CN108504647A - 一种dna促旋酶的药物结合口袋及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种DNA促旋酶的药物结合口袋，以DNA促旋酶B亚基的ATP酶结构域为研究对象，利用化合物片段作为探针，通过蛋白质热稳定性迁移实验、ATP酶水解活性实验以及X射线晶体学衍射方法，发现了存在于细菌DNA促旋酶B亚基上一个新型的可药性配体结合口袋；此口袋是在本发明筛选得到的片段探针4‑苯氧基苯酚或4‑4’‑二羟基二苯硫醚的诱导下获得。本发明发现的新型配体结合口袋可以用来设计和筛选具有新结合模式的DNA促旋酶抑制剂；筛选到的化合物片段为新型抗菌药物的设计提供了片段生长、融合和连接的基元。以此新型可药性口袋为起点，将筛选获得的片段与现有抑制剂拼接可以获得高亲和力、高选择性的DNA促旋酶抑制剂并有望克服现有抑制剂的耐药性问题。

Description

一种DNA促旋酶的药物结合口袋及其应用

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体地，涉及一种DNA促旋酶的药物结合口袋及其应用。

背景技术

自1928年弗莱明发现青霉素后，抗生素成为临床对抗感染类疾病的有力工具，大大降低了细菌感染性疾病的致死率。然而，长期以来人类对抗菌药物的过度依赖与滥用，导致细菌对现有抗菌药物逐渐出现耐药性。近年来，细菌耐药性问题日益严重，给临床抗感染治疗带来了严峻的挑战，人类有可能再次进入无药可用的“后抗生素时代”。为了应对这一挑战，除了加强对现有抗菌药物使用的管制之外，还必须加快具有新靶标、新机制、新骨架的抗菌药物的研发。

DNA促旋酶(DNA gyrase)，也被称为DNA回旋酶、DNA旋转酶等，它是细菌中唯一能引入DNA负超螺旋的DNA拓扑异构酶，它对于细菌DNA的复制、转录、重组、修复等重要生理过程发挥着必不可少的作用。DNA促旋酶是细菌所特有的，不存在于人体内。因此，DNA促旋酶是一种非常理想的抗菌药物靶标。

DNA促旋酶是由两个GyrA亚基和两个GyrB亚基组成的异源四聚体。其中，GyrA主要参与DNA的断裂和连接的过程，而GyrB具有ATP酶的活性，通过催化水解ATP为DNA促旋酶的催化反应提供能量。两个亚基对于DNA促旋酶的生理功能都是必须的。

目前，针对DNA促旋酶已有喹诺酮类抗菌药物上市。喹诺酮类药物是一类广谱抗菌药物，在临床上广泛应用于泌尿生殖系统感染、呼吸道感染、肠道感染、皮肤软组织感染等。但是，在这类药物广泛使用的过程中，多种病原菌逐步对其产生了耐药性。产生耐药性的一个重要原因是这些细菌的DNA促旋酶的喹诺酮类药物作用位点的若干关键性氨基酸残基(如活性口袋的丝氨酸、谷氨酸或天冬氨酸等)发生了突变。这些氨基酸残基的突变使得喹诺酮类化合物与DNA促旋酶的亲和力大大降低，直接影响了喹诺酮类药物的抗菌效果。因此，学术界和工业界都在急切寻找具有新作用机制的DNA促旋酶抑制剂。

上述的喹诺酮类药物作用于DNA促旋酶的GyrA亚基。此外，GyrB也是DNA促旋酶发挥生理的功能的关键亚基，它的ATP酶活性位点与喹诺酮类药物在GyrA上的作用位点是独立的，也是抗菌药物设计重要位点。已报道作用于GyrB的天然产物有新生霉素、氯新生霉素、香豆霉素和cyclothialidines等，而化学合成的GyrB抑制剂的骨架类型更加丰富，如4-5’双噻唑、吲哚-2-酮、吲唑、咪唑并哌啶、苯基咪唑脲类、吡唑三嗪、吡咯酰胺、吡唑并嘧啶等等。在这些化合物中，新生霉素在上个世纪60年代被美国FDA批准应用于临床感染类疾病的治疗，但后来由于有效性和毒性的原因，在2011年被FDA撤下市场。除此之外，还有两个吡咯酰胺类的候选药物进入了临床Ⅰ期实验，但尚未取得成功。

通过对PDB数据库(Protein Data Bank)收集的所有GyrB与抑制剂共晶结构进行分析，我们发现现有抑制剂与靶标的结合模式比较单一，均具有与新生霉素类似的作用模式。现有抑制剂与GyrB的主要结合包括：1)与GyrB的73位天冬氨酸(Asp73，残基编号基于大肠杆菌GyrB的氨基酸序列)以及附近的结合水形成氢键相互作用；2)与76位和136位精氨酸(Arg76、Arg136)形成阳离子-π相互作用和氢键作用。通过这些相互作用，现有抑制剂可以占据底物ATP的腺嘌呤的结合位点，抑制底物ATP与GyrB的结合，最终抑制细菌的生长。然而，已有文献报导，新生霉素耐药菌株的常见突变位点是抑制剂结合的关键氨基酸残基Arg136。这就使得突变菌株也对现有的其他GyrB抑制剂产生耐药性。因此，针对GyrB的抑制剂开发急需寻找新型的抑制模式。

基于片段的药物发现(Fragment-based Drug Discovery,FBDD)是本世纪初以来快速发展的一种新型的药物先导化合物发现手段。通过筛选并组装一些小的化合物片段，FBDD能够发现一些具有新骨架、新机制的药物先导化合物。此外，由FBDD筛选得到的化合物片段，结构简单、分子较小、水溶性较好，容易通过溶剂通道进入蛋白质内部，与蛋白质发生相互作用。因此，化合物片段能够作为探针，探索蛋白质内部新的配体结合位点，研究靶标的结构与功能，开发全新作用机制的抑制剂。

发明内容

本发明利用化合物片段4-苯氧基苯酚和4-4’-二羟基二苯硫醚作为探针，发现了存在于细菌DNA促旋酶B亚基上一个新型的可药性配体结合口袋，可用来设计和筛选具有新结合模式的DNA促旋酶抑制剂。

本发明的技术方案是：

本发明提供了一种DNA促旋酶的药物结合口袋，以DNA促旋酶的B亚基为对象，组成所述药物结合口袋的氨基酸残基为Ile78、Ala91、Ile94、Met95、Val120、Leu132、Ile134、Thr165和Val167；同时以共晶结构中4-苯氧基苯酚或4-4’-二羟基二苯硫醚的1’位苯环或1’位苯酚为平面中心，DNA促旋酶B亚基氨基酸残基Ile78侧链逆时针翻转90°，Met95侧链向后翻转60°以及Leu132侧链顺时针翻转90°形成。

共晶结构为DNA促旋酶的B亚基与4-苯氧基苯酚或4-4’-二羟基二苯硫醚所形成的晶体结构。

本发明同时提供一种DNA促旋酶抑制剂，包括所述的DNA促旋酶的药物结合口袋和相关结合的化合物片段；

所述相关结合的化合物片段的结构如下所示：

其中，X为-O-、-S-、-NH-、-CH₂-或-C(CH)₂-；

R₁为氢、卤基、C1～C3的饱和烷基、被1个或多个卤基取代的C1～C3的饱和烷基；

R₂为氢、卤基、C1～C3的饱和烷基、被1个或多个卤基取代的C1～C3的饱和烷基；

R₃为氢、卤基、C1～C3的饱和烷基、被1个或多个卤基取代的C1～C3的饱和烷基；

R₄为氢、卤基、C1～C3的饱和烷基、被1个或多个卤基取代的C1～C3的饱和烷基；

R₅为氢、羟基、卤基、C1～C3的饱和烷基、被1个或多个卤基取代的C1～C3的饱和烷基。

本发明利用化合物片段作为探针，通过多种片段筛选方法，发现了细菌DNA促旋酶B亚基上一个新型的配体结合口袋，并证明结合该位点的小分子片段可以有效地抑制细菌DNA促旋酶的ATP水解活性以及超螺旋活性。此外，新鉴定的配体结合口袋与新生霉素耐药菌株的常见突变位点Arg136相隔10埃距离以上，因此，针对此口袋进行药物设计，有望避免现有抑制剂共有的耐药性问题。这一可药性的配体结合口袋，以及与其结合的化合物片段，在靶向DNA促旋酶的新型抗菌药物设计中具有潜在的应用价值。

本发明所述的DNA促旋酶新型配体结合口袋的研究发现过程如下：

以DNA促旋酶B亚基的ATP酶结构域为研究对象，利用化合物片段作为探针，通过蛋白质热稳定性迁移实验、ATP酶水解活性实验以及X射线晶体学衍射方法，发现了细菌DNA促旋酶的ATP酶活性位点底部的一个新型可药性配体结合口袋；此口袋是在本发明筛选得到的片段探针4-苯氧基苯酚或4-4’-二羟基二苯硫醚的诱导下获得。

具体过程为：

(1)以大肠杆菌DNA促旋酶GyrB亚基的ATP酶结构域(ATPase domain)为研究对象，通过蛋白质热稳定性迁移实验(Thermal shift assay,TSA)对本实验室的化合物片段库进行筛选。以不添加任何小片段时GyrB的Tm值为参照，测定在添加各个化合物片段时蛋白质的热变性温度Tm。如果添加某种化合物片段能提高GyrB的热变性温度ΔTm>0.5℃时，则认为该化合物片段可以结合GyrB。

(2)以全长的大肠杆菌DNA促旋酶为研究对象，从本实验室的化合物片段库中筛选对DNA促旋酶的ATP水解活性(ATPase activity)具有抑制作用的化合物片段。以不添加小片段时DNA促旋酶的ATP水解活性为参照，如果添加某种化合物片段(终浓度1mM)对DNA促旋酶的ATP水解水平的抑制率超过30％，则认为该片段可以有效地结合GyrB。

(3)收集上述通过蛋白质热稳定性迁移实验和ATP水解活性实验筛选到的可能结合GyrB的化合物片段，通过蛋白质晶体浸泡的方法，制备这些化合物片段与大肠杆菌GyrB的ATP酶结构域的复合物晶体。利用X射线晶体学方法(X-ray crystallography)解析复合物共晶结构，研究上述筛选获得的片段探针与大肠杆菌GyrB的作用模式，确定片段探针在GyrB上的结合口袋以及其对GyrB口袋结构的影响。

按照以上方案，我们获得了一系列能结合GyrB的化合物片段，以及多个片段探针与GyrB的ATP酶结构域的共晶结构坐标。通过与现有抑制剂以及底物ATP与GyrB的结合模式比较，我们发现其中两个片段探针(4-苯氧基苯酚、4-4’-二羟基二苯硫醚)具有新颖的结合模式。它们的部分基团插入到GyrB的ATP腺苷基团结合位点底部一个新的疏水口袋。该疏水口袋在以前解析的GyrB与底物ATP以及现有已知抑制剂的共晶结构中均不存在，表明底物ATP以及其它已知的GyrB抑制剂均没有与该口袋发生相互作用。分析表明，该疏水口袋是在片段探针4-苯氧基苯酚或4-4’-二羟基二苯硫醚的诱导下形成。该疏水口袋毗邻底物ATP腺苷基团的结合位点，数据表明结合在该疏水口袋的片段探针可以抑制底物DNA促旋酶对ATP的水解以及对DNA拓扑结构的调节。因此，我们主张该新发现的疏水口袋可以应用于GyrB新型抑制剂的设计，发现结合机制和骨架类型新颖的GyrB抑制剂，用于治疗多种类型病原菌的感染。

所述片段探针4-苯氧基苯酚的结构式如图1所示；

所述片段探针4-4’-二羟基二苯硫醚的结构式如图2所示；

所述片段探针4-苯氧基苯酚与大肠杆菌DNA促旋酶GyrB的作用模式示意图如图3所示；

所述片段探针4-4’-二羟基二苯硫醚与大肠杆菌DNA促旋酶GyrB的作用模式示意图如图4所示；

所述片段探针4-苯氧基苯酚诱导形成的GyrB新型口袋的结构示意图如图5a所示。口袋显示为半透明灰白色表面，周围棍状为该片段的1’-苯环以内的氨基酸氨基侧链。在ATP类似物(白色棍状模型，图5b)以及新生霉素(蓝绿色棍状模型，图5c)结合的GyrB共晶结构中，此口袋(红色箭头)是不存在的。因此，ATP类似物和新生霉素均不与新发现的疏水口袋发生相互作用。

所述片段探针4-苯氧基苯酚(黄色球棍状模型)结合的新型疏水口袋以及引起的相关氨基酸残基构象变化的结构示意图如图5d所示。组成该口袋的氨基酸残基为Ile78、Ala91、Ile94、Met95、Val120、Leu132、Ile134、Thr165和Val167(黄色棍状模型)。黑色箭头表示，与ATP类似物晶体结构(白色棍状模型)以及新生霉素(蓝绿色棍状模型)晶体结构中相对应氨基酸残基比较，由片段探针结合引起的三个关键氨基酸残基Ile78,Met95和Leu132的构象变化。

具体而言，此发明发现的新型配体结合口袋位于DNA促旋酶的B亚基上，具体位于B亚基ATP酶活性位点的下方，为一个半球形口袋。此口袋是由本发明报道的片段探针4-苯氧基苯酚的1’-苯基或4-4’-二羟基二苯硫醚的1’-苯酚基团结合诱导形成，具体涉及以共晶结构中4-苯氧基苯酚或4-4’-二羟基二苯硫醚的1’位苯环或1’位苯酚为平面中心，DNA促旋酶B亚基氨基酸残基Ile78侧链逆时针翻转90°，Met95侧链向后翻转60°以及Leu132侧链顺时针翻转90°形成。

此口袋口径的长度约为8埃，宽度约为7埃，高度约为6埃。组成该口袋的氨基酸残基为Ile78、Ala91、Ile94、Met95、Val120、Leu132、Ile134、Thr165和Val167，除Thr165外，其他均为疏水性氨基酸残基，因此，该口袋是疏水性口袋，可以容纳疏水性的化学基团。

基于片段探针4-苯氧基苯酚、4-4’-二羟基二苯硫醚开展子结构及相似度检索，并通过实验验证，获得的活性化合物片段如表1所示。因此，这些片段以及其他衍生物在基于新型配体结合口袋的GyrB抑制剂设计中的应用都在本发明的保护之内。

本发明的实验对象是大肠杆菌，但由于细菌的DNA促旋酶之间具有较高的同源性，本发明发现的DNA促旋酶的新型配体结合口袋同样可以存在于其他细菌的DNA促旋酶，包括但不局限于金黄色葡萄球菌、结核分枝杆菌、链球菌、霍乱杆菌、变形杆菌、绿脓杆菌、沙门氏菌等。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

现有GyrB抑制剂与靶标的结合模式单一，导致靶标突变产生的抑制剂耐药性机制相似。本发明利用片段探针发现的GyrB新型可药性配体结合口袋可以用来设计和筛选具有新结合模式的DNA促旋酶抑制剂；将结合在新配体结合口袋的化学基团与现有抑制剂拼接，将有望提高抑制剂的亲和力、选择性和克服现有抑制剂的耐药性问题；此外，本发明发现的化合物片段为新型抗菌药物的设计提供了片段生长、融合和连接的基元。

附图说明

图1为4-苯氧基苯酚的化学结构式。

图2为4-4’-二羟基二苯硫醚的化学结构式。

图3为X射线晶体学阐明的4-苯氧基苯酚(黄色棍状模型)结合大肠杆菌DNA促旋酶(白色卡通模型)的结合模式示意图。

图4为X射线晶体学阐明的4-4’-二羟基二苯硫醚(橘黄色棍状模型)结合大肠杆菌DNA促旋酶(白色卡通模型)的结合模式示意图。

图5中(a)为本发明的4-苯氧基苯酚片段探针诱导形成的DNA促旋酶GyrB的新型配体结合口袋示意图(白色蛋白质表面)。ATP、新生霉素等均不与新发现的配体结合口袋发生相互作用。(b)为ATP类似物(PDB编号4wuc)(白色棍状模型)与DNA促旋酶GyrB的结合模式图。(c)为新生霉素(蓝绿色棍状模型，PDB编号1aj6)与DNA促旋酶GyrB的结合模式图。(d)为本发明组成DNA促旋酶GyrB新型配体结合口袋相关氨基酸残基及其构象变化示意图。

图6为加入4-4’-二羟基二苯硫醚对大肠杆菌DNA促旋酶GyrB亚基的ATP酶结构域的热变性曲线的影响。新生霉素为阳性对照。

图7为不同浓度的4-苯氧基苯酚对大肠杆菌DNA促旋酶ATP水解活性的抑制率。

图8为利用不同浓度的4-苯氧基苯酚对大肠杆菌DNA促旋酶ATP水解活性的抑制率拟合得到的抑制曲线和半数抑制浓度IC₅₀值。

图9为不同浓度的4-4’-二羟基二苯硫醚对大肠杆菌DNA促旋酶ATP水解活性的抑制率。

图10为利用不同浓度的4-4’-二羟基二苯硫醚对大肠杆菌DNA促旋酶ATP水解活性的抑制率拟合得到的抑制曲线和半数抑制浓度IC₅₀值。

图11为化合物片段1-10对DNA促旋酶的DNA超螺旋实验活性测试结果图。

图12为大肠杆菌DNA促旋酶GyrB亚基ATP酶结构域的蛋白质晶体图片。

图13为大肠杆菌DNA促旋酶GyrB亚基ATP酶结构域浸泡4-苯氧基苯酚片段后的晶体衍射画面。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作出进一步的阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1

1.大肠杆菌DNA促旋酶GyrB亚基ATP酶结构域的原核表达质粒的构建

将大肠杆菌DNA促旋酶GyrB亚基(UniProKB编号P0AES6)的ATP酶结构域(氨基酸序列15-220)的DNA编码序列插入到pET20b(+)载体，并在该DNA编码序列的上游插入六组氨酸标签和酵母sumo蛋白标签的DNA序列，构建成表达His₆-sumo-GyrB融合蛋白的原核表达质粒。插入的DNA序列通过测序验证。

大肠杆菌DNA促旋酶GyrB亚基ATP酶结构域(氨基酸序列15-220)的氨基酸序列为：

GGLDAVRKRPGMYIGDTDDGTGLHHMVFEVVDNAIDEALAGHCKEIIVTIHADNSVSVQDDGRGIPTGIHPEEGVSAAEVIMTVLHAGGKFDDNSYKVSGGLHGVGVSVVNALSQKLELVIQREGKIHRQIYEHGVPQAPLAVTGETEKTGTMVRFWPSLETFTNVTEFEYEILAKRLRELSFLNSGVSIRLRDKRDGKEDHFHYEGG

编码大肠杆菌DNA促旋酶GyrB亚基ATP酶结构域的DNA序列为：

ggtctggatgcggttcgtaagcgcccgggtatgtatatcggcgacacggatgacggcaccggtctgcaccacatggtattcgaggtggtagataacgctatcgacgaagcgctcgcgggtcactgtaaagaaattatcgtcaccattcacgccgataactctgtctctgtacaggatgacgggcgcggcattccgaccggtattcacccggaagagggcgtatcggcggcggaagtgatcatgaccgttctgcacgcaggcggtaaatttgacgataactcctataaagtgtccggcggtctgcacggcgttggtgtttcggtagtaaacgccctgtcgcaaaaactggagctggttatccagcgcgagggtaaaattcaccgtcagatctacgaacacggtgtaccgcaggccccgctggcggttaccggcgagactgaaaaaaccggcaccatggtgcgtttctggcccagcctcgaaaccttcaccaatgtgaccgagttcgaatatgaaattctggcgaaacgtctgcgtgagttgtcgttcctcaactccggcgtttccattcgtctgcgcgacaagcgcgacggcaaggaagatcattttcactatgaaggcggttga。

2、大肠杆菌DNA促旋酶GyrB亚基ATP酶结构域融合蛋白的表达

将上述His₆-sumo-GyrB质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)。将转有质粒的BL21(DE3)在含有100μg/L的氨苄霉素的Luria-Bertani(LB)培养基中37℃温度下220rpm震荡培养，直到OD₆₀₀＝0.6。然后，在培养基中加入0.15mM的诱导剂异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达，在18℃温度下继续培养，让目标蛋白充分表达。18小时后，离心收集菌体。

3、大肠杆菌DNA促旋酶GyrB亚基ATP酶结构域的纯化

将上述收集到的菌体用裂解缓冲液(50mMTris-HClpH 8.0，400mMNaCl，20mM咪唑)充分悬浮，然后利用超声破碎法在冰浴温度下裂解细胞。高速离心去除细菌裂解液中的细菌残片、细胞器等，收集上清液。利用Ni-NTA亲和层析树脂结合上清液中的目标蛋白，用裂解缓冲液充分清洗层析柱上的杂蛋白。加入蛋白酶Ulp1低温过夜孵育，将含有组氨酸标签的sumo蛋白与GyrB的ATP酶结构域蛋白切割开，隔天收集穿透峰中的不带标签的GyrB亚基ATP酶结构域蛋白质样品。利用15％SDS-PAGE检测蛋白样品纯度。最后，浓缩得到2ml浓度为20mg/ml的高纯度大肠杆菌DNA促旋酶GyrB亚基ATP酶结构域的蛋白样品。

4、基于蛋白质热稳定性迁移实验的片段筛选

在96孔PCR板上配制20μl反应体系(全程在冰上操作)，包含：100mM HEPES(pH7.5)，150mMNaCl，2×SYPRO orange荧光染料，8μM大肠杆菌DNA促旋酶GyrB亚基ATP酶结构域蛋白质，1mM的各个化合物片段，轻柔混匀。把96孔PCR板放到StepOnePlus实时荧光定量PCR仪中，在25℃孵育10min，然后按照1℃/min的升温速率从25℃升到95℃。升温期间，每30秒检测一次荧光信号。随着温度升高，GyrB亚基ATP酶结构域逐渐发生热变性，随之荧光信号增强。以荧光信号作为纵坐标，温度作为横坐标，用origin8软件的玻尔兹曼拟合绘制蛋白质热变性曲线并测定蛋白质热变性温度Tm。某一个化合物片段对GyrB亚基ATP酶结构域热稳定性的贡献可以用ΔTm来评价。ΔTm是含有小分子片段时GyrB亚基ATP酶结构域的热变性温度与不加化合物片段时空白对照组的GyrB亚基ATP酶结构域热变性温度的差值。如果ΔTm>0.5℃，则认为该化合物片段对GyrB亚基ATP酶结构域热稳定性有明显贡献，该化合物片段能够与GyrB亚基ATP酶结构域结合。

如图6所示，4-4’-二羟基二苯硫醚化合物片段引起的ΔTm为2.0℃，显著大于0.5℃，因此可以结合GyrB亚基ATP酶结构域。

5、基于ATP酶水解活性实验的片段筛选

该实验使用全长的大肠杆菌DNA促旋酶，其制备方法见文献(RSC Advances,2015,5:105600-8)。在96孔深孔板中，配制95μL的反应液，含有：50mM HEPES(pH 7.5)，150mMKCl，8mM MgCl₂，5％DMSO，5mM β-巯基乙醇，250μg/mL牛血清白蛋白，2mM磷酸烯醇丙酮酸盐，160μM NADH，5个单位的丙酮酸激酶，8个单位的乳酸脱氢酶，150nM大肠杆菌DNA促旋酶，以及1mM的各个化合物片段。在30℃孵育5分钟后，加入5μL浓度为7mM的ATP溶液起始反应。用酶标仪检测20分钟内340nm处的吸光值，每15秒读数一次。通过比较加入各种化合物片段时与不加化合物片段时，反应体系吸光值的下降速率，计算各个化合物片段对大肠杆菌DNA促旋酶的ATP水解活性的抑制率。通过以下公式计算出4-苯氧基苯酚、4-4’-二羟基二苯硫醚两个化合物片段在1mM浓度时的抑制率。ATP水解速率＝-ΔABS₃₄₀/Δtime。化合物片段抑制率＝[ATP水解速率(空白)-ATP水解速率(含片段)]/ATP水解速率(空白)×100％＝[ΔA₃₄₀(空白)-ΔA₃₄₀(含片段)]/ΔA₃₄₀(空白)×100％。如果化合物片段在1mM浓度下对ATPase活性的抑制率超过30％，则该片段被视为活性片段。对于这些具有抑制活性的化合物片段，测量在不同浓度下的抑制率，拟合抑制曲线，计算半数抑制浓度(IC₅₀)。

图7为不同浓度的4-苯氧基苯酚对大肠杆菌DNA促旋酶的ATP水解活性的抑制率柱状图。结果表明，4-苯氧基苯酚在1mM浓度时，几乎完全抑制大肠杆菌DNA促旋酶的ATP水解活性，其浓度降低至62.5μM时仍然表现出一定的抑制活性。

图8为根据图7活性测试结果拟合的4-苯氧基苯酚对大肠杆菌DNA促旋酶的ATP水解活性的抑制曲线，拟合结果显示该片段半数抑制浓度IC₅₀值为528.7μM。

图9为不同浓度的4-4’-二羟基二苯硫醚对大肠杆菌DNA促旋酶的ATP水解活性的抑制率柱状图。结果表明，4-4’-二羟基二苯硫醚在2mM浓度时，几乎完全抑制大肠杆菌DNA促旋酶的ATP水解活性；其浓度降低至125μM时，仍具有一定的抑制活性。

图10为根据图9活性测试结果拟合的4-4’-二羟基二苯硫醚对大肠杆菌DNA促旋酶的ATP水解活性的抑制曲线，拟合结果显示该片段半数抑制浓度IC₅₀值为951.0μM。

尽管4-苯氧基苯酚和4-4’-二羟基二苯硫醚对大肠杆菌DNA促旋酶的抑制活性仍较弱，但是因为化合物片段的结构简单，原子数少，所以仍然具有较高的配体效率(Ligandefficiency)，是基于片段发展新型抑制剂的良好起点。

6、DNA超螺旋试验

DNA超螺旋试验的总反应体系为20μL，其中包括35mMTris-HCl(pH 7.5),24mMKCl,4mM MgCl₂,2mM DTT,1mMATP,1.8mM亚精胺,0.1mg/mL牛血清白蛋白,6.5％甘油,125ng松散型pHTO-1质粒和1mM化合物片段。最后，加入终浓度为25nMDNA促旋酶起始反应，并在37℃水浴锅中孵育30min。随后，加入5μL的5×终止缓冲液(5％酰基氨酸,0.125％溴酚蓝,25％甘油)终止反应。吸取20μL反应液，通过1％琼脂糖核酸电泳检测。核酸电泳胶利用3×4SRedPlus核酸染色剂染色，并在紫外光激发下成像，鉴定结果。

图11为DNA超螺旋试验测试结果图。第一泳道为DNA Marker分别表示松散DNA(R)和超螺旋DNA(Sc)；第二泳道仅含有松散型pHTO-1 DNA，作为阴性对照；第三泳道含有终浓度2.5％的DMSO、pHTO-1 DNA和DNA促旋酶作为空白对照；第四泳道含有终浓度2.5％DMSO的1mM已报道抑制剂新生霉素、pHTO-1 DNA和DNA促旋酶，作为阳性对照；第五泳道至第十四泳道为含有pHOT-1DNA、DNA促旋酶和含2.5％DMSO的1mM浓度编号为1-10的化合物片段。结果表明，在含有新生霉素、化合物片段1,3-10的反应液中，DNA促旋酶的活性被完全抑制，不能将松散DNA转化为超螺旋DNA。片段2在1mM浓度时，能够部分抑制DNA促旋酶的活性。

7、DNA促旋酶GyrB亚基ATP酶结构域的结晶与化合物片段浸泡

采用坐滴气相扩散法生长大肠杆菌DNA促旋酶GyrB亚基ATP酶结构域的晶体，结晶条件为100mMTris-HCl(pH 7.5),2.20M磷酸氢二胺(NH₄)₂HPO₄和10mM的氨基苯并咪唑。该条件下生长的晶体具有较好的健壮性，可以用于片段浸泡和X射线衍射数据采集。

浸泡时，在结晶条件中加入10mM的化合物片段，在8℃浸泡2h。然后，把晶体置于冷冻保护液(补加20％甘油的结晶条件)中浸泡5秒钟，捞出并迅速放入液氮冷冻保持。

图12是蛋白质晶体照片。

8、晶体的X射线衍射数据收集与解析

衍射数据采集在上海同步辐射光源(SSRF)BL17U1工作站进行。每颗晶体收集180幅衍射画面，每幅图像曝光时间为0.5秒，旋转角度1°。浸泡有4-苯氧基苯酚和4-4’-二羟基二苯硫醚的两颗晶体分别采集到和分辨率的完整衍射数据。图13显示了浸泡有4-苯氧基苯酚的晶体的一张衍射画面。

衍射数据采用HKL2000软件进行数据处理。利用MOLREP程序，以大肠杆菌DNA促旋酶GyrB亚基的ATP酶结构域结构(PDB编号：4DUH)为模板，通过分子置换解析衍射相位。利用Coot程序，根据实空间的电子密度图形状，手动修正和完善蛋白质结构模型；并使用Refmac5程序，在倒易空间对结构模型进行自动优化。实空间与倒易空间的结构修正交替进行，直至结构模型达到较高质量。在结构修正的末期，在coot程序中手工添加4-苯氧基苯酚和4-4’-二羟基二苯硫醚，并进一步通过refmac5自动修正。关于数据采集和结构修正的主要统计参数见表2。

4-苯氧基苯酚与大肠杆菌GyrB的共晶结构三维原子坐标为PDB编号5Z4O，4-4’-二羟基二苯硫醚与大肠杆菌GyrB的共晶结构三维原子坐标为PDB编号5Z4H。

表1.化合物片段ATP酶活性测试结果

表2.X-射线晶体衍射数据收集与结构模型修正的主要统计参数

*括号内为最高分辨率壳层的数据。

序列表

<110> 中山大学

<120> 一种DNA促旋酶的药物结合口袋及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 208

<212> PRT

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 1

Gly Gly Leu Asp Ala Val Arg Lys Arg Pro Gly Met Tyr Ile Gly Asp

1 5 10 15

Thr Asp Asp Gly Thr Gly Leu His His Met Val Phe Glu Val Val Asp

20 25 30

Asn Ala Ile Asp Glu Ala Leu Ala Gly His Cys Lys Glu Ile Ile Val

35 40 45

Thr Ile His Ala Asp Asn Ser Val Ser Val Gln Asp Asp Gly Arg Gly

50 55 60

Ile Pro Thr Gly Ile His Pro Glu Glu Gly Val Ser Ala Ala Glu Val

65 70 75 80

Ile Met Thr Val Leu His Ala Gly Gly Lys Phe Asp Asp Asn Ser Tyr

85 90 95

Lys Val Ser Gly Gly Leu His Gly Val Gly Val Ser Val Val Asn Ala

100 105 110

Leu Ser Gln Lys Leu Glu Leu Val Ile Gln Arg Glu Gly Lys Ile His

115 120 125

Arg Gln Ile Tyr Glu His Gly Val Pro Gln Ala Pro Leu Ala Val Thr

130 135 140

Gly Glu Thr Glu Lys Thr Gly Thr Met Val Arg Phe Trp Pro Ser Leu

145 150 155 160

Glu Thr Phe Thr Asn Val Thr Glu Phe Glu Tyr Glu Ile Leu Ala Lys

165 170 175

Arg Leu Arg Glu Leu Ser Phe Leu Asn Ser Gly Val Ser Ile Arg Leu

180 185 190

Arg Asp Lys Arg Asp Gly Lys Glu Asp His Phe His Tyr Glu Gly Gly

195 200 205

<210> 2

<211> 624

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 2

ggtctggatg cggttcgtaa gcgcccgggt atgtatatcg gcgacacgga tgacggcacc 60

ggtctgcacc acatggtatt cgaggtggta gataacgcta tcgacgaagc gctcgcgggt 120

cactgtaaag aaattatcgt caccattcac gccgataact ctgtctctgt acaggatgac 180

gggcgcggca ttccgaccgg tattcacccg gaagagggcg tatcggcggc ggaagtgatc 240

atgaccgttc tgcacgcagg cggtaaattt gacgataact cctataaagt gtccggcggt 300

ctgcacggcg ttggtgtttc ggtagtaaac gccctgtcgc aaaaactgga gctggttatc 360

cagcgcgagg gtaaaattca ccgtcagatc tacgaacacg gtgtaccgca ggccccgctg 420

gcggttaccg gcgagactga aaaaaccggc accatggtgc gtttctggcc cagcctcgaa 480

accttcacca atgtgaccga gttcgaatat gaaattctgg cgaaacgtct gcgtgagttg 540

tcgttcctca actccggcgt ttccattcgt ctgcgcgaca agcgcgacgg caaggaagat 600

cattttcact atgaaggcgg ttga 624

Claims (4)

1.一种DNA促旋酶的药物结合口袋，其特征在于，以DNA促旋酶的B亚基为对象，组成所述药物结合口袋的氨基酸残基为Ile78、Ala91、Ile94、Met95、Val120、Leu132、Ile134、Thr165和Val167；同时以共晶结构中4-苯氧基苯酚或4-4’-二羟基二苯硫醚的1’位苯环或1’位苯酚为平面中心，DNA促旋酶B亚基氨基酸残基Ile78侧链逆时针翻转90°，Met95侧链向后翻转60°以及Leu132侧链顺时针翻转90°形成。

2.权利要求1所述的DNA促旋酶的药物结合口袋在制备DNA促旋酶的抑制剂中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述DNA促旋酶是存在于大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、结核分枝杆菌、链球菌、霍乱杆菌、变形杆菌、绿脓杆菌或沙门氏菌的DNA促旋酶。

4.一种DNA促旋酶抑制剂，其特征在于，包括权利要求1中的DNA促旋酶的药物结合口袋和相关结合的化合物片段；

所述相关结合的化合物片段的结构如下所示：

，

其中，X为-O-、-S-、-NH-、-CH₂-或 -C(CH)₂-；

R₁为氢、卤基、C1~C3的饱和烷基、被1个或多个卤基取代的C1~C3的饱和烷基；

R₂为氢、卤基、C1~C3的饱和烷基、被1个或多个卤基取代的C1~C3的饱和烷基；

R₃为氢、卤基、C1~C3的饱和烷基、被1个或多个卤基取代的C1~C3的饱和烷基；

R₄为氢、卤基、C1~C3的饱和烷基、被1个或多个卤基取代的C1~C3的饱和烷基；

R₅为氢、羟基、卤基、C1~C3的饱和烷基、被1个或多个卤基取代的C1~C3的饱和烷基。