CN108440763A - 一种壳寡糖接枝共聚物g2.0及其制备方法和应用 - Google Patents

一种壳寡糖接枝共聚物g2.0及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种壳寡糖接枝共聚物G2.0及其制备方法和应用。本发明采用自由基引发接枝法，采用物理、化学、酶解三种作用因素相结合的方法降解壳聚糖制备壳寡糖，然后以壳寡糖为原料，先由硝酸铈铵引发壳寡糖分子的活性基团发生自由基反应接枝丙烯酸甲酯，进行支化改性，再利用发散法对所制备的壳寡糖进行Michael加成反应，交替接枝乙二胺和丙烯酸甲酯，制备接枝共聚物G2.0。本发明提供了一种水溶性好、抑菌能力更强的壳寡糖接枝共聚物。本发明提供了一种本发明壳寡糖接枝共聚物的制备方法。本发明的壳聚糖接枝共聚物具有水溶性好，抑菌能力强，可作为食品防腐抑菌剂的优点。

Description

一种壳寡糖接枝共聚物G2.0及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于食品化学领域，涉及一种食品化学中的抑菌剂，具体涉及一种壳寡糖接枝共聚物及其制备方法和应用。
背景技术
壳聚糖(Chitosan)是甲壳素(Chitin)脱乙酰度达到55％以上的多糖产物，是由β-(1， 4)-2-氨基-2-脱氧-D-葡萄糖组成的自然界少数存在的天然碱性多糖[1]。甲壳素是自然界内每年生物合成量(高达1010吨/年)维素的第二大天然多糖资源[2；3]，其化学结构单元是由β-(1，4)糖苷键连接的N-乙酰基-2-氨基-2-脱氧-D-葡萄糖二元线性大分子聚合物[4]，主要存在于海洋无脊椎动物如虾、蟹及甲壳类动物的外壳和内角质层、真菌(酵母、霉菌、香菇等)、藻类及高等植物的细胞壁中[5]。虽然甲壳素来源广泛用之不竭，但由于分子内或分子间相邻两个糖单元结构之间，其中一个糖环基上的氧原子和另一个糖环羟基中的氢原子容易彼此结合形成氢键，而且分子内也存在数目众多的CO-NH紧密连接的氢键[6-8]，大量氢键的作用阻碍了糖苷键的自由旋转，使得甲壳素分子形成高度有序排列的结晶区。自然界中甲壳素的存在形式有α、β、γ三种晶型[9]，其中以β型最为常见。规则的晶体结构增大了甲壳素分子的刚性，使它的溶解性很差，不溶于水、烯酸、稀碱和一般有机试剂，极大地限制了其应用和发展。与甲壳素相比，壳聚糖在溶解性方面有所改善，但分子中仍存在较多的氢键，其pK值约为6.5[10]，只能溶解在稀酸溶液中，不溶于水和普通有机溶剂，这一弱点一定程度上也限制了壳聚糖的应用。虽然甲壳素脱乙酰基生成壳聚糖后的溶解性差强人意，但由于壳聚糖的结构单元中除了 C-3和C-6上存在活泼的羟基基团外，C-2还存在着活性氨基基团，当它被分散到10wt％以下的烯酸溶液中时，C-2上的-NH2会和H+发生质子化反应，形成带正电的-NH3+的阳离子电解质，使其呈现正电性[11]。这一重大改变使壳聚糖拥有很多独特的化学性质：良好的生物相容性、可降解性、无毒副作用以及防腐、抑菌、促进伤口愈合、抗癌等生物活性[3]。
壳聚糖及其衍生物在抑菌方面的研究与应用已成为当今的热点，但是由于壳聚糖水溶性差、抑菌能力有限，极大地限制了其在实际生产过程中的应用。
壳聚糖是目前仅次于纤维素的第二大天然多糖资源，也是自然界仅存在的一种天然碱性多糖。因其储量丰富、来源广泛、价格低廉，而且具有良好的生物相容性、可降解性、无毒副作用以及抑菌性等生化活性，被广泛应用在医药、食品、环保、农业等众多领域。自壳聚糖的抑菌性被发现以来，壳聚糖在抑菌方面的开发与应用已逐渐成为现今研究热点。但壳聚糖作为抑菌材料仍存在以下几方面问题：1、由于壳聚糖只能溶解在偏酸环境中，所以极大地限制了其抑菌性能在中性和碱性条件下的应用范围；2、壳聚糖的分子量和脱乙酰度对其抑菌性能有很大的影响，降低分子量在一定程度上可增强其抑菌效果；3、壳聚糖虽然具有一定的杀菌活性，但与常见的抑菌材料相比，壳聚糖的抑菌活性较低，用量大，成本高，难以满足实际生产要求。
发明内容
针对背景技术中存在的问题，本发明提供了一种水溶性好、抑菌能力更强的壳寡糖接枝共聚物。
本发明的另一个目的是提供一种本发明壳寡糖接枝共聚物的制备方法。
本发明的还有一个目的是将本发明的壳寡糖接枝共聚物作为食品防腐抑菌剂的应用。
本发明采用的技术方案如下：一种壳寡糖接枝共聚物G2.0，其分子式如下：
其中n为任意整数值。
一种壳寡糖接枝共聚物G2.0的制备方法，具体步骤如下：
1)称取一定量的壳寡糖，加入1％(v/v)乙酸作为反应溶剂；乙酸加入量与壳寡糖的总量关系如下：每1g壳寡糖中加入上述乙酸25ml；充分溶解，向瓶内通入氮气移除氧气；在氮气保护下加入一定量的硝酸铈铵作为引发剂，引发剂的加入量与壳寡糖的质量比为1.6:1-2.5:1；然后缓慢地逐滴加入适量丙烯酸甲酯；上述壳寡糖和丙烯酸甲酯的反应摩尔比为1：8—1：8.5；设置搅拌速度为200rpm/min,40℃—55℃温度下连续反应8h—10h；待反应完成后，将反应所得物G0.5滤出，接着将滤出的反应所得物G0.5先用反应溶剂1％(v/v)乙酸抽滤3次，再依次丙酮、乙醚、无水乙醇反复冲洗3次，除去未反应的丙烯酸甲酯，最后放入50℃真空干燥箱烘干备用；
2)称取上述步骤制得备用的G0.5，加入色谱级的甲醇溶剂浸泡12h，甲醇的加入量与G0.5 的总量关系如下：每1mgG0.5中加入上述甲醇0.5ml；控制反应温度为20℃，逐滴加入分析纯乙二胺：乙二胺的加入量与G0.5的总量关系如下：每1mgG0.5加入乙二胺0.08mL；N2保护下反应8h；待反应完成后，将反应所得物G1.0滤出，用反应溶剂甲醇冲洗3遍，然后再依次用无水乙醇、蒸馏水反复洗涤3次，置于50℃真空干燥备用；
3)称取步骤2)所得G1.0置于三颈烧瓶中，加入色谱级甲醇溶剂浸泡12h，甲醇的加入量与 G1.0的总量关系如下：每1mgG1.0中加入上述甲醇0.4ml；然后在氮气保护下逐滴加入丙烯酸甲酯，丙烯酸甲酯的加入量与G1.0的总量关系如下：每1mgG1.0中加入上述丙烯酸甲酯0.1ml；在45℃下连续反应8h后，滤出G1.5，按照G0.5的洗涤方法纯化样品，置于50℃真空干燥箱干燥备用；
4)称取上述步骤制得备用的G1.5，加入色谱级甲醇溶剂浸泡12h，甲醇的加入量与G1.5的总量关系如下：每1mgG1.5中加入上述甲醇0.5ml；控制反应温度为20℃，逐滴加入分析纯乙二胺：乙二胺的加入量与G1.5的总量关系如下：每1mgG1.5加入乙二胺0.08mL；N2保护下反应8h；待反应完成后，将反应所得物G2.0滤出，用反应溶剂甲醇冲洗3遍，然后再依次用无水乙醇、蒸馏水反复洗涤3次，置于50℃真空干燥即得。
作为优选，壳寡糖接枝共聚物G2.0的制备方法中反应原料壳寡糖的制备步骤如下：
1)、称取一定量的壳聚糖通过高速搅拌使其充分溶解于一定量的1％(v/v)乙酸溶液中，然后将溶液转移至石英三颈瓶内，添加一定量的30％(v/v)H2O2,正确安装于微波合成仪腔体内，注意一定要使超声波探头没到溶液的界面以下；设置微波功率300w，反应30min,打开紫外灯光照进行辅助降解，待实验结束，将溶液在40℃度下水浴旋蒸浓缩，然后进行冷冻干燥24h，即可得到粘均分子量Mη在25000左右的壳低聚糖样品；上述乙酸加入量与壳聚糖的总量关系如下：每3g壳聚糖加入100mL上述乙酸溶液,H2O2加入量与壳聚糖的总量关系如下：每1g 壳聚糖加入0.1mL30％H2O2；
2)、按照质量比为1：1：1的比例称取一定量的木瓜蛋白酶、果胶酶和纤维素酶溶于pH＝5.5 的HAC-NaAC的缓冲溶液中，配制成1mg/mL的酶液，待用；将上述经微波降解后的壳低聚糖溶液的pH调节至5.5，按照酶与底物的浓度之比为1：10，加入上述待用酶液，搅拌均匀，并置于45℃的恒温水浴槽中酶解4h；完成后煮沸加热10min使酶灭活，40℃下减压蒸馏浓缩得到制备所需的反应原料壳寡糖样品溶液。
作为优选，壳寡糖接枝共聚物G2.0的制备方法中反应原料壳寡糖的制备步骤还包括对制备所得的壳寡糖粉末进行分子量分级，选取分子量为3500-7000的壳寡糖作为原料；具体分级方法如下：分别选取直径为25mm截留分子量7000和直径34mm截留分子量为3500的透析袋进行前处理，去除金属离子；将直径较小的透析袋套入直径较大的透析袋中，其中一端用透析袋夹固定，蒸馏水冲洗干净，然后用5mL的移液枪移取权利要求6制备的壳寡糖样品溶液装入里层透析袋内，蒸馏水填充双层透析袋之间的间隙，透析袋夹封口，然后放入装有蒸馏水的大烧杯中透析5d；透析完成后将双层膜间隙的液体取出，冷冻干燥，即可得到特定分子量的反应原料壳寡糖。
本发明壳寡糖接枝共聚物G2.0作为食品防腐抑菌剂的应用。
本发明具有如下优点：
1、本发明提供的新化合物壳寡糖接枝共聚物G2.0具有水溶性好，抑菌能力强，且可作为食品防腐抑菌剂使用。
2、本发明采用自由基引发接枝法，采用物理、化学、酶解三种作用因素相结合的方法降解壳聚糖制备壳寡糖，然后再对壳寡糖通过双层透析法进行分子量分级，选取特定量的分子量作为为原料，先由硝酸铈铵引发壳寡糖分子的活性基团发生自由基反应接枝丙烯酸甲酯，进行支化改性，再利用发散法对所制备的壳寡糖进行Michael加成反应，接枝乙二胺，制备接枝共聚物G2.0。完全不同于现有技术中的季铵化反应。
3、本发明对壳聚糖进行微波/超声波/UV辅助H2O2快速降粘和非专一性酶解两步处理，通过控制微波和酶解的条件实现对其的快速有效降解处理，此方法可在较低浓度下进行，有效的避免了过氧化氢降解壳聚糖时产生羰氨缩合副反应导致氨基活性降低这一缺点，而且实验条件温和，降解速度快，并且高效。
4、本发明提供的壳寡糖接枝共聚物G2.0抑菌性能突出：本发明采用MIC测定方法，通过对大肠杆菌、铜绿假单胞菌两种革兰氏阴性菌及金黄色葡萄球菌和枯草芽胞杆菌两种革兰氏阳性菌的MIC值测定，发现G2.0对这四种受试菌均具有显著的抑菌效果。
附图说明
图1是双层膜透析分离特定分子量的壳寡糖的示意图。
图2是反应摩尔比对G0.5接枝率的影响。
图3是反应温度对G0.5接枝率的影响。
图4是引发剂添加量对G0.5接枝率的影响。
图5是反应时间对G0.5接枝率的影响。
图6是AB、AC、BC交叉作用的响应面3D图和等高线图。
图7是不同代数分子的碳氮百分含量比柱状图。
图8是壳寡糖(COS)、丙烯酸甲酯(MA)和G0.5红外光谱图。
图9是G0.5、乙二胺(EDA)和G1.0红外光谱图。
图10是G0.5-G3.0红外光谱图。
图11是G0.5-3.0的热重曲线图。
图12是不同代数的COS/PAMAM在水溶液中的Zeta电位值。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的描述，但本发明并不限于以下实施例。
1 制备壳寡糖
1.1.1 实验材料与试剂
表2-1 主要材料与试剂
2.1.2 实验仪器与设备
表2-2 主要仪器与设备
1.2.1 分步降解壳聚糖制备壳寡糖
1.2.1.1 微波/超声波/UV辅助H2O2快速降粘
准确称取3g壳聚糖通过高速搅拌使其充分溶解于100mL特定浓度的(v/v)乙酸溶液中，然后将溶液转移至250mL的石英三颈瓶内，添加一定量的30％H2O2,正确安装于微波合成仪腔体内，注意一定要使超声波探头没过溶液的界面以下。固定超声波的功率为200W，设置微波功率和反应时间，打开紫外灯(70uw/cm2)开关进行辅助降解，待实验结束，将溶液在40℃度下水浴旋蒸浓缩，然后进行冷冻干燥24h，得到壳低聚糖样品。经过此步处理将壳聚糖的分子量降低到几万数量级。
本实验中将通过L9(34)正交试验对反应时间(min)、H2O2添加量(mL)、微波功率(W)、乙酸浓度(V/V，％)四个重要条件进行优化和筛选，最终得到最佳的快速降粘条件。实验设计的因素水平表如表2-3：
表2-3 L9(34)正交实验因素水平表
1.2.1.2 非专一性酶解
按照质量比为1：1：1的比例称取一定量的木瓜蛋白酶、果胶酶和纤维素酶溶于pH＝5.5 的HAc-NaAc的缓冲溶液中，配制成1mg/mL的酶液，待用。将上述经微波降解后的壳低聚糖溶液的pH调节至5.5，按照酶与底物的浓度之比为1：10，加入3mg酶液，搅拌均匀，并置于45℃的恒温水浴槽中酶解4h。完成后煮沸加热10min使酶灭活，40℃下减压蒸馏浓缩得到壳寡糖样品溶液。
1.2.1.3 双层膜透析分离产物
为解决壳寡糖制备过程中产物的分子量分布不均一的问题，本文创造性地利用双层膜透析的方法对上述所得产物进行了分离。具体操作：分别选取直径为25mm截留分子量7000和直径34mm截留分子量为3500的透析袋进行前处理，去除金属离子。将直径较小的透析袋套入直径较大的透析袋中，其中一端用透析袋夹固定，蒸馏水冲洗干净，然后用5mL的移液枪移取适量上述制备的壳寡糖样品溶液装入里层透析袋内，蒸馏水填充双层透析袋之间的间隙，透析袋夹封口，室温条件下在蒸馏水中透析5d。透析完成后将双层膜间隙的液体取出，冷冻干燥，即可得到特定分子量的淡黄色粉末状壳寡糖样品。双层膜透析原理如图1所示。
1.2.1.4 微波/超声波/UV辅助H2O2快速降粘正交试验结果
表2-4 正交实验结果
综合以上正交实验的结果可以得出：影响降解壳聚糖的实验因素依次是：微波时间>H2O2添加量>微波功率>乙酸浓度；实验的最佳条件为：H2O2添加量为0.3mL，微波功率300W，反应时间30min，乙酸浓度为1％。在上述最佳实验条件下重复试验，可得到粘均分子量Mη在 25000左右的壳低聚糖样品。
2 制备G2.0
2.1.1 实验材料与试剂
表3-1 主要试剂
2.1.2 实验仪器与设备
表3-2 主要仪器设备
2.2.1 G0.5的制备
准确称取1g上一章制备的壳寡糖样品置于100mL三颈瓶，加入25mL1％(v/v)乙酸作为反应溶剂，充分溶解，向瓶内通入氮气30min移除氧气。在氮气保护下加入一定量的硝酸铈铵作为引发剂，然后缓慢地逐滴加入适量丙烯酸甲酯(含防止自身聚合的阻聚剂对甲氧基酚 MEHQ)，这里的对甲氧基酚MEHQ是来源于阿拉丁试剂网，产品编号M100033，>99.0％(GC), 含≤100ppm的MEHQ稳定剂。设置搅拌速度为200rpm/min,一定温度下连续反应8h。待反应完成后，将G0.5滤出，先用反应溶剂抽滤3次，再依次用丙酮、乙醚、无水乙醇反复冲洗3次，除去未反应的丙烯酸甲酯，最后放入50℃真空干燥箱烘干备用。
对上述实验中的四个重要影响因素：引发剂添加量(g)、丙烯酸甲酯与壳寡糖反应摩尔比(mL/g)、反应温度(℃)、反应时间进行单因素实验条件探索。固定反应时间，然后根据 Box-Benhnken中心设计的原理通过响应面法对其他三个主要因素两两之间的交叉影响作用进行讨论，利用Design-Expert8.0.4进行因素水平分析，筛选G0.5的最佳合成条件。响应面法设计的因素水平表如表3-3所示：
表3-3 响应面法实验设计的因素水平表
关于硝酸铈铵引发的配体分子与壳寡糖之间发生自由基接枝反应的原理阐释如下[83]：Ce4+先与糖残基的C2-NH2和C3-OH反应，形成一种复合物。随后C2和C3发生歧化，形成-CH＝NH 和-CH(OH)两种自由基。自由基可能在C2和C3原子中心形成，也可能在-NH上形成，因此硝酸铈铵可能会引发壳寡糖分子生成三种不同的自由基，进而发生接枝反应，最终生成壳寡糖衍生物。
式3-2硝酸铈铵引发的配体分子与壳寡糖发生的自由基反应
2.2.2 G1.0的制备
称取最佳条件下合成的G0.550mg置于100mL三颈瓶，并加入25mL甲醇溶剂浸泡12h，控制反应温度为20℃，逐滴加入4ml乙二胺，N2保护下反应8h。待反应完成后，将G1.0滤出，用反应溶剂冲洗3遍，然后再依次用无水乙醇、蒸馏水反复洗涤数次，置于50℃真空干燥。
2.2.3 G1.5的制备
称取G1.050mg置于100mL三颈烧瓶中，加入20mL甲醇溶剂浸泡12h，然后在氮气保护下逐滴加入5mL丙烯酸甲酯，在45℃下连续反应8h后，滤出G1.5，按照G0.5的洗涤方法纯化样品，置于50℃真空干燥箱干燥备用。
3.2.4 G2.0的制备
G2.0的合成重复G1.0的操作步骤；称取最佳条件下合成的G1.550mg置于100mL三颈瓶，并加入25mL甲醇溶剂浸泡12h，控制反应温度为20℃，逐滴加入4ml乙二胺，N2保护下反应8h。待反应完成后，将G2.0滤出，用反应溶剂冲洗3遍，然后再依次用无水乙醇、蒸馏水反复洗涤数次，置于50℃真空干燥。
3.2.5.1 元素分析测定半代的接枝率
通过百万分之一的天平准确称取1.000mg-2.000mg壳寡糖及每代的接枝产物，用锡囊包裹后依次放入样品盘利用元素分析仪进行C、N、H元素含量的测定，并通过以下公式3-1计算半代产物的接枝率(functional group conversion，％)。以接枝率作为因变量进行单因素实验探索以及响应面条件优化。
其中：X--产物接枝率(％)；
Fo--G1.5和G2.5为上半代中氨基含量，G0.5为壳寡糖脱乙酰度(％)；
Mc、Mn--C、N原子的相对原子质量；
Nc--接枝分子中所含C原子个数；
R--产物中C、N百分含量比。
3.2.5.2 双突跃电位测整代的氨基含量
在合成过程中，接枝乙二胺后生成的整代分子都是以氨基为端基的开端化合物，利用双突跃电位滴定可测得整代分子的氨基含量，可对其接枝效率进行评价。准确称取0.1gG1.0、 G2.0、G3.0样品溶于0.1mol/L的盐酸标准溶液中，在恒pH/mV自动电位滴定仪下用已标定的 0.1mol/L的NaOH溶液滴定。通过公式3-2计算样品的氨基含量：
其中，V1--第一次突跃消耗的NaOH体积(mL)；
V2--第二次突跃消耗的NaOH(mL)体积；
C--NaOH标准溶液的浓度(mol/L)；
0.016--与1mL浓度为1mol/LNaOH溶液相当的胺量(g)；
M--样品质量(g)。
3.2.5.3 红外结构表征
将样品分别与KBr(光谱纯)以1：50-1：100的比例混合，充分研磨制成透明薄片，通过NICOLET-380型傅里叶红外光谱仪对其结构进行FTIR谱图扫描，扫描范围为 4000cm-1-400cm-1，分辨率为4cm-1，扫描次数为32次。
3.2.5.4 热重分析(TGA)
热重分析是测定物质热稳定性的重要表征手段，随着程序设定的温度升高的趋势，待测物会在对应温度下发生降解导致质量变化，根据失重率随温度的变化曲线可得出该物质对热的敏感程度，进一步对其结构进行定性分析。具体操作为：将烘至恒重的约20.000mg的样品放入氧化铝坩埚中，然后缓慢放置于热重仪炉体腔的样品池上，关闭腔门，这时程序会自动显示样品的精确质量。设定测定条件为：氮气载气流量为20mL/min，升温速率10℃/min，起止温度为25～800℃。
3.2.5.5 Zeta电位测定
COS/PAMAM树形分子衍生物的整代分子的末端都是活性的-NH2开端，且每代接枝都会有氨基的变化，氨基是带正电的活性基团，利用Zeta电位可观测其电位变化，以此来弥补反复接枝多次后红外特征吸收峰无明显变化而无法判断其结构特征的不足。将样品配制成 0.05mg/mL的水溶液，然后25℃下利用纳米粒度分析仪连续扫描三次测定其Zeta电位值。
3.3.1 G0.5合成的单因素条件探索
3.3.1.1 反应摩尔比对G0.5接枝率的影响
一般情况下，只有当反应活性位点与接枝功能基含量达到适当比例时，反应才会最大限度地进行。从图2可知，在一定范围内，接枝率随反应单体的含量增加而增大，这主要是因为随着接枝单体含量的增加，反应活性功能基的扩散速度加快，使之与被接枝物的活性位点的有效碰撞次数增加，反应向正方向进行。当达到反应饱和比例时，即图中壳寡糖与丙烯酸甲酯的比例达到1：8时，由于单体含量过多造成体系粘度增大，功能基扩散速度减慢，反应单体之间相互竞争活性位点而形成抑制作用，而且由于丙烯酸甲酯容易发生自身聚合，造成副反应的增加，最终导致接枝率降低。
3.3.1.2 反应温度对G0.5接枝率的影响
大多数合成反应都属于吸热反应，适当的温度可以给予反应所必需的能量，推动反应产生吉布斯自由能变化进而发生反应。从图3可以看出：在反应初始阶段，接枝率随着反应温度的升高而增大，提高温度不仅可以最大限度地激发反应位点的活性，而且本实验所用的引发剂硝酸铈铵只有在高于40℃条件下才能满足反应所需的键解离能，引发壳寡糖分子中活性基团产生自由基。当温度达到45℃时，体系的初级自由基浓度达到最大，接枝率最高。当继续提高温度，反应体系中的副反应增多，反应功能基数量减少，抑制了主反应的进行，导致接枝率下降。
3.3.1.3 引发剂添加量对G0.5接枝率的影响
本实验中，引发剂硝酸铈铵的添加量是影响反应接枝率的主要因素之一。在硝酸铈铵的 Ce+作用下，壳寡糖单元分子中会产生大量自由基，增强对丙烯酸甲酯中C＝C的电子吸引作用，在自由基的攻击下，双键打开，与壳寡糖分子间形成化学键，发生接枝反应。根据硝酸铈铵引发壳寡糖产生自由基反应的原理，一定量的壳寡糖分子需要相应剂量的铈离子来引发，由图4 可知，随着硝酸铈铵添加量增加，反应接枝率逐渐增大，当加入1.5g硝酸铈铵时，反应接枝率达到最大。但是在反应进行到一半以后，由于副反应的增多，反应难度增大，再增大引发剂的添加量也不会起到积极作用。
3.3.1.4 反应时间对G0.5接枝率的影响
自由基反应包括链引发、链增长和链终止三个过程，充足的反应时间是该反应所必须的。图5为反应时间对G0.5接枝率的影响。从图中可以看出，在反应初期，由于体系内存在的反应物浓度较大，使接枝率在6h内迅速增大,随着时间的推移，接枝反应有序进行，接枝量逐渐增大。但当反应进行8h后，反应体系中副反应增多，对产物造成了一定影响，导致接枝率严重降低。
3.3.2 G0.5合成的响应面优化分析
3.3.2.1 响应面设计方案与试验结果
在单因素试验结果的基础上，选取反应摩尔比、引发剂添加量和反应温度三个主要因素进行响应面分析与优化。利用Box-Benhnken的中心设计的原理设计以下17组试验，以接枝率作为响应值，通过三因素三水平的响应面法(RSM)对合成条件进一步优化，考察各个因素的响应程度与两两交叉影响作用的结果。试验设计方案与结果如下表3-4所示：
表3-4 响应面设计方案与实验结果
3.3.2.2 多元回归拟合分析与数学模型建立
通过DesignExpert8.0.4软件对表3-4中的实验数据进行多元回归拟合分析，得出接枝率与影响因素引发剂添加量、反应摩尔比、反应温度之间符合多元二次线性方程，其数学模型见式 3-3：
Y＝+52.62+9.70*A+1.96*B+3.08*C-1.03*A*B-0.030*A*C-1.30*B*C
-13.74*A2-2.05*B2-2.89*C2 (3-3)
其中，Y--接枝率；A—引发剂添加量；B—反应摩尔比；C-反应温度。
表3-5 响应面二次型方差分析
方差分析是通过确定过程参数是否对转化率有显著影响来说明上述数学模型是否有意义。响应面二次型方差分析的结果见表3-5，由模型的F值＝106.58表明该响应发展的数学模型是极为显著的，且F值只有0.01％的机会是由于噪音产生的。失拟项的F值为2.55，且只有19.42％的机会是由噪音引起的，相对于纯误差是不显著的，这些都符合多元线性拟合的要求。方程实际值的相关系数R2＝0.9928与预测值的R2＝0.9200是接近的，且两者都接近于1，表明G0.5的接枝率的实际值与预测值之间存在良好的拟合度。校正决定系数AdjR2＝0.9834说明响应值有 98.34％的变异分布可由该方程来解释。另外，该模型的变异系数(C.V＝3.09％)和信噪比(Adeq Precision＝28.356＞4)都在模型允许的范围内。综上，多元线性拟合得出的数学模型对于实验结果的分析与预测具有有效意义。
在A、B、C、AB、AC、BC、A2、B2、C2九个模型项中，A、B、C、A2、B2、C2的Pr ＞F＜0.0500，说明这些模型项是显著的，其余三项的Pr＞F＞0.1000，是不显著的。对于不重要的模型项(不包括支持模型层次结构的模型项)可进行简化来改进模型。同时，比较A、B、C的F值可得出，引发剂添加量、反应摩尔比和反应温度对G0.5的接枝率的影响大小依次为：引发剂添加量＞反应温度＞反应摩尔比，且A的F值表现极为显著(Pr>F值<0.0001)，因素A2也是极为显著的，表明引发剂是丙烯酸甲酯接枝于壳寡糖的主要推动因素。这一点与现有研究成果是一致的，有研究表明在没有引发剂存在的情况下，丙烯酸甲酯与壳聚糖很难发生反应，一般要甲基化丙烯酸甲酯然后通过烷基化作用才可接枝于壳聚糖上，或者在物理因素如等离子体、γ射线等诱导下反应才可进行。
3.3.2.3 影响因素的交叉作用
保持引发剂添加量、反应摩尔比、反应温度其中的一个条件在最佳水平，绘制3D曲面图和等高线图可得到另外两个因素对接枝率的交叉影响作用。等高线的中心点为三维曲面图中的最高点，即在两个独立变量的相互作用下所达到的接枝率的最大值。等高线的形状可以反映两个变量交叉作用的强弱，越趋于椭圆，表示交叉作用越强，越圆则表示交叉作用越弱。AB、AC、 BC的交叉作用的响应面3D图及等高线图如图6所示，从等高线的形状可以看出交叉作用强弱依次为：BC＞AB＞AC，这与方差分析的结果是一致的。由于因素A的独立性特别强，所以它和其他两个变量的交叉作用变弱，反而因素BC之间的相互影响的作用力最强。说明在保证引发剂适量的情况下，随着反应摩尔比的增加以及反应温度的升高，接枝率表现为增大后减小的趋势，这是因为适当的反应摩尔比和温度可以增加反应单体与壳寡糖分子之间的有效碰撞，提高反应接枝率，当反应摩尔比过大或反应温度过高时，丙烯酸甲酯容易自聚，造成反应体系的副反应增多，率降低。
3.3.2.4 最佳合成条件的确定与验证
通过响应面优化分析法可得G0.5的最佳合成条件为：引发剂添加量为1.67g，反应摩尔比 COS:MA＝I:8.48，反应温度为47.39℃，在该条件下合成的G0.5的接枝率预测值为55.2522％。实际操作中实验条件很难达到和上述最佳条件一样精准，所以做如下调整：引发剂添加量1.65g，反应摩尔比1：8.5，反应温度47.5℃。按照调整后的实验方案进行重复试验，测得平均接枝率为52.38％，与预测值基本相符，说明本实验中建立的二次回归方程能较为有效地预测G0.5在一定合成条件下的接枝率。
结论：通过对G0.5合成条件的单因素试验得出：反应摩尔比为COS:MA(g/mL)＝1:8，反应温度为45℃，引发剂添加量为1.5g，反应时间为8h。在单因素的基础上固定反应时间为8h, 选取反应摩尔比、引发剂添加量和反应温度三个主要因素进行响应面优化，得到最佳合成条件为：引发剂添加量1.65g，反应摩尔比COS:MA(g/mL)＝1:8.5,反应温度47.5℃。并且通过方差分析得出：三个因素对接枝率影响强弱顺序依次为：引发剂添加量>反应摩尔比>反应温度，其中，结果显示引发剂添加量的影响力最为显著。
3.3.3.1 半代产物的元素含量和接枝率
由表3-6可知：随着接枝代数的增加，产物的接枝率不断降低，这主要是由于空间位阻不断增大所引起的。支化物有着规则有序的分子排布，当支化度达到一定密集程度，分子内部存在很大的空间位阻效应，接枝单体很难再继续进行支化。而且后一代产物的接枝率受到前一步接枝率的影响，接枝率会越来越低，产物中的副产物逐渐增多，目标产物纯度不断降低，分离提纯困难，这些都是现在合成支化物仍存在的巨大问题。
表3-6 半代分子的元素含量及接枝率
3.3.3.2 整代产物的氨基含量
表3-7 整代分子的氨基含量
表3-7显示：随着接枝代数的增加，氨基含量不断减小，这主要是由于反应主要是在增加整体分子量，产物的整体分子量的增加的幅度比其中氨基增大的幅度大，所以表现出氨基含量减小的趋势。不过，根据反应线路图，随着反应的进行，末端氨基的数量在不断增加。
3.3.3.3 G0.5-G2.0的碳氮比
本实验接枝的丙烯酸甲酯与乙二胺主要涉及碳元素和氮元素含量的变化，所以可以用碳氮百分含量比来估计反应进行的情况。图7为不同代数产物分子中碳氮百分含量比柱状图，从图可以看出，相邻代数碳氮比的不断变化说明进行了化学反应。整代分子的碳氮比随着接枝代数的增加而增大，这主要是由于反应时碳元素的增加量大于氮元素的增加量。半代分子接枝的是丙烯酸甲酯，只会增加碳元素含量，所以产物的碳氮比较前一步的整代分子碳氮比是增大的。只不过随着代数的增加，反应越来越困难，接枝率越来越低。
3.3.4 红外结构解析
3.3.4.1 G0.5代红外图谱解析
图8所示为壳寡糖、丙烯酸甲酯和G0.5的红外光谱对比图。在合成的G0.5谱图中，原壳寡糖谱带中3404.7cm-1处的O-H和N-H伸缩振动吸收重叠峰明显变小，且发生了一定的偏移，由原来的3404cm-1处的宽峰向低波数3385cm-1移动。说明在硝酸铈铵的引发作用下C2位上的 -NH2或C3位上的-OH发生了自由基反应。壳寡糖中1590cm-1处N-H的变形振动吸收峰在G0.5 相应的位置也有明显减小的趋势，进一步说明反应很有可能发生在C2位活泼的氨基上。与丙烯酸甲酯的谱图相比，其中1654cm-1处C＝C的中强伸缩振动吸收峰在G0.5的谱图中完全消失，且在1384cm-1出现了新的较强的特征吸收峰可能为丙烯酸甲酯中-CH3的特征吸收峰，也可能是由丙烯酸甲酯中的C＝C与壳寡糖发生了接枝反应导致其C-C骨架改变所引起的。另外， 1075cm-1处C-O-C振动吸收峰的增强很有可能是丙烯酸甲酯接枝于壳寡糖后酯基作用的结果，这些都说明壳寡糖与丙烯酸甲酯发生了接枝反应。
3.3.4.2 G1.0代红外图谱解析
G0.5、乙二胺和G1.0的红外光谱对比图如图9所示，从图中可以看出：与G0.5相比，G1.0谱带中变化最为显著的是原吸收谱带中1629cm-1处酰胺Ⅰ带的C＝O伸缩振动吸收峰增大，而且-CH3在1384cm-1处的特征吸收峰明显变小，说明G0.5上的酯基与乙二胺发生了迈克尔加成反应。2923cm-1和2878cm-1分别为-CH2的不对称和对称伸缩振动的增强，3385cm-1处N-H 的伸缩振动吸收峰峰形变深且相对于G0.5中有所偏移，也证明了G1.0被合成。
在本实验中，迈克尔加成反应主要涉及丙烯酸甲酯中的酯基与乙二胺中的氨基酰胺化的过程，在此过程中为了防止分子中桥式结构的形成，加入的乙二胺是足量的，但过量的乙二胺与反应物易发生竞争反应，使高代树形分子中含有低代分子，降低了产物的单分散性，所以每次反应完成后需要用大量的无水乙醇和蒸馏水除去未反应的乙二胺，以此来提高产物的纯度。
3.3.4.3 G0.5-G3.0红外光谱对比图
图10为G0.5-G2.0的红外光谱对比图，从图中可以看出：随着接枝代数的增加，3400cm-1处氨基中N-H的伸缩振动峰大小交替，1390cm-1处-CH3特征吸收峰的变化都是丙烯酸甲酯与乙二胺交替接枝的结果。2880cm-1处亚甲基吸收峰的逐渐加强，1640cm-1处C＝O伸缩振动峰的增大是由于合成过程中基团累积的作用效果。而1070cm-1处特征吸收峰的变化则是由丙烯酸甲酯中C-O-C接枝后所引起的。因为整个反应过程中只存在丙烯酸甲酯和乙二胺中基团的交替变换，无其他特征官能团的引入，所以G0.5-G2.0的红外特征吸收峰的谱线的形状和走势是基本一致的，它们只存在峰形大小强弱的区别。结合元素分析的结果可以得出壳寡糖与支化分子发生了接枝反应。
3.3.5 热稳定性分析
由图11可以得出改性后的各代COS/PAMAM衍生物的热稳定性与壳寡糖相比都有不同程度的变化。它们都主要经历两个失重阶段：起始温度到100℃左右所失的重量是由样品中水分的蒸发及晶体结构初步降解引起的；150℃到400℃附近重量的急剧下降主要是由于壳寡糖及其衍生物的糖单元分子的主骨架发生热分解，吡喃糖环中的化学键被打开，晶体结构被完全破坏；400℃以后重量的缓慢降低可能是由降解后残留的灰烬残渣的分解造成的。其中G0.5和 G1.0的热稳定性较壳寡糖有所提高，最终所剩的灰烬残渣的质量比壳寡糖多，说明前两步对壳寡糖的支化改性很成功。但随着接枝代数的增加，接枝率逐渐降低，副反应的增多，导致其热稳定性变化不大，几乎接近于壳寡糖。
3.3.6 Zeta电位测定结果
自由氨基溶于水时会与水中的H+会发生质子化作用，产生多余的OH-离子，导致溶液的 pH降低，电位值也随之减小。如图12所示为不同代数的COS/PAMAM衍生物在水溶液中的 Zeta电位变化图，当合成半代分子时由于丙烯酸甲酯与氨基反应消耗氨基使其数量减少，发生质子化作用减小，溶液中H+浓度增大，导致Zeta电位值升高；当合成整代分子时接枝的是乙二胺，会产生大量的氨基，使溶液中质子化作用增强，OH-浓度增大，溶液的整体电位值降低甚至达到负值。由于丙烯酸甲酯与乙二胺交替接枝，氨基不断进行消耗与产生交替变化，所以随着接枝代数的增加溶液的Zeta电位值呈现锯齿状分布。
4.1 G2.0抑菌剂的杀菌性能测试材料与设备
4.1.1 实验材料与试剂
表4-1 受试菌株
表4-2 主要试剂
4.1.2 实验仪器与设备
表4-3 主要仪器设备
4.2.1 G2.0抑菌剂的杀菌性能测试
4.2.2.1 菌种活化及菌悬液的制备
移取50μL保藏在甘油管中的菌种接种至50ml营养肉汤培养基(以下简称LB培养基)，置于37℃恒温振荡器中振荡培养16-18h，将菌株活化至对数生长期。取适量活化后的菌液于 10mL离心管，4000rpm/min离心10min，倒掉上清液，然后在上述离心条件下用0.85％的生理盐水洗涤白色菌斑1-2次，除去保藏时残留的甘油。移取1ml处理后的菌液于试管中，用0.85％生理盐水按照十倍稀释法逐级稀释成不同浓度梯度的菌悬液，取0.2mL稀释到10-4CFU·mL-1及以下浓度的菌液进行平板计数。选取菌落数在4-5个的浓度梯度确定为该菌的最适生长浓度，此时浓度为10-8cfu·mL-1。按照上述方法配置该浓度的菌悬液，备用。
4.2.2.2 MIC测定
参考周德庆第二版《微生物学实验教程》中杀菌剂MIC的测定方法，利用液体稀释法对本实验所制备的COS/PAMAM杀菌剂进行杀菌性能测试。具体操作：先将样品溶于0.1mol/L CH3COONa-0.2mol/L CH3COOH缓冲溶液，配制成1000μg/mL的溶液，按照表4-4所示的方法在试管中配制不同含药浓度的溶液，然后在各个管中加入0.2mL 4.2.2.1中配制的10-8cfu·mL-1测试菌液，以只含菌和只含样品的培养液作为空白对照。将上述试管置于37℃、200rpm/min 的恒温振荡箱中培养12h，通过肉眼观察各试管的混浊度，如果样品组从某试管开始变得与对照组一样澄清透明，表明该浓度为最小抑菌浓度(MIC,minimuminhibitory concentration)。
表4-4 不同样品含量的试管的配制
4.2.2.3 MBC测定
最小杀菌浓度(MBC)的测定是在4.2.2.2的MIC测定结果的基础上进行。将MIC测试中所有变澄清的试管溶液接种到固体培养基，观察菌落的生长情况，最终将平板中无明显菌落生长的最小样品浓度定义为样品对测试菌的最小杀菌浓度(MBC,minimumbactericidal concentration)。
4.2.2.5 杀菌率曲线
将2mL受试菌接种于50mL的液体培养基中，分装到小试管，将其分成实验组和对照组，在实验组中加入浓度为MIC的样品溶液，对照组加入同体积的生理盐水，摇匀，使抑菌剂和受试菌充分接触。按照GB/T4789.3-2010提供的方法，将上述各组溶液分别逐级稀释到适宜浓度，然后用移液枪移取1mL置于琼脂培养基上，用玻璃涂布棒涂布均匀后，倒置平板，放入 37℃的恒温培养箱中培养不同时间，在设定时间点进行平板活菌计数。通过以下公式计算[95]微球的杀菌率：
其中：B％表示杀菌率；N0为对照组活菌数；N1为实验组活菌数。
4.2.2 COS/PAMAM树形分子吸附Ag+和Cu2+复合抑菌剂的制备
准确称取15.0mg已制备的COS/PAMAM样品于100mL的碘量瓶中，加入25.0mL不同pH的HAc-NaAc缓冲液使其充分溶解。再向碘量瓶中加入5.0mL浓度为3.0mg·mL-1的Ag+、 Cu2+溶液，以不加入样品组作为空白对照试验，置于25℃100rpm·min-1的恒温振荡箱振荡24h。待吸附平衡后，用取上清液测定溶液中剩余离子含量。根据以下公式推算吸附量Q[96]。
其中：Co－吸附前金属离子的浓度(mg·mL-1)；Ce－吸附平衡后金属离子的浓度(mg·mL-1)；Q－COS/PAMAM分子的静态饱和吸附量(mg·g-1)；V－溶液体积(mL)； m－COS/PAMAM样品的干重(g)。
4.2.3 COS/PAMAM/Cu2+抑菌剂的杀菌性能测试
实验方法同4.2.1。
4.2.4 COS/PAMAM及COS/PAMAM/Cu2+杀菌机理探究
4.2.3.1 胞外DNA、RNA测定
杀菌剂的作用机理主要有以下两点：其一为杀菌剂可以击断菌膜上亚单位连接点的疏水键与金属桥，导致膜表面出现裂缝或空隙，失去生理功能；其二为杀菌剂所带的正电荷会与细菌表面所带的负电荷产生静电吸引形成电价键，引起溶菌作用，破坏细菌的细胞壁和细胞膜结构，从而引起细胞内容物如DNA、RNA等外泄，最终导致细胞死亡。因此通过测定DNA、RNA的含量来判断细胞的破裂程度，间接地，可以利用紫外分光光度计在260nm处比色测定吸光度值来判断测试菌细胞的破裂程度。
4.2.3.2 TTC脱氢酶测定[97]
TTC(红四氮唑)可以接受细胞呼吸过程中由脱氢酶产生的H(H+/e)，生成红色的三苯基甲樑(TF)，反应式如下：
TTC在活菌作用下会穿过细胞壁和细胞膜从环境进入细胞内部。因此，TTC可以用来测定受试菌细胞的活力，即活菌数越多，新陈代谢越强，从环境中摄取的TTC越多，生成的TF量也就越多。反之，如果杀菌剂对活菌作用导致数量减少或死亡，TF的生成量就会变少。所以可以通过测定TF产生量来考察杀菌剂的抗菌效果，进一步研究其灭菌机理。
4.2.3.3 扫描电镜形态学观察
目前比较认可的阳离子杀菌剂的作用机理主要是通过自身所带的正电荷与细菌表面所带的负电荷产生静电吸引，扰乱细胞膜表面的电荷分布，破坏其生理活性，进而渗透到细胞内产生溶菌作用，引起DNA、RNA等细胞内容物流出，最终导致细胞死亡。细胞死亡后其细胞碎片会吸附在杀菌剂表面，所以可以对杀菌后的样品进行表面形貌学观察来直观地反应杀菌剂的作用效果。
4.3.1 COS/PAMAM衍生物的杀菌效果
4.3.1.1 MIC测定结果
表4-5 G2.0对四种受试菌作用的MIC值
通过测试G2.0对大肠杆菌、铜绿假单胞菌两种革兰氏阴性菌以及金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌两种革兰氏阳性菌的MIC值可以得出：G2.0对所测的4种受试菌均具有显著的抑菌效果。从受试菌角度来分析，三种杀菌剂对大肠杆菌的抑菌性能优于其他菌种，枯草芽孢杆菌次之，金黄色葡萄球菌处于第三，且它们对铜绿假单胞菌的抑菌性最差，这主要是由于受试菌本身具有很强的抗药性。根据现有理论，聚阳离子杀菌剂中氨基含量越高，其杀菌性能越强。

Claims (7)

1.一种壳寡糖接枝共聚物G2.0，其特征在于其分子式如下：
其中n为任意整数值。
2.一种权利要求1所述的壳寡糖接枝共聚物G2.0的制备方法，其特征在于所述制备方法具体步骤如下：
1)称取一定量的壳寡糖，加入1％(v/v)乙酸作为反应溶剂；乙酸加入量与壳寡糖的总量关系如下：每1g壳寡糖中加入上述乙酸25ml；充分溶解，向瓶内通入氮气移除氧气；在氮气保护下加入一定量的硝酸铈铵作为引发剂，引发剂的加入量与壳寡糖的质量比为1.6:1-2.5:1；然后缓慢地逐滴加入适量丙烯酸甲酯；上述壳寡糖和丙烯酸甲酯的反应摩尔比为1：8—1：8.5；设置搅拌速度为200rpm/min,40℃—55℃温度下连续反应8h—10h；待反应完成后，将反应所得物G0.5滤出，接着将滤出的反应所得物G0.5先用反应溶剂1％(v/v)乙酸抽滤3次，再依次丙酮、乙醚、无水乙醇反复冲洗3次，除去未反应的丙烯酸甲酯，最后放入50℃真空干燥箱烘干备用；
2)称取上述步骤制得备用的G0.5，加入色谱级的甲醇溶剂浸泡12h，甲醇的加入量与G0.5的总量关系如下：每1mgG0.5中加入上述甲醇0.5ml；控制反应温度为20℃，逐滴加入分析纯乙二胺：乙二胺的加入量与G0.5的总量关系如下：每1mgG0.5加入乙二胺0.08mL；N2保护下反应8h；待反应完成后，将反应所得物G1.0滤出，用反应溶剂甲醇冲洗3遍，然后再依次用无水乙醇、蒸馏水反复洗涤3次，置于50℃真空干燥备用；
3)称取步骤2)所得G1.0置于三颈烧瓶中，加入色谱级甲醇溶剂浸泡12h，甲醇的加入量与G1.0的总量关系如下：每1mgG1.0中加入上述甲醇0.4ml；然后在氮气保护下逐滴加入丙烯酸甲酯，丙烯酸甲酯的加入量与G1.0的总量关系如下：每1mgG1.0中加入上述丙烯酸甲酯0.1ml；在45℃下连续反应8h后，滤出G1.5，按照G0.5的洗涤方法纯化样品，置于50℃真空干燥箱干燥备用；
4)称取上述步骤制得备用的G1.5，加入色谱级甲醇溶剂浸泡12h，甲醇的加入量与G1.5的总量关系如下：每1mgG1.5中加入上述甲醇0.5ml；控制反应温度为20℃，逐滴加入分析纯乙二胺：乙二胺的加入量与G1.5的总量关系如下：每1mgG1.5加入乙二胺0.08mL；N2保护下反应8h；待反应完成后，将反应所得物G2.0滤出，用反应溶剂甲醇冲洗3遍，然后再依次用无水乙醇、蒸馏水反复洗涤3次，置于50℃真空干燥即得。
3.如权利要求2所述的壳寡糖接枝共聚物G2.0的制备方法，其特征在于：所述步骤1)中加入的丙烯酸甲酯中含有防止自身聚合的阻聚剂对甲氧基酚MEHQ。
4.如权利要求2所述的壳寡糖接枝共聚物G2.0的制备方法，其特征在于：步骤1)中设置好搅拌速度为200rpm/min,40℃—55℃温度下连续反应时间为8h。
5.如权利要求2所述的壳寡糖接枝共聚物G2.0的制备方法，其特征在于：所述反应原料壳寡糖的制备步骤如下：
1)、称取一定量的壳聚糖通过高速搅拌使其充分溶解于一定量的1％(v/v)乙酸溶液中，然后将溶液转移至石英三颈瓶内，添加一定量的30％(v/v)H2O2,正确安装于微波合成仪腔体内，注意一定要使超声波探头没到溶液的界面以下；设置微波功率300w，反应30min,打开紫外灯光照进行辅助降解，待实验结束，将溶液在40℃度下水浴旋蒸浓缩，然后进行冷冻干燥24h，即可得到粘均分子量Mη在25000左右的壳低聚糖样品；上述乙酸加入量与壳聚糖的总量关系如下：每3g壳聚糖加入100mL上述乙酸溶液,H2O2加入量与壳聚糖的总量关系如下：每1g壳聚糖加入0.1mL30％H2O2；
2)、按照质量比为1：1：1的比例称取一定量的木瓜蛋白酶、果胶酶和纤维素酶溶于pH＝5.5的HAC-NaAC的缓冲溶液中，配制成1mg/mL的酶液，待用；将上述经微波降解后的壳低聚糖溶液的pH调节至5.5，按照酶与底物的浓度之比为1：10，加入上述待用酶液，搅拌均匀，并置于45℃的恒温水浴槽中酶解4h；完成后煮沸加热10min使酶灭活，40℃下减压蒸馏浓缩得到制备所需的反应原料壳寡糖样品溶液。
6.如权利要求2所述的壳寡糖接枝共聚物G2.0的制备方法，其特征在于：所述反应原料壳寡糖的制备步骤还包括对制备所得的壳寡糖粉末进行分子量分级，选取分子量为3500-7000的壳寡糖作为原料；具体分级方法如下：分别选取直径为25mm截留分子量7000和直径34mm截留分子量为3500的透析袋进行前处理，去除金属离子；将直径较小的透析袋套入直径较大的透析袋中，其中一端用透析袋夹固定，蒸馏水冲洗干净，然后用5mL的移液枪移取权利要求2制备的壳寡糖样品溶液装入里层透析袋内，蒸馏水填充双层透析袋之间的间隙，透析袋夹封口，然后放入装有蒸馏水的大烧杯中透析5d；透析完成后将双层膜间隙的液体取出，冷冻干燥，即可得到特定分子量的反应原料壳寡糖。
7.权利要求1所述的壳寡糖接枝共聚物G2.0作为食品防腐抑菌剂的应用。
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