CN108430495A - 组合物 - Google Patents

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Abstract

能够在受试者中增强和/或引发免疫应答的组合物和使用该组合物的方法。该组合物能够增强IgA免疫应答和/或IgG免疫应答，并且包含对于受试者能够降低ATP与P2X7受体结合水平的剂。该组合物用于口服施用。

Description

组合物
技术领域
本发明属于组合物领域。特别地，本发明涉及可用作疫苗的免疫原性组合物。
背景技术
消化道(gut)充当大量食物形式的外来抗原的入口点。粘膜免疫系统必须确保避免对食物抗原的不必要的免疫应答，同时也确保引发对任何致病生物的免疫应答。此外，消化道含有与宿主共生的大约1014个共生微生物。粘膜免疫系统必须确保针对这些生物的免疫应答以受控方式提高以允许偏利共生。因此粘膜免疫应答必须耐受大量的非自身抗原，同时能够对病原体作出反应。
在粘膜系统中发现的主要抗体类别是免疫球蛋白A(IgA)。在消化道腔中分泌的IgA抗体通过捕获粘液中的微生物同时允许偏利共生而提供粘膜保护。
定植的(colonised)消化道一般对经口递送的作为疫苗的免疫原不敏感，因此使用口服接种而诱导物种特异的高亲和性IgA应答构成了粘膜免疫学中的主要挑战。因此，本领域需要特定的组合物和免疫方案，其能够克服适应性粘膜系统的天然不应性以提供对粘膜病原体特异的高滴度IgA(和IgG抗体)。
只有两种口服细菌疫苗获准用于人类，即活的减毒伤寒沙门氏菌(SalmonellaTyphi)和杀死的霍乱弧菌(Vibrio cholerae)。
本发明的目的是提供能够引发和/或增强粘膜免疫应答，特别是IgA和IgG免疫应答并且可以口服施用的组合物。
发明内容
消化道中的IgA应答由促进抗原特异性B细胞成熟至分泌IgA的浆细胞的T滤泡性辅助(Tfh)细胞控制。Tfh细胞促进B细胞增殖并有利于活化诱导的脱氨酶(AID)的表达，AID促进Ig类别转换和体细胞超突变。发明人先前已经描述了三磷酸腺苷(ATP)门控离子型(ionotropic)P2X7受体在调节Tfh细胞丰度中的作用1。显示胞外ATP结合P2X7受体，触发Tfh细胞死亡。已显示小鼠中P2X7的缺失导致肠IgA水平增加，随后共生体消耗。来自发明人的新数据显示由共生体释放的ATP渗透限制Tfh细胞活性的肠上皮。
本发明人令人惊讶地发现，包括能够降低ATP与P2X7受体结合水平的剂的组合物在口服施用时可用于引发有效的免疫应答。组合物可以进一步包含免疫原，使得在递送对免疫原特异的组合物后引发增加的IgA和/或IgG免疫应答。
因此，本发明提供在受试者中增强和/或引发免疫应答的方法，包括给受试者施用能够增强IgA免疫应答和/或IgG免疫应答的组合物，所述组合物包含能够降低ATP与P2X7受体结合水平的剂，其中所述组合物口服施用给受试者。
本发明还提供能够增强IgA免疫应答和/或IgG免疫应答的组合物，用于在受试者中增强和/或引发免疫应答，所述组合物包含能够降低ATP与P2X7受体结合水平的剂，其中所述组合物用于口服施用。
本发明还提供预防或治疗传染病的方法，包括本发明的方法。
本发明还提供用于根据本发明使用的组合物，用于预防或治疗传染病。
本发明的组合物
本发明的组合物能够增强免疫应答。
组合物能够增强的免疫应答也可由组合物引发。例如，在一些实施方式中，组合物能够引发免疫应答，例如，其中组合物包含免疫原。而在其他实施方式中，组合物本身不能够引发特异性免疫应答。例如，组合物可以任选地不包含免疫原(并因此不能够引发免疫应答)，但可以能够增强由与本发明的组合物分开施用的免疫原引发的免疫应答。在这种情况下，组合物可以在使用前与包含免疫原的第二组合物组合，使得组合的组合物能够引发和增强特异性免疫应答。
作为一种选择方案，本发明的组合物可以与能够引发免疫应答的第二组合物伴随地或在相似的时间施用给受试者，使得本发明的组合物能够增强由第二组合物引发的免疫应答。
在组合物不包含免疫原的情况下，其可以单独施用并且可以能够增强已经存在于受试者中的免疫原引发的免疫应答。例如，组合物可以能够增强针对已经存在于将要向其施用组合物的受试者中的共生体或病原体的免疫应答。
组合物可以能够增强和任选地引发IgA免疫应答和/或IgG免疫应答。优选地，组合物能够增强并任选诱发IgA免疫应答。
组合物优选用于增强和任选地引发粘膜免疫应答。胃肠道、生殖道和呼吸道的粘膜表面暴露于外部环境，因此非常容易受到病原体的侵袭。这些粘膜表面受引发和增强粘膜免疫应答的保护。组合物可用于增强和任选地在胃肠粘膜表面、生殖粘膜表面或呼吸粘膜表面引发免疫应答。优选地，组合物用于增强和任选地引发在胃肠粘膜表面的免疫应答。这种胃肠粘膜表面包括消化道(gut)的粘膜表面。消化道包括胃、小肠和大肠。
能够降低ATP与P2X7受体结合水平的剂
本发明的组合物包括至少一种能够降低ATP与P2X7受体结合水平的剂。组合物可以包含多种能够降低ATP与P2X7受体结合水平的剂。例如，组合物可以包含2、3、4或更多种能够降低ATP与P2X7受体结合水平的剂。
这些剂能够降低ATP与P2X7受体的结合水平。Tfh细胞死亡通常在ATP与P2X7受体结合后发生。因此减少ATP与P2X7受体的结合具有减少Tfh细胞死亡触发的结果。Tfh细胞支持B细胞成熟至分泌IgA的浆细胞。因此，发明人已经显示减少Tfh细胞死亡的触发导致B细胞成熟和B细胞分化成分泌IgA的浆细胞的增加。
能够降低ATP与P2X7受体结合水平的剂可以是能够与P2X7受体的ATP结合位点结合的配体形式。配体可竞争性结合P2X7受体的ATP结合位点。竞争性结合P2X7受体的ATP结合位点的配体阻止ATP结合，从而阻止下游Tfh细胞死亡。配体可以是ATP类似物。
能够降低ATP与P2X7受体结合水平的剂可以是能够与P2X7受体结合的抗体形式。抗体可以结合P2X7受体的ATP结合位点。
能够降低ATP与P2X7受体结合水平的剂可以是能够降低P2X7受体表达的剂的形式。剂可以降低编码P2X7受体的基因的转录水平。作为一种选择，剂可以降低编码P2X7受体的mRNA的翻译水平。作为另一种选择，剂可降低编码P2X7受体的前mRNA的前mNA加工水平。这样的剂可以采取siRNA或反义寡核苷酸的形式。
能够降低ATP与P2X7受体结合水平的剂可以能够降低细胞外ATP的浓度。特别地，剂可具有ATP水解活性。剂可以是ATP水解酶。
剂可以作为多肽存在于组合物中。作为一种选择，剂可以作为核酸存在于组合物中。当剂作为核酸存在于组合物中时，核酸可以编码多肽。
ATP水解酶
优选地，能够降低ATP与P2X7受体结合水平的剂是ATP水解酶。
任何ATP水解酶可以用作本发明组合物中能够降低ATP与P2X7受体结合水平的剂。ATP水解酶是指催化ATP至ADP、ATP至AMP和/或ADP至AMP的水解的任何酶。这样的酶包括但不限于腺苷三磷酸双磷酸酶、ATP酶、ATP-二磷酸酶、腺苷二磷酸酶，ADP酶、ATP二磷酸水解酶和CD39(外核苷三磷酸二磷酸水解酶1(Ectonucleoside triphosphatediphosphohydrolase 1)，ENTPD1)。
优选地，ATP-水解酶是腺苷三磷酸双磷酸酶。当ATP水解酶是腺苷三磷酸双磷酸酶时，腺苷三磷酸双磷酸酶可以具有来自任何生物的腺苷三磷酸双磷酸酶的序列。优选地，腺苷三磷酸双磷酸酶是弗累克斯讷氏杆菌(Shigelli flexneri)腺苷三磷酸双磷酸酶。作为一种选择，腺苷三磷酸双磷酸酶可以是马铃薯(Solanum tuberosum(potato))腺苷三磷酸双磷酸酶。
腺苷三磷酸双磷酸酶是改变能量载体如ATP、无机磷和信号分子的比的非能量偶联NTPase。腺苷三磷酸双磷酸酶以膜结合形式和分泌的可溶形式发现于所有真核生物中。
腺苷三磷酸双磷酸酶可以通过任何方法产生。优选地，重组产生ATP水解酶。优选地，ATP水解酶是重组产生的腺苷三磷酸双磷酸酶。优选地，腺苷三磷酸双磷酸酶是具有以GenBank登录号U04539提供的序列(在此并入为SEQ ID NO：1)的重组生产的腺苷三磷酸双磷酸酶。
作为一种选择，腺苷三磷酸双磷酸酶可以直接从其天然来源纯化。腺苷三磷酸双磷酸酶可以从植物来源、动物来源或细菌来源纯化。优选地，腺苷三磷酸双磷酸酶从马铃薯纯化。
载体
上面描述的剂可以在载体中存在于组合物中。允许递送和/或生产能够降低ATP与P2X7受体结合水平的剂的任何载体都可以包括在本发明的组合物中。
载体可以是表达载体。作为一种选择，载体可以是细胞。载体可以是包含并能够表达表达载体的细胞。
优选地，剂是核酸并且被并入到表达载体中。下面描述可用于本发明的组合物中的表达载体。表达载体可以直接包含在组合物中。作为一种选择，表达载体可以转化到包含在组合物中的宿主细胞中。
表达载体
表达载体能够增强已经插入或克隆到载体中的一个或多个分子的表达。此类表达载体的实例包括噬菌体、自主复制序列(ARS)、着丝粒和能够在体外或在细胞中复制或被复制或将核酸片段运送到动物的细胞内特定位置的其他序列。用于本发明的表达载体包括染色体、附加体和病毒来源的载体，例如源自细菌质粒或噬菌体的载体，以及源自其组合的载体，如粘粒和噬菌粒或基于病毒的载体如腺病毒、AAV、慢病毒。
表达载体可以是质粒。任何质粒表达载体都可以使用，只要它在宿主中可复制和存活。
表达载体可以是小环DNA。小环DNA可用于持续高水平的核酸转录。环状载体的特征在于缺乏表达沉默的细菌序列。例如，小环载体与细菌质粒载体的不同之处在于它们缺乏复制起点，并且缺乏通常在细菌质粒中发现的药物选择标记，例如，β-内酰胺酶、tet等。因此，小环DNA的大小变得更小，允许更有效的递送。
表达载体可以是病毒载体。
基于任何病毒的任何病毒载体都可以用作剂的载体。用于基因治疗的常用病毒系统种类可根据它们的基因组是整合到宿主细胞染色质(癌逆转录病毒(oncoretroviruses)和慢病毒)中还是主要作为染色体外附加体持续存在于细胞核中(腺相关病毒、腺病毒和疱疹病毒)而分为两组。
病毒载体可以是腺病毒(AdV)载体。腺病毒是中等大小的双链无包膜DNA病毒，具有26-48Kbp之间的线性基因组。腺病毒通过受体介导的结合和内化、穿透非分裂细胞和分裂细胞中的细胞核而进入靶细胞。腺病毒严重依赖于宿主细胞来存活和复制，并且能够使用宿主的复制机器在脊椎动物细胞的核中复制。
病毒载体可以来自细小病毒科。细小病毒是小的单链无包膜DNA病毒家族(科，family)，具有大约5000个核苷酸长的基因组。本公开的病毒载体可以是腺相关病毒(AAV)。AAV是依赖性细小病毒，其通常需要与另一种病毒(一般是腺病毒或疱疹病毒)同时感染来启动并维持产生的感染周期。在缺乏这种辅助病毒的情况下，AAV仍然能够通过受体介导的结合和内化、穿透非分裂细胞和分裂细胞中的细胞核来感染或转导靶细胞。因为在缺乏辅助病毒的情况下子代病毒没有从AAV感染产生，所以转导的程度仅限于用病毒感染的初始细胞。与逆转录病毒、腺病毒和单纯疱疹病毒不同，AAV似乎缺乏人类致病性和毒性2。
可以使用基于来自逆转录病毒科的病毒的病毒载体。逆转录病毒包含单链RNA动物病毒，其由两个独特特征表征。第一，逆转录病毒的基因组是二倍体，由两个RNA拷贝组成。第二，该RNA被病毒体相关酶逆转录酶转录成双链DNA。然后，该双链DNA或前病毒可以整合到宿主基因组中并作为宿主基因组的稳定整合组分从亲本细胞传递给后代细胞。
病毒载体可以是慢病毒载体。
本领域技术人员已知的其他病毒或非病毒系统可用作递送剂的载体。
优选地，表达载体是质粒。作为一种选择，优选地，表达载体是噬菌体。当表达载体是质粒或噬菌体时，可将表达载体转化到细菌细胞中，并且细菌细胞包含在本发明的组合物中。细菌细胞可以是大肠杆菌。作为一种选择，细菌载体可以是减毒的肠道沙门氏菌(肠炎沙门氏菌亚属，Salmonella enterica)。减毒的肠道沙门氏菌可以是血清型鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhimurium)。
免疫原
本发明的组合物可以包括能够引起特异性免疫应答的免疫原。本发明可以与广泛的免疫原一起使用，用于治疗或抵御(protect from)广泛的疾病。免疫原可以引发免疫应答，该免疫应答抵御(protect from)病毒病(例如，由于包膜或无包膜病毒)、细菌病(例如，由于革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌)、真菌病、寄生虫病或任何其他疾病。
免疫原可以采取各种形式，例如整个生物、外膜囊泡、蛋白质、糖类、脂糖、缀合物(例如载体和半抗原的，或载体和糖或脂糖的)等。
在优选的实施方式中，免疫原可以采取细菌载体的形式，其包含编码能够降低ATP与P2X7受体结合的剂的核酸。在这种情况下，细菌载体既充当能够降低ATP与P2X7结合水平的剂的载体，又充当免疫原。例如，组合物可以包含重组细菌如大肠杆菌或减毒的肠道沙门氏菌，其包含编码能够降低ATP与P2X7受体结合的剂的核酸。减毒的肠道沙门氏菌可以是血清型鼠伤寒沙门氏菌。
在特别优选的实施方式中，免疫原可以采取包含编码ATP水解酶，优选腺苷三磷酸双磷酸酶的核酸的细菌载体的形式。免疫原可以采取包含编码弗氏志贺氏菌(Shigellaflexneri)三磷酸腺苷双磷酸酶的核酸的细菌载体的形式。
作为一种选择，免疫原可以包含核酸。核酸可编码多肽免疫原。如上所述，核酸可以存在于载体中。例如，核酸可以存在于表达载体中。这种表达载体可以存在于细胞内。
可以将免疫原和能够降低ATP与P2X7受体结合的剂并入相同的表达载体中。作为一种选择，可以将免疫原和能够降低ATP与P2X7受体结合的剂并入分开的表达载体中。作为另一种选择，免疫原和能够降低ATP与P2X7受体结合的剂之一可以存在于表达载体中，同时另一个不存在于表达载体中。例如，免疫原可以存在于表达载体中，同时能够降低ATP与P2X7受体结合的剂不存在于表达载体中。作为一种选择，能够降低ATP与P2X7受体结合的剂可存在于表达载体中，同时能够降低ATP与P2X7受体结合的剂不存在于表达载体中。
免疫原可以不包含在本发明的组合物中。作为一种选择，免疫原可以与本发明的组合物分开施用。本发明的组合物可以在使用前与包含免疫原的第二组合物组合，或者本发明的组合物可以与包含免疫原的第二组合物伴随地或在相似的时间施用。
作为另一种选择，免疫原可以不在本发明的组合物或第二组合物中施用。在施用本发明的组合物之前，免疫原可以已经存在于受试者中。
免疫原的特异性
优选地，免疫原引发针对胃肠道病原体或全身性病原体的免疫应答。优选地，全身性病原体是粘膜传播的全身性病原体。
免疫原可以引发针对任何胃肠道细菌病原体的免疫应答。胃肠道细菌病原体包括但不限于肠毒性大肠杆菌(ETEC)、肠侵袭性大肠杆菌(EIEC)、产志贺样毒素(verotoxin)的大肠杆菌(EHEC)、肠致病性大肠杆菌(EPEC)、包括伤寒和非伤寒沙门氏菌的沙门氏菌属(例如伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、副伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌和猪霍乱沙门氏菌)、弯曲杆菌、霍乱弧菌、鲍氏志贺菌、痢疾志贺菌、弗氏志贺菌、艰难梭菌(Clostridiumdifficile)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、肉毒杆菌、蜡状芽孢杆菌、副溶血性弧菌、小肠结肠炎耶尔森菌、幽门螺杆菌、金黄色葡萄球菌和单核细胞增生李斯特菌。
免疫原可以引发针对任何胃肠道病毒病原体的免疫应答。胃肠道病毒病原体包括但不限于脊髓灰质炎病毒、轮状病毒、腺病毒、杯状病毒(calciviruses)、星状病毒、细小病毒、冠状病毒、甲型、丁型和戊型肝炎、披膜病毒。
免疫原可以引发针对任何胃肠道原生动物病原体的免疫应答。胃肠道原生动物病原体包括但不限于兰伯贾第虫(Giardia lamlia)、小隐孢子虫(Cryptosporidiumparvum)、贝氏等孢子球虫(Isospora belli)、溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)、结肠内阿米巴(Entamoeba coli)、鼠短小内阿米巴原虫(Endolimax nana)、布氏嗜碘阿米巴(Iodamoeba butschlii)、双核阿米巴(Dientamoeba fraglis)、结肠肠袋虫(Balantidium coli)和人毛滴虫(Trichomonas hominis)。
免疫原可以引发针对任何胃肠道蠕虫病原体的免疫应答。胃肠道蠕虫病原体包括但不限于人蛔虫(Ascaris lumbricoides)、十二指肠钩虫(Ancylostoma duodenale)、美洲板口线虫(Necator americanus)、粪类圆线虫(Strongyloides stercoralis)、牛肉绦虫(Taenia saginata)、旋毛虫(Trichinella spiralis)、菲律宾毛细线虫(Capillariaphilippinensis)、猪肉绦虫(Taenia solium)、阔节裂头绦虫(Diphyllobothrium latum)、短膜壳绦虫(Hymenolepis nana)、缩小包膜绦虫(Hymenolepis diminuta)、布斯克姜片虫(Fasciolopsis buski)、横川后殖吸虫(Metagonimus yokogawi)、异形异形吸虫(Heterophyes heterophyes)、人似腹盘吸虫(Gastrodiscoides hominis)、蠕形住肠蛲虫(Enterobius vermicularis)和鞭形鞭虫(Trichuris trichiura)。
免疫原可以引发针对任何粘膜传播的全身性病原体如人免疫缺陷病毒(HIV)的免疫应答。
免疫原可在任何动物中引起免疫应答。动物可以是脊椎动物或非脊椎动物。脊椎动物可以是哺乳动物。脊椎动物哺乳动物可以是人类。哺乳动物的实例包括但不限于小鼠、大鼠、猪、狗、猫、兔、马、牛、绵羊、灵长类动物等。动物可以是灵长类动物。优选地，动物是人类。免疫原可以引发针对任何能够感染动物的病原体的免疫应答。在使用这样的免疫原——其能够引发针对能够感染特定动物或特定组动物的免疫原的免疫应答——的情况下，包含免疫原的组合物适于施用给该特定动物或特定组动物。
药物组合物
本文公开的组合物可以包含除上述剂和免疫原以外的附加组分。例如，它们一般包含一种或多种药学上可接受的组分。对这些组分的全面讨论在参考文献3中获得。
组合物可以包含防腐剂如硫柳汞或2-苯氧乙醇。
组合物优选是无菌的。组合物优选是无热原的，例如每剂量含<1EU(内毒素单位，标准量度)，且优选每剂量<0.1EU。组合物优选不含谷蛋白。
本发明的组合物可以是疫苗。
试剂盒
本文还公开了包括第一隔室的试剂盒，所述第一隔室包含能够降低ATP与P2X7受体结合水平的剂。
试剂盒可以进一步包括包含免疫原的第二隔室。
免疫原性组合物的治疗和施用方法
本发明的组合物旨在施用给动物对象。如此，本发明提供在受试者中增强和/或引发免疫应答的方法，其包括向受试者施用本发明的组合物的步骤。动物受试者可以是任何动物。动物可以是脊椎动物或非脊椎动物。脊椎动物可以是哺乳动物。脊椎动物哺乳动物可以是人类。哺乳动物的实例包括但不限于小鼠、大鼠、猪、狗、猫、兔、马、牛、绵羊、灵长类动物等。动物可以是灵长类动物。优选地，动物是人类。本发明的方法包括预防或治疗动物中的传染病的方法，包括施用本发明的组合物。
增强和/或引发受试者中免疫应答的方法可包括用本发明的组合物免疫受试者。因此，本发明提供用包含能够降低ATP与P2X7受体结合水平的剂的组合物免疫受试者的方法。
本发明还提供本发明的组合物或试剂盒作为药物的用途，例如用于增强和/或引发受试者中的免疫应答。本发明提供包含能够降低ATP与P2X7受体结合水平的剂的组合物，用于增强和/或引发受试者中免疫应答的方法。另外，本发明提供包含能够降低ATP与P2X7受体结合水平的剂的组合物，用于预防或治疗传染病。本发明还提供能够降低ATP与P2X7受体结合水平的剂在制备用于增强受试者中免疫应答的药物中的用途。另外，本发明提供能够降低ATP与P2X7受体结合水平的剂在制备用于预防或治疗传染病的药物中的用途。药物还可以包含免疫原。作为一种选择，药物可以用于与免疫原组合施用。
本发明提供包含能够降低ATP与P2X7受体结合水平的剂的组合物，用于免疫受试者的方法。本发明还提供能够降低ATP与P2X7受体结合水平的剂在制备用于免疫受试者的药物中的用途。可以通过本发明的方法和组合物预防或治疗的传染病可以是由病原体引起的任何疾病。病原体可以是胃肠道病原体或全身性病原体。全身性病原体可以是粘膜传播的全身性病原体。疾病可以由细菌、病毒、原生动物或蠕虫病原体引起。
胃肠道细菌病原体包括但不限于肠毒性大肠杆菌(ETEC)、肠侵袭性大肠杆菌(EIEC)、产志贺样毒素的大肠杆菌(EHEC)、肠致病性大肠杆菌(EPEC)、包括伤寒和非伤寒沙门氏菌的沙门氏菌属(例如伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、副伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌和猪霍乱沙门氏菌)、弯曲杆菌、霍乱弧菌、鲍氏志贺菌、痢疾志贺菌、弗氏志贺菌、艰难梭菌、产气荚膜梭菌、肉毒杆菌、蜡状芽孢杆菌、副溶血性弧菌、小肠结肠炎耶尔森菌、幽门螺杆菌、金黄色葡萄球菌和单核细胞增生李斯特菌。
胃肠道病毒病原体包括但不限于脊髓灰质炎病毒、轮状病毒、腺病毒、杯状病毒、星状病毒、细小病毒、冠状病毒、甲型、丁型和戊型肝炎、披膜病毒。
胃肠道原生动物病原体包括但不限于贾第鞭毛虫、小隐孢子虫、贝氏等孢子球虫、溶组织内阿米巴、结肠内阿米巴、鼠短小内阿米巴原虫、布氏嗜碘阿米巴、双核阿米巴、结肠肠袋虫和人毛滴虫。
胃肠道蠕虫病原体包括但不限于人蛔虫、十二指肠钩虫、美洲板口线虫、粪类圆线虫、牛肉绦虫、旋毛虫、菲律宾毛细线虫、猪肉绦虫、阔节裂头绦虫、短膜壳绦虫、缩小包膜绦虫、布斯克姜片虫、横川后殖吸虫、异形异形吸虫、人似腹盘吸虫、蠕形住肠蛲虫和鞭形鞭虫。
粘膜传播的全身性病原体包括人免疫缺陷病毒(HIV)。
本发明的组合物可用于预防或治疗肠炎。
本发明的组合物可以用作佐剂。作为一种选择，本发明的组合物可以用作疫苗。
本发明的方法、组合物和用途将通常用于在受试者中产生抗体应答，优选IgA免疫应答和/或IgG免疫应答。
本发明的方法、组合物和用途优选在受试者中提供免疫保护性应答，优选免疫保护性IgA应答。
本发明的方法、组合物和用途优选提供与不存在包含能够降低ATP与P2X7受体结合水平的剂的组合物的情况下免疫原提供的免疫应答相比改善的免疫应答。优选地，本发明的方法、组合物和用途提供与不存在包含能够降低ATP与P2X7受体结合水平的剂的组合物的情况下免疫原提供的IgA免疫应答相比改善的IgA免疫应答。本发明的组合物可以以各种方式施用。通常的免疫途径是通过口服施用，但其他可用的途径包括鼻内、口腔、舌下等。因此，优选地，将组合物配制用于口服施用。
当组合物被配制用于口服施用时，组合物可以是片剂、胶囊剂、囊剂、糖锭剂、粉剂、颗粒剂、锭剂、用于重构的粉剂、液体制剂或栓剂的形式。
对于口服施用，本发明的化合物可以以片剂或胶囊剂的形式，或者作为溶液、乳剂或悬浮剂提供。
口服片剂可以包括与药学上可接受的赋形剂如惰性稀释剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、着色剂和防腐剂混合的根据本发明的组合物。合适的惰性填料包括碳酸钠和碳酸钙、磷酸钠和磷酸钙、乳糖、淀粉、糖、葡萄糖、甲基纤维素、硬脂酸镁、甘露醇、山梨糖醇等。示例性的液体口服赋形剂包括乙醇、甘油、水等。淀粉、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、羟基乙酸淀粉钠、微晶纤维素和海藻酸是合适的崩解剂。粘合剂可以包括淀粉和明胶。润滑剂(如果存在的话)可以是硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。如果需要，片剂可以用材料诸如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯包被以延迟在胃肠道中的吸收，或者可以用肠溶衣包被。
用于口服施用的胶囊包括硬明胶胶囊和软明胶胶囊。为了制备硬明胶胶囊，本发明的化合物可以与固体、半固体或液体稀释剂混合。软明胶胶囊可以通过将本发明化合物与水、油如花生油或橄榄油、液体石蜡、短链脂肪酸的单甘油酯和二甘油酯的混合物、聚乙二醇400或丙二醇混合来制备。
用于口服施用的液体可以是悬浮液、溶液、乳液或糖浆的形式，或者可以冻干或作为干燥产品呈现，用于在使用前用水或其他合适的载体重构。这样的液体组合物可以任选地含有：药学上可接受的赋形剂如悬浮剂(例如山梨糖醇、甲基纤维素、海藻酸钠、明胶、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、硬脂酸铝凝胶等)；非水载体，例如油(例如杏仁油或分馏的椰子油)、丙二醇、乙醇或水；防腐剂(例如，对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸)；润湿剂如卵磷脂；和如果需要的话，调味剂或着色剂。
根据本发明制备的组合物可以用作疫苗来治疗儿童和成人。受试者可以小于1岁、1-5岁、5-15岁、15-55岁或至少55岁。接受疫苗的受试者可以是老年人(例如，≥50岁、≥60岁，并且优选≥65岁)、年轻人(例如，≤5岁)、住院的受试者、健康护理工作者、武装部队和军事人员(armed service and military personnel)、孕妇、慢性病患者、免疫缺陷受试者、出国旅游的人等。
治疗可以通过单剂量方案或多剂量方案。多个剂量可用于初次免疫方案和/或加强免疫方案。在多剂量方案中，各种剂量可以通过相同或不同的途径给予，例如，肠胃外引发和粘膜加强，粘膜引发和肠胃外加强等。多于一个剂量(一般为两个剂量)的施用在免疫幼稚(immunologically)受试者中特别有用。多个剂量一般将间隔至少1周(例如约2周、约3周、约4周、约6周、约8周、约12周、约16周等)施用。
一般
术语“包含(comprising)”包含“包括(including)”以及“由......组成(consisting)”，例如“包含”X的组合物可以仅由X组成或可以包括另外的组分例如X+Y。
关于数值x的术语“约”是任选的并且意味着例如x±10％。
除非特别说明，包含混合两种或更多种组分的步骤的方法不需要任何特定的混合顺序。因此组分可以以任何顺序混合。在有三个组分的情况下，两个组分可以相互组合，然后该组合可以与第三个组分组合等。
在动物(特别是牛)材料用于细胞培养时，它们应从无传染性海绵状脑病(TSE)，特别是无牛海绵状脑病(BSE)的来源获得。总体而言，优选在完全不存在动物来源材料的情况下培养细胞。
在化合物作为组合物的部分施用于身体的情况下，那么该化合物可以可选地被合适的前药替代。
附图简述
图1小肠ATP的细菌来源。(a)来自SPF和无菌小鼠(GF)的回肠管腔、胆汁、尿和血清中的ATP浓度。(b)培养基中的ATP浓度(棒)和分离自小肠的指示的细菌种的细胞生长(OD600)。(c)来自(左至右)门静脉、颈静脉和下腔静脉和心脏的血清中的ATP浓度。(d)针对膜损伤(DIBAC+细胞，上面的点图)、细胞死亡(SybrGren+DAPI+细胞，下面的点图)的未处理(LB)或用VAM处理(VAM)的回肠细菌的FACS分析。(e)未处理(LB)和VAM处理的培养物中的ATP浓度(上图)和回肠细菌生长(下图)。(f)来自用PBS(左侧棒)或VAM(右侧棒)强饲的小鼠的回肠ATP浓度。(g)通过FACS对来自未处理(左侧棒)或者用VAM口服强饲(右侧棒)的WT和p2rx7-/-小鼠的PP的Tfh细胞中的钙磷脂膜结合蛋白(Annexin)V+细胞的分析。
图2腺苷三磷酸双磷酸酶对分泌的抗大肠杆菌IgA应答的有效诱导。(a，b)如下的示意性图示：通过大肠杆菌(OM，外膜，PS，周质间隙，IM，内膜，Cyt，胞质溶胶)的ATP分泌(a)和腺苷三磷酸双磷酸酶的影响(b)；pBAD28(a)或pHND10转化体(b)随时间的培养基中的ATP浓度(棒)和细菌生长(OD600)。(c)来自用pBAD28或pHND10转化体免疫的小鼠的肠冲洗物中的抗大肠杆菌IgA的FACS分析。(d，e)用pBAD28(d)或pHND10(e)转染的大肠杆菌免疫并用各自的(d)或相互的细菌菌株(e)测试的小鼠中的肠抗大肠杆菌IgA定量。(f)细菌强饲之前和之后(12h)用CA(右侧棒)或PSV(左侧棒)处理的小鼠中回肠ATP的倍数增加。(g)响应于pBAD28或(h)pHND10转化体的抗大肠杆菌IgA的定量(不同比例)。(i)针对在指示的细菌种上用pBAD28或pHND10转染的大肠杆菌强饲的小鼠的肠液中IgA的FACS分析。
图3腺苷三磷酸双磷酸酶对分泌的抗大肠杆菌IgA应答的有效诱导。(a)肠冲洗物的连续稀释中的IgA的大肠杆菌染色；(b)表显示肠IgA浓度和大肠杆菌特异性抗体的几何平均值。(c)针对总的肠IgA浓度和拟合曲线的相对函数绘制的通过FACS的抗大肠杆菌IgA的几何平均值。(d)显示在存在不同抗生素结合时大肠杆菌强饲和ATP测量的时间点的图。(e，f)在存在CA(e)或PSV(f)的情况下，在未免疫小鼠(Unim；左侧棒)中或响应pBAD28(右侧棒)和pHND10(中间棒)转化体中的抗大肠杆菌IgA的定量。
图4用带有pBAD28的大肠杆菌(中间棒)、带有pHND10的大肠杆菌(右侧棒)单定植(monocolonize)的无菌小鼠和对照无菌小鼠(GF；左侧棒)的内腔ATP水平。
图5用带有pBAD28的大肠杆菌(中间棒)、带有pHND10的大肠杆菌(右侧棒)单定植的动物中和对照无菌小鼠(GF；左侧棒)中Tfh细胞数(左图)和生发中心细胞数(右图)的分析。
图6针对来自用带有pBAD28的大肠杆菌单定植的无菌小鼠、用带有pHND10的大肠杆菌定植(colonized)的无菌小鼠和对照无菌小鼠(GF)的总的肠IgA浓度绘制的通过FACS的肠液中抗大肠杆菌IgA的几何平均值。
图7带有pBAD28(A)或带有pHND10(B)的无毒力鼠伤寒沙门氏菌随着时间的培养基中的ATP浓度(棒)和细菌生长(OD600)。
图8针对来自对照小鼠(左侧棒)、用带有pHND10的减毒鼠伤寒沙门氏菌免疫的小鼠(中间棒)和用带有pBAD28的减毒鼠伤寒沙门氏菌免疫的小鼠(右侧棒)的总的肠IgA浓度绘制的通过FACS的肠液中抗鼠伤寒沙门氏菌IgA的几何平均值。
图9从对照未免疫小鼠(左侧棒)、用带有pHND10的减毒鼠伤寒沙门氏菌免疫的小鼠(中间棒)和用带有pBAD28的减毒鼠伤寒沙门氏菌免疫的小鼠(右侧棒)的PP、肠系膜淋巴结(MLN)、脾和肝中回收有毒力的沙门氏菌。CFU，菌落形成单位；CTRL，未免疫的小鼠。
图10(a)与对照未处理小鼠相比，用具有pBAD28或pHND10的减毒沙门氏菌免疫并然后用有毒力的沙门氏菌攻击的小鼠中的脾脏大小。(b)对照、未处理的小鼠(左侧棒)、用具有pHND10的减毒沙门氏菌免疫并然后用有毒力的沙门氏菌攻击的小鼠(中间棒)和用具有pBAD28的减毒沙门氏菌免疫并然后用有毒力的沙门氏菌攻击的小鼠(右侧棒)中的脾重量。CTRL，未处理的小鼠。
图11(a)用具有pBAD28的减毒沙门氏菌或具有pHND10的减毒沙门氏菌免疫并然后用有毒力的沙门氏菌攻击的小鼠和对照、未处理小鼠中的肝组织图像。(b)用具有pBAD28(右侧棒)或具有pHND10(中间棒)的减毒沙门氏菌免疫并然后用有毒力的沙门氏菌攻击的小鼠中的肝组织学评分。左侧棒显示对照未处理的小鼠的肝组织学评分。
图12在用有毒力的鼠伤寒沙门氏菌感染之后，用带有pHND10的减毒鼠伤寒沙门氏菌免疫的小鼠(中间棒)、未免疫小鼠(CTRL；左侧棒)和用带有pBAD28的减毒鼠伤寒沙门氏菌免疫的小鼠(右侧棒)中的葡聚糖量。
图13在用有毒力的沙门氏菌攻击后48小时，来自重组酶活化基因-1(Rag-1)缺陷小鼠的肠系膜淋巴结(MLN)、肝和脾中回收的有毒力的沙门氏菌集落形成单位(CFU)的数量。未免疫的小鼠(CTRL)由左侧棒表示，用带有pBAD28的减毒鼠伤寒沙门氏菌免疫的小鼠由右侧棒表示和用带有pHND10的减毒鼠伤寒沙门氏菌免疫的小鼠由中间棒表示。
图14未处理小鼠(左侧棒——由三角形表示)、用来自具有pBAD28的大肠杆菌的周质蛋白处理的小鼠(中间棒——由菱形表示)和用来自具有pHND10的大肠杆菌的周质蛋白处理的小鼠中的粪便IgA浓度。
实施发明的方式
小鼠和抗生素施用
C57BL/6J和p2rx7-/-(B6.129P2-P2rx7tm1Gab/J,Jackson Lab)小鼠在瑞士贝林佐纳生物医学研究所的特定无病原体(spf)设施中繁殖。C57BL/6J无菌小鼠在瑞士伯尔尼大学的清洁动物设施(Clean Animal Facility)保持在柔性膜隔离器中。对于抗生素治疗，在饮用水中给予小鼠以下抗生素联合4周：氨苄青霉素1g/l和氯霉素0.5g/l(对内源菌群而不是pBAD28转化的大肠杆菌有杀菌联合活性)或链霉素(Stretpomycin)1g/1、青霉素1g/l和万古霉素0.5g/l(对内源性和pBAD28转化的细菌均有杀菌作用)。
ATP的定量
为了定量回肠ATP，肠内容物通过用10ml肠冲洗缓冲液(PBS、0.5M EDTA、大豆胰蛋白酶抑制剂、PMSF)灌洗来收集，在无菌管中以14’000rpm旋转，过滤(0.22μm)以去除任何细菌大小的污染物并立即在干冰中冷冻。肠冲洗物中的ATP浓度乘以稀释因子以获得实际的内腔ATP浓度。通过用34G针穿刺从胆囊和膀胱收集胆汁和尿。为了定量培养物中共生细菌分泌的ATP，将肠内容物铺在BHI琼脂上并在37℃培养16h。挑取单菌落并在BHI肉汤中培养。将来自单菌落的16h培养物的培养基离心(15,000×g)，收集上清液并过滤(0.22μm)。为了定量循环区域中的ATP，暴露下腔静脉、颈静脉和门静脉以及心脏并通过用34G针穿刺采血。将血液以1000×g离心并将血清收集和以1000×g第二次离心。排出溶血的血清(Emolysedsera)。根据制造商的方案，通过用重组萤火虫萤光素酶及其底物D-萤光素的生物发光测定来评估细胞外ATP浓度。
用抗生素处理细菌培养物
在0.5OD下将氨苄青霉素(2.5μg/ml)、万古霉素(1μg/ml)、甲硝唑(1μg/ml)加入到肠细菌培养物中。在加入抗生素后3、4和5h收集来自细菌培养物的上清液，在无菌管中以14’000rpm旋转并过滤(0.22μm)。通过生物发光测定来评估ATP浓度(参见上文)。
抗体和流式细胞术
以下mAb购自BD Biosciences：生物素缀合的抗CXCR5(克隆：2G8，目录号：551960)和藻红蛋白(PE)缀合的抗-ICOS(克隆：7E.17G9，目录号：552146)。PE-Cy7缀合的抗CD4(克隆：GK1.5，目录号100422)和APC缀合的链菌抗生物素(目录号：405207)来自Biolegend。Percp-eFluor710缀合的抗CD3(克隆：17A2，目录号：46-0032-80)从eBioscience获得。按照制造商的方案，在Biolegend钙磷脂膜结合蛋白V结合缓冲液(目录号422201)(1×106个细胞/ml)中进行钙磷脂膜结合蛋白V染色。使用FlowJo软件(TreeStar，Ashland，OR)或FACSDiva软件(BD Biosciences)分析数据。
质粒
将福氏志贺菌的全长phoN2::HA融合物克隆进质粒pBAD28(ATCC 8739387402)的多接头位点——在PBAD L-阿拉伯糖诱导型启动子的控制下，产生质粒pHND10(参考文献8)。
用大肠杆菌的口服免疫和用于检测抗大肠杆菌IgA的流式细胞术
将用pBAD28或pHND10转化的大肠杆菌无菌地接种到含有阿拉伯糖(0.3％)和氨苄青霉素(100μg/ml)的LB培养基中，并在37℃温育18h。细菌通过离心收获，在无菌PBS中洗并在PBS中浓缩至2×1010CFU/ml的密度。将细菌悬浮物(300μl中的1010CFU)强饲到胃中。该程序每3天重复持续3周，并在第28天将小鼠处死。肠内容物通过用5ml肠冲洗缓冲液(PBS、0.5M EDTA、大豆胰蛋白酶抑制剂、PMSF)灌洗来收集，在无菌管中以14’000rpm旋转并过滤(0.22μm)以除去任何细菌大小的污染物4。对于抗大肠杆菌IgA的流式细胞术分析，将3mlLB肉汤用单菌落接种并在37℃培养过夜。随后将培养物离心(以7000rpm，3min)，用无菌过滤的PBS、2％BSA、0.005％NaN3洗3次，并以大约107个细菌/ml的密度重新悬浮。然后将肠内容物和细菌混合并在4℃温育1h。在重悬于单克隆FITC-抗小鼠IgA(Southern Biotech，目录号：1040-02，工作稀释度1：200)之前，将细菌洗两次。温育1h后，将细菌洗两次并重悬于PBS中的2％多聚甲醛中以采用对数模式下的FSC和SSC参数在FACSCanto上获得。对于分析的每只动物，使用ELISA来确定用于大肠杆菌表面染色的相同肠冲洗样品的未稀释等分试样中的总IgA浓度。该值用于计算用于大肠杆菌流式细胞术的肠冲洗物的每个稀释度时的总IgA浓度，并将其对流式细胞术中获得的几何平均值荧光作图。
用减毒鼠伤寒沙门氏菌的口服免疫和用于检测抗鼠伤寒沙门氏菌IgA流式细胞术
用pBAD28或pHND10转化的无毒力gyrA1816Δcya1Δcrp1鼠伤寒沙门氏菌(其具有cya和crp基因中的突变并且不能产生功能性腺苷酸环化酶以及环AMP受体蛋白)(53648TM)被无菌接种到含有阿拉伯糖(0.05％)和氯霉素(30μg/ml)的LB培养基中，并在37℃温育18小时。细菌通过离心收获，在无菌PBS中洗并在PBS中浓缩至5×1010CFU/ml的密度。每三天将细菌悬浮物(100μl中5×109CFU)强饲至正常定植的C57BL/6小鼠的胃中三次。在饮用水中加入0.05％阿拉伯糖以确保pHND10转化体的腺苷三磷酸双磷酸酶的最大表达。最后一次免疫后一个月，如上所述针对大肠杆菌定植的小鼠测试小鼠的抗沙门氏菌分泌型IgA。
实施例1-在正常定植的小鼠中的大肠杆菌
共生体产生的细胞外ATP水平的检测
细胞外ATP先前已在源自鼠粪便的体外培养的肠共生体的上清液中检测到5,6。为了解决共生体的代谢活性是否对肠ATP水平起作用，小肠中的ATP水平在来自无特定病原体设施的小鼠中和完全无菌小鼠中观察到。在无特定病原体小鼠中检测到微摩尔浓度的ATP，而在完全无细菌的小鼠中几乎检测不到ATP。发现液体如源于无菌(或几乎无菌)上皮或内皮器官的尿、胆汁和血清未显示大量的内腔ATP(参见图1(a))。该发现表明，通过共生体进行的粘膜定植在增加细胞外ATP水平中起作用。
为了测试小肠中存在的细菌是否释放ATP，与细胞生长相比，在培养基中测试了从鼠回肠分离的好氧和厌氧菌落的培养物的ATP。图1(b)显示发现培养基中的ATP与细菌生长成比例地增加。因此这些数据表明存在于小肠中的细菌有助于腔ATP的产生。
本发明人还研究了细菌细胞死亡是否导致细胞裂解过程中由于释放ATP而引起的细胞外ATP的额外增加。用万古霉素、氨苄青霉素和甲硝唑(VAM)处理回肠细菌培养物。如参考文献7所述，使用DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)染色监测细胞死亡并且在流式细胞术中使用DIBAC(双-(1,3-二丁基巴比妥酸)三亚甲基氧醇(trimethine oxonol))染色监测膜损伤。图1(d)-(f)显示细菌细胞死亡和膜通透性与显著的ATP释放有关。如图1(g)所示，用VAM的体内口服施用也导致内腔ATP的急剧和显著增加，其与来自野生型小鼠而不是P2rx7-/-小鼠的Peyer’s淋巴集结(Peyer’s patch)的Tfh细胞中增加的磷脂酰丝氨酸暴露(其是细胞死亡的信号)相关联。这表明通过杀菌死亡引起的ATP释放通过P2X7影响Tfh细胞的丰度。
对ATP的上皮渗透性
为了评估小肠中对ATP的上皮渗透性，每天用ATPγS(ATP的非水解性类似物)强饲小鼠。由于Tfh细胞通过P2X7对细胞外ATP敏感，所以本发明人分析了治疗后两周Peyer’s淋巴集结中的Tfh细胞恢复。ATPγS的施用导致野生型小鼠而不是p2rx7-/-小鼠中的Tfh细胞显著减少。该发现表明，腔ATP可以渗透Peyer’s淋巴集结并且可以通过P2X7影响Tfh细胞的丰度。
从门静脉或颈静脉、腔静脉和心脏采集的血液中的ATP浓度分析显示，与其他样品相比，来自门静脉的血液中ATP浓度增加30-50倍(见图1(c))，表明ATP容易在小肠中被吸收。
使用腺苷三磷酸双磷酸酶降低内腔ATP水平
本发明人使用表达pHND10(基于pBAD28的重组质粒，其携带phoN2::HA融合物8——其编码来自弗氏志贺氏菌的周质腺苷三磷酸双磷酸酶(ATP-二磷酸水解酶)9的重组大肠杆菌K-12菌株。
如图2(a)和(b)所示，携带pHND10的细菌中不能检测到伴随大肠杆菌生长释放的胞外ATP，表明腺苷三磷酸双磷酸酶有效地消除了ATP分泌。用表达pHND10的大肠杆菌定植小鼠导致VAM施用后小肠中ATP浓度显著降低，表明细菌细胞死亡后PhoN2(腺苷三磷酸双磷酸酶)的释放有效水解了内腔ATP。
抗原特异性免疫应答的增强
本发明人证明了使用PhoN2增强抗大肠杆菌IgA应答。C57BI/6小鼠用带有pHND10质粒和pBAD28质粒(其不编码腺苷三磷酸双磷酸酶PhoN2)的大肠杆菌强饲。在用pHND10(其编码腺苷三磷酸双磷酸酶)转染的细菌强饲的小鼠中，大肠杆菌特异性IgA水平显著增加。因此，由细菌释放的ATP限制了高亲和力IgA应答的发展，如所证明的，通过表达腺苷三磷酸双磷酸酶来降低ATP水平允许发生高亲和力的IgA应答，如图2(c)和3所示。由表达腺苷三磷酸双磷酸酶的细菌引发的抗大肠杆菌IgA对包含pBAD28和pHND10的细菌具有相等的反应性，表明腺苷三磷酸双磷酸酶不促进“腺苷三磷酸双磷酸酶特异性”IgA应答(见图2(d)和(e))。
本发明人通过在口服施用氯霉素和氨苄青霉素(CA；其对内源性菌群而不是pBAD28转化的大肠杆菌有活性)或青霉素/链霉素/万古霉素(PSV；其对内源性和pBAD28转化的细菌都是杀菌的)后测量内腔ATP和抗大肠杆菌IgA来论述腺苷三磷酸双磷酸酶作为高亲和力IgA应答的佐剂的作用。在用pBAD28转化的细菌强饲的小鼠中抗大肠杆菌IgA由于PSV而不是CA施用减少，伴随着内腔ATP的增加。在用带有pHND10的细菌定植的小鼠中，内腔ATP和抗大肠杆菌IgA应答均不受CA或PSV影响(见图2(f)-(h))。
发现上述发现对于其中递送腺苷三磷酸双磷酸酶的细菌是特异性的，即测试对其他细菌物种特异的大肠杆菌IgA抗体，并且与施用带有pBAD28的大肠杆菌时相比，当将带有pHND10的大肠杆菌施用给小鼠时没有记录到增加，如图2(i)所示。
因此，本文提供的数据显示，包含腺苷三磷酸双磷酸酶或能够降低ATP与P2X7受体结合水平的另一种剂的组合物可增加对组合物中包含的免疫原的特异性IgA应答。因此，本发明的组合物可用作疫苗。
实施例2-无菌的单定植的小鼠中的大肠杆菌
本发明人单定植无菌小鼠以证明腺苷三磷酸双磷酸酶对受控实验环境中的内腔ATP水平、Tfh和生发中心细胞数量和抗大肠杆菌IgA水平的作用，其中相同量的细菌刺激存在于消化道中，除了胞外ATP。
在单定植的小鼠中在腺苷三磷酸双磷酸酶存在下降低内腔ATP
无菌小鼠通过用pHND10或pBAD28转化的大肠杆菌进行单定植。图4显示与用带有pBAD28的大肠杆菌单定植的小鼠和对照小鼠相比，用带有pHND10的大肠杆菌单定植的小鼠显示肠中显著降低的内腔ATP浓度。使用未用大肠杆菌定植的无菌小鼠作为对照。
在单定植的小鼠中在存在腺苷三磷酸双磷酸酶时Tfh细胞和生发中心B细胞的数目增加
通过列举Peyer’s淋巴集结中的总细胞并通过它们在FACS的频率推断Tfh和GC B细胞的相对丰度来测试用转化有pHND10或pBAD28的大肠杆菌单定植的无菌小鼠的Tfh细胞(CD3+CD4+CXCR5+ICOS+)数和生发中心B细胞(CD19+Fas+PNA+)数。图5显示与用带有pBAD28的大肠杆菌单定植的小鼠或对照小鼠相比，用带有pHND10的大肠杆菌单定植的小鼠中Tfh细胞和生发中心B细胞的数目增加。
该发现与在调节小肠Peyer’s淋巴集结中的Tfh细胞和生发中心B细胞中具有作用的内腔ATP是一致的。在带有pHND10的大肠杆菌中表达的腺苷三磷酸双磷酸酶的存在降低了内腔ATP的水平，其防止ATP减少Tfh细胞和生发中心细胞的数目。
在单定植的小鼠中在存在三磷酸腺苷双磷酸酶的情况下抗大肠杆菌IgA增加
如上所述测试用转化有pHND10或pBAD28的大肠杆菌单定植的无菌小鼠的抗大肠杆菌IgA。图6显示，与用pBAD28单定植的小鼠或对照小鼠相比，用pHND10单定植的小鼠中大肠杆菌特异性IgA水平显著增加。
该发现证实，由于存在腺苷三磷酸双磷酸酶而产生的IgA对与腺苷三磷酸双磷酸酶同时施用的免疫原是特异的。
实施例3-正常定植的小鼠中的减毒鼠伤寒沙门氏菌
产生表达腺苷三磷酸双磷酸酶的鼠伤寒沙门氏菌
为了论述活的减毒鼠伤寒沙门氏菌中的腺苷三磷酸双磷酸酶表达是否可以增加特异性IgA应答并赋予对有毒力株感染的增强的保护，发明人使用无毒力的gyrA1816 Δcya1 Δcrp1鼠伤寒沙门氏菌(53648TM)(其包括cya和crp基因中的突变，并且不能产生功能性腺苷酸环化酶以及环AMP受体蛋白)作为模型疫苗。如上所述，发明人用pBAD28或pHND10转化鼠伤寒沙门氏菌。如在大肠杆菌中观察到的，图7显示ATP在携带pHND10(并因此表达腺苷三磷酸双磷酸酶)的鼠伤寒沙门氏菌的培养基中检测不到(见图7b)，但在携带pBAD28(并因此不表达腺苷三磷酸双磷酸酶)的鼠伤寒沙门氏菌中以与细菌细胞密度相关的渐增量检测到(见图7a)。
在存在腺苷三磷酸双磷酸酶的情况下抗鼠伤寒沙门氏菌IgA增加
正常定植的小鼠每3天通过用5×109转化有pHND10或pBAD28的无毒力鼠伤寒沙门氏菌强饲免疫3次。向动物的饮用水中加入阿拉伯糖0.05％以确保免疫期间通过pHND10转化体最大表达腺苷三磷酸双磷酸酶。在最后一次免疫一个月后，如上所述针对大肠杆菌定植的小鼠测试所述小鼠的抗沙门氏菌分泌型IgA。图8显示与携带pBAD28的减毒鼠伤寒沙门氏菌或对照小鼠相比，沙门氏菌特异性IgA应答在用携带pHND10的减毒鼠伤寒沙门氏菌的经口免疫的小鼠中显著增加。
该发现证实，由于存在腺苷三磷酸双磷酸酶而产生的IgA对于与腺苷三磷酸双磷酸酶同时施用的免疫原是特异的。
用携带腺苷三磷酸双磷酸酶的减毒鼠伤寒沙门氏菌进行免疫抵御有毒力的鼠伤寒沙门氏菌
通过共生菌群的定植抗性限制了用有毒力的鼠伤寒沙门氏菌的感染。相反，用链霉素预处理小鼠允许有效发展小肠结肠炎和伤寒。测试了用转化有pFTND10或pBAD28的减毒鼠伤寒沙门氏菌对小鼠的免疫在距最后一次免疫一个月施用链霉素后抵御5×107有毒力沙门氏菌(S.Tmwt:SB300肠血清型鼠伤寒沙门氏菌(S.enterica serovar Thyphimurium)SL1344(野生型)——对链霉素抗性，如参考文献10中所公开的)的感染的能力。先前用具有pHND10的无毒力沙门氏菌免疫的小鼠的感染导致在感染后48h当与用pBAD28转化体免疫的小鼠或对照未免疫小鼠相比时，显著降低的来自Peyer’s淋巴集结的有毒力的沙门氏菌的回收，和在肠系膜淋巴结(MLN)、脾和肝中几乎检测不到水平的有毒力沙门氏菌(参见图9)。
这与用含有pHND10的减毒鼠伤寒沙门氏菌免疫的小鼠中观察到的感染后病理生理学改变的减少——与用含有pBAD28的鼠伤寒沙门氏菌免疫的小鼠或未免疫小鼠相比——一致。图10显示与未处理小鼠的对照脾相比，在用带有pBAD28的鼠伤寒沙门氏菌免疫的感染小鼠中而不是在用带有pHND10的减毒鼠伤寒沙门氏菌免疫的感染小鼠中，脾大小和重量大大增加。图11显示与未处理小鼠的对照肝相比，在用带有pBAD28的鼠伤寒沙门氏菌免疫的感染小鼠中而不是在用带有pHND10的减毒鼠伤寒沙门氏菌免疫的感染小鼠中肝组织学更坏。
本发明人证明用含有pHND10的减毒鼠伤寒沙门氏菌免疫导致抵御有毒力沙门氏菌的另一方式是通过监测用有毒力沙门氏菌的感染引起消化道内皮屏障渗漏的程度。通过分析消化道对通过强饲法施用给小鼠的葡聚糖的渗透性来监测这种渗漏。为此，用无毒力沙门氏菌免疫的C57BL/6J小鼠用5×107有毒力沙门氏菌口服感染，并用5mg 70KDa FITC-葡聚糖强饲。4小时后收集外周血并检测血清中荧光团的存在。从每个值中减去从未处理小鼠收集的血清的背景荧光值。
已经有效保护免受有毒力沙门氏菌感染影响的小鼠不显示消化道对葡聚糖的渗透性，因此较(that)遭受有毒力沙门氏菌感染影响的小鼠(即，其受到较少有效的保护)，来自此类小鼠的血清含有较少的葡聚糖。
图12显示，与对照未免疫小鼠和用带有pBAD28的减毒鼠伤寒沙门氏菌免疫的小鼠相比，在用有毒力鼠伤寒沙门氏菌感染后，来自用带有pHND10的减毒鼠伤寒沙门氏菌免疫的小鼠的血清含有显著降低量的葡聚糖。这些结果表明，通过用表达腺苷三磷酸双磷酸酶的细菌的免疫提供的IgA应答赋予保护免于沙门氏菌的全身传播。
适应性IgA是在存在腺苷三磷酸双磷酸酶时观察到的保护的原因
如上针对C57BL/6小鼠所述，发明人用携带pBAD28或pHND10的减毒鼠伤寒沙门氏菌免疫了重组酶活化基因-1(Rag-1)缺陷小鼠，以观察这种免疫具有的对不能产生成熟的B或T淋巴细胞的小鼠的影响。如图13所示，通过在来自对照未免疫小鼠或来自用有毒力沙门氏菌攻击后48h用带有pBAD28或pHND10的鼠伤寒沙门氏菌免疫的小鼠的肠系膜淋巴结(MLN)、肝和脾中回收的相当数量的有毒力沙门氏菌集落形成单位(CFU)，腺苷三磷酸双磷酸酶(在用携带pHND10的减毒鼠伤寒沙门氏菌免疫的小鼠中)的存在没有导致对有毒力沙门氏菌的感染的增强抵御。这些结果表明淋巴细胞(例如，适应性IgA)是野生型小鼠中通过免疫引起的观察到的保护的原因。
应该理解的是，本发明仅通过举例的方式进行了描述，并且可以进行修改同时保持在本发明的范围和精神内。
实施例4-在缺少细菌载体形式的免疫原的情况下用腺苷三磷酸双磷酸酶组合物对小鼠的处理
周质蛋白的提取
将转化有pBAD28或pHND10的大肠杆菌无菌地接种到含有阿拉伯糖(0.3％)和氨苄青霉素(100μg/ml)的LB培养基中，并在37℃温育18小时。细菌(1011)在4℃以6000rpm离心20min，在PBS中洗两次，重悬于1ml 30mM Tris-HCl(pH8.0)、4mM EDTA、1mM PMSF、20％蔗糖和0.5mg/ml溶菌酶(lysozime)中并在30℃温育3min；然后加入终浓度为10mM的MgCl2，并将细菌在30℃温育1h。将细菌悬浮液在4℃以10'000离心10min，并通过强饲法给C57BL/6小鼠施用100μl上清液(即，周质蛋白质)。
粪便IgA在用来自具有腺苷三磷酸双磷酸酶的大肠杆菌的周质蛋白处理的小鼠中增加
测量了未处理的或者用来自阿拉伯糖诱导的pBAD28(空载体)或pHND10(含有腺苷三磷酸双磷酸酶的载体)大肠杆菌转化体的周质蛋白每日强饲持续15天的小鼠中的粪便IgA浓度。
图14显示与未处理的小鼠或用不含有腺苷三磷酸双磷酸酶的组合物处理的小鼠相比，用含有腺苷三磷酸双磷酸酶的组合物处理的小鼠具有增加的粪便IgA。这些数据表明，腺苷三磷酸双磷酸酶能够在消化道中和在缺少细菌载体形式的免疫原的情况下在免疫惰性组合物内提供IgA免疫应答(如通过缺少来自pBAD28转化体的周质蛋白对IgA浓度的修改所示)。
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tcacaaatca tcataatcaa gagacaaaac gatacgaaaa aataagataa aaaacatcgt 60
tcttttacca cattattttc cgtgaatatg aaaaataatg ttattacttt aatataagac 120
tattttttgt ttttccatca ctctgttcaa atttttccgc atgacttgtg ttttttgtaa 180
tacagctcgt tttttacagc tgaccaaaat catcaattaa ttatgctaag gaaataaatt 240
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gcaaatgctc tgaaggcaga aggttttctc actcaacaaa cttcaccaga cagtttgtca 360
atacttccgc cgcctccggc agagaattca gtagtatttc aggctgacaa agctcattat 420
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tacgagaatt ttggtcttgc attttcagat gcttatggca tggatatttc aagggaaaat 540
accccaatct tatatcagtt gttaacacaa gtactacagg atagccatga ttacgccgtg 600
cgtaacgcca aagaatatta taaaagagtt cgtccattcg ttatttataa agacgcaacc 660
tgtacacctg ataaagatga gaaaatggct atcactggct cttatccctc tggtcatgca 720
tcctttggtt gggcagtagc actgatactt gcggagatta atcctcaacg taaagcggaa 780
atacttcgac gtggatatga gtttggagaa agtcgggtca tctgcggtgc gcattggcaa 840
agcgatgtag aggctgggcg tttaatggga gcatcggttg ttgcagtact tcataataca 900
cctgaattta ccaaaagcct tagcgaagcc aaaaaagagt ttgaagaatt aaatactcct 960
accaatgaac tgaccccata aagctggaca gcctgtatca ggctatggag ggcccataga 1020
caaatctacc ctatatgagc ataggaggag tctatgggca caccacgttt tacccctgaa 1080
tttaagggat tactggaaag gctgggacat atcctccggc agaagcagaa aaag 1134

Claims (25)

1.在受试者中增强和/或引发免疫应答的方法，其包括给受试者施用能够增强IgA免疫应答和/或IgG免疫应答的组合物，所述组合物包含能够降低ATP与P2X7受体结合水平的剂，其中所述组合物口服施用给所述受试者。
2.能够增强IgA免疫应答和/或IgG免疫应答的组合物，用于在受试者中增强和/或引发免疫应答，所述组合物包含能够降低ATP与P2X7受体结合水平的剂，其中所述组合物用于口服施用。
3.权利要求1所述的方法或权利要求1所述的用于使用的组合物，其中所述剂能够降低细胞外ATP的浓度。
4.权利要求1或权利要求3所述的方法或权利要求2或权利要求3所述的用于使用的组合物，其中所述剂包含ATP水解活性。
5.权利要求4所述的方法或用于使用的组合物，其中所述剂包含ATP水解酶。
6.权利要求5所述的方法或用于使用的组合物，其中所述ATP水解酶是腺苷三磷酸双磷酸酶。
7.权利要求6所述的方法或用于使用的组合物，其中所述腺苷三磷酸双磷酸酶是福氏志贺氏菌腺苷三磷酸双磷酸酶。
8.权利要求1或3-7中任一项所述的方法或权利要求2-7中任一项所述的用于使用的组合物，其中所述组合物还包含免疫原。
9.权利要求8所述的方法或用于使用的组合物，其中所述免疫原能够引发针对胃肠道病原体或全身性病原体的免疫应答。
10.权利要求8或权利要求9所述的方法或用于使用的组合物，其中所述免疫原是细菌抗原、寄生虫抗原或病毒抗原。
11.权利要求10所述的方法或用于使用的组合物，其中所述免疫原能够引发针对选自以下的病原体的免疫应答：霍乱弧菌、艰难梭菌、肉毒杆菌、大肠杆菌、鲍氏志贺菌、痢疾志贺菌、弗氏志贺菌、宋氏志贺菌、肠道沙门氏菌、Salmonella bognori、蠕虫如人蛔虫、原生动物如兰伯贾第虫或溶组织内阿米巴、脊髓灰质炎病毒、轮状病毒、腺病毒、甲型肝炎和人类免疫缺陷病毒。
12.权利要求1或3-11中任一项所述的方法或权利要求2-11中任一项所述的用于使用的组合物，其中所述组合物包含重组细菌，所述重组细菌包含编码所述能够降低ATP与所述P2X7受体结合的剂的核酸。
13.权利要求12所述的方法或用于使用的组合物，其中所述重组细菌还包含编码免疫原的核酸。
14.权利要求12或权利要求13所述的方法或用于使用的组合物，其中所述细菌是大肠杆菌或减毒肠道沙门氏菌。
15.权利要求1或3-11中任一项所述的方法或权利要求2-11中任一项所述的用于使用的组合物，其中所述组合物包含噬菌体，所述噬菌体包含编码所述能够降低ATP与所述P2X7受体结合的剂的核酸。
16.权利要求15所述的方法或用于使用的组合物，其中所述噬菌体还包含编码免疫原的核酸。
17.权利要求1或3-11中任一项所述的方法或权利要求2-11中任一项所述的用于使用的组合物，其中所述组合物包含病毒载体，所述病毒载体包含编码所述能够降低ATP与所述P2X7结合的剂的核酸。
18.权利要求17所述的方法或用于使用的组合物，其中所述病毒载体还包含编码免疫原的核酸。
19.前述权利要求中任一项所述的方法或用于使用的组合物，其中所述IgA免疫应答和/或所述IgG免疫应答是粘膜应答。
20.前述权利要求中任一项所述的方法或用于使用的组合物，其中所述IgA免疫应答和/或所述IgG免疫应答在消化道中。
21.预防或治疗传染病的方法，包括权利要求1或3-20中任一项所述的方法。
22.根据权利要求2-20中任一项所述的用于使用的组合物，其用于预防或治疗传染病。
23.权利要求21所述的方法或根据权利要求22所述的用于使用的组合物，其中所述传染病由胃肠道病原体引起。
24.根据前述权利要求中任一项所述的方法或用于使用的组合物，其中所述组合物被配制用于以纳米胶囊施用。
25.根据前述权利要求中任一项所述的方法或用于使用的组合物，其中所述组合物是疫苗。
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