CN108474787A - 用于治疗心脏损伤的方法 - Google Patents

Abstract

本文中提供了用于在确定为心脏内或心脏周围具有心脏祖细胞的受试者中促进心脏祖细胞向肌细胞分化并抑制心脏祖细胞向成纤维细胞和肌成纤维细胞的转化的方法，其通过施用治疗有效量的NRG‑1肽或其功能变体或片段。本文中公开的方法可以用于治疗、预防或延缓心脏损伤的进展，例如心力衰竭或心肌梗死。

Description

用于治疗心脏损伤的方法

相关应用

本申请要求于2015年9月25日提交的美国临时专利申请No.62/233,148的优先权权益，其内容通过引用整体并入本文。

关于联邦资助研究的声明

这项工作部分得到了国立卫生研究院/国立心脏肺和血液研究所在拨款U01HL100398的支持。因此，政府对本发明具有一定的权利。

本公开涉及促进心脏祖细胞向肌细胞分化并抑制心脏祖细胞向成纤维细胞和肌成纤维细胞的转化的方法，通过施用治疗有效量的神经调节蛋白(NRG)肽或其功能片段来进行。

心血管疾病继续成为全球死亡率和发病率的主要原因，每年造成1730万人死亡。例如，由缺血性心脏病、高血压、糖尿病、心瓣膜病、心肌炎、感染、全身性毒素和心脏毒性药物对心脏组织的进行性损伤可能最终导致心力衰竭。存在有在衰竭的心脏试图维持适当的功能时出现的几种代偿机制。这些包括增加心输出，通过心室重塑增加心室体积和壁厚度，以及通过激活神经激素系统维持组织灌注以及提升的平均动脉压。虽然最初对心力衰竭的早期阶段有益，但所有这些代偿机制最终都导致恶化心力衰竭的恶性循环。

此外，心脏损伤需要复杂的结构重塑，涉及肌纤维重排、间质纤维化、胞外基质积聚和血管生成。作为心脏重塑基础的许多过程与慢性炎症过程具有共同特征。在这些过程中，驻留于或浸润到心肌间质中的非肌细胞如内皮细胞、成纤维细胞和免疫细胞发挥积极的作用。

虽然新的疗法已经改善了受试者结果，但是症状性心力衰竭仍然是一种慢性进行性疾病，其用目前的疗法未充分治疗。干细胞疗法已成为治疗严重心肌病的潜在新机制。然而，使用人胚胎干细胞部分由于心脏肌源性分化效率低下而具有相当大的限制。最近已经使用干细胞标志物物如c-Kit和干细胞抗原-1(Sca-1)分离出能够增殖并分化成心肌细胞的内源性心脏干细胞。不幸的是，这些心脏祖细胞还分化为多种谱系，包括肌成纤维细胞，其与可导致心力衰竭的致病性心脏重塑相关。

先前，动物研究和正在进行的临床试验已经证明重组NRG作为潜在的治疗剂对心脏功能的有益效果(参见例如Sawyer等人，2011；Lenihan等人，2013)。现在已经发现NRG/ErbB信号传导在心脏结构和功能完整性中发挥重要作用，其通过抑制心脏祖细胞向肌成纤维细胞的分化和增加向肌细胞的分化实现。因此，本发明部分基于建立以下的研究：心脏祖细胞上的ErbB2和ErbB3受体是导致NRG/ErbB信号传导的NRG靶物，所述NRG/ErbB信号传导驱动心脏祖细胞向肌细胞形成的分化并抑制分化为成纤维细胞和肌成纤维细胞。此发现可以用于鉴定将最受益于用NRG肽或其功能变体或片段的心脏损伤(包括心力衰竭)的治疗的患者。

因此，本发明的一个方面提供了用于鉴定含有响应用NRG治疗的心脏祖细胞的受试者的方法。这可以通过例如在心脏手术期间或心脏导管插入术(cardiaccathertization)期间获得的心脏组织的活组织检查来确定。方法可以包括从受试者分离细胞的步骤，或者可以使用源自受试者的细胞样品完全在体外进行。然后，可以将从活组织检查材料分离的心脏祖细胞暴露于NRG肽或其功能变体或片段，以通过表现出向成纤维细胞和肌成纤维细胞的转化减少和/或通过优先分化为心肌细胞来确定细胞是否响应。可以预期心脏祖细胞表现对NRG肽或其功能变体或片段的此种响应的受试者良好响应用NRG肽或其功能片段或变体的心脏损伤的治疗或预防。

因此，本发明的另一方面提供了用于治疗发现含有响应NRG肽或其功能变体或片段的心脏祖细胞的受试者的方法，所述发现通过远离成纤维细胞和/或向心肌细胞的优先分化实现。本发明还提供了NRG肽或其功能变体或片段，用于治疗此类受试者的方法，例如治疗或预防心脏损伤的方法，诱导心脏组织再生的方法或修复心脏组织的方法。该方法可以在通过如本文的方法鉴定的任何受试者中进行。方法包括施用治疗有效量的NRG肽或其功能变体或片段以在患有心脏损伤的受试者中促进心脏祖细胞向心脏单核细胞的分化并且抑制心脏祖细胞转化为成纤维细胞和肌成纤维细胞。本发明的其它方面提供了用于诱导心脏组织形成、增强心脏组织和预防心脏损伤发作的方法，其通过对鉴定为具有响应NRG的心脏祖细胞的患者施用治疗有效量的NRG肽或其功能变体或片段进行。还提供了NRG肽或其功能变体或片段，用于诱导心脏组织形成、增强心脏组织或预防心脏损伤发作的方法，其通过对鉴定为具有响应NRG的心脏祖细胞的患者施用治疗有效量的NRG肽或功能变体或片段进行。通过向受试者施用NRG肽或其功能变体或片段来激活NRG/ErbB信号传导在那些受试者中促进心脏祖细胞向心肌细胞分化，导致增强的心肌再生和改善的心脏功能。本发明的方法可以包括共施用人胚胎干细胞或人心脏祖细胞。

在某些实施方案中，抑制心脏祖细胞向成纤维细胞和肌成纤维细胞的转化通过驱动向肌细胞形成的分化诱导心脏组织再生。在其它实施方案中，抑制心脏祖细胞向成纤维细胞和肌成纤维细胞的转化和/或诱导分化成心肌细胞，修复并增强心脏组织。在另一个实施方案中，抑制心脏祖细胞转化成成纤维细胞和肌成纤维细胞防止心脏纤维化。在更具体的实施方案中，减少心脏损伤后的心脏纤维化防止瘢痕组织的形成。在一些实施方案中，可以逆转或修复疤痕组织。在某些实施方案中，抑制心脏祖细胞向成纤维细胞和肌成纤维细胞的转化防止心脏损伤的发作。

在一个方面，在发现具有响应用NRG治疗的心脏祖细胞的受试者中诱导心脏损伤后心脏组织再生的方法包括施用治疗有效量的NRG肽或其功能变体或片段。

另一方面，在发现具有响应用NRG治疗的心脏祖细胞的受试者中修复心脏损伤后心脏组织的方法包括施用治疗有效量的NRG肽或其功能变体或片段。

另一方面，在发现具有响应用NRG治疗的心脏祖细胞的受试者中预防心脏损伤发作的方法包括施用治疗有效量的NRG肽或其功能变体或片段。

在某些实施方案中，心脏损伤是由心血管疾病导致的。在一些实施方案中，心血管疾病是由以下导致的：冠状动脉疾病、中风、心肌梗死、心肌病、高血压、缺血性心脏病、心房纤颤、先天性心脏病、心肌炎、心内膜炎、心包炎、动脉粥样硬化、血管疾病、冠状动脉搭桥手术、暴露于心脏毒性化合物、甲状腺疾病、病毒感染、牙龈炎、药物滥用、酒精滥用或高血液胆固醇。在具体的实施方案中，受试者患有左心室收缩功能障碍。在一些实施方案中，受试者患有心力衰竭。

在某些实施方案中，受试者有形成心脏损伤的风险或具有心血管疾病史。在其它实施方案中，受试者可以正在考虑用已知损害心脏组织的化学治疗剂进行化学疗法。鉴定受试者是否具有响应NRG治疗的心脏祖细胞指示受试者将受益于用NRG肽或其功能变体或片段的同时治疗。因此，在一些实施方案中，本文中提供的方法还包括在施用NRG肽或其功能变体或片段之前，期间或之后施用治疗有效量的抗癌剂，例如阿扎胞苷。

在其它实施方案中，本文中提供的受试者是哺乳动物。在一些实施方案中，哺乳动物是人。在一些实施方案中，人患有癌症并且已经接受与对心脏组织和功能的损害相关的癌症治疗。在一些实施方案中，人是患有先天性心脏损伤或从心脏手术，特别是重塑或重新设计心脏部分的手术恢复的儿童或婴儿。

在一些实施方案中，静脉内或皮下施用NRG肽或其功能变体或片段。

在某些实施方案中，NRG肽是NRG-1或NRG-2肽(特别是NRG-1β，更特别是神经胶质生长因子(GGF)2肽(例如Cimaglerminα)或功能性变体。在一些具体的实施方案中，NRG肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或SEQ ID NO:1的功能性变体或片段。在一些实施方案中，NRG肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或SEQ ID NO:2的功能片段。在一些实施方案中，NRG肽包含SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22的氨基酸序列或其功能片段。

在某些实施方案中，NRG肽或其功能变体或片段结合心脏祖细胞上表达的ErbB3受体以激活ErbB信号传导。

在某些实施方案中，NRG肽或其功能变体或其片段与ErbB3受体的结合激活ErbB信号传导。在至少一些实施方案中，NRG肽或其功能变体或片段结合ErbB3受体并通过募集心脏祖细胞上的ErbB2受体来实现ErbB信号传导。所得的ErbB信号传导促进心脏祖细胞向心肌细胞的分化和/或抑制心脏祖细胞向成纤维细胞和肌成纤维细胞的转化。

本发明的另一方面提供了鉴定将受益于用NRG治疗或预防心脏损伤的受试者的方法，其包括：

a)从具有心脏损伤或处于心脏损伤风险的受试者中分离人心脏祖细胞；

b)将所述受试者的细胞暴露于NRG肽或功能变体或片段；

c)通过确定细胞向成纤维细胞和成肌纤维细胞的转化是否受到抑制和/或所述细胞是否优先分化成心肌细胞来评估所述细胞是否响应于NRG；并且

其中若发现抑制所述心脏祖细胞向成纤维细胞和成肌纤维细胞的转化或优先分化成心肌细胞，则受试者将受益于用NRG肽或其功能变体或片段治疗或预防心脏损伤。在相关方面，该方法在来自受试者的心脏祖细胞上进行，并且该方法不包括分离那些细胞的步骤。例如，提供了鉴定受益于NRG治疗或预防心脏损伤的受试者的方法，其包括：

a)在体外将来自具有心脏损伤或处于心脏损伤风险的受试者的人心脏祖细胞暴露于NRG肽或其功能变体或片段；

b)通过确定细胞向成纤维细胞和成肌纤维细胞的转化是否受到抑制和/或所述细胞是否优先分化成心肌细胞来评估所述细胞是否对神经调节蛋白响应；

其中若发现抑制心脏祖细胞向成纤维细胞和成肌纤维细胞的转化或优先分化成心肌细胞，则受试者将受益于用NRG肽或其功能变体或片段治疗或预防心脏损伤。

本发明的另一方面提供了治疗或预防心脏损伤的方法，其包括：

a)从具有心脏损伤或处于心脏损伤风险的受试者中分离人心脏祖细胞；

b)通过抑制心脏祖细胞向成纤维细胞和肌成纤维细胞的转化和/或促进心脏祖细胞分化成心肌细胞，评估所述受试者的心脏祖细胞是否响应NRG肽或其功能变体或片段；并且

c)若所述心脏祖细胞是响应性的，则施用NRG肽或其功能变体或片段以治疗或预防心脏损伤或减轻心脏损伤的严重性。

在相关方面，本发明提供了NRG肽或其功能变体或片段，用于此类方法或用于治疗受试者的方法，所述受试者通过如本文描述的方法鉴定为将受益于心脏损伤的治疗或预防。

在另一个实施方案中，本发明的方法包括：

a)培养并扩增心脏祖细胞，所述心脏祖细胞通过抑制心脏祖细胞向成纤维细胞和肌成纤维细胞的转化和/或促进心脏祖细胞分化成心肌细胞而发现能够响应于NRG肽或其功能变体或片段；并且

b)将扩增的心脏祖细胞与治疗有效量的NRG肽或其功能变体或片段一起施用于受试者。还提供了用于此类方法的NRG肽或其功能变体或片段。

本发明的另一方面提供了生产富含心肌细胞的细胞群的方法，其包括：

a)分离从受试者获得的心脏祖细胞；

b)在生长培养基中培养所述细胞；

c)将所述细胞与有效量的NRG肽或其功能变体或片段温育以促进向心肌细胞的分化；并且

d)分离心肌细胞。

此方法可以继之以向受试者施用心肌细胞。可以在步骤a)中从体外样品如如本文所述的活组织检查样品中分离细胞。

附图说明

图1显示了鼠Sca-1^posCD31^neg心脏祖细胞表达ErbB2和ErbB3受体。图1A描绘了代表性流式细胞术直方图，其表明在磁活化细胞分选之前(左图)和之后(右图)分离的心脏祖细胞亚群的纯度。图1B显示了心脏祖细胞中ErbB受体的mRNA表达谱(profile)。图1C描绘了Sca-1^pos/CD31^neg心脏祖细胞上细胞表面标志物的代表性流式细胞术直方图。阴影区代表用相应的同种型匹配抗体对照处理的细胞的荧光。

图2显示了鼠Sca-1^pos/CD31^neg心脏祖细胞在体外向内皮细胞和心肌细胞分化。图2A描绘了在生长培养基(左图)或内皮细胞(EC)分化培养基(中图)中温育心脏祖细胞之后毛细管样结构形成的示例性显微照片。使用CD31^pos心脏内皮细胞作为阳性对照(右图)。图2B显示了在生长培养基(对照，左柱形)或内皮细胞分化培养基(diff，中间柱形)和心脏内皮细胞(EC，右柱形)中温育的心脏祖细胞的形态发生活性的图示。毛细管形成通过测量它们的总长度来估计。图2C显示了在正常生长培养基(Con)或心肌细胞分化培养基(Diff)中培养1或3周(w)的心脏Sca-1^posCD31^neg细胞中心脏特异性基因表达的示例性实时-PCR分析。这些值是三次实验的平均值。cTnT，心肌肌钙蛋白T；-MHC，-肌球蛋白重链。

图3显示了NRG-1防止鼠心脏祖细胞转化为肌成纤维细胞。图3A描绘了代表性流式细胞术点图，其表明在小鼠中的实验性心肌梗死后第7天(D7，MI)存在有心脏祖细胞向αSMA阳性和胶原1生成性肌成纤维细胞的体内积累。图3B描绘了来自αSMA阳性(左)和胶原1α阳性(右)Sca-1^posCD31^neg心脏祖细胞的流式细胞术分析的数据的图示。指示P值，非配对t检验。图3C描绘了代表性的细胞荧光照片点图，显示了在单独的TGFβ(TGFβ)或与30ng/mlNRG-1组合的TGFβ(TGFβ+NRG-1)温育48小时的心脏祖细胞中αSMA蛋白的表达。图3D描绘了如通过流式细胞术评估的心脏Sca-1^posCD31^neg祖细胞中αSMA表达的平均荧光强度。数据代表来自三个独立实验的平均值±SEM。P值指示通过t检验计算的显著性水平。

图4显示了ErbB2和ErbB3受体定位于人心脏中的血管/血管周围区域。绿色：ErbB2(左图)和ErbB3(右图)的染色(分别来自Invitrogen和Santa Cruz Biotech的抗体)；红色：鬼笔环肽；蓝色：TO-PRO-3(核染色)；黄色箭头指示血管周围染色。

图5显示了NRG-1防止人心脏祖细胞转化为肌成纤维细胞。图5A描绘了在再铺板单细胞来源的克隆之后立即(d0，上图)和3天后(d3，下图)的人心脏祖细胞的相差显微照片。比例尺＝100μm。图5B描绘了在(C)之前和在分化培养基中培养1或2周(w)之后的人心脏祖细胞中心脏特异性基因表达的实时PCR分析。数值是三次实验的平均值，非配对t检验。图5C描述了人心脏祖细胞上细胞表面标志物的流式细胞术直方图。阴影区代表用相应的同种型匹配抗体对照处理的细胞的荧光

发明详述

为了可以更容易理解本公开，首先定义了某些术语。这些定义应根据本公开的其余部分并且如本领域普通技术人员所理解来阅读。除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同的含义。在整个详细描述中阐述了另外的定义。

如本文所用，术语“一个”实体或“一种”实体指一个/种或多个/种所述实体。例如，提及“肽”包括两种或更多种此类肽的混合物，等等。因此，术语“一种”、“一个”、“一个/种或多个/种”和“至少一个/种”可以互换使用。例如，“剂量”包括一剂或多剂。此外，除非上下文另有要求，单数术语应当包括复数，并且复数术语应当包括单数。

如本文所用，术语“约”是叙述的值加或减另一个量；从而建立数值范围。在某些优选实施方案中，“约”表示相对于基础(或核心或参考)值或量加或减高达15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.75％、0.5％、0.25％或0.1％。

当在列表中的元素之间使用时，短语“和/或”意图指(1)仅存在单个列出的元素，或(2)存在列表中的超过一个元素。例如，“A、B和/或C”指选择可以是单独的A；单独的B；单独的C；A和B；A和C；B和C；或A、B和C。短语“和/或”可以与列表中的“至少一个”或“一个或多个”元素互换使用。

如本文所用，术语“心脏毒性”指通过直接或间接损害或杀死心肌细胞来降低心脏功能的化合物。

如本文所用，术语“赋形剂”指加入药物组合物以进一步促进活性成分施用的惰性物质。实例包括但不限于碳酸氢钙、磷酸钙、各种糖和淀粉类型、纤维素衍生物、明胶、植物油、聚乙二醇和表面活性剂，包括例如聚山梨醇酯20。

如本文所用，术语“间歇或不连续施用”包括按至少(或不少于)24小时、36小时、48小时、72小时、96小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、90天、1周、2周、3周、4周、1个月、2个月、3个月(每季度)、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、或更长，或其任何组合或增量的间隔给药的方案，只要间隔/方案是至少24小时、36小时、48小时、72小时、96小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、90天、1周、2周、3周、4周、1个月、2个月、3个月(每季度)、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、或更长时间。例如，肽以给药间隔施用至少2周，例如至少2周、3周或4周。例如，给药间隔大于4个月。

如本文所用，术语“NRG肽”指与心脏祖细胞上的至少ErbB3结合并激活ErbB信号传导的肽。NRG肽包括NRG-1、NRG-2或含表皮生长因子(EGF)样域的肽，其至少与ErbB3受体结合并募集ErbB2受体以实现ErbB信号传导。“含有EGF样域的肽”携带与EGF受体结合域的结构相似性，例如如Holmes等，1992；美国专利号5,530,109；美国专利号5,716,930；美国专利号7,037,888；Hijazi等，1998；Chang等，1997；Carraway等，1997；Higashiyama等，1997；和WO 97/09425中公开。NRG-1肽描述于美国专利号4,910,621；美国专利号5,530,109；美国专利号5,716,930；和美国专利号7,037,888，其各自通过引用整体并入本文。美国专利8,114,838中描述了NRG-2肽，其通过引用完整并入本文。在一些实施方案中，NRG-2肽是NRG-2α。在一些实施方案中，NRG-2肽是NRG-2β。在某些实施方案中，用于本发明方法中的NRG肽是NRG-1β肽，例如同种型GGF2(SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2)或其功能变体或片段。在其它实施方案中，用于本发明方法中的NRG肽是NRG-2肽，例如NRG-2α(SEQ ID NO:21)或NRG-2β(SEQ IDNO:22)，或功能性变体或其片段。术语“NRG肽或其功能变体或片段”意图包括如本文公开的NRG肽、NRG肽的功能变体、NRG肽的功能性片段或NRG的功能性变体的功能性片段肽。

如本文所用，术语NRG肽的“功能变体”意指该肽拥有EGF样域并结合ErbB3，募集ErbB2，并诱导NGR/ErbB信号传导，从而导致心脏祖细胞向成纤维细胞和肌成纤维细胞的转化受到抑制和/或通过心脏祖细胞优先分化成心肌细胞。NRG的功能变体可以携带与GGF2的实质性序列相似性。在一些实施方案中，NRG肽的功能变体与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:21、或SEQ ID NO:22或其功能片段是80％、82％,85％、88％、90％、92％、95％、98％、或99％相同的。在一些实施方案中，变体与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:21、或SEQ ID NO:22的相应部分相差氨基酸取代、缺失或插入。在一些实施方案中，变体与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:21、或SEQ ID NO:22仅相差氨基酸的保守取代。在一些实施方案中，变体与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:21、或SEQ ID NO:22的相应部分相差小于25、小于20、小于15、小于12个、小于10个、小于8个、小于5个、小于2个氨基酸取代，其可以是保守取代。

如本文所用，术语NRG肽的“功能片段”指NRG肽的任何截短部分，例如具有SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:21、或SEQ ID NO:22的氨基酸序列或其功能变体，其保留至少结合心脏祖细胞上的ErbB3并激活NRG/ErbB信号传导，从而导致心脏祖细胞向成纤维细胞和肌成纤维细胞的转化受到抑制和/或通过心脏祖细胞优先分化成心肌细胞的能力。

如本文所用，“对神经调节蛋白响应”和“响应用神经调节蛋白的治疗”指暴露于NRG肽或其功能变体或片段后优先分化成心肌细胞和/或表现出分化为成纤维细胞或肌成纤维细胞减少的心脏祖细胞。

如本文所用，短语“生理上可接受的载体”和“药学上可接受的载体”可互换使用，指不对生物造成显著刺激并且不消除施用的细菌化合物的生物活性和性质的载体或稀释剂。这些短语下包含佐剂。

肽和其功能变体及其片段是纯化和/或分离的。如本文所用，当通过重组技术产生时，“分离的”或“纯化的”肽、变体或片段基本上不含其它细胞材料或培养基，或在化学合成时不含化学前体或其它化学物质。纯化的化合物为按重量(干重)计至少60％的目标化合物。优选地，该制剂按重量计至少75％，更优选至少90％，最优选至少99％的感兴趣化合物。例如，纯化的化合物是按重量计至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、98％、99％或100％(w/w)d期望化合物。通过任何适当的标准方法，例如通过柱层析、薄层层析或高效液相层析(HPLC)分析测量纯度。纯化或分离的多核苷酸(核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA))不含在其天然存在的状态下位于其侧翼的基因或序列。纯化或分离的肽不含在其天然存在状态下在其侧翼的氨基酸或序列。纯化还限定对于施用于人受试者是安全的无菌性程度，例如缺乏传染源或毒性剂。

如本文所用，术语“预防”意指最小化或部分或完全抑制由心脏损伤引起的纤维化和瘢痕组织的形成。

如本文所用，术语“再生”指对功能已经受损的丧失或受损的细胞、组织或器官恢复功能。再生能力可以作为细胞、组织或器官的功能来测量。此类功能可以是但不限于蛋白质的表达、组织重塑、血管生成/血管发生的诱导、肥大的减少以及作为组织或器官的协调功能、收缩性和松弛。在一些实施方案中，再生器官功能的至少20、30、40、50、60、70、80、90、95、98、99或100％。

如本文所用，术语“稳态水平”指外源试剂的水平，例如足以在施用和消除之间达到平衡(在随后剂量之间的波动范围内)的肽。“维持稳定状态治疗水平”指维持足以对受试者赋予治疗益处的水平的外源试剂的浓度。

如本文所用，术语“治疗有效量”意图指药物或药剂(例如本文所述的NRG肽，如NRG-1β，特别是GGF2)的量，例如具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列的肽或其功能变体或片段，其引起产生的肌成纤维细胞数目的减少和/或增加由内源性心脏祖细胞或共施用的心脏祖细胞产生的肌细胞数目。“治疗有效量”指足以改善或维持心脏组织的健康和完整性，减少或减轻与心脏损伤或纤维化相关的症状发生，使与导致特定身体功能损害的心脏损伤相关的疾病或病症中身体功能正常化，或者提供一种或多种涉及心脏损伤的疾病的临床测量参数的改善的量。

如本文所用，术语“治疗”指施用本文所述的NRG肽如NRG-1β，特别是同种型GGF2，例如具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列的肽，或其功能变体或片段将以统计学显著的方式在发现具有响应NRG的心脏祖细胞的受试者中显示或抑制在不存在治疗的情况下会发生的心脏损伤的进展。可以使用公知的指数，诸如左心室射血分数、运动表现、二尖瓣回流、呼吸困难、外周性水肿和上文列举的其它临床测试，以及存活率和住院率可来评估疾病进展。可以通过本领域公知的方法来确定治疗是否以统计学显著的方式减缓或抑制心脏损伤进展(参见例如SOLVD Investigators，1992和Cohn等，1998，通过引用并入本文)。

心脏祖细胞中的NRG/ErbB信号传导

通常，由于心脏成纤维细胞的激活而引起的纤维化阻碍了心脏再生并且促成心脏损伤后收缩功能的丧失、病理性重塑以及对心力衰竭和心肌梗死的易感性。现在已经发现，可以通过施用NRG肽或其功能变体或片段来刺激哺乳动物心脏以使心脏损伤后的天然再生潜力最大化。在一些实施方案中，通过先前的程序将患者鉴定为具有天然心脏祖细胞的供应。或者，此种天然再生潜力可以通过共施用(同时或顺序、连续或间歇)人心脏祖细胞或人胚胎干细胞来补充。理想地，共施用的心脏祖细胞最初从正在治疗的受试者获得。

NRG肽或其功能变体或片段的施用在受试者中促进心脏祖细胞向心肌细胞的分化并抑制心脏祖细胞向成纤维细胞和肌成纤维细胞的转化。

在某些实施方案中，向受试者施用治疗有效量的NRG肽或其功能变体或片段在施用后至少12周、至少10周、至少8周、至少6周、至少4周、至少2周或至少1周的时段内促进心脏祖细胞向心肌细胞的分化并抑制心脏祖细胞转化成成纤维细胞和肌成纤维细胞。在其它实施方案中，向受试者施用治疗有效量的NRG肽或其功能变体或片段在施用后至少10天、至少9天、至少8天、至少7天、至少6天、至少5天、至少4天、至少3天、至少2天或至少1天的时段内促进心脏祖细胞向肌细胞的分化并抑制心脏祖细胞转化成成纤维细胞和肌成纤维细胞。在另一个实施方案中，向受试者施用治疗有效量的NRG肽或其功能变体或片段在施用后促进心脏祖细胞向心肌细胞的分化并且抑制心脏祖细胞转化成成纤维细胞和肌成纤维细胞达至少70小时、至少60小时、至少50小时、至少40小时、至少30小时、至少20小时、至少15小时、至少10小时、至少5小时、至少4小时、至少3小时、至少2小时，或至少1小时。

在另一个实施方案中，向受试者施用NRG肽或其功能变体或片段促进至少约00.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、的心脏祖细胞向心肌细胞的分化。

在其它实施方案中，向受试者施用NRG肽或其功能变体或片段抑制心脏祖细胞向成纤维细胞和肌成纤维细胞的转化达约1％、5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、或100％。

在某些实施方案中，向受试者施用NRG肽或其功能变体或片段促进至少约0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、或100％的心脏祖细胞向心肌细胞的分化，并抑制心脏祖细胞向成纤维细胞和肌成纤维细胞的转化达约1％、5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、或100％。

在某些实施方案中，向受试者施用NRG肽或其功能变体或片段导致成纤维细胞的产生减少和功能性肌细胞的产生增加。在其它实施方案中，向受试者施用NRG肽或其功能变体或片段具有抗纤维化效果。

在某些实施方案中，向受试者施用NRG肽或其功能变体或片段抑制心肌纤维化。在其它实施方案中，向受试者施用NRG肽或其功能变体或片段降低促纤维化基因的表达。在具体的实施方案中，向受试者施用NRG肽或其功能变体或片段降低胶原、微纤维蛋白、骨粘连蛋白，骨膜蛋白(periostin)和多功能蛋白聚糖(versican)的表达。

在某些实施方案中，在受试者中促进心脏祖细胞分化成心肌细胞并抑制心脏祖细胞向成纤维细胞和肌成纤维细胞的转化的方法包括向受试者施用NRG肽或其功能变体或片段，并且(同时、顺序、连续或间歇地)共施用表达心脏转录因子的载体。在某些实施方案中，心脏转录因子是GATA4、Hand2、MEF2C、MesP1、Nkx2-5、或Tbx5。

在某些实施方案中，促进心脏祖细胞分化成心肌细胞并抑制心脏祖细胞转化成成纤维细胞和肌成纤维细胞的方法包括向患有癌症的受试者施用NRG肽或其功能变体或片段。NRG肽或其功能变体或片段可以在化疗剂之前、之后或同时施用。它可以与化学治疗剂同时或顺序施用。在一些实施方案中，化学治疗剂是赫赛汀(Herceptin)。在一些实施方案中，化学治疗剂选自：苯达莫司汀(bendamustine)、白消安(busulfan)、卡莫司汀(carmustine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、达卡巴嗪(dacarbazine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、美法仑(melphalan)、丙卡巴肼(procarbazine)、链佐星(streptozocin)、替莫唑胺(temozolomide)、天冬酰胺酶(asparaginase)、卡培他滨(capecitabine)、阿糖胞苷(cytarabine)、5-氟尿嘧啶(5-Fluoro Uracil)、氟达拉滨(fludarabine)、吉西他滨(gemcitabine)、甲氨喋呤(methotrexate)、培美曲塞(pemetrexed)、雷替曲塞(raltitrexed)、放线菌素D/更生霉素(dactinomycin)、博来霉素(bleomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、多柔比星(doxorubicin)、多柔比星(聚乙二醇化脂质体)、表柔比星(epirubicin)、伊达比星(idarubicin)、丝裂霉素(mitomycin)、米托蒽醌(mitoxantron)、天冬酰胺酶、卡培他滨、阿糖胞苷(cytarabine)、5-氟尿嘧啶、氟达拉滨、吉西他滨、甲氨喋呤、培美曲塞、放线菌素D/更生霉素、博来霉素、柔红霉素、多柔比星、多柔比星(聚乙二醇化脂质体)、表柔比星、伊达比星、丝裂霉素、米托蒽醌、依托泊苷、多西他赛(docetaxel)、伊立替康(irinotecan)、紫杉醇(paclitaxel)、托泊替康(topotecan)、长春碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)、长春瑞滨(vinorelbine)、卡铂(carboplatin)、顺铂(cisplatin)、奥沙利铂(oxaliplati)、阿仑单抗(alemtuzamab)、BCG、贝伐单抗(bevacizumab)、西妥昔单抗(cetuximab)、狄诺塞麦(denosumab)、厄洛替尼(erlotinib)、吉非替尼(gefitinib)、伊马替尼(imatinib)、干扰素、易普利姆玛(ipilimumab)、拉帕替尼(lapatinib)、帕尼单抗(panitumumab)、利妥昔单抗(rituximab)、舒尼替尼(sunitinib)、索拉非尼(sorafenib)、西罗莫司(temsirolimus)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、氯膦酸(clodronate)、伊班膦酸(ibandronic acid)、帕玛二磷酸(pamidronate)、唑来膦酸(zolendronic acid)、阿那曲唑(anastrozole)、阿比特龙(abiraterone)、氨磷汀(amifostine)、贝沙罗汀(bexarotene)、比卡鲁胺(bicalutamide)、布舍瑞林(buserelin)、环丙孕酮(cyproterone)、地加瑞克(degarelix)、依西美坦(exemestane)、氟他胺(flutamide)、亚叶酸、氟维司群(fulvestrant)、戈舍瑞林(goserelin)、兰瑞肽(lanreotide)、来那度胺(lenalidomide)、来曲唑(letrozole)、亮丙瑞林(leuprorelin)、甲羟孕酮(medroxyprogesterone)、甲地孕酮(megestrol)、美司钠(mesna)、奥曲肽(octreotide)、己烯雌酚(stilboestrol)、他莫昔芬(tamoxifen)、沙利度胺(thalidomide)或曲普瑞林(triptorelin)。

在某些实施方案中，在受试者中促进心脏祖细胞分化成心肌细胞并抑制心脏祖细胞向成纤维细胞和肌成纤维细胞的转化的方法包括向受试者施用NRG肽或其功能变体或片段，并且共施用(同时、顺序、连续或间歇)响应NRG的人心脏祖细胞。在一些实施方案中，最初从接受治疗的受试者中分离人心脏祖细胞并体外扩增，之后用NRG肽或其功能变体或片段再施用。在某些实施方案中，本发明方法中施用的心脏祖细胞表达干细胞抗原、c-kit、sca-1、isl-1、SSEA-I或ABCG2。在其它实施方案中，本文提供的心脏祖细胞表达心脏特异性标记物；例如NKx2.5、GATA4、α-MHC。在一个优选的实施方案中，心脏祖细胞表达sca-1。在其它实施方案中，心脏祖细胞不表达c-kit。在一些实施方案中，心脏祖细胞可以是心球体(cardiospheres)。

在某些实施方案中，本文提供的心脏祖细胞获自和/或施用于心脏的心房和/或心室。在更具体的实施方案中，心脏祖细胞获自和/或施用于左心室。在更具体的实施方案中，心脏祖细胞获自和/或施用于心脏的左心室游离壁、血管或血管周围区域。在某些实施方案中，获得和/或施用的心脏祖细胞表达sca-1的。可以通过本领域已知或本文公开的任何手段分离心脏祖细胞。

在某些实施方案中，向受试者施用NRG肽或其功能变体或片段限制TGF-β激活并降低成纤维细胞激活。TGF-β以三种同种型(TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3)存在，它们在免疫、炎症和组织修复中具有独特但重叠的功能，并且TGF-β在成纤维细胞激活和分化成肌成纤维细胞中也具有中心作用。

神经调节蛋白

NRG是结合ErbB受体的与表皮生长因子超家族有关的生长因子。已经显示了它们在心力衰竭、心脏毒性和缺血的多种模型中改善心脏功能。还已经显示了NRG保护中风、脊髓损伤、神经试剂暴露、周围神经损伤和化学毒性模型中的神经系统(对于综述，参见Sawyer和Caggiano，2011)。

NRG家族成员包含NRG-1、NRG-2、NRG-3和NRG-4基因，拥有允许它们结合并激活ErbB受体的EGF样域。由于可变剪接转录物，每个NRG基因可以作为多种独特的蛋白质同种型表达(Falls，2003)。NRG还包含具有基本上不改变其生物学活性的保守氨基酸取代的变体或功能同源物。氨基酸的合适保守取代是本领域技术人员已知的，并且通常可以在不改变所得分子的生物学活性的情况下进行。

Holmes等人(1992)已经显示了单独的EGF样域足以结合并激活ErbB信号传导。因此，由NRG-1、NRG-2、NRG-3或NRG-4基因编码的任何肽产物或任何NRG样肽，例如具有由NRG基因或cDNA编码的EGF样域的肽(例如，含有EGF样域的NRG-1肽亚域CC/D或CC/D’，如记载于美国专利号5,530,109、美国专利号5,716,930和美国专利号7,037,888；或如WO 97/09425中公开的EGF样域)可用于本公开的方法中以预防、治疗心血管疾病，例如心力衰竭或延缓心血管疾病，例如心力衰竭的进展。美国专利号5,530,109；美国专利号5,716,930；美国专利号7,037,888；和WO 97/09425中每篇的内容整体并入本文。

NRG-1包含一组约15种独特的结构上相关的同种型(Lemke，1996；Peles和Yarden，1993)。在一些实施方案中，用于本公开方法中的肽或其功能片段包含至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14或至少15种NRG-1同种型。这些同种型可以根据它们的N-末端序列分成三组(I、II或III)。在本公开中，可以使用NRG-1的任何同种型。NRG同种型可以从短转录物产生，直接导致分泌性配体或者是合成的配体或作为跨膜前体蛋白合成。

NRG-1

在一些实施方案中，NRG肽是NRG-1β或其功能变体或片段。在更具体的实施方案中，NRG-1肽或其功能片段是NRG-1β同种型1、同种型2、同种型3、同种型4、同种型5、同种型6、同种型7、同种型8、同种型9、同种型10、同种型11或同种型12。在特别优选的实施方案中，同种型是GGF2。

在某些实施方案中，NRG-1β肽或其功能变体或片段是重组蛋白。在另一个实施方案中，NRG-1β肽或其功能片段是包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的重组蛋白。在另一个实施方案中，NRG-1β肽或其功能片段是包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的重组蛋白。

神经胶质生长因子2

在一些实施方案中，NRG肽是神经胶质生长因子GGF2。成熟GGF2的氨基酸序列在SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2中显示。在一些实施方案中，肽包含GGF2的功能变体或片段。结合并激活心脏祖细胞上的ErbB3受体并激活ErbB信号传导的GGF2功能片段可以包含SEQ IDNO:2的371个氨基酸或更少，例如370、369、368、367、366、365、360、355、350、340、330、320、310、300、290、280、270、260、250、240、230、220、210、200、190、180、170、160、150、140、130、120、110、100、90、80、70、60、55、50、45、40、35、30、25、20个氨基酸或更少。

GGF2的功能变体结合并激活心脏祖细胞上的ErbB3受体并激活ErbB信号传导。用于本发明方法的变体GGF2可以包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10。在某些实施方案中，GGF2肽包含与SEQ ID NO:2或其功能性片段80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、相同的氨基酸序列。

NRG-2

在一些实施方案中，NRG肽是NRG-2肽，例如NRG-2α或NRG-2β。NRG-2α的氨基酸序列在SEQ ID NO:21中显示，并且NRG-2β的氨基酸序列在SEQ ID NO:2中显示。在一些实施方案中，肽包含NRG-2α或NRG-2β的功能变体或片段。结合并激活心脏祖细胞上的ErbB3受体并激活ErbB信号传导的NRG-2α功能片段可以包含SEQ ID NO:21的329个氨基酸或更少，例如325、320、310、300、290、280、270、260、250、240、230、220、210、200、190、180、170、160、150、140、130、120、110、100、90、80、70、60、55、50、45、40、35、30、25、20个氨基酸或更少。结合并激活心脏祖细胞上的ErbB3受体并激活ErbB信号传导的NRG-2β功能片段可以包含SEQ IDNO:22的297个氨基酸或更少，例如295、290、280、270、260、250、240、230、220、210、200、190、180、170、160、150、140、130、120、110、100、90、80、70、60、55、50、45、40、35、30、25、20个氨基酸或更少。

NRG-2α或NRG-2β的功能变体结合并激活心脏祖细胞上的ErbB3受体并激活ErbB信号传导。在本发明的方法中使用的变体NRG-2α或NRG-2β可以包含与SEQ ID NO:21或SEQ IDNO:22或其功能片段80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％相同的氨基酸序列。

EGF样域

适用于本公开方法的NRG变体肽或其功能性片段包含含有EGF样域的肽。在一些实施方案中，含有EGF样域的肽包含氨基酸序列SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12。在一些实施方案中，本发明方法中使用的NRG肽或其功能变体或片段包含源自NRG-1β，特别是GGF2的EGF样域。在具体的实施方案中，本发明方法中使用的NRG肽或其功能变体或片段包含源自GGF2的EGF样域。在其它具体实施方案中，本公开方法中使用的肽或其功能片段包含源自NRG-1β，特别是GGF2的EGF样域。适用于本发明方法的示例性的含有EGF域的肽可以包含SEQ IDNO:13(EGFL1)、SEQ ID NO:14(EGFL2)、SEQ ID NO:15(EGFL3)、SEQ ID NO:16(EGFL4)、SEQID NO:17(EGFL5)、或SEQ ID NO:18(EGFL6)中所示的氨基酸序列。

组合物、施用和剂量

在某些实施方案中，适用于本发明方法的NRG肽或其功能变体或片段是纯化的重组或化学合成的肽。

在某些实施方案中，本文所述的NRG肽或其功能变体或片段可以与药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂一起施用于受试者，例如人、兽医受试者或实验动物。本公开的组合物可以以单位剂型提供。治疗配制剂可以是液体溶液或悬浮液的形式；对于口服给药，配制剂可以为片剂或胶囊的形式；并且对于鼻内配制剂，为粉剂、滴鼻剂或气雾剂的形式。

用于制备配制剂的方法见于例如“Remington’s Pharmaceutical Sciences”。用于肠胃外施用的配制剂可以例如含有赋形剂、无菌水或盐水、聚亚烷基二醇(polyalkyleneglycol)如聚乙二醇、植物来源的油或氢化萘。用于施用本公开分子的其它潜在有用的肠胃外递送系统包括乙烯-乙酸乙烯酯共聚物颗粒、渗透泵、可植入输注系统和脂质体。用于吸入的配制剂可以含有赋形剂，例如乳糖，或者可以是含有例如聚氧乙烯-9-月桂基醚、甘胆酸盐和脱氧胆酸盐的水溶液，或者可以是用于以滴鼻剂形式，或作为凝胶施用的油性溶液。

在某些实施方案中，间歇或不连续施用本文提供的NRG肽或其功能变体或片段。

根据本公开，间歇或不连续施用本文所述的肽涉及实现给药方案，其中所施用的肽的窄稳定状态浓度未得到维持，从而降低哺乳动物经历不利副作用的概率，所述不利副作用可能源自在延长的持续时间内维持施用的肽的超生理水平。例如，与外源施用的NRG的超生理水平有关的副作用包括神经鞘增生、乳房增生、肾病、精子减少症(hypospermia)、肝酶升高，心脏瓣膜改变和注射部位处的皮肤变化。

在一个优选的实施方案中，本公开涉及间歇给药方案，其引发或允许NRG肽或其功能变体或片段的血清水平的波动，并因此降低与更频繁的肽施用相关的不利副作用的潜力。因此，本公开的间歇给药方案对哺乳动物赋予治疗优势，但不维持肽的稳定状态治疗水平。如本领域普通技术人员所理解，存在有获得间歇给药的本公开的各种实施方案；这些实施方案的益处可以以各种方式陈述，例如，施用不维持肽的稳定状态治疗水平，施用降低与更频繁施用NRG肽相关的不利副作用的潜力，等等。

在某些实施方案中，NRG肽或其功能变体或片段提供至少24小时、36小时、48小时、72小时、96小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、90天、1周、2周、3周、4周、1个月、2个月、3个月(每季度)、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月或更长，或其任何组合或增量的给药间隔，只要间隔/方案是24小时、36小时、48小时、72小时、96小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、90天、1周、2周、3周、4周、1个月、2个月、3个月(每季度)、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月或更长。在某些实施方案中，NRG肽功能变体或其片段以每月至少一次、每2个月一次、每3个月一次或每6个月一次的给药间隔施用。例如，肽以给药间隔施用至少2周，例如至少2周、3周或4周。例如，肽以大于4个月的给药间隔施用。

在一些实施方案中，以48、72、96小时或更多的给药间隔将治疗有效量的NRG肽或其功能变体或片段施用于哺乳动物。优选地，给药方案包括以72、96小时或更多的给药间隔对哺乳动物施用治疗有效量的肽。因此，本发明方法要求对哺乳动物间歇或不连续地施用(每72-96小时，或甚至更长的间隔)NRG肽、其功能性变体或其片段，其中施用肽的量有效治疗、预防或延缓哺乳动物心力衰竭的进展。对于NRG(例如GGF2或其功能片段)的给药方案，不维持稳定状态浓度的施用与更频繁的给药方案同等有效，但没有可以源自更频繁施用的不便、成本或副作用。

在某些实施方案中，本文中术语间歇或不连续施用包括每2周至少一次、每3周一次、每4周一次、每月一次、每2个月一次、每3个月一次、每4个月一次、每5个月一次、每6个月一次、每7个月一次、每8个月一次、每9个月一次、每10个月一次，每11个月一次、或每12个月一次给药的方案。

在本文描述的给药方案的某些实施方案中，NRG肽或其功能变体或片段每月一次、每隔一月一次、每三个月一次、每3.5个月一次、每4个月一次、一次每4.5个月、每5个月一次、每6个月一次、每7个月一次或不太频繁的给药间隔施用。

可以在评估多种因素后起始、建立或随后修改本发明的给药方案，所述因素包括但不限于射血分数、左心室射血分数、舒张末期容积、收缩末期容积、心脏体积、心脏重量、肝脏毒性或B型利尿肽、N末端B型利钠肽和/或肌钙蛋白I的心脏组织或血液样品中蛋白质表达水平的升高或降低。还可以在心力衰竭的一种或多种症状(例如呼吸短促、运动不耐性、住院、再住院、死亡率和/或发病率)的评估、改善或改善后起始、建立或随后进行修改本发明的给药方案。这些中的一个或多个因素的变化可以指示剂量之间的间隔可能太小，施用太频繁或施用途径不是最佳的。在其它情况下，这些中一个或多个因素的变化可以指示已经达到最佳剂量和/或给药间隔，并且可选地可以得到保持。

在一些情况下，诸如以定期的间隔监测肝毒性，例如至少24小时、36小时、48小时、72小时、96小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、90天、1周、2周、3周、4周、1个月、2个月、3个月(每季度)、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月或更长，或其任何组合或增量评估肝毒性。

在一些情况下，例如在受试者的血浆、血清或血液中以定期间隔监测葡萄糖水平，例如至少24小时、36小时、48小时、72小时、96小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、90天、1周、2周、3周、4周、1个月、2个月、3个月(每季度)、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月或更长，或其任何组合或增量评估评估肝毒性。

例如，按本文描述的任何给药方案，例如，逐渐增加的给药方案、递减给药方案和/或维持并且例如不改变治疗有效剂量的给药方案监测肝毒性和/或葡萄糖水平。

采用常规药物实践来提供合适的配制剂或组合物，并将此类组合物施用给受试者或动物。可以采用任何适当的施用途径，例如肠胃外、静脉内、皮下、肌肉内、经皮、心内、腹膜内、鼻内、气雾剂、口服或表面施用，例如通过应用粘附贴片，其携带能够穿过真皮并进入血液的配制剂。例如，施用途径是静脉内或皮下注射/输注。例如，可以通过本文所述的途径，例如静脉内或皮下注射/输注施用NRG肽或其功能变体或片段。在其它实例中，通过导管、泵递送系统或支架递送组合物。

例如，通过注射(例如静脉内或皮下注射)施用的NRG肽或其功能变体或片段的剂量水平范围为约0.001mg/kg至约4mg/kg体重。例如，肽的剂量水平范围为约0.001mg/kg至约1.5mg/kg、约0.007mg/kg至约1.5mg/kg、约0.001mg/kg至约0.02mg/kg、约0.02mg/kg至约0.06mg/kg、约0.06mg/kg至约0.1mg/kg、约0.1mg/kg至约0.3mg/kg、约0.02mg/kg至约0.75mg/kg、约0.3mg/kg至约0.5mg/kg、约0.5mg/kg至约0.7mg/kg、约0.5mg/kg至约1.0mg/kg、约0.7mg/kg至约1.0mg/kg、约0.3mg/kg至约4mg/kg、约0.3mg/kg至约3.5mg/kg、约1.0mg/kg至约1.5mg/kg、或约1mg/kg至约10mg/kg。

在一些情况下，NRG肽或其功能变体或片段的剂量水平等于或小于约1.5mg/kg体重，例如等于或小于约0.8mg/kg或小于约约0.756mg/kg体重。

例如，NRG肽或其功能变体或其片段的剂量水平包括约0.007mg/kg、约0.02mg/kg、约0.06mg/kg、约0.19mg/kg、约0.38mg/kg、约0.76mg/kg、或约1.5mg/kg体重，例如0.007mg/kg、0.021mg/kg、0.063mg/kg 0.189mg/kg、0.378mg/kg、0.756mg/kg、或1.512mg/kg体重。

在一些实例中，以至少24小时，例如至少24小时、36小时、48小时、72小时、96小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、90天、1周、2周、3周、4周、1个月、2个月、3个月(每季度)、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月或更长，或其任何组合或增量的给药间隔以约0.005mg/kg至约4mg/kg体重的剂量水平施用NRG肽或其功能变体或片段。

在其它实例中，以至少24小时，例如至少24小时、36小时、48小时、72小时、96小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、90天、1周、2周、3周、4周、1个月、2个月、3个月(每季度)、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月或更长，或其任何组合或增量的给药间隔以约0.007mg/kg、约0.02mg/kg、约0.06mg/kg、约0.19mg/kg、约0.38mg/kg、约0.76mg/kg、或约1.5mg/kg体重的剂量水平施用NRG肽或其功能变体或片段。

在一些情况下，以至少24小时，例如至少24小时、36小时、48小时、72小时、96小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、90天、1周、2周、3周、4周、1个月、2个月、3个月(每季度)、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月或更长，或其任何组合或增量的给药间隔以0.007mg/kg、0.021mg/kg、0.063mg/kg、0.189mg/kg、0.378mg/kg、0.756mg/kg、或1.512mg/kg体重的剂量水平施用NRG肽或其功能变体或片段。

在其它情况下，以至少24小时，例如至少24小时、36小时、48小时、72小时、96小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、90天、1周、2周、3周、4周、1个月、2个月、3个月(每季度)、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月或更长，或其任何组合或增量的给药间隔以约0.35mg/kg至约3.5mg/kg体重，例如约3.5mg/kg、约1.75mg/kg、约0.875mg/kg、or约0.35mg/kg体重的剂量水平施用NRG肽或其功能变体或片段。

在一些实施方案中、NRG肽或其功能变体或片段的治疗有效量为约0.06mg/kg体重至约0.38mg/kg体重，且给药间隔为至少2周，例如至少2周、3周、4周、1个月、2个月、3个月(季度)、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月或更长。例如、本文描述的肽的治疗有效量为约0.063mg/kg、约0.189mg/kg或约0.375mg/kg。例如，通过静脉注射或输注施用约0.063mg/kg、约0.189mg/kg或约0.375mg/kg的治疗有效量的肽，例如以预防、治疗心脏衰竭或延迟心脏衰竭的进展。

在一些情况下，以至少24小时，例如至少24小时、36小时、48小时、72小时、96小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、90天、1周、2周、3周、4周、1个月、2个月、3个月(每季度)、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月或更长，或其任何组合或增量的给药间隔以约0.056mg/kg至约0.57mg/kg体重，例如约0.056mg/kg、约0.1mg/kg、约0.2mg/kg、约0.3mg/kg、约0.4mg/kg、或约0.57mg/kg的剂量水平施用NRG肽或其功能变体或片段。

通过上述途径，例如静脉内或皮下注射/输注施用NRG肽或其功能变体或片段的剂量水平。

当通过皮下途径施用时，NRG肽或其功能性变体或片段的剂量水平可以等于或大于通过静脉内途径施用时相同肽的剂量水平。此外，与静脉内途径相比，当通过皮下途径施用肽时，剂量之间的间隔时间长度可以减少或给药频率可以增加。在某些实施方案中，可以通过皮下途径使用相等或更高剂量的肽治疗通过静脉内途径接受本公开内容的肽并且随后表明指示肝脏毒性的肝酶增加的受试者。

通常选择透皮剂量以提供与使用注射剂量所实现的血液水平相似或更低的血液水平。

在本公开的一些给药方案中，将NRG肽或其功能变体或片段的初始剂量施用于受试者，并且随后的剂量(例如第二剂、第三剂、第四剂量等等)以本文描述的给药间隔施用于受试者。在一些情况下，初始剂量与一个或多个后续剂量相同。例如，初始剂量与所有后续剂量相同。在一些情况下，初始剂量低于一个或多个后续剂量，例如，如本文所述递增给药方案提供。在其它情况下，初始剂量高于一个或多个后续剂量，例如，如由本文所述的递减给药方案所提供。

联合治疗

NRG肽或其功能变体或片段可以作为唯一的活性剂施用，或者它们可以与人心脏祖细胞或人胚胎干细胞联合施用。另外的试剂可以在具有或没有人心脏祖细胞的情况下与NRG肽或其功能变体或片段一起施用，包括其它化合物，例如证明相同或相似治疗活性并且确定为对于此类联合施用安全和有效的肽。其它用于治疗CHF的化合物包括脑利钠肽(BNP)；他汀类药物(例如阿托伐他汀(atorvastatin)、氟伐他汀(fluvastatin)、洛伐他汀(lovastatin)、匹伐他汀(pitavastatin)、普伐他汀(pravastatin)、瑞舒伐他汀(rosuvastatin)或辛伐他汀(simvastatin))；阻断特定神经激素的形成或作用的药物(例如血管紧张素转换酶抑制剂(ACE-抑制剂)、血管紧张素受体拮抗剂(ARB)、醛固酮拮抗剂和β-肾上腺素能受体阻断剂)；正性肌力药(inotropes)(例如多巴酚丁胺、地高辛)以增强心脏收缩力；血管扩张剂(例如硝酸盐、奈西立肽(nesiritide))；利尿药(例如呋塞米)以减少充血；一种或多种抗高血压剂(如β受体阻滞剂、ACE抑制剂和ARB)；硝酸盐(例如二硝酸异山梨酯)；肼屈嗪；和/或钙通道阻滞剂。

在具体的实施方案中，可以在具有或没有人心脏祖细胞共施用的情况下与阿扎胞苷组合对受试者施用NRG肽或其功能性片段或变体。在一些实施方案中，与如本文所述的NRG肽，诸如例如NRG-1β，特别是GGF2、NRG-2α或NRG-2β或其功能变体或片段同时施用阿扎胞苷。在其它实施方案中，在施用NRG肽或其功能片段之前、期间或之后施用阿扎胞苷。在一些实施方案中，阿扎胞苷促进心脏祖细胞的分化。在更具体的实施方案中，阿扎胞苷促进心脏祖细胞分化成心肌细胞。

在一些实施方案中，在具体的实施方案中，可以在具有或没有人心脏祖细胞共施用的情况下与苯二氮杂卓(benzodiazepine)药物组合施用NRG肽或其功能性片段或变体。NRG肽或其功能片段或变体和苯二氮杂卓药物可以在相同组合物内或者备选作为与包含EGF样域的肽相同治疗的部分和/或根据相同的施用方案对受试者施用。苯二氮杂卓药物源自苯环和二氮卓(diazepine)环的融合。苯二氮杂卓药物可分为短效、中效或长效。苯二氮杂卓药物共享抗焦虑、镇静、催眠、肌肉松弛、遗忘、抗惊厥和抗高血压的特性。本发明的示例性苯二氮杂卓药物包括但不限于阿普唑仑(alprazolam)、溴他西尼(bretazenil)、溴西泮(bromazepam)、溴替唑仑(brotizolam)、氯氮卓(chlorodiazepoxide)、西诺西泮(cinolazepam)、氯巴占(clobazam)、氯硝西泮(clonazepam)、氯拉卓酸(clorazepate)、氯噻西泮(clotiazepam)、氯噁唑仑(cloxazolam)、地洛西泮(delorazepam)、安定(diazepam)、艾司唑仑(estazolam)、左旋佐匹克隆(eszopiclone)、依替唑仑(etizolam)、氯氟卓乙酯、5-(2-溴苯基)-7-氟-1H-苯并[e][1,4]二氮杂卓-2(3H)-酮、氟西泮(flurazepam)、氟托西泮(flutoprazepam)、哈拉西泮(halazepam)、凯他唑仑(ketazolam)、氯普唑仑(loprazolam)、劳拉西泮(lorazepam)、氯甲西泮(lormetazepam)、美达西泮(medazepam)、咪达唑仑(midazolam)、尼美西泮(nimetazepam)、硝西泮(nitrazepam)、去甲西泮(nordazepam)、奥沙西泮(oxazepam)、溴氯苯基二氢苯并二氮杂卓酮(phenazepam)、匹那西泮(pinazepam)、普拉西泮(prazepam)、普瑞西泮(premazepam)、purazolam、夸西泮(quazepam)、替马西泮(temazepam)，四氢西泮(tetrazepam)、三唑仑(triazolam)、扎来普隆(zaleplon)、唑吡坦(zolpidem)和佐匹克隆(zopiclone)。以下示例性苯二氮杂卓药物可以具有抗焦虑性质：阿普唑仑、溴他西尼、氯氮卓、氯巴占、氯硝西泮、氯拉卓酸、氯噻西泮、氯噁唑仑、地洛西泮、安定、艾司唑仑、氯氟卓乙酯、哈拉西泮、凯他唑仑、氯普唑仑、劳拉西泮、美达西泮、去甲西泮、奥沙西泮、溴氯苯基二氢苯并二氮杂卓酮、匹那西泮、普拉西泮、普瑞西泮和purazolam。以下示例性的苯二氮杂卓药物可以具有抗惊厥药特性：溴他西尼、氯硝西泮、氯拉卓酸、氯噁唑仑、安定、氟托西泮、劳拉西泮、咪达唑仑、硝西泮、和溴氯苯基二氢苯并二氮杂卓酮。以下示例性的苯二氮杂卓药物可以具有催眠特性：溴替唑仑、艾司唑仑、左旋佐匹克隆、氟硝西泮(flunitrazepam)、氟西泮、氟托西泮、氯普唑仑、氯甲西泮、咪达唑仑、尼美西泮、硝西泮、夸西泮、替马西泮、三唑仑、扎来普隆、唑吡坦、和佐匹克隆。以下示例性的苯二氮杂卓药物可以具有镇静特性：西诺西泮。以下示例性的苯二氮杂卓药物可以具有肌肉松弛特性：安定和四氢西泮。

在具体的实施方案中，可以在具有或没有人心脏祖细胞共施用的情况下与咪达唑仑组合对受试者施用NRG肽或其功能片段或变体。咪达唑仑可以与相同组合物内的NRG肽或功能变体或片段一起施用，或者备选，作为与NRG肽或其功能变体或片段相同的治疗的部分和/或根据相同的施用方案施用。尽管苯二氮杂卓药物，例如咪达唑仑可以根据本公开中描述的任何给药方案施用，但是在具体的实施方案中，苯并二氮杂卓药物例如咪唑安定可以在一剂或多剂中施用，包括口服剂量。在某些实施方案中，当苯二氮杂卓药物例如咪达唑仑以一剂或多剂施用，包括口服剂量时，NRG肽或其功能变体或片段以单剂施用，例如单次静脉内输注。苯二氮杂卓药物，例如咪达唑仑可以在NRG肽或其功能变体或片段的剂量之前、同时或之后施用。在一个具体的实施方案中，苯二氮杂卓药物，例如咪达唑仑以5个口服剂量施用，在第二剂后，NRG或其功能变体或片段以单剂施用，例如单次静脉内输注。

方法的效用

结合心脏导管插入术或心脏手术，可以确定受试者是否含有响应NRG的心脏祖细胞群。典型地，此分析将通过从受试者的心脏组织进行活组织检查并且对组织筛选心脏祖细胞的标志物(诸如例如Sca-1和c-Kit)来进行。ErbB2和ErbB3受体的存在也将指示心脏祖细胞的存在。一旦受试者已经鉴定为具有合适的心脏祖细胞群体，则将细胞暴露于NRG肽或其功能变体或片段以确定细胞是否通过表现出向成纤维细胞和肌成纤维细胞的转化减少和/或通过优先分化成心肌细胞而响应。然后，用NRG肽或其功能片段或变体处理其心脏祖细胞表现出响应NRG肽或其功能变体或片段的受试者。这些方法可以与任何目前的心脏损伤、疑似心脏损伤或预期的心脏损伤(包括心力衰竭)一起使用。

人体心力衰竭始于心肌收缩力降低，这导致心输出降低。本文提供的方法可以用于提升心脏功能，减少疤痕组织并且再生健康的心脏组织。例如，可以在确定受试者含有响应NRG的心脏祖细胞以在已经受损或变为缺血的心脏区域中促进心脏祖细胞向心肌细胞的分化并抑制心脏祖细胞向成纤维细胞和肌成纤维细胞细胞的转化之后使用本文的方法。

在一个方面，如本文公开的方法可以用于再生心脏组织，修复心脏组织或减少心脏损伤后的心脏纤维化。另一方面，本文描述的方法防止心脏损伤的发作。

合适的受试者包括哺乳动物。哺乳动物包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔、狗、猴或猪。在本公开的一个实施方案中，哺乳动物是人。

在某些实施方案中，心脏损伤是由心血管疾病导致的。本领域技术人员会理解存在许多心血管疾病。在具体的实施方案中，心血管疾病可以由以下导致：例如冠状动脉疾病；心力衰竭；中风；心肌梗死；心肌病；高血压；缺血性心脏病；心房颤动；先天性心脏病；心肌炎；心内膜炎；心包炎(periocarditis)；动脉粥样硬化；血管疾病；左心室收缩功能障碍；冠状动脉架桥外科；暴露于心脏毒性化合物；甲状腺疾病；病毒感染；牙龈炎；药物滥用；酒精滥用或高血液胆固醇。

在一些实施方案中，本公开中提供的方法的受试者可以表现出慢性心力衰竭。在一个优选的实施方案中，受试者的状况保持稳定至少1、2、3、4、5、或6个月。稳定或慢性心力衰竭的进一步特征可以在于至少1、2、3、4、5、或6个月时段内心脏功能缺乏增加或减少和/或损害。例如，在施用如本文所述的肽之前，受试者已经患有慢性心力衰竭达至少1个月，例如至少1、2、3、4、5、6或更多个月。

例如，在施用如本文所述的肽之前，受试者患有2、3或4类心力衰竭。使用纽约心脏协会功能分类系统(New York Heart Association Functional Classification system)来根据身体活动期间受试者的受限程度来确定心力衰竭的类别。属于1类心力衰竭的受试者患有心脏疾病，但没有身体活动的限制。普通的身体活动不导致过度疲劳、心悸、呼吸困难或心绞痛。属于2类心力衰竭的受试者患有心脏病，其导致身体活动轻微受限。这些受试者在休息时感觉舒适，但普通的身体活动会导致疲劳、心悸、呼吸困难或心绞痛。3类心力衰竭受试者患有导致身体活动显著受限的心脏疾病。尽管这些受试者在休息时感觉舒适，但小于普通的身体活动导致疲劳、心悸、呼吸困难或心绞痛。IV类心力衰竭受试者患有心脏疾病，其导致无法在无不适的情况下进行任何身体活动。休息时，这些受试者可能经历心力衰竭或心绞痛综合征的症状。任何身体活动增加不适水平。

在一些实施方案中，受试者患有收缩性心力衰竭。例如，受试者患有收缩性左心室功能障碍。例如，在施用本文所述的肽之前，受试者具有40％或更少，例如40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％或更少的左心室射血分数。

在一些例子中，受试者是至少18岁龄，例如至少18、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、或95的人。在某些情况下，人年龄在18-75岁之间。在一些实例中，受试者是13-18岁龄之间的人。

在一些情况下，受试者可以在施用本文所述的肽之前患有急性失代偿性心力衰竭(acute decompensated heart failure，ADHD)。例如，急性失代偿性心力衰竭的特征在于心力衰竭的一种或多种症状或体征的突然或逐渐发作，其需要急诊室访问、住院和/或非计划的医生办公室访问。在一些情况下，ADHD与肺和/或系统性充血有关，这可以是由左心和/或右心充盈压增加引起的。例如参见Joseph等，2009。例如，可以通过使用本领域中公知的方法测量受试者中血浆B型利钠肽(BNP)或N末端B型利钠肽(NT-proBNP)的水平来诊断ADHD。例如，来自受试者的生物样品(如血液、血浆、血清或尿液)中的BNP水平高于100pg/dL，例如至少100pg/dL、200pg/dL、300pg/dL、400pg/dL、500pg/dL、600pg/dL或更高可以指示受试者患有ADHD。在一些实例中，本文所述肽的治疗给药方案足以预防、减少ADHD或延缓ADHD的发生。

在一些实施方案中，心力衰竭可以源自高血压、缺血性心脏病、暴露于心脏毒性化合物(例如可卡因、酒精、抗ErbB2抗体或抗HER抗体如或蒽环类抗生素，如多柔比星或道诺霉素)、心肌炎、甲状腺疾病、病毒感染、牙龈炎、药物滥用、酒精滥用、心包炎、动脉粥样硬化、血管疾病、肥厚型心肌病、急性心肌梗死或既往心肌梗死、左心室收缩功能障碍、冠状动脉搭桥手术、饥饿、辐射暴露、饮食失调或遗传缺陷。

在本公开的另一个实施方案中，在蒽环类施用之前、期间或之后，将抗ErbB2或抗HER2抗体如施用于哺乳动物。

在本公开的其它实施方案中，测试受试者的心脏祖细胞对NRG的响应性，并且若响应，则在暴露于心脏毒性化合物前、在暴露于心脏毒性化合物期间、或在暴露于心脏毒性化合物后施用NRG肽或其功能变体或片段；在诊断哺乳动物中充血性心力衰竭之前或之后施用NRG肽或其功能变体或片段。本发明的方法可以在受试哺乳动物已经经历代偿性心脏肥大之后发生。在一些实例中，本文描述的方法的结果是维持左心室肥大，预防/延迟心肌变薄的进展或抑制心肌细胞凋亡。在本公开的其它实施方案中，在诊断哺乳动物中的充血性心力衰竭之前或之后施用NRG肽或其功能变体或片段。在本公开的另一个实施方案中，将NRG肽或其功能变体或片段被施用于已经经历代偿性心脏肥大的哺乳动物。在本公开的其它具体实施方案中，NRG肽或其功能变体或片段的施用维持左心室肥大，防止/延迟心肌变薄的进展和/或抑制心肌细胞凋亡。

在其它实施方案中，需要测试对神经调节蛋白响应的心脏祖细胞和本文所述的治疗或预防的受试者有心力衰竭(例如充血性心力衰竭)的风险。增加个体形成心力衰竭的可能性的风险因素是公知的。这些包括但不限于吸烟、肥胖、高血压、缺血性心脏病、血管疾病、冠状动脉搭桥手术、心肌梗死、左心室收缩功能障碍、暴露于心脏毒性化合物(酒精、药物如可卡因和蒽环类药物抗生素如多柔比星和柔红霉素)、病毒感染、心包炎、心肌炎、牙龈炎、甲状腺疾病、辐射暴露、已知增加心力衰竭风险的遗传缺陷(诸如Bachinski和Roberts，1998；Siu等，1999；以及Arbustini等，1998中描述)、饥饿、饮食失调如厌食症和食欲亢进、心力衰竭家族史和心肌肥厚。可以如下降低此风险：测定受试者是否具有响应NRG的心脏祖细胞，然后若确定心脏祖细胞是响应性的，则施用如本文所述的NRG肽或其功能变体或片段。或者，可以通过向发现具有响应NRG的心脏祖细胞的受试者施用心脏祖细胞群体并同时或顺序施用本文所述的NRG肽或其功能变体或片段来降低风险。

根据本公开内容，可以对于发现具有响应NRG的心脏祖细胞的受试者间歇施用NRG肽或其功能变体或片段，以实现预防，诸如通过预防或延缓/降低那些鉴定为有危险的受试者中的充血性心脏病进展的速率。例如，在早期代偿性肥大中向受试者施用肽允许维持肥大状态并防止/延缓进展为心力衰竭。另外，若发现受试者具有响应NRG的心脏祖细胞，则可以在形成代偿性肥大之前对那些鉴定为有风险的受试者给予用肽的心脏保护治疗。

在蒽环类药物化学疗法或蒽环类药物/抗ErbB2(抗HER2)抗体，例如联合疗法之前和期间对发现具有响应NRG的心脏祖细胞的癌症受试者施用本文描述的NRG肽或其功能变体或片段可以预防/延缓受试者的心肌细胞经历凋亡，从而保存心脏功能。已经遭受心肌细胞丧失的受试者也从NRG治疗中获益，因为剩余的心肌组织通过表现出肥大性生长和增加的收缩力来响应NRG暴露。

心脏功能的示例性度量包括但不限于心室射血分数(EF)，例如左心室射血分数(LVEF)、收缩末期容积(ESV)、舒张末期容积(EDV)、分数缩短(FS)、住院次数、运动耐量、二尖瓣回流、呼吸困难、周围性水肿和ADHD发生。例如通过以下中的一种或多种来检测例如由于施用如本文公开的肽而导致的心脏功能的改善：LVEF的增加、ESV的减少、EDV的减少、FS增加、住院次数减少、运动耐量增加、二尖瓣回流发生次数减少或严重性降低、呼吸困难降低、外周水肿减少以及ADHD发生的预防或降低。在一些实例中，在受试者患有具有保留的LVEF的心力衰竭的情况下，心脏功能的度量包括但不限于ESV、EDV、FS、住院次数、运动耐量、二尖瓣回流、呼吸困难、ADHD发生和周围性水肿。

在一些实例中，与施用肽之前的LVEF相比，将治疗有效量的NRG肽或其功能变体或片段施用于发现具有响应NRG的心脏祖细胞的受试者或已经接受响应NRG的心脏祖细胞的受试者足以将受试者中的LVEF增加至少1％，例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30％、或更大。例如，LVEF增加至少1-20％。在一些情况下，治疗有效量的如本文所述的NRG肽或其功能变体或片段足以将有此需要的受试者的LVEF增加至约10-40％的射血分数，例如受试者的LVEF增加至约10％、15％、20％、25％、30％、35％、或约40％的射血分数。在其它情况下，治疗有效量的NRG肽或其功能变体或片段足以将有此需要的受试者的LVEF增加至约40-60％的射血分数，例如受试者的LVEF增加到约40％、45％、50％、55％、或约60％的射血分数。在其它情况下，治疗有效量的NRG肽或其功能变体或片段足以将有此需要的受试者的LVEF完全恢复至正常的LVEF值。例如，受试者的LVEF在受试者中的NRG肽或其功能变体或片段的首次施用，例如初始剂量的90天或更短，例如在90d、80d、70d、60d、50d、40d、30d、20d、10d或更短内增加。在一些情况下，在首次施用肽后，例如在不后续施用肽的情况下，受试者中增加的LVEF维持至少12小时，例如至少12小时、24小时、36小时、48小时、72小时、96小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、90天、1周、2周、3周、4周、1个月、2个月、3个月(按季度)、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、或更长。例如，在首次施用肽后，例如在不后续施用肽的情况下，本文所述的肽的治疗有效剂量足以维持和/或稳定受试者中的LVEF达至少12小时，例如12小时、24小时、36小时、48小时、72小时、96小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、90天、1周、2周、3周、4周、1个月、2个月、3个月(按季度)、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、或更长。

在一些实例中，与施用肽之前受试者的EDV相比，施用治疗有效量的NRG肽或其功能性变体或片段足以将受试者中的EDV降低至少1mL，例如至少1mL、5mL、10mL、15mL、20mL、25mL、30mL、40mL、50mL、60mL、70mL、80mL、90mL、100mL、或更大，例如至少1-60mL。例如，受试者的EDV在受试者中首次施用肽，例如肽的起始剂量的90天或更短内，例如在90d、80d、70d、60d、50d、40d、30d、20d、10d、或更短内降低。在一些情况下，在首次施用肽后，例如在不后续施用肽的情况下，受试者中EDV降低维持至少12小时，例如至少12小时、24小时、36小时、48小时、72小时、96小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、90天、1周、2周、3周、4周、1个月、2个月、3个月(按季度)、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、或更长。

在其它实例中，在与施用肽之前受试者的ESV相比，向发现具有响应NRG的心脏祖细胞的受试者施用治疗有效量的NRG肽或其功能变体或片段足以将受试者中的ESV降低至少1mL、5mL、15mL、20mL、25mL、30mL、40mL、50mL、60mL、70mL、80mL、90mL、100mL、或更大，例如至少1-30mL。例如，受试者的ESV在受试者中首次施用肽，例如肽的起始剂量的90天或更短内，例如，在90d、80d、70d、60d、50d、40d、30d、20d、10d、或更短内减少。在一些情况下，在首次施用肽后，例如在不后续施用肽的情况下，受试者的ESV降低维持至少12小时，例如至少12小时、24小时、36小时、48小时、72小时、96小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、90天、1周、2周、3周、4周、1个月、2个月、3个月(按季度)、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月或更长。

在一些情况下，与施用肽之前的FS相比，向发现具有响应NRG的心脏祖细胞的受试者施用治疗有效量的NRG肽或其功能变体或片段足以将受试者中的FS增加至少1％，例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30％、或更多。例如，FS增长至少1-15％。在一些情况下，治疗有效量的本文所述的肽足以将有此需要的受试者的FS增加至约15％的百分比分数缩短，例如约1％、2％、3％、4％、6％、7％、8％、9％、10％、或约15％。在其它情况下，治疗有效量的本文所述的肽足以将有此需要的受试者的FS增加至约15-20％的百分比分数缩短，例如约15％、16％、17％、18％、19％、或约20％。在其它情况下，治疗有效量的本文所述的肽足以将有此需要的受试者的FS增加至约20-25％的百分比分数缩短，例如约20％、21％、22％、23％、24％、或约25％。在进一步的情况下，治疗有效量的本文所述的肽足以将有此需要的受试者的FS增加至约25-45％的百分比分数缩短，例如约25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、或约45％。例如，受试者的FS在受试者中首次施用肽，例如肽的起始剂量的90天或更短内，例如在90d、80d、70d、60d、50d、40d、30d、20d、10d或更短内增加。在一些情况下，在首次施用肽后，例如在不后续施用肽的情况下，受试者中增加的FS维持至少12小时，例如至少12小时、24小时、36小时、48小时、72小时、96小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、90天、1周、2周、3周、4周、1个月、2个月、3个月(按季度)、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月或更长。

通过本领域中公知的方法来确定本文描述的用于评估心脏功能的度量。

参考文献：

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5.Cohn et al.,N.Engl.J Med.339:1810-1816,1998

6.Galindo et al.,Journal of American Heart Assocication 3:e000773,2014

7.Falls.Exp.Cell Res.284(1):14–30,2003.

8.Higashiyama et al.,J.Biochem.122:675-680,1997

9.Hijazi et al.,Int.J.Oncol.13:1061-1067,1998

10.Holmes et al.,Science 256:1205-1210,1992

11.Joseph et al.,Tex.Heart Inst.J.36(6):510-20,2009

12.Lemke,Mol.Cell.Neurosci.7:247-262,1996

13.Lenihan et al.,American College of Chemistry Meeting,March 9-11,2013

14.No authors listed,Am.J.Cardiol.,83(2A):1A-38-A,1999

15.Peles and Yarden,BioEssays 15:815-824,1993

16.Sawyer and Caggiano,J.Mol.Cell Cardiol.51(4):501-5,2011

17.Siu et al.,Circulation 8:1022-1026,1999

18.SOLVD Investigators,N.Engl.J.Med.327:685-691,1992

本文描述的实施方案仅仅是示例性的，并且本领域技术人员将认识到或仅仅使用常规实验能够确定本文描述的特定程序的许多等同方案。认为所有这些等同方案在本公开的范围内，并且由以下实施方案覆盖。本文引用的所有参考文献(包括专利申请、专利和出版物)通过引用整体并入本文用于所有目的，其程度如同每个单独的出版物或专利或专利申请明确且单独地指出通过引用并入全部用于所有目的一样。

实施例1：一般方法

心脏细胞的分离

在使用10mg/ml胶原酶II、2.5U/ml分散酶II、1μg/ml DNA酶I和2.5mM CaCl₂在37℃消化心室20分钟后进行鼠心脏细胞的分离。使用磁活化细胞分选微珠技术(MiltenyiBiotec，Inc)分离心脏CD31^posCD45^neg内皮细胞和Sca-1^posCD31^neg祖细胞。

使用单细胞克隆形成技术来分离人心脏祖细胞。从经历搭桥手术的受试者获得的前部左心室游离壁心外膜活组织检查分离人心脏祖细胞。使用胶原酶II/分散酶II/CaCL2消化溶液制备单细胞悬液，并以每cm² 10³个细胞的浓度分配到48孔皿中。使用人CD45微珠通过磁分离除去造血细胞。将经CD45消减的细胞在M199-EGM-2培养基中以每cm² 10³个细胞的密度分配到48孔板上。每周两次分析各孔的生长菌落。收获迅速生长的克隆(2-3个菌落/样品)，重悬浮于新鲜生长培养基中，并以5x10³个细胞/cm²的密度在经0.1％明胶包被的组织培养皿上分配。通过CD105的细胞表面表达和缺乏CD31内皮标志物、CD45和CD117/c-Kit造血标志物来表征人心脏祖细胞。

诱导心肌源性分化

为了诱导心肌源性分化，在补充有10％FBS的DMEM-LG培养基中用5μM 5’-氮胞苷预处理心脏祖细胞达72小时，并在补充有2％FBS、1ng/ml TGFβ、100μM抗坏血酸、0.2％DMSO和10ng/ml bFGF的DMEM-LG培养基中培养，培养基每3天更换。

通过将细胞在含有20ng/ml VEGF的15％FBS 199培养基中温育来诱导心脏祖细胞向内皮细胞的分化。

诱导心肌梗死

通过左冠状动脉的永久性结扎诱导小鼠心肌梗死。

可以使用熟练技术人员已知的任何技术来诱导心肌梗死。例如，心肌梗死可以通过血管造影引导的冠状动脉内球囊闭塞(angiographically guided intracoronaryballoon occlusion)诱导(参见例如Galindo等，2014)。

免疫组化

使用缀合有FITC的单克隆抗αSMA(Sigma)和缀合有生物素的抗I型胶原(600-401-103；Rockland，Inc.，Rockland，PA)抗体在固定且透化的细胞(Cytofix/Cytoperm试剂盒，BD Biosciences)中进行αSMA和I型胶原的胞内染色。使用小鼠IgG2a-FITC-(Sigma)和缀合有生物素的兔全IgG(Jackson ImmunoResearch，Inc.，West Grove，PA)作为同种型对照。使用LIVE/DEADFixable Stain试剂盒(Life Technologies，Carlsbad，CA)区分活细胞和非活细胞。

使用LSRII流式细胞仪进行流式细胞术分析，并用WinList 5.0软件分析数据。

重组NRG蛋白

遵循如国际公开号WO2010030317和WO2014138502中描述的建立方法，克隆并产生多种NRG剪接变体。

实施例2.在心脏中表达NRG受体

为了确定分离的心脏祖细胞的亚群的纯度，进行了前和后磁活化细胞分选(图1A)。接下来，为了确定哪种NRG受体(即ErbB2、ErbB3、Erb4)在鼠心脏祖细胞中表达，分析ErbB受体的mRNA表达。如图1B所示，小鼠心脏Sca-1^posCD31^neg基质细胞表达功能性ErbB2和ErbB3受体。通过分析Sca-1^pos/CD31^neg心脏祖细胞上细胞表面标志物的流式细胞术直方图证实NRG受体的表达(图1C)。这些研究显示了小鼠心脏祖细胞表达高水平的ErbB、中等水平的Erb3和非常少量的ErbB4(图1B)。

实施例3：鼠心脏祖细胞向内皮细胞和心肌细胞的体外分化

图2A显示了在生长培养基或内皮细胞分化培养基中培养心脏祖细胞之后毛细血管样结构形成的显微照片。使用CD31^pos心脏内皮细胞作为阳性对照。图2B显示在生长培养基或内皮细胞分化培养基中培养的心脏祖细胞和心脏内皮细胞的形态发生活性的图示。通过测量它们的总长度来估计毛细管形成。使用实时RT-PCR分析在正常生长培养基或心肌细胞分化培养基中培养1或3周的心脏Sca-1^posCD31^neg细胞中的心脏特异性基因表达(图2C)。此研究显示鼠心脏祖细胞向内皮细胞和心肌细胞分化。数值是三次实验的平均值。

实施例4：NRG-1防止鼠心脏祖细胞转变为肌成纤维细胞

代表性流式细胞术点图证明心脏祖细胞在小鼠的实验性心肌梗死后第7天在体内向αSMA阳性和胶原1生成性肌成纤维细胞积累(图3A)。图3B显示来自αSMA阳性和胶原1α阳性Sca-1^posCD31^neg心脏祖细胞的流式细胞术分析的图示数据。指示P值，非配对t检验。图3C中的代表性细胞荧光点图中显示了与单独的TGFβ或与30ng/ml NRG-1组合的TGFβ温育48小时的心脏祖细胞中的αSMA蛋白的表达。令人感兴趣的是，此实验显示NRG-1降低肌成纤维细胞表达。另外，通过流式细胞术评估心脏Sca-1^posCD31^neg祖细胞中αSMA表达的平均荧光强度(图3D)。数据代表来自三个独立实验的平均值±SEM。P值表示通过t检验计算的显著性水平。

实施例5：人心脏的血管和血管周围区域中Erb2和ErbB3受体的定位

本研究检查人心脏中NRG受体的定位。图4显示在源自人心脏的心脏^posCD31^neg祖细胞中存在鼠心脏中的ErbB受体的类似表达。具体而言，ErbB2和ErbB3受体定位于人心脏的血管/血管周围区域中(图4)

实施例6：NRG-1防止人心脏祖细胞转化为肌成纤维细胞

本研究考察了用NRG-1刺激心脏祖细胞的效果。图5A显示了再分配单细胞来源克隆之后立即和3天后的人心脏祖细胞的示例性相差显微照片。比例尺＝100μm。接下来，使用实时PCR分析在分化培养基中培养1或2周之前和之后人心脏祖细胞中的心脏特异性基因表达(图5B)。数值是三次实验的平均值，非配对t检验。图5C显示了人心脏祖细胞上细胞表面标志物的代表性流式细胞术直方图。阴影区代表用相应的同种型匹配抗体对照处理的细胞的荧光。这些研究显示了用NRG-1和内源性ErbB受体配体刺激细胞阻止它们转变为肌成纤维细胞。

Claims (49)

1.鉴定将受益于用神经调节蛋白治疗或预防心脏损伤的受试者的方法，所述方法包括：

a)从具有心脏损伤或处于心脏损伤风险的受试者中分离人心脏祖细胞；

b)将所述受试者的细胞暴露于神经调节蛋白肽或功能变体或片段；

c)通过确定细胞向成纤维细胞和成肌纤维细胞的转化是否受到抑制和/或所述细胞是否优先分化成心肌细胞来评估所述细胞是否对神经调节蛋白响应；并且

其中若发现抑制所述心脏祖细胞向成纤维细胞和成肌纤维细胞的转化，或优先分化成心肌细胞，则所述受试者将受益于用所述神经调节蛋白肽或其功能变体或片段治疗或预防心脏损伤。

2.治疗需要心脏组织再生的受试者的方法，其包括：

a)将从所述受试者分离的心脏祖细胞暴露于神经调节蛋白肽或其功能变体或片段；

b)评估所述心脏祖细胞是否对神经调节蛋白响应；并且

c)若所述受试者的心脏祖细胞是响应性的，则施用治疗有效量的神经调节蛋白肽或其功能变体或片段。

3.权利要求2的方法，其中所述神经调节蛋白肽或其功能变体或片段在所述受试者中促进心脏祖细胞分化成心肌细胞并抑制所述心脏祖细胞向成纤维细胞和肌成纤维细胞的转化。

4.权利要求2或权利要求3的方法，其中所述受试者患有或预期患有心脏损伤。

5.权利要求2-4中任一项的方法，其中抑制心脏祖细胞向成纤维细胞和肌成纤维细胞的转化诱导心脏损伤后的心脏组织再生。

6.权利要求2-5中任一项的方法，其中抑制心脏祖细胞向成纤维细胞和肌成纤维细胞的转化导致心脏损伤后心脏组织的修复。

7.权利要求2-6中任一项的方法，其中抑制心脏祖细胞向成纤维细胞和肌成纤维细胞细胞的转化减少心脏损伤后的心脏纤维化。

8.权利要求7的方法，其中减少心脏损伤后的心脏纤维化防止瘢痕形成。

9.权利要求2-4中任一项的方法，其中抑制心脏祖细胞向成纤维细胞和肌成纤维细胞的转化预防心脏损伤的发作。

10.权利要求2-9中任一项的方法，其中所述心脏祖细胞表达干细胞抗原-1(sca-1)细胞。

11.权利要求10的方法，其中所述sca-1细胞位于所述心脏的左心室游离壁或血管或血管周围区域内。

12.在先前确定为具有对神经调节蛋白响应的心脏祖细胞的受试者中诱导心脏损伤后心脏组织再生的方法，其包括施用治疗有效量的神经调节蛋白肽或其功能变体或片段。

13.在先前确定为具有对神经调节蛋白响应的心脏祖细胞的受试者中在心脏损伤后修复心脏组织的方法，其包括施用治疗有效量的神经调节蛋白肽或其功能变体或片段。

14.在先前确定为具有对神经调节蛋白响应的心脏祖细胞的受试者中预防心脏损伤发作的方法，其包括施用治疗有效量的神经调节蛋白肽或其功能变体或片段。

15.权利要求4或12-14中任一项的方法，其中所述心脏损伤是由心血管疾病导致的。

16.权利要求15的方法，其中所述心血管疾病是由以下导致的：冠状动脉疾病；心力衰竭；中风；心肌梗死；心肌病；高血压；缺血性心脏病；心房颤动；先天性心脏病；心肌炎；心内膜炎；心包炎(periocarditis)；动脉粥样硬化；血管疾病；左心室收缩功能障碍；冠状动脉架桥外科；暴露于心脏毒性化合物；甲状腺疾病；病毒感染；牙龈炎；药物滥用；酒精滥用或高血液胆固醇。

17.权利要求16的方法，其中所述受试者已经患有心肌梗死。

18.权利要求16的方法，其中所述受试者患有心力衰竭。

19.权利要求18的方法，其中所述心力衰竭是收缩性心力衰竭。

20.权利要求2-19中任一项的方法，其中所述受试者是哺乳动物。

21.权利要求20的方法，其中所述哺乳动物是人。

22.权利要求2-21中任一项的方法，其中静脉内或皮下施用所述神经调节蛋白肽或其功能变体或片段。

23.权利要求2-22中任一项的方法，其中在施用治疗有效量的化学治疗剂之前、期间或之后施用所述神经调节蛋白肽或其功能变体或片段。

24.权利要求23的方法，其中所述化学治疗剂是阿扎胞苷。

25.权利要求23或24的方法，其中与所述化学治疗剂和人心脏祖细胞或人胚胎干细胞共施用所述神经调节蛋白肽或其功能变体或片段。

26.在体外促进心脏祖细胞向心肌细胞分化并抑制心脏祖细胞向成纤维细胞和肌成纤维细胞转化的方法，其包括以下步骤：

a)从生物样品中分离人心脏祖细胞；

b)将细胞悬浮在生长培养基中；

c)通过将所述细胞与有效量的神经调节蛋白肽或其功能变体或片段温育来诱导心肌细胞分化。

27.生产富含心肌细胞的细胞群的方法，其包括：

a)从受试者分离人心脏祖细胞；

b)在生长培养基中培养所述细胞；

c)将所述细胞与有效量的神经调节蛋白肽或其功能变体或片段温育以促进向心肌细胞的分化；并且

d)分离所述心肌细胞。

28.权利要求27的方法，其中将分离的心肌细胞施用于所述受试者。

29.方法，其包括：

a)培养并扩增心脏祖细胞，所述心脏祖细胞通过抑制心脏祖细胞向成纤维细胞和肌成纤维细胞的转化和/或促进心脏祖细胞分化成心肌细胞而发现能够对神经调节蛋白肽或其功能变体或片段响应；并且

b)将扩增的心脏祖细胞与治疗有效量的神经调节蛋白肽或其功能变体或片段一起施用于受试者。

30.鉴定将受益于用神经调节蛋白治疗或预防心脏损伤的受试者的方法，其包括：

a)从具有心脏损伤或处于心脏损伤风险的受试者中分离人心脏祖细胞；

b)将所述受试者的细胞暴露于神经调节蛋白肽或功能变体或片段；

c)通过确定细胞向成纤维细胞和成肌纤维细胞的转化是否受到抑制和/或所述细胞是否优先分化成心肌细胞来评估细胞是否对神经调节蛋白响应；并且

其中若发现抑制所述心脏祖细胞向成纤维细胞和肌成纤维细胞的转化，或优先分化成心肌细胞，则受试者将受益于用神经调节蛋白肽或其功能变体或片段治疗或预防心脏损伤。

31.治疗或预防心脏损伤的方法，其包括：

a)从具有心脏损伤或处于心脏损伤风险的受试者中分离人心脏祖细胞；

b)通过抑制心脏祖细胞向成纤维细胞和肌成纤维细胞的转化和/或促进心脏祖细胞分化成心肌细胞，评估所述受试者的心脏祖细胞是否对神经调节蛋白肽或其功能变体或片段响应；并且

c)若所述心脏祖细胞是响应性的，则施用神经调节蛋白肽或其功能变体或片段以治疗或预防心脏损伤或减轻心脏损伤的严重性。

32.权利要求1、26、27、30或31中任一项的方法，其中在心脏手术或心脏导管插入术(cardiac cathertization)期间从所述受试者分离所述人心脏祖细胞。

33.权利要求2、12-14或31中任一项的方法，其中与人胚胎干细胞或人心脏祖细胞共施用所述神经调节蛋白肽或其功能变体或片段。

34.权利要求33的方法，其中最初从正在治疗的受试者中采集共施用的心脏祖细胞。

35.权利要求33的方法，其中与所述神经调节蛋白肽或其功能变体或片段同时、序贯、连续或间歇共施用所述人胚胎干细胞或人心脏祖细胞。

36.权利要求1-33中任一项的方法，其中所述神经调节蛋白肽是NRG-1β肽或其功能变体或片段。

37.权利要求36的方法，其中所述NRG-1β肽是包含SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20的氨基酸序列的重组蛋白。

38.权利要求36的方法，其中所述NRG-1β肽是GGF2或其功能变体或片段。

39.权利要求38的方法，其中所述神经调节蛋白肽包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列或其功能变体或片段。

40.权利要求38的方法，其中GGF2功能变体包含SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的氨基酸序列。

41.权利要求1-33中任一项的方法，其中所述神经调节蛋白肽或其功能变体或片段包含EGF样域。

42.权利要求41的方法，其中所述表皮生长因子样域包含SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18的氨基酸序列。

43.权利要求1-33中任一项的方法，其中所述神经调节蛋白肽是NRG-2或其功能变体或片段。

44.权利要求1-33中任一项的方法，其中所述神经调节蛋白肽包含SEQ ID NO:21或SEQID NO:22的氨基酸序列或其功能变体或片段。

45.鉴定将受益于用神经调节蛋白治疗或预防心脏损伤的受试者的方法，其包括：

a)将来自具有心脏损伤或处于心脏损伤风险的受试者的人心脏祖细胞在体外暴露于神经调节蛋白肽或功能变体或片段；并且

b)通过确定细胞向成纤维细胞和肌成纤维细胞的转化是否受到抑制和/或所述细胞是否优先分化成心肌细胞来评估所述细胞是否对神经调节蛋白响应；

其中若发现抑制所述心脏祖细胞向成纤维细胞和肌成纤维细胞的转化或，优先分化成心肌细胞，则受试者将受益于用神经调节蛋白肽或其功能变体或片段治疗或预防心脏损伤。

46.神经调节蛋白肽或其功能变体或片段，用于权利要求1至44中任一项的方法。

47.神经调节蛋白肽或其功能变体或片段，用于治疗需要心脏组织再生的受试者的方法，所述方法包括

a)将从所述受试者分离的心脏祖细胞暴露于神经调节蛋白肽或其功能变体或片段；

b)评估所述心脏祖细胞是否对神经调节蛋白响应；并且

若所述受试者的心脏祖细胞是响应性的，则施用治疗有效量的神经调节蛋白肽或其功能变体或片段。

48.神经调节蛋白肽或其功能变体或片段，用于治疗需要心脏组织再生的受试者的方法，其中所述受试者已经通过根据权利要求1或45的方法鉴定为将受益于心脏损伤的治疗或预防的受试者。

49.神经调节蛋白肽或其功能变体或片段，用于治疗或预防心脏损伤的方法，所述方法包括：

a)从具有心脏损伤或处于心脏损伤风险的受试者中分离人心脏祖细胞；

b)通过抑制心脏祖细胞向成纤维细胞和肌成纤维细胞的转化和/或促进心脏祖细胞分化成心肌细胞，评估所述受试者的心脏祖细胞是否对神经调节蛋白肽或其功能变体或片段响应；并且

c)若所述心脏祖细胞是响应性的，则施用神经调节蛋白肽或其功能变体或片段以治疗或预防心脏损伤或减轻心脏损伤的严重性。