗LPAR6基因高表达肝癌患者的药物，包括以全长基因表达出来的HGF蛋白，或/和与HGF蛋白具有相同功能的截短型、同工型变构体。

进一步，还包括抗血管生成药物。

更进一步地，所述抗血管生成药物包括索拉非尼等所有具有抗血管生成作用的药物。

通过裸鼠异种成瘤体内实验表明：HGF联合抗血管生成药物原位注射治疗肝癌，肿瘤的生长明显受到抑止，裸鼠的精神状态也普遍好于对照组；免疫组化结果也表明HGF结合索拉非尼(sorafenib)用药组，LPRA6表达明显降低。

本发明的药物的用药方式包括以下任意一种或多种：直接原位注射用药，通过病毒或质粒系统携带HGF基因感染细胞表达用药，脂质体或纳米材料作为载体口服或注射用药。

本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：

1、本发明中含有HGF或其变构体的药物能够在体外和体内调控LPAR6的表达，因而HGF处理细胞或治疗肝癌动物模型后，LPAR6的转录水平和蛋白水平均降低，进而得到良好的抗肿瘤活性；

2、本发明中的HGF来源于正常人体细胞合成的细胞因子，因此安全性高，副作用低，不易产生肿瘤耐药。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明实施例的限定。在附图中：

图1为两例肝癌病人癌旁组织和癌组织中LPAR6的表达情况示意图。

图2为LPAR6的表达在63例病人癌旁组织和癌组织的免疫组化结果图。

图3为LPAR6的表达量与肝癌病人生存预后关系图。

图4为通过数据库分析得到的LPAR6在肝癌组织和正常组织中的表达情况显示图。

图5为敲低LPAR6后肝癌细胞HepG2的增殖情况图。

图6为过表达LPAR6后肝癌细胞HepG2的增殖情况图。

图7为HGF处理肝癌细胞HepG2后，异种种植到裸鼠皮下肿瘤的生长情况图。

图8为HGF处理肝癌细胞HepG2后，异种种植到裸鼠皮下肿瘤的免疫组化结果图。

图9为荷瘤裸鼠处死后HGF原位注射肝癌异种成瘤裸鼠模型图。

图10为HGF原位注射肝癌异种成瘤裸鼠模型的肿瘤体积和重量结果图。

图11为荷瘤裸鼠处死后HGF联合用药治疗异种成瘤肝癌模型图。

图12为HGF联合用药治疗异种成瘤肝癌模型的肿瘤重量和体积结果图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。

实施例1

HGF或/和其变构体作为治疗LPAR6基因高表达肝癌患者药物的应用。

1、LPAR6的表达具有促进癌生长的效果。

本发明首先利用公共数据库资料和实验来验证LPAR6在肝癌组织中的表达情况，数据证明LPAR6在肝癌组织中高表达，可能扮演的是一个促癌的角色。推导过程如下：

在基于TCGA数据库资源的Oncolnc和Ualcan分析网站中，我们分析发现相对于正常肝脏组织，LPAR6在肝癌组织中高表达(p<0.0001)，如图4所示。为了测定LPAR6在肝癌组织中的表达情况，先测量两例肝癌病人癌旁组织和癌组织中LPAR6的表达情况，显示出在癌组织中LPAR6基因高表达，如图1所示；同时，本发明还收集了63例肝癌病人的肿瘤组织及其配对的癌旁组织标本进行免疫组化的分析结果，分析结果通过光密度与阳性染色细胞总面积的比值(IOD/Area)表示，如图2所示。通过免疫组化分析发现，LPAR6在肿瘤组织中表达高于癌旁组织。同时，还分析了LPAR6的表达量与肝癌病人生存预后关系，生存分析表明LPAR6高表达的患者生存预后越差，LPAR6低表达的患者生存预后越好，如图3所示。这些数据提示我们LPAR6在肝癌中扮演了一个促癌的角色，可能会是一个有潜力的治疗靶点。

为了验证我们的推导，我们在肝癌细胞HepG2中分别敲低了和过表达了LPAR6。具体验证方式和结果如下：

CCK8是一种可以检测细胞增殖活性的试剂，WST-8化合物是其主要成分。该化合物可以和细胞中的脱氢酶反应生成可溶性的黄色甲瓒，其含量与活细胞数量成正比。我们利用shRNA载体系统敲低LPAR6基因后获得shLPAR6#1和shLPAR6#2组，NT为LPAR6基因敲低后的空病毒组，WT为对LPAR6基因不做处理的原始细胞组，通过检测得知：shLPAR6#1和shLPAR6#2组的细胞增殖明显减慢，如图5所示。利用过表达载体系统过表达LPAR6基因后获得pHBLV-LPAR6过表达组，pHBLV-Control为LPAR6基因正常表达组，通过检测得知：pHBLV-LPAR6组的细胞增殖则明显加快，如图6所示。通过上述验证方式和结果进一步证明：LPAR6的表达能够促进肝癌细胞HepG2的生长，其扮演了一个促癌的角色。

2、HGF处理肝癌细胞HepG2后，能有效抑止肝癌细胞的生长。

实验组用50ng/ml终浓度的HGF培养HepG2细胞，对照组采用等体积HGF溶剂培养HepG2细胞，HGF溶剂为0.1％BSA溶液。4天后，将实验组和对照组分别接种于4周龄裸鼠背腹侧皮下，其中Matrigel与细胞悬液1：1混合后进行接种成瘤。跟踪测量肿瘤体积30天，检测结果如7所示，该结果显示HGF处理组重瘤体积小于对照组。免疫组化显示异种肿瘤标本中LPAR6在HGF+处理组中的表达降低，如图8所示。

通过上述实验即可证明：HGF能够调控LPAR6的转录，抑止肝癌细胞生长，发挥抗肿瘤作用；但HGF的调控不仅限于LAPR6，包括LPAR6基因相关上下游调控通路中的基因或辅助因子，具有等拮抗肿瘤，发挥治疗作用。

因而，本发明中HGF或/和其变构体可作为治疗LPAR6基因高表达肝癌患者的药物。其中，HGF或/和其变构体是指：以全长基因表达出来的HGF蛋白，或/和与HGF蛋白具有相同功能的截短型、同工型变构体。

HGF给药方式可以用临床级别提纯或重组生产的该种因子直接用药，也可通过病毒携带HGF基因感染细胞表达，HGF基因质粒表达系统，脂质体和纳米材料等药物递送工具和系统来进行间接给药。同时，也适用于病毒和质粒系统携带不同长度，但具有相似功能的HGF基因片段来进行给药。

实施例2

HGF原位注射肝癌异种成荷瘤裸鼠模型。实验组每只荷瘤裸鼠注射总量20ug HGF，原位注射于肿瘤内，连续7天，对照组注射等体积的HGF溶剂，HGF溶剂为0.1％BSA溶液。30天后统一处死，测量小鼠肿瘤体积和重量，处死后的小鼠图片如图9所示。结果显示HGF用药组平均肿瘤体积和肿瘤重量均小于对照组，如图10所示。

综上，可以证明单独HGF用药可以很好的抑止肝癌肿瘤的生长。

实施例3

利用sorafenib和HGF联合用药来治疗荷瘤裸鼠。Sorafenib用药剂浓度为40nM，50ul/只；HGF用药剂量为20ug/只；对照组采用0.1％BSA替换HGF。连序跟踪观察60天，测量小鼠的肿瘤体积，观察60天后处死，测量小鼠的肿瘤质量。发现：相较于sorafenib+0.1％BSA对照组，sorafenib和HGF联合用药组肿瘤大小一直小于对照组，重量也小于对照组，如图11和图12所示。

其中，0.1％BSA是指浓度为0.1％的牛血清白蛋白溶液，该溶液用于溶解HGF。HGF联合索拉菲尼用药可以很好的抑止肝癌肿瘤的生长，但不仅限于索拉菲尼，包括所有已上市抗血管生成药物，都可以作为联合用药方案。

通过临床肿瘤标本特定基因的测定和TCGA肿瘤数据库资料的整合分析，并结合体内体外实验发现了HGF具有明显抑制肿瘤细胞生长的功能。我们展示了HGF单独用药或联合抗血管生成等药物靶向作用于LPAR6治疗肝癌的优异性能，效果十分显著。

以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.HGF或/和其变构体作为治疗LPAR6基因高表达肝癌患者药物的应用。

2.HGF或/和其变构体联合抗血管生成药物作为治疗LPAR6基因高表达肝癌患者药物的应用。

3.一种具有HGF的治疗LPAR6基因高表达肝癌患者的药物，其特征在于，包括以全长基因表达出来的HGF蛋白，或/和与HGF蛋白具有相同功能的截短型、同工型变构体。

4.根据权利要求3所述的一种具有HGF的治疗LPAR6基因高表达肝癌患者的药物，其特征在于，还包括与抗血管生成药物联合用药。

5.根据权利要求4所述的一种具有HGF的治疗LPAR6基因高表达肝癌患者的药物，其特征在于，所述抗血管生成药物为索拉非尼。

6.根据权利要求3-4任一项所述的一种具有HGF的治疗LPAR6基因高表达肝癌患者的药物，其用药方式包括以下任意一种或多种：直接原位注射用药，通过病毒或质粒系统携带HGF基因感染细胞表达用药，脂质体或纳米材料作为载体口服或注射用药。