CN108431006A - 酪蛋白激酶1δ在乳腺癌中的治疗靶向 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种抑制酪蛋白激酶1δ(CK1δ)的方法，所述方法包括使CK1δ与如本文定义的式(I)化合物；诸如化合物SR‑3029接触。证明CSNK1D在人乳腺肿瘤中被扩增和/或过表达，并且CK1δ可以在过表达该激酶的人乳腺癌亚型中医学靶向。本发明还提供一种治疗癌症的方法，所述癌症诸如乳腺癌、黑素瘤、成胶质细胞瘤、成神经管细胞瘤、肾癌、膀胱癌或结肠癌、或为转移至脑、肺或骨的癌症，前提条件是升高的CK1δ和β‑连环蛋白依赖性参与这些癌细胞转移的疾病。癌症可以为具有三阴性亚型乳腺癌(TNBC)的乳腺癌或可以为HER+乳腺癌。

Description

酪蛋白激酶1δ在乳腺癌中的治疗靶向

相关申请的交叉引用

本申请要求于2015年10月13日提交的美国临时申请序列号62/240,689的优先权，其公开内容通过引用整体并入本发明。

政府支持声明

本发明由国立健康研究院在CA175094下由政府支持完成。政府对本发明具有特定权利。

背景技术

乳腺癌占所有癌症诊断的近四分之一，并且是全球女性癌症相关死亡率的主要原因(1,2)。目前，乳腺癌的治疗选择是基于病理信息和组织学分级，以及雌激素(ER)、孕酮(PR)和表皮生长因子2(HER2/neu)受体的表达状态，其中阻断受体功能的靶向治疗已经在总生存率方法获得改善(1,3)。事实上，ER和/或PR的表达是由内分泌治疗获得有益效果的良好的预后因子和预测指标，并且尽管HER2过表达意味着不良预后，但患者极大地受益于抗HER2靶向治疗(4,5)。

相比之下，由ER和PR受体缺失以及缺少HER2扩增定义的三阴性亚型乳腺癌(TNBC)不具有靶向治疗选择，具有高度侵袭性并且表现出不良预后(6,7)。尽管乳腺癌研究已经开创并强调了靶向治疗的临床有益效果，但仍需要进一步鉴定驱动子和相关信号传导途径，尤其是TNBC和HER2乳腺癌的，以指导靶向治疗的开发、延长无病生存期并改善癌症患者的生活。

酪蛋白激酶-1δ(CK1δ)和酪蛋白激酶-1ε(CK1ε)是已知调节不同细胞过程(包括昼夜节律、膜运输和细胞骨架)的两种高度相关的丝氨酸/苏氨酸激酶，并且两者都与癌症有关(8-11)。例如，肉豆蔻酰化的CK1ε足以在体外转化乳腺上皮细胞，然而CK1δ的显负性突变体的表达在体内削弱SV40诱导的乳腺癌发生(12)。因为激酶CK1δ和CK1ε对于小分子药物发现而言非常容易。然而，这些激酶对人类癌症的贡献知之甚少，并且先前报道的CK1δ/CK1ε抑制剂的非选择性阻碍了批准这些激酶作为抗癌靶(9，13-15)。事实上，现在已知原来归因于抑制CK1δ/CK1ε的药理作用是由于所用的非选择性抑制剂的脱靶作用(13,16)。

发明内容

在各种实施方案中，本发明涉及一种抑制CK1δ的方法，所述方法包括使CK1δ与有效量或有效浓度的式(I)化合物接触：

其中：

每个R独立地选自氢或(C₁-C₆)烷基，或者键合到氮原子的两个R基团与氮原子一起能形成5-7元杂环，所述5-7元杂环任选地还包含选自O、S和NR’的1或2个杂原子，其中R’选自氢或(C₁-C₆)烷基；

Ar¹为芳基或5元或6元杂芳基，其是未经取代的或被1-3个独立选择的卤素、(C₁-C₆)烷基、(C₁-C₆)氟烷基、(C₁-C₆)烷氧基、氰基、硝基、C(＝O)NR₂、OC(＝O)NR₂、N(R)C(＝O)OR、N(R)C(＝O)R、或C(＝O)OR取代；

Het¹是单环或双环杂芳基，其是未经取代的或被1-3个独立选择的卤素、(C₁-C₆)烷基、(C₁-C₆)氟烷基、(C₁-C₆)烷氧基、氰基、硝基、C(＝O)NR₂、OC(＝O)NR₂、N(R)C(＝O)OR、N(R)C(＝O)R、或C(＝O)OR取代；

或其药学上可接受的盐。

在各种实施方案中，本发明涉及一种治疗癌症的方法，所述癌症包括但不限于乳腺癌、黑素瘤、成胶质细胞瘤、成神经管细胞瘤、肾癌、膀胱癌和结肠癌。此外，癌症如转移至脑、肺或骨的乳腺癌也适于用我们的CK1δ抑制剂治疗，只要升高的CK1δ和β-连环蛋白依赖性两者参与这些转移疾病即可。治疗方法包括向患有其的患者施用有效剂量的如上所述的式(I)化合物。

更具体地，所述式(I)化合物可以为：

或其药学上可接受的盐。

本发明还公开了特别容易由CK1δ抑制剂治疗的癌症是CK1δ和β-连环蛋白表达水平上调的那些癌症。因此，在各种实施方式中，本发明提供鉴定有效治疗患者癌症的抗癌药物的方法，其包括测定患者中CK1δ水平和β-连环蛋白水平并且如果两者水平都升高则选择CK1δ抑制剂用于治疗方案。本发明还提供治疗患有乳腺癌、黑素瘤、成胶质细胞瘤、成神经管细胞瘤、或肾癌、膀胱癌或结肠癌、或转移至脑、肺或骨的癌症的患者的方法，所述方法包括确定患者中是否存在升高的CK1δ和β-连环蛋白水平，并且如果两者水平均升高，则选择CK1δ抑制剂用于治疗方案。

在各种实施方案中，本发明提供了治疗三阴性亚型乳腺癌(TNBC)的方法。在其它实施方案中，本发明提供了治疗HER+乳腺癌的方法。所述方法包括向将患有乳腺癌的患者施用有效剂量的式(I)化合物。

附图说明

图1：CK1δ临床相关并有效靶向所选乳腺癌亚型。(A)CK1δmRNA乳腺浸润性导管癌(IDC)相对于相邻正常组织中的表达(***，p＝6.78e～15)。(B)基于RNA-Seq数据，CK1α1、CK1δ、CK1ε在PAM50乳腺癌亚型中的表达(n＝972个肿瘤样品、113个实心正常组织)。示出Log2归一化读取计数(RSEM)。(C)根据CK1δ表达聚集的侵袭性乳腺癌中的CSNKID DNA拷贝数分析(n＝303)。示出基因级拷贝数估计(G1STIC2阈值)：-2、-1、0、1、2，其代表纯合缺失、单拷贝缺失、二倍体正常拷贝、低级拷贝数扩增、或高级拷贝数扩增。(D)CSNKID Log₂mRNA表达与Log₂拷贝数值的散点图(972名乳腺癌患者)。(E)指示的乳腺癌细胞系和MCF10A乳腺上皮细胞中的CK1δ和CKlε蛋白表达。(F)SR-3029的化学结构。(G)SR-3029在所示乳腺癌细胞系中的抗增殖功效。数据作为增殖％相对于载体关系作图(n＝6)。(H)在SR-3029或载体存在下所示细胞的克隆形成生长和存活率(n＝3；p＝0.0008)。(I)用指示剂量的SR-3029治疗72小时之后PI/膜联蛋白相对于FACS的细胞凋亡百分比(n＝3；***，从左到右，p＝0.0007和0.0001)。(J)左图，过表达CK1δ或GFP+/-SR-3029的MDA-MB-231细胞的克隆形成生长(n＝3；***，p＝0.001，**，p＝0.0035)。右图，48小时时西方墨点法确认CK1δ过表达+/-30nM SR-3029。(K)在用非靶向(NT)或CK1δsiRNA转染MDA-MB-231后5天，通过台盼蓝排除法测量相对生长(左图，n＝3，siδ1；p＝0.01，siδ2p＝0.003)和细胞死亡百分比(右图，n＝3，siδ1；p＝0.01，siδ2p＝0.0027)。(L)qPCR和免疫印迹法确认敲除CK1δ而不是CK1ε(n＝3；***，p＜0.0001)。

图2：CK1δ/CK1ε抑制削减体内原位乳腺癌生长。(A)通过随时间推移的发光强度监测CK1δ/CK1ε抑制剂对MDA-MB-231-luc肿瘤的生长和构建的影响。小鼠用SR-3029或载体(10:10:80,DMSO:Tween-80:水)以20mg/kg通过腹腔注射每天处理一次。箭头指示处理开始(每组n＝8；**，p＝0.01)。(B)通过发光测定肿瘤大小和(C)在55天时大体肿瘤大小的比较。示出代表性肿瘤。(D)用如上所示载体(黑线)或SR-3029(蓝线)治疗的小鼠中的指示TNBC肿瘤模型的生长曲线。箭头指示首次给药的时间(每组n＝8-10；**，p＝0.01；***，p＝0.0008)。(E)对于载体或SR-3029治疗的MDA-MB-231肿瘤的连续切片的TUNEL染色(示出代表性图像)(白线标度＝200μm)。(F)对应于(D)中的研究的Kaplan-Meier存活曲线(p值使用对数秩检验计算)。(G)用SR-3029(蓝线)或载体(黑线)每天治疗并持续8周之后的小鼠体重(n＝8-10)。

图3：CK1δ的沉默或抑制引起乳腺癌退化并有效阻断PDX乳腺模型的生长。(A)左图，qPCR确认在用Dox(0.3μg/ml)治疗MDA-MB-231shCK1δ表达细胞72小时之后，有效敲除CK1δ而不是CK1ε转录物(n＝3；***，p＝0.0003)。右图，相应的CK1δ蛋白质表达。(B)用1μg/ml Dox处理表达Dox诱导型CK1δ或非靶向(NT)shRNA的细胞72小时，并用表达抗shRNA的CK1δ或GFR cRNA的载体转染。另外72小时之后，通过台盼蓝排除法测量MDA-MB-231shCK1δ(黑色)和表达非靶向shRNA的细胞(NT-白色)中的细胞死亡百分比(n＝4；***，p＝0.0001)。(C)小鼠+/-Dox中原位MDA-MB-231shCK1δ肿瘤的生长(随意在食物中施用，200mg/kg)，如通过卡尺测量所监控的(每组n＝8；**，p＝0.006)。箭头指示增加Dox。(D)在Dox给药开始7天之后，从三只独立小鼠中分离的肿瘤组织中的CK1δ敲除。(E)人正常乳腺或三个独立的BMC-4013PDX肿瘤的提取物中CK1δ表达的免疫印迹比较。(F)BMC-4013PDX肿瘤在用载体(黑线)或SR-3029(蓝线)处理的小鼠中的生长曲线。箭头指示首次给药的时间(每组n＝12，***，p＝0.0001)。(G)对应于(F)中的研究的Kaplan-Meier存活曲线(p值使用对数秩检验计算)。(H)对于载体或SR-3029治疗的BMC-4013肿瘤的连续切片的TUNEL染色(示出代表性图像)(白线标度＝200μm)。

图4：Wnt/β-连环蛋白途径的调节是CK1δ活性和异质的生物标记。(A)Wnt途径基因显著富集于CK1δ过表达人乳腺中(倍数变化＞2，p值＜0.05)(红色为CK1δ基因)。(B)SR-3029(+)或载体(-)处理(18小时，30nM)对指示的乳腺癌细胞系中的细胞核相对于细胞质β-连环蛋白的作用。(C)用SR-3029或载体处理18小时之后，或用CK1δsiRNA转染后(48小时收获)MB-A-MB-231细胞中的活性β-连环蛋白(ABC)的表达。(D)用增加剂量的SR-3029处理6小时或用1μg/ml Dox处理5天以激活指定shRNA的表达的MDA-MB-231细胞中TCP依赖性萤光素酶活性的抑制(n＝3；*，p＝0.013；***，p＝0.0002)。(E)通过免疫印迹法或qPCR确定CK1δ抑制(左图，用100nM SR3029处理24小时)或敲除(右图，在转染之后48小时)分别对指定蛋白质的表达的影响并且(F)通过免疫印迹法或qPCR确定分别对mRNA的影响(n＝3)。(G)用100nM SR3029处理24小时之后，指定mRNA的表达(n＝3；*，p＜0.05；**,p＜0.01；***,p＜0.001；SFRP1P＝0.0003；WNT3p＝0.001；WNT9A p＝0.0007；MYC p＝0.0271；CCND1p＝0.0054；CD44p＝0.0071)。(H)+/-CK1δshRNA表达(+/-1μg/ml Dox 72小时)，之后用1μg/mlWnt-3a处理3小时的HEK293T细胞中的TCF依赖性荧光素酶活性(***，p＝7.23E-05和5.57E-06，从左到右)。(I)用对照载体或β-连环蛋白的结构活性(核)突变体(S33Y)转染稳定表达TCF依赖性萤光素酶报道基因的HEK293T细胞并在加入重组Wnt-3a之前，+/-SR-3029温育过夜(3小时)(示出3个独立实验的代表；***，p＝0.0004(左)和0.0002(右)。(J)ABC表达的免疫染色(白线标度＝200μm)。(K)用表达非靶向(NT)或β-连环蛋白shRNA的慢病毒感染指定的细胞系后4天的相对生长(n＝3；从左到右；*，p＝0.05，***；p＝0.0009，***，p＝0.001，***，p＝0.001)和相应的西方点墨法(右图)。

图5：CK1δ是人乳腺癌中Wnt/β-连环蛋白信号传导的必要且充分的驱动子。(A)在用空载体或β-连环蛋白S33Y转染的MD A-MB-231细胞中，在+/-SR-3029 72小时之后测量的细胞生长(左)和凋亡(右)(n＝4；*，p＝0.005)。(B)用空载体或β-连环蛋白S33Y转染用Dox处理的MD A-MB-231shCK1δ细胞(4天，1μg/ml)，并且在72小时之后测量细胞数(n＝3；***，p＝0.001)。(C)工程化以过表达CK1δ或GFP的MCF7细胞中核和细胞质β-连环蛋白的表达。底部，归一化为组蛋白H4的核β-连环蛋白表达的量化(n＝3；*，p＝0.02)。(D)过表达CK1δ或GFP的MCF7细胞中ABC的免疫染色(白线标度＝200μm)。(E)MCF7-CK1δ相对于MCF7-GFP细胞的β-连环蛋白靶的qPCR分析(n＝3；**，p＝0.01；***，p＝0.001)。(F)免疫印迹法确认CK1δ过表达和增加的细胞周期蛋白-D1。(G)SR-3029对过表达CK1δ相对于GFP的MCF7细胞的克隆形成生长的影响(n＝6；从左到右；**，p＝0.01，**，p＝0.002)。(H)用β-连环蛋白shRNA慢病毒感染后4天，MCF7-CK1δ相对于MCF7-GFP细胞的生长(n＝3；从左到右；***，p＝0.0006，**，p＝0.004，**，p＝0.001)。右图，免疫印迹法示出CK1δ过表达和敲除β-连环蛋白。

图6：CK1δ是体内Wnt/β-连环蛋白信号传导的驱动子。(A)核和细胞质β-连环蛋白的表达，并且(B)在来自每天用20mg/kg SR-3029相对于载体处理并持续7天的小鼠的MDA-MB-231肿瘤中的指定的mRNA(n＝4；*，p＝0.05，**，p＝0.01，***，p＝0.001)。(C)在第7天，SR-3029对于肿瘤细胞周期蛋白-D1蛋白质表达的作用。右图是量化(n＝3；**，p＝0.01)。(D)肾乳头细胞癌(肾乳头癌)和膀胱癌囊肿(TCGA)中CSNK1D拷贝数扩增的频率。(E)肾乳头细胞癌(n＝172)和膀胱癌(n＝220)中CSNK1D DNA拷贝数和CK1δ表达的相关性。(F)-log₁₀p值示出指定癌症类型的Wnt/β-连环蛋白信号传导途径基因和CK1δ信号列表之间的显著重叠(p＜0.05，倍数变化＞1.5)(红线为信号的阈值，p＝0.05)。

具体实施方式

需要鉴定人癌症的特异性驱动子以指导靶向疗法的开发。在此证明CSNK1D在人类乳腺癌中扩增和/或过度表达，并且CK1δ是过表达该激酶的人乳腺癌亚型的未被利用的弱点。具体地讲，CK1δ的选择性敲除或利用内部高选择性和有效CK1δ抑制剂的治疗在体外激发表达CK1δ的乳腺肿瘤细胞的细胞凋亡，三阴性乳腺癌的原位模型(包括来源于患者的异种移植物)中的有效肿瘤消退和HER2+乳腺癌模型中的肿瘤生长抑制。值得注意的是，示出Wnt/β-连环蛋白信号传导是过表达CK1δ的人肿瘤的标志，其使得CK1δ不能阻断β-连环蛋白的核积累和T细胞因子转录活性，并且结构上激活β-连环蛋白超过了抑制或沉默CK1δ的作用。因此，CK1δ抑制代表Wnt/β-连环蛋白参与的人乳腺癌中用于靶向治疗的有前景的策略。

试图评估CK1δ和/或CK1ε在乳腺癌中作为可利用的弱点的功能作用和潜在的临床相关性。本文中，确定了CK1δ是用于乳腺癌治疗的有前景的靶点，并证实内部的选择性且有效的小分子抑制剂的功效，其对过表达CK1δ的乳腺癌亚型有效。另外，证实在每个主要乳腺癌亚型中，编码CK1δ的基因CSNK1D通常在人乳腺癌的子集中扩增和/或过表达，并且敲除或抑制CK1δ引起来源于患者的异种移植物和TNBC和HER2+乳腺癌的乳腺癌细胞系原位异种移植物模型中乳腺癌的消退。值得注意的是，我们的机制研究已经确立CK1δ活性是乳腺癌中Wnt/β-连环蛋白途径激活的关键驱动子，其是已知与乳腺癌患者的不良预后相关的分子表型

结果将在下文更详细的讨论。本发明提供了抑制酪蛋白激酶1δ(CK1δ)的方法，并且因此提供了治疗乳腺癌的方法，所述方法包括使CK1δ，例如在活患者的组织中与有效量的式(I)的化合物，或更具体地式SR-3029的化合物(其结构如上文所示)接触。

CSNK1D在人乳腺癌的子集中扩增和/或过表达

为评估CK1δ和CK1ε在人乳腺癌中的参与，检查与正常乳房组织相比，每种同种型在人乳腺肿瘤样本中的表达。癌症基因组图谱(TCGA)数据集和独立数据集的分析显示CK1δ(CSNK1D)在浸润性乳腺癌中的高度升高的表达(图1A)。评估CK1同种型在四种主要乳腺癌亚型(Pam50内在分类)(18)中的表达显示CK1δ在各主要类别的肿瘤子集内广泛过表达(图1B)。相比之下，CKlε表达更限于基底样亚类(图1B)并与浸润性乳腺癌不相关。引人惊讶的是，基因拷贝数分析(TCGA)显示在超过三分之一(36％)的人乳腺肿瘤中17q25.3的扩增(高水平和低水平)涉及CSNK1D基因座，并且在管状B(luminal B)和基底样类型(basal-likeclasses)中具有较高的扩增频率。相比之下，CSNK1E基因座在乳腺癌中未扩增(数据未示出)。值得注意的是，增加的CSNK1D拷贝数与CK1δ转录物的表达显著相关(p值<0.0001)，其中与管状A(luminal A)型肿瘤相比，在HER2+、基底样和管状B亚型中观察到增加的相关性(图1C和D)。与这些发现一致，免疫组织化学分析确认CK1δ在人乳腺肿瘤样本中相对于正常乳腺组织过表达并且CK1δ在一组人乳腺癌细胞系中过表达(图1E)。相比之下，在被分析的乳腺癌细胞系中仅3种检测到高CK1ε表达(图1E)，并且在永生化人MCFI OA乳腺上皮细胞以及MCF7和T47D ER+乳腺癌细胞中CK1同种型的表达均较低。

有效的高选择性CK1δ/CK1ε抑制剂选择性抑制乳腺癌细胞生长和存活

最近报道了CK1δ和CK1ε的一系列小分子双重抑制剂的初始结构活性关系(16)。例如，SR-3029(图1F)是具有特殊功效和选择性的ATP竞争性抑制剂，因此构成CK1δ/CK1ε生物学的理想小分子探针。细胞增殖测定显示过表达CK1δ的乳腺癌细胞类型对CK1δ/CK1ε抑制非常敏感，其中EC50在低纳摩尔范围(5-70nM)内。相比之下，MCF7和T47D乳腺癌细胞和MCF10A细胞系，其全部均表达低水平的CK1δ，对SR-3029的敏感性要低2-3个数量级(图1G)。在克隆形成生长测定中确认了过表达CK1δ的乳腺癌细胞的这种选择性，其中SR-3029完全阻断了克隆形成生长和MDA-MB-231细胞的存活，但对MCF7乳腺癌细胞的集落形成能力没有影响(图1H)。最后，FACS分析确定SR-3029治疗选择性激发CKIδ过表达乳腺癌细胞的快速凋亡(图1I)。

确认SR-3029的抗癌作用是由于CK1δ和/或CK1ε的靶向抑制。首先，CK1δ的强制过表达要求MDA-MB-231TNBC细胞相对于GFP表达对照的克隆形成生长，并足以拯救SR-3029的生长抑制效应(图1J)。其次，CK1δ和CK1ε同时敲除或仅CK1δ沉默触发细胞凋亡并损害MDA-MB-231细胞的生长(图1K,L)。这种效应是特异性的，因为siRNA抗性CK1δcDNA的表达有效地拯救了CK1δ沉默的生长抑制效应。值得注意的是，仅敲除CK1ε对MDA-MB-231细胞生长和存活没有影响。最后，研究是否存在任何潜在的脱靶效应。SR-3029仅抑制1％的激酶，并且除了CK1δ和CKlε之外，还仅对三种激酶的具有较弱亲和力(CDK4、MYLK4和FLT3)(16)。当然，只有FLT3是SR-3029及其接近类似物SR-2890和SR-1277(其全部均示出对人癌细胞，包括MDA-MB-231TNBC细胞的相似的抗增殖活性)的常见(且较弱的)脱靶(16)。相比之下，这些细胞对AC220(FLT3和FLT3突变体的低纳摩尔抑制剂)不敏感。总之，这些发现构建CK1δ作为某些乳腺癌细胞的生长和存活所需的SR-3029的生物学相关靶点。

CK1δ的沉默或抑制引发体内的有效抗肿瘤作用

SR-3029表现出适合于体内研究的药代动力学特性(16)。因此，测试SR-3029在前临床肿瘤模型中的功效。工程化以表达萤火虫萤光素酶的MDA-MB-231TNBC细胞被移植到免疫缺陷裸鼠的乳房脂肪垫中，并且在七天后开始治疗。单一试剂SR-3029(每天腹腔注射20mg/kg)显著削弱肿瘤生长(图2A,B)。事实上，只有2个经历SR-3029治疗的受体发生肿瘤，并且这些肿瘤的尺寸与载体治疗的小鼠中出现的那些相比令人惊讶的小(图2B,C)。接着，在治疗之前，允许原位MDA-MB-231、MDA-MB-468(TNBC)、SKBR3和BT474(HER2+)肿瘤异种移植物达到100mm³的平均尺寸。在所有异种移植模型中每天腹腔注射施用SR-3029(20mg/kg)引发显著的肿瘤生长抑制。值得注意的是，侵袭性MDA-MB-231肿瘤的消退与暴发性细胞凋亡(图2E)和显着延长的寿命(图2F)相关。此外，通过组织化学分析体重、血液化学和组织完整性显示，SR-3029长期每天给药(48天)耐受性良好；没有明显毒性(图2G)。

为了确认CK1δ抑制对体内肿瘤生长削弱的影响，将MDA-MB-231细胞工程化以稳定表达针对CK1δ(MDA-MB-231-shCK1δ)的多西环素(Dox)诱导型shRNA。用Dox体外处理这些细胞导致了CK1δ的有效且选择性的敲除和快速的细胞凋亡/细胞生长抑制，并且该效应由shRNA抗性CK1δ的外源性表达获得(图3A,B)。在构建MDA-MB-23l-shCK1δ肿瘤(>100-mm³)的原位异种移植物之后，施用Dox并且诱导性敲除CK1δ导致肿瘤生长的显著抑制，这与SR-3029获得的结果一致(图3C,D)。还评估了SR-3029对来源于原发性患者的异种移植物(PDX)模型，BCM-4013的生长的影响；所述模型是侵袭型基底样浸润性导管癌，具有对达沙替尼和多西他赛的治疗有限应答。值得注意的是，这种稳定传代的PDX的组织学和分子谱概述了原发性肿瘤的许多特征，包括对治疗的应答(19)。

体内扩展BCM-4013PDX模型后，建立原位肿瘤，测试CK1δ的表达(图3E)，并进行功效研究。根据细胞系模型，施用SR-3029(20mg/kg每天腹腔注射)显著抑制这些PDX肿瘤的生长并引发肿瘤细胞凋亡(图3F-H)(p＝0.0002)。这些研究确定了CK1δ表达预测对SR-3029的敏感性，并指示CK1δ是与人类疾病潜在相关的有效的乳腺癌靶点。

Wnt/β-连环蛋白信号传导是CK1δ表达乳腺腺癌的标志

为定义由CK1δ在人乳腺癌中调节的途径并鉴定CK1δ抑制的潜在生物标记，分析TCGA患者肿瘤数据集中与CK1δ过表达相关的基因标记。鉴定出612个基因，其表达与CK1δ表达显著相关(倍数变化>2；p值<0.05)，并且Ingenuity Pathway Analysis(IPA)鉴定出与标准Wnt途径的基因，包括Wnt/β-连环蛋白靶(CCND1)、Wnt途径组分(FZD9)和途径的内源性调节剂(WNT3，WNT9A和SFRP1)(分泌的卷曲相关蛋白1)的显著重叠(图4A)。

重要的是，虽然激活的Wnt/β-连环蛋白信号传导与较差临床结果相关，但其它癌症类型的经典途径激活突变在乳腺癌中很少见(20,21)。这些发现表明CK1δ是人乳腺肿瘤形成中Wnt途径的重要激活因子并且受该途径调节的基因可潜在地用作CK1δ抑制剂的进一步临床前和临床开发所需的生物标记。

CK1δ和CKlε在发育和疾病中的作用归因于Wnt依赖性和独立性作用(10,15,22,23)。此外，经典Wnt/β-连环蛋白途径的活化对CKlδ/CKlε的需要在细胞类型和环境特异性情况下是有争议的(13,22)。因此评估了CK1δ抑制对于在CK1δ表达乳腺癌细胞中的β-连环蛋白活性的影响。Wnt信号传导的激活导致β-连环蛋白的稳定化和核转位，其与TCF/LEF转录因子一起诱导与乳腺癌肿瘤形成相关的下游靶基因的表达(24-26)。用SR-3029治疗(CK1δ过表达)MDA-MB-231、MDA-MB-436、MDA-MB-468和BT474乳腺癌细胞显著降低β-连环蛋白的活性核库的表达(图4B)。此外，CK1δ敲除或SR-3029治疗导致β-连环蛋白的未磷酸化活性形式减少(ABC，图4C)，并且显著减少内源性β-连环蛋白/TCF转录活性，如在稳定表达TCF依赖性的荧光素酶报告基因中的MDA-MB-231细胞中测得的(图4D)。因此，CK1δ的选择性敲除或由SR-3029进行的抑制抑制了内源性β-连环蛋白/TCF靶基因(包括CCND1、MYC、CD44以及WNT3和WNT9A)的表达，这些基因全部与人肿瘤中的CK1δ表达相关(图4E,F)。此外，SR-3029治疗还导致内源性Wnt拮抗剂SFRP1的表达显著增加，但对Notch途径mRNAs(JAG1、NUMB、DTX)没有影响(图4G)，所述途径是乳腺癌发病机制有密切关系的附加的途径(27)。

为测试对CK1δ/CKlε的抑制是否足以响应Wnt配体而关闭经典Wnt信号传导，形成稳定表达TCF依赖性荧光素酶报告基因的HEK293T细胞。如所预测的，通过用SR-3029或CK1δ敲除处理废除了TCF报告基因的Wnt-3a指导诱导(图4H和I)。此外，β-连环蛋白组成型活性(核)突变体(S33Y)(28)的强制表达增加了TCF报告基因活性，并且这对SR-3029的抑制作用是难治性的(图4I)。因此，抑制CK1δ足以阻断人乳腺癌细胞中活化的β-连环蛋白信号传导以及通过经典信号传导的途径的Wnt诱导活化。

为评估受损的Wnt/β-连环蛋白信号传导对CK1δ抑制敏感的人乳腺癌细胞亚型的肿瘤形成生长的影响，在MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞中表达β-连环蛋白shRNA。这些细胞类型中的每一种均表达高水平的核β-连接蛋白(图4J)，并依赖于维持细胞生长和存活的β-连环蛋白(图4K)。相比之下，表达很少至不表达核β-连环蛋白的MCF7细胞对β-连环蛋白敲除不敏感，这与其CK1δ低表达和对SR-3029的相对不敏感性一致(图4K)。为更直接评估受损的β-连环蛋白信号传导在靶向CK1δ的抗肿瘤活性中的作用，利用两种组成性活化的β-连环蛋白突变体。β-连环蛋白-S33Y，或NH₂封端组成型活性突变体(β-连环蛋白N90)的强制表达足以挽救SR-3029或CK1δ敲除在MDA-MB-231细胞中的生长抑制剂和细胞凋亡作用(图5A,B)。因此，CK1δ控制乳腺癌细胞生长和存活所必需的β-连环蛋白活性。

相对于MDA-MB-231细胞，MCF7ER+乳腺癌细胞表达低水平的CK1δ(图1E)，具有减少的活性(核)β-连环蛋白表达，是SR-3029难治性的(图1G)，并且相对于其它人肿瘤癌细胞具有有限的致瘤潜能(29-31)。值得注意的是，工程化以过表达CK1δ的MCF7细胞显示出核β-连接蛋白(图5C,D)和下游Wnt靶基因(包括CCND1、CD44、WNT3和WNT9A)(图5E,F)的增加的表达。另外，在短期和长期生长测定中(图5G)，CK1δ的强制过表达增强MCF7细胞的克隆形成生长并使它们对SR-3029敏感。值得注意的是，β-连环蛋白的敲除足以削弱外源性CK1δ驱动的MCF7细胞生长(图5H)，从而证实Wnt/β-连环蛋白途径在CK1δ的生长促进活性中的关键机制作用。

为了评估CK1δ抑制是否会削弱体内Wnt/β-连环蛋白信号传导和该途径的调节是否代表预测性生物标记，分析从用20mg/kg SR-3029或载体(每天一次，腹腔注射给药)处理的小鼠分离的MDA-MB-231肿瘤的活化β-连环蛋白信号传导的标志物。与载体处理的对照相比，来源于SR-3029处理的小鼠的肿瘤中核β-连环蛋白的表达显著降低(图6A)，并且这与CCND1、WNT3、WNT9A和RARA mRNA转录物的减少以及与SFRP1转录物的表达显著增加相关(图6B)。此外，来源于经SR-3029处理的小鼠的肿瘤以及经受CK1δ的Dox诱导沉默的那些肿瘤中在蛋白质水平观察到CCND1的下调(图6C)。最后，因为已知Wnt/β-连环蛋白信号传导在再生组织的稳态中起关键作用，评估长期SR-3029治疗对小肠完整性的影响。值得注意的是，H&E染色显示没有大体形态学缺陷，并且TUNEL染色未能检测到凋亡迹象，这与在相应肿瘤中观察到的相反(图2E)。

总之，这些发现建立了激活CK1δ-至-β-连环蛋白途径和对SR-3029敏感性之间的联系，并且表明该途径的特征将限定将响应于该靶向疗法的肿瘤。值得注意的是，附加TCGA癌症数据集的分析显示超过70％的乳头状肾细胞癌患者和近50％的膀胱癌患者中的CSNK1D拷贝数扩增(高和低)，并且这些肿瘤中的基因扩增也与增加的CK1δ表达相关(图6D,E)。值得注意的是，在两种癌症类型中，在CK1δ基因标志列表和Wnt途径基因之间存在显著重叠(CK1δ高相对于CK1δ低，p<0.05，倍数变化1.5)(图6F)。因此，CK1δ-至-β-连环蛋白信号传导循环可能是一系列人类恶性肿瘤中未被利用的弱点。

鉴定人乳腺癌的特异性驱动子已经指导了靶向疗法的开发，诸如用于治疗HER2扩增的乳腺癌的曲妥珠单抗和用于治疗ER+乳腺癌的激素疗法，并且这些靶向药物已经改善了这些疾病的存活和临床管理(32)。相比之下，患有复发性疾病的患者和患有TNBC的那些患者缺少靶向治疗并且代表了迫切未得到满足的临床需求。本文提供的数据表明CK1δ是具有高度吸引力的治疗靶点，其对于异常表达CK1δ的HER2+和TNBC乳腺癌患者具有潜在有益效果。

迄今为止，CK1δ在人癌症中的作用人们所了解的很少，并且现有的CK1δ小分子调节剂缺乏验证CK1δ作为抗癌靶所需的功效和/或选择性(9,13-15,33)。例如，用于几项研究中的探针分子IC261随后显示不是通过抑制CK1δ/CK1ε起作用，而是通过阻断微管蛋白功能起作用(13)。此外，使用CK1δ/CK1ε双重抑制剂PF670462的研究已经示出其缺乏抗癌活性(13,14)，并且这可能是由于针对多种激酶(包括具有促生素活性的多种激酶)的重要的脱靶活性(16)。相比之下，小分子抑制剂(SR-3029)在人乳腺癌的多种临床前模型中是高度选择性的、有效力的(16)和有功效的。此外，发现证实，CK1δ的过表达预测乳腺癌的基于细胞的模型中对SR-3029的敏感性，从而表明对于CK1δ的依赖性是细胞类型和环境特异性

CK1δ的过表达(其在四种主要乳腺癌亚型的每一种中广泛分布)可因此鉴定将响应于该靶向治疗策略的肿瘤。需要进一步研究更广谱的来源于患者的肿瘤样品以充分研究该假设。

人类癌症中以高频率普遍存在Wnt途径的阳性(β-连环蛋白)和阴性(APC、AXIN1等)调节组件的获得性和丧失性功能突变(由(34)综述)。相比之下，虽然Wnt途径的异常激活在乳腺癌中很频繁(21,35,36)，但这些恶性肿瘤中Wnt途径组分的突变很少(20,21,37)。在此已经示出，CK1δ-至-β-连环蛋白信号传导在人乳腺癌子集中被激活，其中CK1δ的沉默或药理学抑制足以使β-连环蛋白失活并引起乳腺癌细胞凋亡。因此，发现表明CK1δ作为关键靶激酶，可被利用(例如通过SR-3029)以抑制多种乳腺癌亚型中出现的异常Wnt/β-连环蛋白信号传导。以前的报道描述了CK1δ起重要作用的多种途径(23,33)。因此，虽然SR-3029的抗乳腺癌活性明确靶向Wnt/β-连环蛋白信号传导，但附加效应子可有助于其在体内的显著抗肿瘤活性。

总体而言，本文示出的发现将CK1δ鉴定为有效的治疗靶标，其在选择的癌症子集中具有很大的临床相关性潜力，所述癌症子集包括但不限于乳腺癌，其中CK1δ是：(i)经由扩增和/或过表达激活；(ii)这些肿瘤亚型中β-连环蛋白活性的必要驱动子；和(iii)人乳腺癌的细胞和临床前模型的生长和存活所必需的。

因此，在各种实施方案中，本发明可提供抑制酪蛋白激酶1δ(CK1δ)的方法，所述方法包括使CK1δ与有效量或有效浓度的式(I)化合物接触。

其中：

每个R独立地选自氢或(C₁-C₆)烷基，或者键合到氮原子的两个R基团与氮原子一起能形成5-7元杂环，其任选地还包含选自O、S和NR’的1或2个杂原子，其中R’是氢或(C₁-C₆)烷基；

Ar¹为芳基或5元或6元杂芳基，其是未经取代的或被1-3个独立选择的卤素、(C₁-C₆)烷基、(C₁-C₆)氟烷基、(C₁-C₆)烷氧基、氰基、硝基、C(＝O)NR₂、OC(＝O)NR₂、N(R)C(＝O)OR、N(R)C(＝O)R、或C(＝O)OR取代；

Het¹是单环或双环杂芳基，其是未经取代的或被1-3个独立选择的卤素、(C₁-C₆)烷基、(C₁-C₆)氟烷基、(C₁-C₆)烷氧基、氰基、硝基、C(＝O)NR₂、OC(＝O)NR₂、N(R)C(＝O)OR、N(R)C(＝O)R、或C(＝O)OR取代；

或其药学上可接受的盐。

在各种实施方案中，本发明还提供一种治疗癌症的方法，所述方法包括向患有所述癌症的患者施用有效剂量的式(I)的化合物

其中：

每个R独立地选自氢或(C₁-C₆)烷基，或者键合到氮原子的两个R基团与氮原子一起能形成5-7元杂环，其任选地还包含选自O、S和NR’的1或2个杂原子，其中R’是氢或(C₁-C₆)烷基；

Ar¹为芳基或5元或6元杂芳基，其是未经取代的或被1-3个独立选择的卤素、(C₁-C₆)烷基、(C₁-C₆)氟烷基、(C₁-C₆)烷氧基、氰基、硝基、C(＝O)NR₂、OC(＝O)NR₂、N(R)C(＝O)OR、N(R)C(＝O)R、或C(＝O)OR取代；

Het¹是单环或双环杂芳基，其是未经取代的或被1-3个独立选择的卤素、(C₁-C₆)烷基、(C₁-C₆)氟烷基、(C₁-C₆)烷氧基、氰基、硝基、C(＝O)NR₂、OC(＝O)NR₂、N(R)C(＝O)OR、N(R)C(＝O)R、或C(＝O)OR取代；

或其药学上可接受的盐。

例如，式(I)的化合物可以为：

或其药学上可接受的盐。

可用有效量的式(I)化合物治疗的癌症可以为具有上调的CK1δ和β-连环蛋白的表达水平的癌症。例如，所述癌症可以为乳腺癌、黑素瘤、成胶质细胞瘤、成神经管细胞瘤、肾癌、膀胱癌或结肠癌、或可以为转移至脑、肺或骨的癌症，前提条件是升高的CK1δ和β-连环蛋白依赖性都参与这些癌细胞转移的疾病。例如，所述乳腺癌可以为三阴性亚型乳腺癌(TNBC)或HER+乳腺癌。

因此，本发明可提供根据权利要求1所述的式(I)化合物用于治疗癌症，诸如其中化合物为SR-3或其药学上可接受的盐。

可用有效剂量的式(I)化合物治疗的癌症可以为乳腺癌、黑素瘤、成胶质细胞瘤、成神经管细胞瘤、肾癌、膀胱癌或结肠癌、或可以为转移至脑、肺或骨的癌症，前提条件是升高的CK1δ和β-连环蛋白依赖性参与这些癌细胞转移的疾病。例如，所述乳腺癌可以为三阴性亚型乳腺癌(TNBC)或可以为HER+乳腺癌。

本发明还公开了特别容易用CK1δ抑制剂治疗的癌症是具有上调的CK1δ和β-连环蛋白表达水平的癌症。因此，在各种实施方案中，本发明提供了鉴定有效治疗患者癌症的抗癌药物的方法，所述方法包括测定患者中的CK1δ水平和β-连环蛋白水平并且如果两者水平都升高则选择CK1δ抑制剂作为抗癌药物。另外，本发明可以提供治疗患有乳腺癌、黑素瘤、成胶质细胞瘤、成神经管细胞瘤、肾癌、膀胱癌或结肠癌、或为转移至脑、肺或骨的癌症的方法，所述方法包括确定患者是否存在升高的CK1δ和β-连环蛋白水平，并且如果两者水平均升高，则选择CK1δ抑制剂以用于治疗方案。CK1δ水平和β-连环蛋白水平可使用本领域普通技术和知识结合本文所公开的主题物质来测定。如果其在身体组织中的浓度在统计学上显著高于相当患者的平均水平，则认为患者的CK1δ和β-连环蛋白水平是“升高的”。

本文含义中的“正治疗”或“治疗”是指减轻与障碍或疾病相关的症状，或抑制这些症状的进一步发展或恶化，或防止或预防疾病或病症，或治愈疾病或病症。类似地，如本文所用，本发明化合物的“有效量”或“治疗有效量”是指全部或部分减轻与障碍或病症相关的症状，或暂停或减缓这些症状的进一步发展或恶化，或预防或提供对障碍或病症的预防的化合物的量。特别地讲，“治疗有效量”是指在实现期望的治疗结果必要的剂量和时间段下有效的量。治疗有效量也是其中治疗有益效果超过本发明化合物的任何毒性或有害作用的量。

表述“有效量”当用于描述患有疾病的个体的治疗时，是指有效抑制或以其它方式作用于其中CK1δ参与疾病如乳腺癌的个体组织中的CK1δ的本发明化合物的数量或浓度，其中此类抑制或其它作用在足以产生有益治疗效果的程度上发生。

在合成方法的背景中，本文中使用的短语诸如“在适于提供……的条件下”或“在足以产生……的条件下”等是指在实验者的普通技术范围内可以改变以提供反应产物的有用量或收率的反应条件，诸如时间、温度、溶剂、反应物浓度等。不必要期望的反应产物是唯一的反应产物或者原料完全消耗，前提条件是期望的反应产物可被分离或以其它方式进一步使用。可根据文献程序结合有机合成中的普通知识和技术制备可用于本发明实践的化合物。

除非特别指出具体立体化学或异构体形式，否则结构的所有单一对映异构体、非对映异构体和外消旋形式都是预期的。在多种情况下，尽管在具体要求保护的化合物中描述了各个立体异构体，但立体化学名称并不意味着另选的异构体形式不是优选的、不期望的或不受保护的。用于本发明的化合物可以任何富集度包括在任何或所有不对称原子处富集或拆分的光学异构体，如由描述中显而易见的。外消旋混合物和非对映混合物两者，以及各个光学异构体可分离或合成以便基本上不含它们的对映体或非对映体配偶体，并且这些都在本发明的范围内。

如本文所使用的，术语“稳定的化合物”和“稳定的结构”意指足够稳健的以经受从反应混合物中分离至有用纯度并配制成有效治疗剂的化合物。本文仅考虑稳定的化合物。

当基团例如烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基等中的碳原子数被规定为一个范围时，意指每个独立的整数表示所述碳原子数。例如，(C₁-C₄)烷基的引用指示烷基基团可以是甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲丁基、异丁基或叔丁基中的任一种。应当理解碳原子数的规格必须是整数。

一般来讲，“取代的”是指如本文定义的有机基团，其中对其中所含的氢原子的一个或多个键被一个或多个对非氢原子的键取代，非氢原子例如但不限于卤素(例如F、CI、Br或I)；诸如羟基基团、烷氧基基团、芳氧基基团、芳烷氧基基团、氧(羰基)基团，羧基基团，包括羧酸、羧酸盐、和羧酸酯之类的基团中的氧原子；诸如巯基、烷基和芳基硫化物基团、亚砜基团、砜基团、磺酰基基团和磺酰胺基团之类的基团中的硫原子；诸如胺、羟胺、腈、硝基基团、亚硝基基团、N-氧化物、酰肼、叠氮化物和烯胺之类的基团中的氮原子；以及各种其它基团中的其它杂原子。可键合到取代的碳(或其它)原子的取代基的非限制示例包括F、Cl、Br、I、OR、CN、NO、NO₂、ONO₂、叠氮基、CF₃、OCF₃、O(氧)、S(硫)、亚甲二氧基、亚乙二氧基、N(R)₂、SR、SOR、SO₂R、SO₂N(R)₂、SO₃R、C(O)R、C(O)C(O)R、C(O)CH₂C(O)R、C(S)R、C(O)OR、OC(O)R、C(O)N(R)₂、OC(O)N(R)₂、C(S)N(R)₂、(CH₂)_0-2N(R)C(O)R、(CH₂)_0-2N(R)N(R)₂、N(R)N(R)C(O)R、N(R)N(R)C(O)OR、N(R)N(R)CON(R)₂、N(R)SO₂R、N(R)SO₂N(R)₂、N(R)C(O)OR、N(R)C(O)R、N(R)C(S)R、N(R)C(O)N(R)₂、N(R)C(S)N(R)₂、N(COR)COR、N(OR)R、C(＝NH)N(R)₂、C(O)N(OR)R或C(＝NOR)R，其中R可以为氢或基于碳的部分，并且其中所述基于碳的部分本身可被进一步取代；例如，R可以为氢、烷基、酰基、环烷基、芳基、芳烷基、杂环己、杂芳基或杂烷基芳基，其中任何烷基、酰基、环烷基、芳基、芳烷基、杂环基、杂芳基或杂芳基烷基可进一步独立地被上述列出的官能团中的一些或全部或被其它官能团单取代或多取代；或其中键合到氮原子或邻近氮原子键合的两个R基团可与一个或多个氮原子一起形成杂环，其可进一步被上文列出的官能团中的一些或全部或被其它官能团单取代或独立地多取代。

在各种实施方案中，取代基可以为卤素、硝基、氰基、OR、NR₂或R，或为C(O)OR、C(O)NR₂、OC(O)OR、OC(O)NR₂、N(R)C(O)OR、N(R)C(O)NR₂或其硫/硫代类似物。关于包含O的基团，所谓“其硫/硫代类似物”是指基团中的任何或所有O原子可由S原子取代；例如，就基团C(O)OR而言，“其硫/硫代类似物”包括C(S)OR、C(O)SR和C(S)SR；例如就基团OC(O)NR₂而言，“其硫/硫代类似物”包括SC(O)NR₂、OC(S)NR₂和SC(S)NR₂等。

在各种实施方案中，取代基可以为下列中的任一种：卤素、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基、羟基(C1-C6)烷基、烷氧基(C1-C6)烷基、(C1-C6)链烷醇基、(C1-C6)链烷醇基氧基、氰基、硝基、叠氮基、R₂N、R₂NC(O)、R₂NC(O)O、R2NC(O)NR、(C1-C6)烯基、(C1-C6)炔基、(C6-C10)芳基、(C6-C10)芳氧基、(C6-C10)芳酰基、(C6-C10)芳基(C1-C6)烷基、(C6-C10)芳基(C1-C6)烷氧基、(C6-C10)芳氧基(C1-C6)烷基、(C6-C10)芳氧基(C1-C6)烷氧基、(3元至9元)杂环基、(3元至9元)杂环基(C1-C6)烷基、(3元至9元)杂环基(C1-C6)烷氧基、(5元至10元)杂芳基、(5元至10元)杂芳基(C1-C6)烷基、(5元至10元)杂芳基(C1-C6)烷氧基、或(5元至10元)杂芳酰基。

烷基基团包括具有1至约20个碳原子，并且典型地1至12个碳，或在一些实施方案中1至8个碳原子或1至4个碳原子的直链和支链的基于碳的基团。直链烷基基团的示例包括具有1至8个碳原子的那些，例如甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基、正己基、正庚基和正辛基。支链烷基基团的示例包括但不限于异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基、新戊基、异戊基和2,2-二甲基丙基基团。如本文所使用的，术语“烷基”涵盖正烷基、异烷基和反异烷基以及烷基的其它支链形式。

除非另有说明，否则术语“卤代”或“卤素”或“卤素”本身或作为另一取代基的一部分是指氟、氯、溴或碘原子，优选氟、氯或溴。

术语“氟烷基”包括单氟和多氟烷基基团；示例包括CF₃、C₂F₅等。

术语“烷氧基团”或“烷氧基”是指连接到烷基基团，包括连接到如上所述的环烷基基团的氧原子。直链烷氧基的示例包括但不限于甲氧基、乙氧基、正丙氧基、正丁氧基、正戊氧基、正己氧基等。支链烷氧基的示例包括但不限于异丙氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、异戊氧基、异己氧基等。示例性烷氧基基团包括但不限于，1-6个或2-6个碳原子的烷氧基基团，在本文中分别称为C_1-6烷氧基和C_2-6烷氧基基团。示例性烷氧基基团包括但不限于甲氧基、乙氧基、异丙氧基等。

芳基基团是在环中不含杂原子的环状芳族烃。如本领域众所周知的，芳族化合物是含有4n+2π个电子的多不饱和环状体系，其中n是整数。因此芳基基团包括单环和多环环系统。在一些实施方案中，芳基基团在所述基团的环部分中含有约6至约14个碳。芳基基团可以是未经取代的或经取代的，如上定义。代表性的经取代的芳基基团可以是经单取代的或经多于一次取代的，诸如但不限于经2-、3-、4-、5-或6-取代的苯基或经2-8取代的萘基基团，其可以被如上文所列出的碳或非碳基团取代。

杂环基基团或术语“杂环基”包括含有3个或更多个环成员的芳族和非芳族环化合物，其中一个或多个环原子是杂原子，诸如但不限于N、O和S。因此，杂环基可以是环杂烷基或杂芳基，或者如果是多环的，则可以是任何组合。在一些实施方案中，杂环基基团包含3至约20个环成员，然而其它此类基团具有3至约15个环成员。

杂芳基是包含5个或更多个环成员的杂环芳族环化合物，其中一个或多个为杂原子，诸如但不限于N、O和S；例如，杂芳基环可具有5至约8-12个环成员。杂芳基基团是具有芳族电子结构的多个杂环基基团，其为包含4n+2π电子的多不饱和环状体系，其中n是整数。

术语“药学上可接受的盐”是指具有在提供用于药物应用的范围内的毒性特征的盐。然而，药学上不可接受的盐具有诸如高结晶度的特性，其在实施本发明时具有实用性，例如在合成、纯化或配制本发明化合物的过程中的实用性。“药学上或药理学上可接受的”包括分子实体和组合物，其在视情况施用于动物或人时，不产生不利的、过敏的或其它不良反应。对于人给药而言，制剂应满足FDA生物制品标准局要求的无菌性、热原性和一般安全性和纯度标准。

评价本文所公开和要求保护的任何化合物在抑制CK1δ方面以及在使用上述程序或存在于科学文献中的各种细胞测定中的有效性，是在常规技术范围内。因此，本领域普通技术人员可制备和评价任何所要求保护的化合物但不进行不适当的实验。

发现是CK1δ的有效抑制剂的任何化合物同样可使用研究者的技能和经验在动物模型和人体临床研究中进行测试，以指导剂量和治疗方案(例如用于治疗乳腺癌)的选择。

用于实施本发明方法的化合物可基于文献程序，使用合成有机化学家的常规知识和技能制备，所述文献程序包括由本文某些发明人公布的PCT专利申请“WEE1DegradationInhibitors"”的那些，序列号PCT/US2013/027784、WO2013/130461，其公开内容以引用方式全文并入本文。

实施例

研究设计

本研究旨在评估CK1δ和CK1ε在人乳腺癌中的参与，并研究内部高特异性的双重CK1δ/CK1ε抑制剂在人乳腺癌的前期临床模型中的功效。使用五种人原位乳房异种移植模型，药理学和遗传学研究来验证靶向过表达该激酶的乳腺癌亚群中的CK1δ。功效分析表明，基于各组间的肿瘤体积差异以及各组内的肿瘤体积的标准偏差(置信度为90％)，需要n为至少7或更大。因此，实验包括每个实验或对照(载体)组7-12只荷瘤小鼠，其中在处理之前将小鼠随机化以确定随机取样，使得组之间的中值肿瘤大小相同。在整个实验过程中测量所有的肿瘤大小，并绘于图中但不排除任何样品。对于存活分析，当濒死时和/或当肿瘤变得溃烂或达到大于1.2cm³时使小鼠安乐死。所有基于细胞的测定一式三份进行并重复至少3次。

小鼠的异种植入物模型和生物发光图像

所有动物研究均由Scripps Florida IACUC批准。通过将2×10⁶个癌细胞注射到6周龄雌性无胸腺裸鼠(Charles River Laboratories)的乳房脂肪垫中来构建稳定的MDA-MB-231-Luc、MDA-MB-231、MDA-MB-468、SKBR3或BT474细胞库。如本文所述构建来源于BCM-4013患者的异种移植物(19)。简而言之，将新鲜的异种移植肿瘤片段(～1mm³)移植到受体SCID/Bg小鼠(Charles River Laboratories)的经清洗的乳房脂肪垫中。用SR-3029或载体(10:10:80，DMSO：Tweeo-80：水)以每天20mg/kg腹腔注射来处理小鼠。在皮下注射荧光素(15mg/ml，Goldbio Technology)之后，使用卡尺或通过使用IVIS 100成像仪(暴露时间1-60秒；装仓8；视场15cm；f/停止1；开放式过滤器)发光成像，按指定的时间间隔来测量肿瘤体积。使用Living-Image(Xenogen)分析软件从感兴趣的肿瘤区域(ROI)确定平均辐射度(p/s/cm²/sr)。

细胞增殖和克隆形成测定

根据制造商的说明使用Cell-Tteter Glo(Promega)在SR-3029或载体治疗后72小时测量细胞增殖。使用非线性回归和四参数算法(GraphPad Prism5)测定EC₅₀值。对于克隆形成测定，将细胞以每孔500-1000个细胞的密度一式三份接种在6孔板中。温育过夜后，将SR-3029或载体(DMSO)加入培养基中72小时，使细胞生长7-10天，期间在化合物不存在的情况下每2-3天更换一次培养基。将菌落固定在4％多聚甲醛/PBS中并在室温下用0.5％亚甲蓝的50％乙醇溶液染色1小时并用水脱色。使用低倍光学显微镜计数具有大于50个细胞的菌落。

试剂、细胞系和转染

除非另有说明，否则所有化学品均购自Sigma Aldrich。MDA-MB-231、MDA-MB-436、MDA-MB-468、HS578T、BT474、SKBR3、MDA-MB-453、MCF4和T47D乳腺癌细胞和永生化MCF-10A乳腺上皮细胞来自美国典型培养物保藏中心(ATCC)。对于CK1δ和CK1ε敲除，根据制造商的说明(Qiagen)制备siRNA双链体，并使用HiPerfect转染试剂(Qiagen)优化特异性敲除条件。使用最终浓度为20nM的总siRNA来实现敲除。按照制造商的说明将FuGene6(Roche)用于DNA转染。

慢病毒转导

按照制造商的推荐(System Biosciences)，将表达CK1δ(Y3989-Lv105-0200，GeneCopoeia)、GFP(EGFP-Lv105-0200，GeneCopoeia)、萤光素酶或TCP报告基因7TFP(Addgene，Roel Nusse)的慢病毒载体与pPACKH共转染，将质粒包装到HEK293T细胞以产生慢病毒颗粒。为稳定表达特异性shRNA，使用推荐的方案将shRNA寡核苷酸克隆到Tet-pLKO-Puro载体中(38)，并且使用Mission Packaging System(Sigma)形成慢病毒。用优化滴度的慢病毒转导MDA-MB-231细胞，并在含有嘌呤霉素(1μ/ml)或杀稻瘟菌素(5μg/ml)的培养基中选择经感染细胞以扩增稳定感染的库。

免疫印迹法

使用NuPAGE 4-12％Bis-Tris凝胶(Invitrogen)进行SDS-PAGE凝胶电泳，并使用转染印迹转移培养基(Biorad)通过半干转移将其转移至PVDF膜上。在Odyssey封闭缓冲液(LI-COR Biosciences)中封闭膜并在4℃下与一级抗体温育过夜。用TBST(20mM Tris，pH7.6，140mM NaCl和0.1％Tween-20)重复洗涤后，印迹与合适的IRDye-共轭二抗(LI-CORBiosciences)一起温育并使用LI-COR Odyssey成像。使用Odyssey软件(LI-CORBiosciences)对条带进行定量。在该研究中使用以下抗体：CK1δ和组蛋白H4(Abcam)、CKlε、c-Myc(9E60)、细胞周期蛋白-D1和β-肌动蛋白(Santa Cruz)、β-连环蛋白(CellSignaling)、GAPDH(Millipore)和CD44(R&D Systems)。

定量实时PGR

使用RNeasy Plus Mini Kit(Qiagen)获得总RNA，并用Superscript III FirstStrand Synthesis System(Life Technologies)反转录1-2μg的RNA。使用Power SYBR Green PGR主混合机(Life technologies)和ABI7900HT Fast实时PGR系统进行定量FCR。使用Primer3算法设计内含子跨基因特异性引物对，并通过使用^△△C_t法对GAPDH mRNA表达归一化获得每种感兴趣基因的相对表达值。

免疫细胞化学和H&E染色

对于冷冻切片中的细胞凋亡检测，将肿瘤和小肠固定在10％缓冲福尔马林中2小时，在20％蔗糖中温育过夜并包埋在OCT中。根据制造商说明(CHEM1CON)，使用ApopTag红原位试剂盒将冷冻切片(5μM)固定并染色。对于H&E染色，将组织在10％福尔马林缓冲液中固定48小时，转移至70％乙醇/PBS中并包埋于石蜡中。在去石蜡化后(AML Laboratories)对5μM切片进行染色。

流式细胞术

将6孔培养皿中一式三份接种的2×10⁵个细胞与SR-3029或载体一起培养72小时。然后收集细胞并根据制造商的说明书，使用膜联蛋白V-FITC凋亡检测试剂盒(Bio Vision)用膜联蛋白V-FITC和PI染色并使用LSRI II流式细胞分析仪(Becton Dickinson)分析。星形孢菌素(细胞信号传导)处理的细胞(1μM)用作阳性/补偿对照。

TCF报告基因测定

用β-连环蛋白-S33Y或空载体(pcDNA)转染稳定表达TCF萤光素酶报告基因7TFP(39)的MDA-MB-231或HEK293细胞。在18小时后，将细胞以6000个细胞/孔的密度接种到96孔板上。在24小时后，用SR-3029或载体处理细胞并温育6小时，然后加入1μg/ml重组人Wnt3a(R&D Systems)或PBS。3小时后，使用BriteLite Pius(Perkin Elmer)进行报告基因测定，其等体积直接加入培养基中并使用Spectramax读板器(Molecular Devices)读取发光。

生物信息学分析

癌症基因组图谱(TCGA)数据检索、乳腺癌(BRCA)、肾乳头状细胞癌(KJRC)和膀胱癌(BLCA)基因表达和拷贝数数据集从TCGA入口(http://tcga-data.nci.nih.gov/)下载。就表达特征分析而言，下载来自RNASeqV2平台的20,475个基因的3级表达数据。

对于基因表达特征分析，使用通过Expectation-Maximization(RSEM)归一化计数进行的RNA测序(RNA-Seq)分析来自TCGA乳腺癌数据集的RNASeqV2数据的基因表达估计。Log₂归一化计数被导入GeneSpring GX V12.1(Agilent Technologies)中。基线转换设置为每个数据集的所有样品(919个乳腺癌样品、228个肾癌样品和260个膀胱癌样品)的中值。

为鉴定CK1δ基因特征列表，基于CK1δ(CSNKID)表达来定义较小数据集(肾癌和膀胱癌)的100个上限和100个下限肿瘤乳房肿瘤样品(CK1δ高和CKlδ低组)。在20,501个基因中，至少一个样品中仅表达高于中值的基因被过滤用于下游分析。GeneSpring VolcanoPlot函数用于鉴定CK1δ高和CKlδ低组之间的差异表达的基因。统计测试参数如下设置：选择测试，不配对t检验；p-值计算，渐近性、多重检验校正，Benjamini-Hochberg。校正的p值截止值设为0.05，并且倍数变化截止值如文中所示。

为了生成热图，使用GeneSpring分级群聚算法。相似性测量被设置为Pearson居中，并且关联规则被设置为平均值。使用Ingenuity途径分析软件(Qiagen)鉴定乳腺癌数据库中具有与CK1δ基因标记重叠的经典途径。使用Fisher精确检验进行显著性检验(p值<0.05)。为了分析附加的癌症数据集，将IPA Wnt/β-连环蛋白信号传导基因(172个基因)的列表导入GeneSpring中，并使用GeneSpring软件计算与CK1δ标记列表重叠的p值(重叠公式的概率)。

拷贝数分析，TCGA RNA-seq和GISTIC2阈值拷贝数数据基于CSNK1D RNA-Seq表达进行排序。为确认相关性，基于log₂mRNA表达和log₂拷贝数值在GraphPad Prism 6中生成散点图(40)。Pearson r和p值使用GraphPad Prism 6计算。

统计分析

除非另有说明，否则图中的所有值均表示为平均值±SE。通过使用Kaplan-Meier方法计算存活曲线，并通过对数秩检验确定曲线之间的差异。使用Pearson检验计算相关系数。关于生物信息学分析的详细信息在上文示出。所有其它实验均采用excel或prism中的Student's双尾t检验进行分析，其中p值<0.05被认为是显著的。

引用文献：

1.E.A.Rakha，J.S.Reis-Filho，F.Baehner，D.J.Dabbs，T.Decker，V.Eusebi，S.B.Fox，S.Ichihara，J.Jacquemier，S.R.Lakhani，J.Palacios，A.L.Richardson，S.J.Schnitt，F.C.Schmitt，P.H.Tan，G.M.Tse，S.Badve，I.O.Ellis，Breast cancer prognosticclassification in the molecular era：the role of histological grade.BreastCancer Res 12，207(2010)10.1186/bcr2607).

2.N.Cancer Genome Atlas，Comprehensive molecular portraits of human breasttumours.Nature 490，61-70(2012)；published online EpubOct 4(10.1038/nature11412).

3.R.Siegel，J.Ma，Z.Zou，A.Jemal，Cancer statistics，2014.CA：a cancer journalfor clinicians 64，9-29(2014)；published online EpubJan-Feb(10.3322/caac.21208).

4.F.Andre，K.Slimane，T.Bachelot，A.Dunant，M.Namer，A.Barrelier，O.Kabbaj，J.P.Spano，H.Marsiglia，R.Rouzier，S.Delaloge，M.Spielmann，Breast cancer withsynchronous metastases：trends in survival during a 14-year period.Journal ofclinical oncology：official journal of the American Society of ClinicalOncology 22，3302-3308(2004)；published online EpubAug 15(10.1200/JCO.2004.08.095).

5.L.Moja，L.Tagliabue，S.Balduzzi，E.Parmelli，V.Pistotti，V.Guarneri，R.D′Amico，Trastuzumab containing regimens for early breast cancer.The Cochranedatabase of systematic reviews 4，CD006243(2012)10.1002/14651858.CD006243.pub2).

6.L.Carey，E.Winer，G.Viale，D.Cameron，L.Gianni，Triple-negative breastcancer：disease entity or title of convenience？Nat Rev Clin Oncol 7，683-692(2010)；published online EpubDec(10.1038/nrclinonc.2010.154).

7.C.M.Perou，Molecular stratification of triple-negative breastcancers.Oncologist 16 Suppl 1，61-70(2011)10.1634/thconcologist.2011-S1-61).

8.M.Kaucka，K.Plevova，S.Pavlova，P.Janovska，A.Mishra，J.Verner，J.Prochazkova，P.Krejci，J.Kotaskova，P.Ovesna，B.Tichy，Y.Brychtova，M.Doubek，A.Kozubik，J.Mayer，S.Pospisilova，V.Bryja，The Planar Cell Polarity PathwayDrives Pathogenesis of Chronic Lymphocytic Leukemia by the Regulation of B-Lymphocyte Migration.Cancer Research 73，1491-1501(2013)；published onlineEpubMar 1(Doi 10.1158/0008-5472can-12-1752).

9.C.Brockschmidt，H.Hirner，N.Huber，T.Eismann，A.Hillenbrand，G.Giamas，B.Radunsky，O.Ammerpohl，B.Bohm，D.Henne-Bruns，H.Kalthoff，F.Leithauser，A.Trauzold，U.Knippschild，Anti-apoptotic and growth-stimulatory functions ofCK1 delta and epsilon in ductal adenocarcinoma of the pancreas are inhibitedby IC261 in vitro and in vivo.Gut 57，799-806(2008)；published online EpubJun(10.1136/gut.2007.123695).

10.I.C.Tsai，M.Woolf，D.W.Neklason，W.W.Branford，H.J.Yost，R.W.Burt，D，M.Virshup，Disease-associated casein kinase I delta mutation may promoteadcnomatous polyps formation via a Wnt/beta-catenin independent mechanism.IntJ Cancer 120，1005-1012(2007)；published online EpubMar 1(10.1002/ijc.22368).

11.N.Rodriguez，J.Z.Yang，K.Hasselblatt，S.B.Liu，Y.L.Zhou，J.A.Rauh～Hain，S.K.Ng，P.W.Choi，W.P.Fong，N.Y.R.Agar，W.R.Welch，R.S.Berkowitz，S.W.Ng，Caseinkinase I epsilon interacts with mitochondrial proteins for the growth andsurvival of human ovarian cancer cells.Embo Molecular Medicine 4，952-963(2012)；published online EpubSep(DOi 10.1002/emmm.201101094).

12.H.Hirner，C.Gunes，J.Bischof，S.Wolff，A.Grothey，M.Kuhl，F.Oswald，F.Wcgwitz，M.R.Bosl，A.Trauzold，D.Henne-Bruns，C.Peifer，F.Leithauser，W.Deppert，U.Knippschild，Impaired CK1 delta activity attenuates SV40-induced cellulartransformation in vitro and mouse mammary carcinogenesis in vivo.PloS one 7，e29709(2012)10.1371/journal.pone.0029709).

13.J.K.Cheong，T.H.Nguyen，H.Wang，P.Tan，P.M.Voorhoeve，S.H.Lee，D.M.Virshup，IC261 induces cell cycle arrest and apoptosis ofhuman cancer cells viaCK1delta/epsilon and Wnt/beta-catenin independent inhibition of mitoticspindle formation.Oncogene 30，2558-2569(2011)；published online EpubJun 2(10.1038/onc.2010.627).

14.S.Y.Kim，I.F.Dunn，R.Firestein，P.Gupta，L.Wardwell，K.Repich，A.C.Schinzel，B.Wittner，S.J.Silver，D.E.Root，J.S.Boehm，S.Ramaswamy，E.S.Lander，W.C.Hahn，CKlepsilon is required for breast cancers dependent on beta-cateninactivity.PloS one 5，e8979(2010)10.1371/journal.pone.0008979).

15.S.Foldynova-Trantirkova，P.Sekyrova，K.Tmejova，E.Brunovska，O.Bernatik，W，Blankenfeldt，P.Krejci，A.Kozubik，T.Dolezal，L.Trantirek，V.Bryja，Breast cancer-specific mutations in CK1epsilon inhibit Wnt/beta-catenin and activate theWnt/Racl/JNK and NFAT pathways to decrease cell adhesion and promote cellmigration.Breast Cancer Res 12，R30(2010)bcr2581[pii]10.1186/bcr2581).

16.M.Bibian，R.J.Rahaim，J.Y.Choi，Y.Noguchi，S.Schurer，W.Chen，S.Nakanishi，K.Licht，L.H.Rosenberg，L.Li，Y.Feng，M.D.Cameron，D.R.Duckett，J.L.Cleveland，W.R.Roush，Development of highly selective casein kinase ldelta/lepsilon(CK1delta/epsilon)inhibitors with potent antiproliferativeproperties.Bioorganic&medicinal chemistry letters 23，4374～4380(2013)；published online EpubAug 1(10.1016/j.bmcl.2013.05.075).

17.G.Finak，S.Sadekova，F.Pepin，M.Hallett，S.Meterissian，F.Halwani，K.Khetani，M.Souleimanova，B.Zabolotny，A.Omeroglu，M.Park，Gene expressionsignatures of morphologically normal breast tissue identifybasal-likctumors.Breast Cancer Res 8，R58(2006)10.1186/bcr1608).

18.J，S.Parker，M.Mullins，M.C.Cheang，S.Leung，D.Voduc，T.Vickery，S.Davies，C.Fauron，X.He，Z.Hu，J.F.Quackenbush，I.J.Stijleman，J.Palazzo，J.S.Marron，A.B.Nobel，E.Mardis，T.O.Nielsen，M.J.Ellis，C.M.Perou，P.S.Bernard，Supervisedrisk predictor of breast cancer based on intrinsic subtypes.Journal ofclinical oncology：official journal of the American Society of ClinicalOncology 27，1160-1167(2009)；published online EpubMar 10(10.1200/JCO.2008.18.1370).

19.X.Zhang，S.Claerhout，A.Prat，L.E.Dobrolecki，I.Petrovic，Q.Lai，M.D.Landis，L.Wiechmann，R.Schiff，M.Giuliano，H.Wong，S.W.Fuqua，A.Contreras，C.Gutierrez，J.Huang，S.Mao，A.C.Pavlick，A.M.Froehlich，M.F.Wu，A.Tsimelzon，S.G.Hilsenbeck，E.S.Chen，P.Zuloaga，C.AShaw，M.F.Rimawi，C.M.Perou，G.B.Mills，J.C.Chang，M.T.Lewis，A renewable tissue resource of phenotypically stable，biologicallyand ethnically diverse，patient-derived human breast cancer xenograftmodels.Cancer research 73，4885-4897(2013)；publishcd online EpubAug 1(10.1158/0008-5472.CAN-12～4081).

20.K.R.Brennan，A.M.Brown，Wnt proteins in mammary development and cancer.JMammary Gland Biol Neoplasia 9，119-131(2004)；published online EpubApr(10.1023/B：JOMG.0000037157.94207.33).

21.F.C.Geyer，M.Lacroix-Triki，K.Savage，M.Arnedos，M.B.Lambros，A.MacKay，R.Natrajan，J.S.Reis-Filho，beta-Catenin pathway activation in breast cancer isassociated with triple-negative phenotype but not with CTNNB1 mutation.ModPathol 24，209-231(2011)；published online EpubFeb(10.1038/modpathol.2010.205).

22.V.Bryja，G.Schulte，E.Arenas，Wnt-3a utilizes a novel low dose and rapidpathway that does not require casein kinase 1-mediated phosphorylation of Dylto activate beta-catenin.Cell Signal 19，610-616(2007)；published onlineEpubMar(10.1016/j.cellsig.2006.08.011).

23.U.Knippschild，M.Kruger，J.Richter，P.Xu，B.Garcia-Reyes，C，Peifer，J.Halekotte，V.B-akulev，J.Bischog，The CK1 Family：Contribution to CellularStress Response and Its Role in Carcinogenesis.Front Oncol 4，96(2014)10.3389/fonc.2014.00096)，

24.P，Wend，S.Runke，K.Wend，B.Anchondo，M.Yesayan，M.Jardon，N.Hardie，C.Loddenkemper，I.Ulasov，M.S.Lesniak，R.Wolsky，L.A.Bentolila，S.G.Grant，D.Elashoff，S.Lehr，J.J.Latimer，S.Bose，H.Sattar，S.A.Krum，G.A.Miranda-Carboni，WNT10B/beta-catenin signalling induces HMGA2 and proliferation in metastatictriple-negative breast cancer，EMBO molecular medicine 5，264-279(2013)；published online EpubFeb(10.1002/emmm.201201320).

25.B.Schade，R.Lesuff，V.Sanguin-Gendreau，T.Bui，G.Deblois，S.A.O′Toole，E.K.A.Millar，S.J.Zardawi，E.Lopez-Knowles，R.L.Sutherland，V，Giguere，M.Kahn，M.Hallett，W.J.Muller，beta-Catenin Signaling Is a Critical Event in ErbB2-Mediated Mammary Tumor Progression.Cancer Research 73，4474-4487(2013)；published online EpubJul 15(Doi 10.1158/0008-5472.Can-12-3925).

26.M.Moumen，A.Chiche，C.Decraene，V.Petit，A.Gandarillas，M.A.Deugnier，M.A.Glukhova，M.M.Faraldo，Myc is required for beta-catenin-mediated mammarystem cell amplification and tumorigenesis.Mol Cancer 12，132(2013)；publishedonline EpubOct 30(10.1186/1476-4598-12-132).

27.H.Al-Hussaini，D.Subramanyam，M.Reedijk，S.S.Sridhar，Notch signalingpathway as a therapeutic target in breast cancer.Molecular cancertherapeutics 10，9-15(2011)；published online EpubJan(10.1158/1535-7163.MCT-10-0677).

28.C.Liu，Y.Li，M.Semenov，C.Han，G.H.Baeg，Y.Tan，Z.Zhang，X.Lin，X.He，Controlof beta-catenin phosphorylation/degradation by a dual-kinase mechanism.Cell108，837-847(2002)；published online EpubMar 22(

29.J.I.Yook，X.Y.Li，I.Ota，C.Hu，H.S.Kim，N.H.Kim，S.Y.Cha，J.K.Ryu，Y.J.Choi，J.Kim，E.R.Fearon，S，J.Weiss，A Wnt-Axin2-GSK3beta cascade regulates Snaillactivity in breast cancer cells.Nat Cell Biol 8，1398-1406(2006)；publishedonline EpubDec(10.1038/neb1508).

30.J.I.Yook，X.Y.Li，I.Ora，E.R.Fearon，S.J.Weiss，Wnt-dependent regulation ofthe E-cadherin repressor snail.J Biol Chem 280，11740-11748(2005)；publishedonline EpubMar 25(10.1074/jbc.M413878200).

31.A.Bafico，G.Liu，L.Goldin，V.Harris，S.A.Aaronson，An autocrinc mechanismfor constitutive Wnt pathway activation in human cancer cells.Cancer Cell 6，497-506(2004)；published online EpubNov(10.1016/j.ccr.2004.09.032).

32.M.J.Higgins，J.Baselga，Targeted therapies for breast cancer.J ClinInvest 121，3797-3803(2011)；published online EpubOct(10.1172/JCI57152).

33.J.K.Cheong，D.M.Virshup，Casein kinase 1：Complexity in the family.Theinternational journal of biochemistry&cell biology 43，465-469(2011)；publishedonline EpubApr(10.1016/j.biocel.2010.12.004).

34.P.Polakis，Wnt signaling in cancer.Cold Spring Harb Perspect Biol 4，(2012)；published online EpubMay(10.1101/cshperspect.a008052).

35.S，Y.Lin，W.Xia，J.C.Wang，K.Y.Kwong，B.Spohn，Y.Wen，R.G.Pestell，M.C.Hung，Beta-catenin，a novel prognostic marker for breast cancer：its roles in cyclinD1 expression and cancer progression.Proc Natl Acad Sci U S A 97，4262-4266(2000)；published online EpubApr 11(10.1073/pnas.060025397).

36.W.H.Xu，Z.B.Liu，C.Yang，W.Qin，Z，M.Shao，Expression of dickkopf-1 andbeta-catenin related to the prognosis of breast cancer patients with triplenegative phenotype.PLoS One 7，e37624(2012)10.1371/journal.pone.0037624).

37.A.M.Brown，Wnt signaling in breast cancer：have we come full circle？Breast Cancer Res 3，351-355(2001).

38.D.Wiederschain，S.Wee，L.Chen，A.Loo，G.Yang，A.Huang，Y.Chen，G.Caponigro，Y.M.Yao，C.Lengauer，W.R.Sellers，J.D.Benson，Single-vector inducible lentiviralRNAi system for oncology target validation.Cell cycle 8，498-504(2009)；published online EpubFeb 1.

39.C.Fuerer，R.Nusse，Lentiviral vectors to probe and manipulate the Wntsignaling pathway.PLoS One 5，e9370(2010)10.1371/journal.pone.0009370).

40.C.H.Mermel，S.E.Schumacher，B.Hill，M.L.Meyerson，R.Beroukhim，G.Getz，GISTIC2.0facilitates sensitive and confident localization of the targets offocal somatic copy-number alteration in human cancers.Genome Biol 12，R41(2011)gb-2011-12-4-r41[pii]10.1186/gb-2011-12-4-r41).

本文提及的所有专利和出版物以引用方式并入本文至一定程度，如同每个单独的出版物专门且单独地指明以引用方式全文并入。

已经使用的术语和表达被用作说明而不是限制的术语，并且不旨在使用此类术语和表达来排除所示出和描述的特征或其部分的任何等同方案，但是应当认识到在要求保护的本发明的范围内可以进行各种修改。因此，应当理解，尽管本发明已经通过优选的实施方案和任选的特征结构进行具体公开，但是本领域技术人员可利用本文公开的概念的修改和变化，并且认为此类修改和变化在如所附权利要求限定的本发明的范围内。

Claims (13)

1.一种抑制酪蛋白激酶1δ(CK1δ)的方法，所述方法包括使CK1δ与有效量或有效浓度的式(I)化合物接触：

其中：

每个R独立地选自氢或(C₁-C₆)烷基，或者键合到氮原子的两个R基团与所述氮原子一起能形成5-7元杂环，其任选地还包含选自O、S和NR’的1或2个杂原子，其中R’是氢或(C₁-C₆)烷基；

Ar¹为芳基或5元或6元杂芳基，其是未经取代的或被1-3个独立选择的卤素、(C₁-C₆)烷基、(C₁-C₆)氟烷基、(C₁-C₆)烷氧基、氰基、硝基、C(＝O)NR₂、OC(＝O)NR₂、N(R)C(＝O)OR、N(R)C(＝O)R、或C(＝O)OR取代；

Het¹是单环或双环杂芳基，其是未经取代的或被1-3个独立选择的卤素、(C₁-C₆)烷基、(C₁-C₆)氟烷基、(C₁-C₆)烷氧基、氰基、硝基、C(＝O)NR₂、OC(＝O)NR₂、N(R)C(＝O)OR、N(R)C(＝O)R、或C(＝O)OR取代；

或其药学上可接受的盐。

2.根据权利要求1，其中所述式(I)化合物为SR-3029,

或其药学上可接受的盐。

3.一种治疗癌症的方法，所述方法包括对患有所述癌症的患者施用有效剂量的式(I)化合物：

其中：

每个R独立地选自氢或(C₁-C₆)烷基，或者键合到氮原子的两个R基团与所述氮原子一起能形成5-7元杂环，其任选地还包含选自O、S和NR’的1或2个杂原子，其中R’是氢或(C₁-C₆)烷基；

Ar¹为芳基或5元或6元杂芳基，其是未经取代的或被1-3个独立选择的卤素、(C₁-C₆)烷基、(C₁-C₆)氟烷基、(C₁-C₆)烷氧基、氰基、硝基、C(＝O)NR₂、OC(＝O)NR₂、N(R)C(＝O)OR、N(R)C(＝O)R、或C(＝O)OR取代；

Het¹是单环或双环杂芳基，其是未经取代的或被1-3个独立选择的卤素、(C₁-C₆)烷基、(C₁-C₆)氟烷基、(C₁-C₆)烷氧基、氰基、硝基、C(＝O)NR₂、OC(＝O)NR₂、N(R)C(＝O)OR、N(R)C(＝O)R、或C(＝O)OR取代；

或其药学上可接受的盐。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述癌症为具有上调的CK1δ和β-连环蛋白的表达水平的癌症。

5.根据权利要求3所述的方法，其中所述癌症为乳腺癌、黑素瘤、成胶质细胞瘤、成神经管细胞瘤、肾癌、膀胱癌或结肠癌、或为转移至脑、肺或骨的癌症，前提条件是升高的CK1δ和β-连环蛋白依赖性参与这些癌细胞转移的疾病。

6.根据权利要求4所述的方法，其中所述乳腺癌为三阴性亚型乳腺癌(TNBC)或HER+乳腺癌。

7.根据权利要求3所述的方法，其中所述式(I)化合物为SR-3029,

或其药学上可接受的盐。

8.根据权利要求1所述的式(I)化合物，其用于治疗癌症。

9.根据权利要求8所述的化合物，其中所述化合物为SR-3029,

或其药学上可接受的盐。

10.根据权利要求8所述的化合物，其中所述癌症为乳腺癌、黑素瘤、成胶质细胞瘤、成神经管细胞瘤、肾癌、膀胱癌或结肠癌、或为转移至脑、肺或骨的癌症，前提条件是升高的CK1δ和β-连环蛋白依赖性参与这些癌细胞转移的疾病。

11.根据权利要求10所述的化合物，其中所述乳腺癌为三阴性亚型乳腺癌(TNBC)或为HER+乳腺癌。

12.一种鉴定有效治疗患者癌症的抗癌药物的方法，所述方法包括测定患者中CK1δ的水平和β-连环蛋白的水平，并且如果两者水平均升高则选择CK1δ抑制剂作为抗癌药物。

13.一种治疗患有乳腺癌、黑素瘤、成胶质细胞瘤、成神经管细胞瘤、或肾癌、膀胱癌或结肠癌、或转移至脑、肺或骨的癌症的患者的方法，所述方法包括确定患者中是否存在升高的CK1δ和β-连环蛋白水平，并且如果两者水平均升高，选择CK1δ抑制剂用于治疗方案。