CN108383906A - 抗人rbp抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及抗人视黄醇结合蛋白抗体及其应用。本发明制备了人视黄醇结合蛋白多种抗体，并进行配对筛选，获得灵敏度及特异性均能满足需求的抗体组合(B08及B14)；同时其方便大量生产，可满足日后大规模临床应用的需求。对上述抗体组合进行检测体系的调试优化工作，获得操作简便，灵敏度，特异性及相关检测性能可满足人临床样本检测的人视黄醇结合蛋白的胶体金定量检测卡，并可满足人血液或尿液样本检测。

Description

抗人RBP抗体及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体的涉及两种抗人视黄醇结合蛋白(Retinol-Binding Protein， RBP)抗体及其制备方法以及上述抗体在人视黄醇结合蛋白定量检测中的应用。
背景技术
视黄醇结合蛋白(Retinol-Binding Protein，RBP)由一条多肽链及小部分碳水化合物组成， 分子量约21KD，半衰期3～12小时。RBP主要由肝脏合成，具有从肝细胞中转运视黄醇至 周围组织的功能，广泛分布于血液、脑脊液、尿液及其他体液中。在血液中，RBP与视黄醇、 前白蛋白以1:1:1(mol)的复合物形式存在，转运体内90％的视黄醇至机体组织。当RBP与 细胞表面的RBP受体结合时，视黄醇进入细胞内，复合物解体，游离的RBP从肾小球滤出， 其中绝大部分被近端肾小管上皮细胞重吸收并被分解，供组织利用，仅少量从尿中排出。体 内锌、铁缺乏及严重感染等疾病能降低RBP的生物合成。
在蛋白质营养不良时，肝的蛋白质合成不足并引起RBP不足，视黄醇不能进入血液，视 黄醇对RBP的分泌起调节作用，两者呈正相关。RBP与前白蛋白一起参与维生素A的转运， 血清RBP和血清维生素含量具有高度相关性，因此认为RBP可作为反映维生素A缺乏的敏 感指标。另有研究表明，血清RBP水平是反映营养性疾病疗效的灵敏、特异性指标。测定视 黄醇结合蛋白能早期发现肾小管的功能损害，并能灵敏的反映肾近曲小管的损害程度，还可 作为肝功能早期损害和监护治疗的指标。临床中，血清RBP定量检测可用于各科室，如肾病 科、ICU、急诊科、内分泌科、消化科、老年科、儿科等。
综上，制备抗人视黄醇结合蛋白特异性抗体并应用于制备人视黄醇结合蛋白定量检测试 剂盒具有重要的临床应用价值。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一组能有效的、特异性结合人视黄醇结合蛋白的抗体。 更具体地说：
本发明的第一目的在于提供两种抗人视黄醇结合蛋白抗体。
第一种抗人视黄醇结合蛋白抗体(B08)，
其重链可变区含有以下的互补决定区：氨基酸序列如序列SEQ ID NO：1所示的HCDR1、 如序列SEQ ID NO：2所示的HCDR2、和/或如序列SEQ ID NO：3所示的HCDR3；
以及其轻链可变区序列含有以下的互补决定区：氨基酸序列如序列SEQ ID NO：4所示 的LCDR1、如序列SEQ ID NO：5所示的LCDR2、和/或如序列SEQ ID NO：6所示的LCDR3。
优选的是本发明中的第一种抗人视黄醇结合蛋白抗体(B08)重链可变区的氨基酸序列 如SEQ ID NO:7所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。
第二种抗人视黄醇结合蛋白抗体(B14)，
其重链可变区含有以下的互补决定区：氨基酸序列如序列SEQ ID NO：9所示的HCDR1、 如序列SEQ ID NO：10所示的HCDR2、和/或如序列SEQ ID NO：11所示的HCDR3；
以及其轻链可变区序列含有以下的互补决定区：氨基酸序列如序列SEQ ID NO：12所示 的LCDR1、如序列SEQ ID NO：13所示的LCDR2、和/或如序列SEQ ID NO：14所示的LCDR3。
优选的是本发明中的第二种抗人视黄醇结合蛋白抗体(B14)重链可变区的氨基酸序列 如SEQ ID NO:15所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示。
本发明第二个目的是提供两种单链抗体，分别是单链抗体B08的氨基酸序列如SEQID NO:33所示，其核苷酸序列经优化后如序列SEQ ID NO：35所示；单链抗体B14的氨基酸序列如SEQ ID NO:34所示，其核苷酸序列经优化后如序列SEQ ID NO：36所示。
本发明第三个目的是提供一种含有上述核苷酸序列的表达载体。
本发明第四个目的是提供一种含有上述表达载体的重组宿主菌。
本发明第五个目的是提供一种生产上述单链抗体的方法，包括：
1)在合适的条件下培养上述重组宿主菌表达抗体；
2)然后从宿主菌中纯化、收集抗体。
本发明的第六个目的在于提供上述抗人视黄醇结合蛋白抗体在检测人视黄醇结合蛋白含 量中的应用。
本发明的第七个目的在于提供一组可进行配对并检测人视黄醇结合蛋白的抗体对组合； 且检测灵敏度高，特异性好。
本发明的第八个目的在于提供一种利用所述抗人视黄醇结合蛋白抗体检测人视黄醇结合 蛋白的胶体金免疫层析定量检测卡，包括样品吸收垫、金标垫、反应膜和吸水垫；所述金标 垫喷涂有胶体金颗粒标记的抗体B14，所述反应膜上有检测带和质控带，检测带位置包被有 抗体B08，质控带位置包被抗His标签抗体或Protein L。所述反应膜优选硝酸纤维素膜。所 述抗His标签抗体优选鼠抗His抗体。
本发明制备了多种单克隆抗体，并进行配对筛选，获得灵敏度及特异性均能满足需求的 一组抗体组合(B08及B14)；同时其方便大量生产，可满足日后大规模临床应用的需求。对 上述抗体组合进行检测体系的调试优化工作，获得操作简便，灵敏度，特异性及相关检测性 能可满足人血液或尿液样本检测的人视黄醇结合蛋白的胶体金免疫层析定量检测卡。
附图说明
图1.抗体B08和B14重链及轻链可变区基因电泳图。Lane 1为B08轻链可变区PCR扩增基因，Lane 2为200DNA Ladder，Lane 3为B08重链可变区PCR扩增基因，Lane 4为B14 轻链可变区PCR扩增基因，Lane 5为B14重链可变区PCR扩增基因。
图2.单链抗体结构示意图。VH表示重链可变区序列，VL表示轻链可变区序列，His标签 为六个组氨酸。
图3.单链抗体表达PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图。图3-a为B08基因PCR产物；图3-b为B14基因PCR产物。
图4.单链抗体特异性检测效果图(Western Blot)。图4-a为抗体B08；图4-b为抗体B14。
图5.本发明胶体金免疫层析定量检测卡结果示意图。1为样品垫、2为反应膜、3为吸 收垫、4为质控线(C线)、5为检测线(T线)、6为金标垫、7为PVC片材。
图6.RBP检测卡(B08-B14)拟合曲线图，其中标准曲线方程为y＝-2E-05x2+0.008x+ 0.109，其中相关系数R2＝0.998。
图7.RBP检测卡(B08-B14)线性范围图，其中，标准曲线方程为y＝0.793x-3.347，相关系数为R2＝0.980。
图8.RBP检测卡(B08-B14)方法学比对
具体实施方式
定义
“抗体”又称免疫球蛋白，是一类由B淋巴细胞分泌的大型Y形蛋白质，能够通过Y形的其中两个分叉顶端的互补位点(抗原结结合位)特异性结合靶抗原的免疫球蛋白分子，所述靶抗原如蛋白质、糖、多核苷酸、脂、多肽、小分子化合物等。
“单链抗体”(scFv)指的是抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)通过15～20个氨基酸短肽(linker)连接形成的单一链融合蛋白，用于连接的linker通常富含甘氨酸和丝 氨酸，以利于单链抗体的稳定性与柔韧性。连接方式可将VL的N端连接至VH的C末端，或者相反。尽管去除了恒定区并引入linker，单链抗体依然保留了抗体对抗原的特异性，且其具 有分子量小、穿透力强和抗原性弱等特点。
互补决定区(complementarity-determining region,CDR)，也叫做高变区。成型于抗体单 体氨基酸的末端，是靶抗原与抗体结合的最关键区域，在免疫网络理论中，每个抗体的互补 决定区又被称为独特型或者基因型。
实施例1.抗人视黄醇结合蛋白杂交瘤细胞株的制备
1.动物免疫
以重组人视黄醇结合蛋白(大肠杆菌重组表达，本公司制备)按照一般免疫程序免疫 BALB/c雌性小鼠(购自常州卡文斯实验动物有限公司)。具体免疫情况参见《抗体制备与使 用实验指南》。采用间接ELISA法跟踪免疫小鼠血清滴度，选取血清效价最高的免疫小鼠， 进行小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞进行融合实验。
2.细胞融合
(1).脾脏细胞的制备
将免疫小鼠，摘眼球取血，经断颈椎处死后置于75％(v/v)的酒精中浸泡10分钟，于无菌 操作台中取出其脾脏，置于细胞筛网中，充分研磨细胞，过筛网，用无菌1640培养基(购自 Gibco公司)离心洗涤数次后，重悬细胞以制成单细胞悬液，并计数，备用。
(2).饲养细胞的制备
取8～10周龄的雌性BALB/c小鼠一只，摘眼球获取阴性血清，经断颈椎处死后置75％(v/v) 酒精中浸泡10分钟；无菌揭开腹部皮肤，暴露腹膜，用注射器将约10mL 1640HT培养基(购 自SIGMA公司)注入小鼠腹腔，轻轻按摩腹部并吹打数次。吸取含有巨噬细胞的培养基注入 20％1640HAT培养基中备用；
取2～3周龄的雌性BALB/c小鼠一只，经断颈椎处死后置于75％(v/v)酒精中浸泡10分 钟；无菌取胸腺于细胞筛网中，研磨，过筛网，获得胸腺细胞置于上述含有巨噬细胞的20％1640HAT培养基中，备用。
(3).细胞融合
选择处于对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞株SP2/0，收集并计数。取约108个上述脾细胞与 2×107个上述SP2/0细胞株加入融合管中混合，1000rpm离心10分钟后弃上清(尽量弃净)， 将融合管置手掌上来回轻轻摩擦以使沉淀松散。60秒内先慢后快地加入1mL预热的PEG1450(聚乙二醇1450，购自SIGMA公司)，加入1640HT培养基30mL终止，1000rpm离 心10分钟，去上清，轻轻摩擦使沉淀松散，加入步骤2所获得的20％的1640HAT培养基中。
将上述HAT培养基充分混匀后，以200μL/孔分装至96孔细胞培养板中，置37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养。一周后用10％1640HT培养基替换20％1640HAT培养基，3天后取上清进行检测。
3.抗人视黄醇结合蛋白特异性杂交瘤株筛选
(1).检测板的准备：用CB包被液稀释重组人视黄醇结合蛋白(大肠杆菌系统表达，本 公司制备)至1μg/mL，包被96孔ELISA酶标板，100μL/孔，2～8℃包被过夜，洗涤一次拍干；含2％牛血清白蛋白的PBST缓冲液封闭(200ul/孔)，37℃封闭2小时；拍干，备用。
(2).阳性克隆的筛选：将待检细胞培养上清100μL/孔加入上述检测板中，于37℃作用30 分钟后洗涤并拍干，加入100μL/孔的HRP标记的羊抗鼠IgG，于37℃作用30分钟后洗涤并 拍干，加入100μL/孔的TMB显色液，于37℃避光显色15分钟，每孔加入50μL的2M H2SO4终止反应，并于OD450处读取数值。阳性孔确定原则：OD450值/阴性对照值≥2.1。选取阳 性克隆株进行细胞克隆化筛选。经过三至四轮的克隆化筛选后，单克隆细胞株阳性率100％即确定为稳定细胞株，对细胞株进行定株。杂交瘤细胞株R08及R14均具有较高的效价，遂后续进一步对上述杂交瘤细胞株进行抗体可变区序列测序分析。
实施例2.杂交瘤细胞株抗体可变区序列的测定
对上述杂交瘤细胞株R08及R14抗体可变区序列进行测定。
a.RNA的提取：参照细胞总RNA抽提试剂盒(购自Roche公司)说明书对上述杂交瘤细胞株R08及R14进行总RNA提取并立即进行反转录；
b.RNA反转录成为DNA：参照Thermo Scientific Reverted First strand cDNASynthesis Kit(购自Thermo公司)对上一步骤中所提取的总RNA进行反转录，制得cDNA，冻存于-20℃ 备用；
c.可变区序列的PCR扩增及回收：以上一步骤中所得cDNA为模板，以鼠IgG亚型单克 隆抗体可变区序列通用引物为引物，对重链及轻链的可变区序列进行PCR扩增，将PCR产物经DNA胶回收试剂盒(购自TIANGEN公司)进行回收，见附图1；
d.可变区序列的克隆和序列测定：按照克隆载体pMD18-T kit(购自Takara公司)说明 书，将重链和轻链可变区基因分别与pMD18-T载体进行连接，转化大肠杆菌DH5α，挑取阳 性克隆，交由南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序。
测序得到杂交瘤细胞株R08的抗体B08重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示、轻 链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。Vbase2数据库分析上述序列，其重链可变区的 各互补决定区的氨基酸序列分别是：如序列SEQ ID NO：1所示的HCDR1、如序列SEQ IDNO： 2所示的HCDR2和/或如序列SEQ ID NO：3所示的HCDR3；其轻链可变区的各互补决定区的氨基酸序列是：如序列SEQ ID NO：4所示的LCDR1、如序列SEQ ID NO：5所示的LCDR2 和/或如序列SEQ ID NO：6所示的LCDR3。
测序得到杂交瘤细胞株R14的抗体B14重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示、 轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：16所示。Vbase2数据库分析上述序列，其重链可变区 的各互补决定区的氨基酸序列分别是：如序列SEQ ID NO：9所示的HCDR1、如序列SEQID NO：10所示的HCDR2和/或如序列SEQ ID NO：11所示的HCDR3；其轻链可变区的各互补 决定区的氨基酸序列是：如序列SEQ ID NO：12所示的LCDR1、如序列SEQ ID NO：13所 示的LCDR2和/或如序列SEQ ID NO：14所示的LCDR3。
实施例3.单链抗体的重组表达及纯化
根据实施例2中测序结果，将杂交瘤细胞株R08及R14的抗体重链及轻链可变区之间加 入连接肽(GGGGS)3，引入六个组氨酸，并将其全基因进行人工合成，构建到毕赤酵母中进行 单链抗体的重组表达，所表达得到的抗体分别命名为抗体B08及B14，其结构组成如附图2 所示。上述单链抗体的重组表达具体如下：
1.融合蛋白基因的表达质粒构建
密码子优化后的抗体B08的基因序列如SEQ ID NO:35所示、氨基酸序列如SEQ IDNO: 33所示；密码子优化后的抗体B14的基因序列如SEQ ID NO:36所示、氨基酸序列如SEQID NO:34所示。将人工合成的抗体B08，B14的基因片段上游引入pPICZαA载体中XhoI序列酶切位点，下游引入XbaI酶切位点，构建到pMD19-T Simple Vector质粒(购自Invitrogen公司)中，得到一种长期保存质粒，质粒记为pMD19-B08-scFv-(HIS)6、pMD19- B14-scFv-(HIS)6。进行PCR扩增，其中上游引物P1为CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC； 下游引物P2为:AGCGGATAACAATTTCACACAGGA。常规PCR程序后，琼脂糖凝胶电泳 分析(附图3)，显示产物大小与预期大小一致。分别将PCR获得基因产物回收纯化后，采 用XhoI(#R0146S,购自NewEngland Biolabs公司)和XbaI(#R0145V,购自New England Biolabs公司)双酶切，用T4连接酶连接到pPICZαA(V19520，购自Invitrogen)质粒中，转 化到DH5α感受态细胞中，在含有Zeocin(R250-01，购自Invitrogen公司)的LB平板中37℃ 培养过夜。第二天筛选阳性克隆菌测序，比对，与预期序列完全一致，即得到抗体B08、B14 的表达质粒，记为pPICZα-B08-scFv-(HIS)6、pPICZα-B14-scFv-(HIS)6。
2.融合蛋白基因在毕赤酵母宿主工程菌株的构建、筛选及表达
YPDS固体培养基配制：参照Invitrogen公司EasySelectPichia Expression Kit说明书；毕 赤酵母感受态细胞：参照EasySelectPichia Expression Kit说明书；BMGY培养基配制：参照 Invitrogen公司Multi-Copy Pichia Expression Kit说明书；BMMY培养基配制：参照Invitrogen 公司Multi-Copy Pichia Expression Kit说明书。
分别将pPICZα-B08-scFv-(HIS)6、pPICZα-B14-scFv-(HIS)6质粒，用SacI限制性内切酶酶 切线性化。乙醇沉淀后将线性化载体，电转化进入到X-33感受态酵母细胞，涂布到含有Zeocin 的YPDS固体培养基，30℃培养3-5天，就有阳性克隆产生。
挑取上述获得的单克隆于5mL BMGY培养基中，30℃培养至OD600＝2.0～6.0时，取1mL 保存菌种，并将剩余菌液重悬后转移到BMMY中小量诱导表达，每隔24h补加甲醇至终浓度 为1％(v/v)。一周后，离心收集菌液上清，通过SDS-PAGE凝胶电泳和蛋白免疫印迹分析(Western blot)，观察目标蛋白表达情况。Western blot中一抗为抗HIS-Tag抗体(His-Tag(2A8) Mouse mAb，M20001，购于艾比玛特生物医药(上海)有限公司)。
将上述获得的B08及B14重组融合蛋白基因工程菌株接种于BMGY培养基中，30℃，220rpm培养至菌体密度到OD600＝2.0～6.0，每隔24小时补加甲醇至终浓度为1.0％(v/v)。一周后，收集发酵培养液。
3.融合蛋白纯化
采用组氨酸标签亲和柱纯化抗体B08及B14融合蛋白，预装柱子选择为HisTrap HP(17-5248-02,购自GE healcare公司)，具体步骤如下：
发酵液的除杂预处理：将上述表达得到抗体B08及B14融合蛋白发酵液上清，离心收集 上清，并加入结合缓冲液，使得上清终浓度为300mMNaCl，20mM NaH2PO4，20mMImidazole， 调pH7.5，0.45μm滤膜过滤。
HisTrap HP亲和柱纯化：运用全自动智能蛋白纯化系统(AKTA avant150，购自GEhealcare公司)对预处理获得的抗体B08及B14融合蛋白发酵液进行亲和纯化，柱子为HisTrap HP。结合缓冲液为300mM NaCl，20mM NaH2PO4，20mM Imidazole，pH7.5，洗脱缓冲液为 300mM NaCl，20mM NaH2PO4，500mM Imidazole，pH7.5。洗脱时进行线性洗脱，并收集各个洗脱峰。通过SDS-PAGE电泳鉴定纯度，合并符合要求的收集管，更换缓冲液为PBS溶液 并超滤浓缩(1mg/mL)，过滤除菌于-20℃保存备用。
实施例4.抗体的性能评价
1.抗体B08及B14的Western blot鉴定
a.聚丙烯酰胺凝胶电泳：配置12％分离胶、5％浓缩胶，分别上样标准蛋白质及重组人 视黄醇结合蛋白蛋白(大肠杆菌系统表达，本公司制备)，恒压下电泳1小时；
b.转膜：恒流(35mA/膜)条件下转膜1小时，将聚丙烯酰胺凝胶上的蛋白质转移至硝 酸纤维素膜上。考马斯亮蓝G250对完成转膜的SDS-PAGE胶进行染色，观察蛋白的残留情况；
c.封闭：含5％脱脂奶的TBST缓冲液封闭(封闭液)，4℃过夜；封闭后洗涤液(TBST，详见TaKaRa公司TBST buffer)洗涤一次，10分钟；
d.抗原抗体反应：封闭液稀释(按1:1000体积比)辣根过氧化物酶标记B08(B08-HRP， 1mg/mL，本公司采用经典过碘酸钠法标记，下同)及辣根过氧化物酶标记B14(B14-HRP， 1mg/mL，本公司采用经典过碘酸钠法标记，下同)，分别加入上述两张硝酸纤维素膜中，室 温反应1小时；TBST洗涤5次，每次10分钟；
e.显色及拍照：吸干硝酸纤维素膜上残留液体，硝酸纤维素膜加入2mL稳定型过氧化 物酶溶液(1mL)与鲁米诺/增强剂溶液(1mL)的混合液(购买于Thermo公司)，均匀润湿硝酸纤维素膜的表面，室温避光反应一分钟后于凝胶成像系统(购买于GE公司)拍照，留 取结果。
检测结果可见，抗体B08及B14均具有较好的特异性，可特异性检测人视黄醇结合蛋白 蛋白。
3.单链抗体B08及B14在胶体金检测平台的评价
将实施例3中纯化的抗体进行配对组合，分别作为包被抗体或标记抗体进行配对检测视 黄醇结合蛋白(RBP)，检测步骤如下：
1)用抗体包被液将B08或B14稀释至1mg/ml，划线于硝酸纤维素膜上；
2)用0.01M PB缓冲液将胶体金标记的B08或B14稀释后喷与结合垫上；
3)按附图所示贴膜，切条，装卡(具体制备参见实施例5)
4)用样本稀释液稀释RBP标准品(大肠杆菌重组表达)，至浓度为150mg/L，16mg/L，将这两个浓度标准品和零浓度标准品(即样本稀释液)分别添加50ul到胶体金检测卡中(B08 包被-B14标记或B14包被-B08标记)，10min后将检测卡放置在读数仪上进行读数。结果如 下表所示：
由上述结果可知，可见B08作为包被抗体，B14作为标记抗体组成的双抗体夹心法检测系 统可应用于胶体金检测平台，进行RBP的检测。
实施例5抗人视黄醇结合蛋白的胶体金免疫检测卡的制备
1、溶液配制
1)0.01M PB缓冲液制备：称取Na2HPO4·12H2O 3.22g，NaH2PO4·2H2O 0.15g，加纯化 水1000ml，转子搅拌至溶解，用pH计测定其pH7.4±0.1，0.45um滤膜过滤。
2)0.01M PBS缓冲液制备：称取Na2HPO41.44g，KH2PO4 0.24g，NaCl 8g，KCl 0.2g加纯化水1000ml，转子搅拌至溶解，用pH计测定其pH7.4±0.1，0.45um滤膜过滤。
2)封闭液制备：称取牛血清白蛋白5g，加0.01M PB溶液(pH7.4±0.1)50ml，转子搅拌至溶解。
3)抗体包被液制备：取0.05g牛血清白蛋白，加入10ml 0.01M PBS溶液(pH7.4±0.1)， 转子搅拌5-10min。
4)金标抗体复溶液制备：称取1g牛血清白蛋白，5g海藻糖，加入100ml 0.01M PB溶液(pH7.4±0.1)，转子搅拌至溶解后，加入25ul Tween-20，继续用转子搅拌5-10min。
5)样本稀释液制备：取500ml 0.01M PBS溶液(pH7.4±0.1)，加入0.5mlProclin300，转 子搅拌至溶解。
2、人视黄醇结合蛋白胶体金检测卡制备
1)胶体金的标记
抗体B14的胶体金标记(以1ml胶体金溶液标记为例)：用K2CO3调节胶体金pH值(每1ml胶体金中加入10ul 0.2M K2CO3)，搅拌5-10分钟，向胶体金溶液中缓慢加入抗体B14(每1ml胶体金中加入5ug抗体B14)，低速搅拌30分钟；加入封闭液BSA至其终浓度为10％(质 量百分比)，搅拌20分钟；静置30min后12000rpm离心30min；去上清用100ul金标抗体复 溶液复溶沉淀即得胶体金标记的B14抗体。
2)金标垫及反应膜制备
将B14金标抗体喷涂在金标垫6上，干燥备用；
将抗体B08用抗体稀释液稀释至1.0mg/ml后，包被于反应膜2(硝酸纤维素膜)的T线 5位置；将抗His标签抗体用抗体稀释液稀释至0.2mg/ml后，包被于反应膜2(硝酸纤维素膜)的C线4位置，反应膜干燥备用。
3)贴膜、切膜、组装
将样品垫1、金标垫6、包被有抗体的硝酸纤维素膜2、吸水垫3从左至右依次设置(如 图5所示)，且两两之间应少许接触，所述包被有抗体的硝酸纤维素膜的T线5在左、C线4在右，并根据外壳大小进行切割，装入外壳，完成检测卡制备。
4)试剂盒组装
将组装好的检测卡，干燥剂装入铝箔袋中，热封机封口，贴标签；
将样本稀释液按1ml/管进行分装，并按照试剂盒规格装入自封袋，贴标签；
按照成品规格，将一定份数的内包，1个含样本稀释液的自封袋，1份说明书，1个合格 标签装入包装盒内，并在包装盒外贴好标签。
3、人视黄醇结合蛋白胶体金检测卡使用方法
1)打开外包装，从密封铝箔袋中取出检测卡，置于平坦台面上。
2)吸取10μl血清/血浆样本，加入样本稀释液A中充分混合，从中吸取10ul混合液加入 到B管样本稀释液中，充分混合。
3)吸取40ul经处理后的样本加入检测卡的加样孔中，室温下静置10min。
4)将检测卡放入免疫层析定量分析仪中，按“快速检测”键开始检测，仪器将自动对检测 卡进行扫描。
5)从免疫层析定量分析仪的显示屏幕上读取/打印检测结果。
4、人视黄醇结合蛋白胶体金检测卡检测效果评估
1)精密性：将B08(包被)-B14(标记)检测卡按检测卡使用方法检测16、150mg/L的RBP 参考品各10次重复测定，剔除离群值后计算检测卡精密度。实验结果显示三个浓度检测结果 变异系数CV<15％。
浓度点(mg/L) 16 150
CV 11.24％ 8.56％
2)检测范围：将B08(包被)-B14(标记)检测卡检测不同浓度的RBP重组蛋白5.625、11.25、 22.5、45、90、180mg/L，拟合曲线及检测范围为8-180mg/L(如附图6)。
3)线性范围：将高值样本与样本稀释液按照一定比例配制成5个系列浓度样本，用B08(包 被)-B14(标记)检测卡检测，每个样本检测3次，将结果与理论浓度进行回归统计，判断在该 浓度范围内是否成线性。线性范围为8-180mg/L(如附图7)。
4)准确度：将B08(包被)-B14(标记)检测卡按检测卡使用方法检测16、150mg/L的RBP 参考品各3次重复，计算平均值和理论值的相对偏差，实验结果显示三个浓度检测结果相对 偏差B<15％。
浓度点(mg/L) 16 150
B 9.78％ 5.67％
5、准确度—方法学比对：
选择同类产品中目前市场上获得良好信誉的重庆中元生物技术有限公司视黄醇结合蛋白检测 试剂盒(胶乳增强免疫比浊法)作对照产品比对验证。选择30份临床病人标本，按1到30的 顺序编号，用对照产品和待评价的B08(包被)-B14(标记)的胶体金检测卡同时进行实验，按照 1，2，3......28，29，30，30，29，28......3，2，1的样本顺序进行测定。对照和待评价产品的 检测结果相关系数R2＝0.99，说明两种方法检测结果有较好的相关性(如附图8)。
6、配方筛选
除上述最优制备例1外，申请人还尝试多种制备方案，例如下面几组检测卡制备及应用 结果如下表：
序列表
<110> 江苏众红生物工程创药研究院有限公司
<120> 抗人RBP抗体及其应用
<130> 抗人RBP抗体及其应用
<160> 36
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> mus musculus
<400> 1
Gly Tyr Ser Phe Thr Arg Tyr Tyr
1 5
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 2
Ile Phe Pro Gly Ser Gly Asn Thr
1 5
<210> 3
<211> 17
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 3
Ala Arg Ser Pro Pro Leu Tyr Phe Gly Asn Tyr Glu Gly Ala Met Asp
1 5 10 15
Tyr
<210> 4
<211> 7
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 4
Ser Ser Val Asn Ser Ser Tyr
1 5
<210> 5
<211> 3
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 5
Ser Thr Ser
1
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 6
His Gln Tyr His Arg Ser Pro Leu Thr
1 5
<210> 7
<211> 124
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 7
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Arg Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Phe Pro Gly Ser Gly Asn Thr Glu Tyr Ser Glu Met Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Pro Pro Leu Tyr Phe Gly Asn Tyr Glu Gly Ala Met Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ala
115 120
<210> 8
<211> 108
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 8
Gln Ile Val Leu Thr His Ser Pro Pro Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Thr Ala Asn Ser Ser Val Asn Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp
35 40 45
Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Thr Ser Met Glu
65 70 75 80
Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr His Arg Ser Pro
85 90 95
Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 9
<211> 8
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 9
Gly Tyr Arg Phe Thr Asp Tyr Trp
1 5
<210> 10
<211> 8
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 10
Ile Asp Gly Tyr Asp Ser Glu Thr
1 5
<210> 11
<211> 14
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 11
Ala Arg Ser Gly Ala Val Glu Gly Arg Tyr Ser Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 12
<211> 10
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 12
Glu Ser Val His Ser Tyr Gly His Ser Phe
1 5 10
<210> 13
<211> 3
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 13
Arg Ala Ser
1
<210> 14
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 14
Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Arg Thr
1 5
<210> 15
<211> 121
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 15
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Arg Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Asp Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Gly Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Thr Gln Tyr Phe
50 55 60
Arg Asp Lys Ala Met Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Ala Val Glu Gly Arg Tyr Ser Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 16
<211> 111
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 16
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Val Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val His Ser Tyr
20 25 30
Gly His Ser Phe Met His Trp Tyr Arg Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Val
50 55 60
Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn
65 70 75 80
Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
85 90 95
Glu Asp Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 17
<211> 24
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 17
ggctacagct tcacaaggta ctat 24
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 18
atttttcctg gaagtggtaa tact 24
<210> 19
<211> 51
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 19
gcaagaagcc cccccctcta ctttggtaac tacgaggggg ctatggacta c 51
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 20
tcaagtgtaa attccagtta c 21
<210> 21
<211> 9
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 21
agcacatcc 9
<210> 22
<211> 27
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 22
accagtatca tcgttccccg ctcacgt 27
<210> 23
<211> 372
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 23
caggtccagc tgcagcagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata 60
tcctgcaagg cttctggcta cagcttcaca aggtactata tacactgggt gaagcagagg 120
cctggacagg gacttgagtg gattggatgg atttttcctg gaagtggtaa tactgagtac 180
agtgagatgt tcaaggacaa ggccacactg acggcagaca catcctccag cacagcctac 240
atgcagctca gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct atttctgtgc aagaagcccc 300
cccctctact ttggtaacta cgagggggct atggactact ggggtcaagg aacctcagtc 360
accgtctccg ca 372
<210> 24
<211> 325
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 24
caaattgttc tcacccattc tccaccaatc atgtctgcat ctctagggga acgggtcacc 60
atgacctgca ctgccaactc aagtgtaaat tccagttact tgcactggta ccagcagaag 120
ccaggatcct cccccaaact ctggatttat agcacatcca acctggcttc tggagtccca 180
gcccgcttca gtggcagtgg gtctgggacc tcttactctc tcacaatcac cagcatggag 240
gctgaagatg ctgccactta ttactgccac cagtatcatc gttccccgct cacgttcggt 300
gctgggacca agctggaaat caaac 325
<210> 25
<211> 24
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 25
ggctacaggt tcaccgacta ctgg 24
<210> 26
<211> 24
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 26
attgatggtt acgatagtga aact 24
<210> 27
<211> 42
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 27
gcaagatctg gggcagtaga agggaggtat tctatggact ac 42
<210> 28
<211> 30
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 28
gaaagtgttc atagttatgg ccatagtttt 30
<210> 29
<211> 9
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 29
cgtgcatcc 9
<210> 30
<211> 27
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 30
aacaaagtaa tgaagatcct cggacgt 27
<210> 31
<211> 363
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 31
caggtccaac tgcagcagcc tggggctgaa ttggtgaggc ctgggacttc tgtgaaactg 60
tcctgcaagg cttctggcta caggttcacc gactactgga tgaactgggt taagcagagg 120
cctgaccaag gccttgagtg gattggaagg attgatggtt acgatagtga aactcactac 180
actcaatact tcagggacaa ggccatgttg actgtagaca agtcctccag cacagcctac 240
atgcaactca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagatctggg 300
gcagtagaag ggaggtattc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt cactgtctcc 360
tca 363
<210> 32
<211> 334
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 32
gacattgtgc tgacccagtc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 60
gtatcctgca gagccagtga aagtgttcat agttatggcc atagttttat gcactggtac 120
cggcagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatc gtgcatccaa tcttgaatct 180
gggatccctg tcaggttcac tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caccattaat 240
cctgtggagg ctgatgatgt tgcaacctat tactgtcaac aaagtaatga agatcctcgg 300
acgttcggtg gaggcaccaa gttggaaata aaac 334
<210> 33
<211> 247
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 33
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Arg Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Phe Pro Gly Ser Gly Asn Thr Glu Tyr Ser Glu Met Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Pro Pro Leu Tyr Phe Gly Asn Tyr Glu Gly Ala Met Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ile Val Leu Thr
130 135 140
His Ser Pro Pro Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly Glu Arg Val Thr Met
145 150 155 160
Thr Cys Thr Ala Asn Ser Ser Val Asn Ser Ser Tyr Leu His Trp Tyr
165 170 175
Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr Ser Thr Ser
180 185 190
Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
195 200 205
Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Thr Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala
210 215 220
Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr His Arg Ser Pro Leu Thr Phe Gly Ala
225 230 235 240
Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
245
<210> 34
<211> 247
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 34
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Arg Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Asp Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Gly Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Thr Gln Tyr Phe
50 55 60
Arg Asp Lys Ala Met Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Ala Val Glu Gly Arg Tyr Ser Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro
130 135 140
Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Val Ser Cys Arg
145 150 155 160
Ala Ser Glu Ser Val His Ser Tyr Gly His Ser Phe Met His Trp Tyr
165 170 175
Arg Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser
180 185 190
Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Val Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly
195 200 205
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala
210 215 220
Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Arg Thr Phe Gly Gly
225 230 235 240
Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
245
<210> 35
<211> 742
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 35
caggtccagc tgcagcagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata 60
tcctgcaagg cttctggcta cagcttcaca aggtactata tacactgggt gaagcagagg 120
cctggacagg gacttgagtg gattggatgg atttttcctg gaagtggtaa tactgagtac 180
agtgagatgt tcaaggacaa ggccacactg acggcagaca catcctccag cacagcctac 240
atgcagctca gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct atttctgtgc aagaagcccc 300
cccctctact ttggtaacta cgagggggct atggactact ggggtcaagg aacctcagtc 360
accgtctccg caggtggcgg agggtctggt ggcggagggt ccggtggcgg agggtcacaa 420
attgttctca cccattctcc accaatcatg tctgcatctc taggggaacg ggtcaccatg 480
acctgcactg ccaactcaag tgtaaattcc agttacttgc actggtacca gcagaagcca 540
ggatcctccc ccaaactctg gatttatagc acatccaacc tggcttctgg agtcccagcc 600
cgcttcagtg gcagtgggtc tgggacctct tactctctca caatcaccag catggaggct 660
gaagatgctg ccacttatta ctgccaccag tatcatcgtt ccccgctcac gttcggtgct 720
gggaccaagc tggaaatcaa ac 742
<210> 36
<211> 742
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 36
caggtccaac tgcagcagcc tggggctgaa ttggtgaggc ctgggacttc tgtgaaactg 60
tcctgcaagg cttctggcta caggttcacc gactactgga tgaactgggt taagcagagg 120
cctgaccaag gccttgagtg gattggaagg attgatggtt acgatagtga aactcactac 180
actcaatact tcagggacaa ggccatgttg actgtagaca agtcctccag cacagcctac 240
atgcaactca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagatctggg 300
gcagtagaag ggaggtattc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt cactgtctcc 360
tcaggtggcg gagggtctgg tggcggaggg tccggtggcg gagggtcaga cattgtgctg 420
acccagtctc cagcttcttt ggctgtgtct ctagggcaga gggccaccgt atcctgcaga 480
gccagtgaaa gtgttcatag ttatggccat agttttatgc actggtaccg gcagaaacca 540
ggacagccac ccaaactcct catctatcgt gcatccaatc ttgaatctgg gatccctgtc 600
aggttcactg gcagtgggtc tgggacagac ttcaccctca ccattaatcc tgtggaggct 660
gatgatgttg caacctatta ctgtcaacaa agtaatgaag atcctcggac gttcggtgga 720
ggcaccaagt tggaaataaa ac 742

Claims (8)

1.抗人视黄醇结合蛋白抗体，其重链可变区含有以下的互补决定区：氨基酸序列如序列SEQ ID NO：9所示的HCDR1、如序列SEQ ID NO：10所示的HCDR2、和/或如序列SEQ ID NO：11所示的HCDR3；
以及其轻链可变区序列含有以下的互补决定区：氨基酸序列如序列SEQ ID NO：12所示的LCDR1、如序列SEQ ID NO：13所示的LCDR2、和/或如序列SEQ ID NO：14所示的LCDR3。
2.权利要求1所述的抗人视黄醇结合蛋白抗体，其重链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO:15所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示。
3.抗人视黄醇结合蛋白单链抗体，所述单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:34所示。
4.编码权利要求书3所述单链抗体的核苷酸序列，如SEQ ID NO:36所示。
5.含有权利要求4所述核苷酸序列的表达载体。
6.含有权利要求5所述表达载体的重组宿主菌。
7.一种单链抗体的生产方法，包括：
1)在合适的条件下培养权利要求6所述的重组宿主菌表达抗体；
2)然后从宿主菌中纯化、收集抗体。
8.权利要求1至3任一项所述抗人视黄醇结合蛋白抗体在检测人视黄醇结合蛋白含量中的应用。
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