CN108372194A - 利用丛枝菌根真菌及猪炭联合修复多氯联苯污染土壤的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了利用丛枝菌根真菌及猪炭联合修复多氯联苯污染土壤的方法，选择多氯联苯污染土壤的表层土壤0‑20cm，去除土壤中杂物，在自然条件下风干备用；常温条件下将土壤、丛枝菌根真菌菌剂、猪炭按照质量比为35:4:1进行播撒，翻耕，混合均匀，灌水至土壤最大持水量的60％，从而实现土壤中多氯联苯的降解。丛枝菌根真菌及猪炭均显著提高了土壤有效磷含量，猪炭还显著提高了土壤有机碳、速效钾含量和pH值；猪炭显著促进了菌根真菌侵染率，接种丛枝菌根真菌的同时添加猪炭提高了细菌的丰度，且接种丛枝菌根真菌同时添加粒径大于0.25mm的猪炭显著促进土壤多氯联苯降解率，促进了植物生物量和土壤多氯联苯降解。

Description

利用丛枝菌根真菌及猪炭联合修复多氯联苯污染土壤的方法

技术领域

本发明涉及修复污染土壤的方法，具体为利用丛枝菌根真菌及猪炭联合修复多氯联苯污染土壤的方法，属于环保应用技术领域。

背景技术

多氯联苯是一种典型的持久性有机污染物，具有高度的化学、热稳定性，抗氧化性、高疏水性以及潜在的生物致癌效应，导致其长期存在于土壤中，并通过生物链的 富集作用，浓缩放大后进入食物链，对人体健康产生重大影响。因此，修复多氯联苯 污染土壤已经成为亟需解决的关键问题。

丛枝菌根真菌是自然界中广泛存在的一类植物共生真菌，已被广泛应用于有机污染土壤，如多氯联苯、PAHs、农药、石油等污染土壤的生物修复。目前的研究表明， 丛枝菌根真菌主要是通过促进植物生长以及菌丝分泌物等来影响土壤微生物活性，从 而达到降解有机污染物的目的。生物质炭近年来已经成为环境修复领域的热门，由于 其具有极强的吸附能力，可以固定土壤中的有机污染物，降低其生物有效性。同时， 生物质炭还能改变土壤微生物群落及其活性，从而影响土壤有机污染物的降解。

然而丛枝菌根真菌和生物质炭对多氯联苯污染土壤的联合修复缺少相应的方法，传统的真菌对植物根系生物量具有抑制作用，不能有效的改善土壤微生物的丰度，不 能有效的促进土壤多氯联苯降解，因此，针对上述问题提出利用丛枝菌根真菌及猪炭 联合修复多氯联苯污染土壤的方法。

发明内容

本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供利用丛枝菌根真菌及猪炭联合修复 多氯联苯污染土壤的方法。

本发明通过以下技术方案来实现上述目的，利用丛枝菌根真菌及猪炭联合修复多氯联苯污染土壤的方法，包括以下步骤：

步骤A、选择多氯联苯污染土壤的表层土壤0-20cm，去除土壤中杂物，在自然条 件下风干后充分混合备用；

步骤B、常温条件下将土壤、丛枝菌根真菌、猪炭按照质量比为35:4:1进行播撒，翻耕，混合均匀，灌水至土壤最大持水量的60％，从而实现土壤中多氯联苯的降解。

优选的，所述步骤B中丛枝菌根真菌的制备；将菌种以黑麦草为宿主植物在灭菌河砂中繁殖四个月后，去除黑麦草的地上部分，将黑麦草根剪碎，制成菌丝体、真菌 孢子、侵染根段的混合接种物在自然条件下风干得到丛枝菌根真菌。

优选的，步骤B中猪炭的制备；利用热解装置将病死整猪在650℃缺氧条件下热 解制成后磨碎成细小颗粒，并用粒径为0.25mm的不锈钢筛进行筛分。

优选的，播撒的所述猪炭粒径为小于0.25mm或大于0.25mm中的一种。

优选的，所述菌种为摩西管柄囊霉采用保藏号为M47V的菌株。

本发明的有益效果是：

1)、本发明的丛枝菌根真菌及猪炭均显著提高了土壤有效磷含量，猪炭还显著提高了土壤有机碳、速效钾含量和pH值；

2)、猪炭显著促进了菌根真菌侵染率；接种丛枝菌根真菌的同时添加猪炭提高了细菌16S rDNA丰度，且接种丛枝菌根真菌同时添加粒径大0.25mm的猪炭显著促进土壤 多氯联苯降解率；

3)、丛枝菌根真菌与猪炭改变了土壤微生物种群的相对丰度，丛枝菌根真菌及猪炭提高了土壤有效养分含量，促进了植物生物量和土壤多氯联苯降解。

附图说明

图1为本发明的流程图；

图2为本发明的土壤多氯联苯同系物组分含量图；

图3为本发明的土壤16S rDNA基因丰度图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。 基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的 所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

请参阅图1所示，利用丛枝菌根真菌及猪炭联合修复多氯联苯污染土壤的方法，包括以下步骤：

步骤A、选择多氯联苯污染土壤的表层土壤0-20cm，去除土壤中杂物，在自然条 件下风干后充分混合备用；

步骤B、常温条件下将土壤、丛枝菌根真菌、猪炭按照质量比为35:4:1进行播撒，翻耕，混合均匀，灌水至土壤最大持水量的60％，从而实现土壤中多氯联苯的降解。

其中，所述步骤B中丛枝菌根真菌的制备；将菌种以黑麦草为宿主植物在灭菌河砂中繁殖四个月后，去除黑麦草的地上部分，将黑麦草根剪碎，制成菌丝体、真菌孢 子、侵染根段的混合接种物在自然条件下风干得到丛枝菌根真菌。

步骤B中猪炭的制备；利用热解装置将病死整猪在650℃缺氧条件下热解制成后磨碎成细小颗粒，并用粒径为0.25mm的不锈钢筛进行筛分。

播撒的所述猪炭粒径为小于0.25mm或大于0.25mm中的一种。

所述菌种为摩西管柄囊霉采用保藏号为M47V的菌株。

供试土壤采自浙江省台州市某电子废弃物拆解场地，表层土壤0-20cm采集后去除碎石等杂物，自然风干后充分混合备用。混合后土壤基本理化性质为pH 8.17，有 机碳15.34g kg^-1，有效磷16.84mg kg^-1，速效钾112.19mg kg^-1，土壤多氯联苯浓 度181.14mgkg^-1，属严重污染；供试玉米为京科糯2000，购自当地农资公司。供试 丛枝菌根真菌菌种为摩西管柄囊霉M47V，从中国科学院南京土壤研究所获得。以黑麦 草为宿主植物在灭菌河砂中繁殖4个月后，去除黑麦草地上部分，将根剪碎，制成菌 丝体、真菌孢子、侵染根段的混合接种物。供试猪炭是利用热解装置将病死整猪在 650℃缺氧条件下热解制成后磨碎成细小颗粒，利用0.25mm不锈钢筛将猪炭分为＞ 0.25mm和<0.25mm粒径。猪炭的基本理化性质为pH 10.1，19.8％C，1.5％N，0.6％H， 灰分74.8％，电导率5.1dS m^-1。

实施例一：

将不接种丛枝菌根真菌和不加猪炭的作为对照，取风干的多氯联苯污染土壤1300g装入容量为2.5L的塑料盆钵中，混合均匀加水至土壤含水量为田间最大持水量的 60％；选择长势相近的玉米幼苗，每三颗作为一组移栽到每个盆栽当中，对玉米幼苗进 行培养，盆栽从移栽开始计算，常温下生长90天；培养期结束后，收获植物并进行 土壤取样，对玉米生物量、土壤多氯联苯含量以及微生物进行分析。

实施例二：

取风干的多氯联苯污染土壤1300g、粒径小于0.25mm的猪炭37.1g装入容量为2.5L的塑料盆钵中，混合均匀加水至土壤含水量为田间最大持水量的60％；选择长势 相近的玉米幼苗，每三颗作为一组移栽到每个盆栽当中，对玉米幼苗进行培养，盆栽 从移栽开始计算，常温下生长90天；培养期结束后，收获植物并进行土壤取样，对 玉米生物量、土壤多氯联苯含量以及微生物进行分析。

实施例三：

取风干的多氯联苯污染土壤1300g、添加粒径大于0.25mm的猪炭37.1g装入容 量为2.5L的塑料盆钵中，混合均匀加水至土壤含水量为田间最大持水量的60％；选 择长势相近的玉米幼苗，每三颗作为一组移栽到每个盆栽当中，对玉米幼苗进行培养， 盆栽从移栽开始计算，常温下生长90天；培养期结束后，收获植物并进行土壤取样， 对玉米生物量、土壤多氯联苯含量以及微生物进行分析。

实施例四：

取风干的多氯联苯污染土壤1486.1g、添加丛枝菌根真菌149g装入容量为2.5L 的塑料盆钵中，混合均匀加水至土壤含水量为田间最大持水量的60％；选择长势相近 的玉米幼苗，每三颗作为一组移栽到每个盆栽当中，对玉米幼苗进行培养，盆栽从移 栽开始计算，常温下生长90天；培养期结束后，收获植物并进行土壤取样，对玉米 生物量、土壤多氯联苯含量以及微生物进行分析。

实施例五：

取风干的多氯联苯污染土壤1486.1g、添加丛枝菌根真菌149g、粒径小于0.25mm的猪炭37.1g装入容量为2.5L的塑料盆钵中，混合均匀加水至土壤含水量为田间最 大持水量的60％；选择长势相近的玉米幼苗，每三颗作为一组移栽到每个盆栽当中， 对玉米幼苗进行培养，盆栽从移栽开始计算，常温下生长90天；培养期结束后，收 获植物并进行土壤取样，对玉米生物量、土壤多氯联苯含量以及微生物进行分析。

实施例六：

取风干的多氯联苯污染土壤1486.1g、添加丛枝菌根真菌149g、粒径大于0.25mm的猪炭37.1g装入容量为2.5L的塑料盆钵中，混合均匀加水至土壤含水量为田间最 大持水量的60％；选择长势相近的玉米幼苗，每三颗作为一组移栽到每个盆栽当中， 对玉米幼苗进行培养，盆栽从移栽开始计算，常温下生长90天；培养期结束后，收 获植物并进行土壤取样，对玉米生物量、土壤多氯联苯含量以及微生物进行分析。

对实施例一、实施例二、实施例三、实施例四、实施例五、实施例六的样品进行 采集与测定方法。植物生物量与丛枝菌根真菌侵染率：试验结束后，将玉米按照地上 部和地下部分别收获。玉米根系收获后用去离子水冲洗干净，取少量新鲜细根，采用 醋酸墨水染色法测定丛枝菌根真菌侵染率。剩余植物样品在70℃下烘干至恒重，分别 称重。多氯联苯含量测定土壤多氯联苯：含量测定参照Qinetal方法。称取3g过100 目筛的风干土壤，加入30ml正己烷/丙酮溶液(V正己烷:V丙酮＝1:1)超声提取30min(100KHz，25℃)后离心，收集上清液。重复3次超声提取，合并上清后于旋转蒸 发仪上浓缩。浓缩液采用Florisil柱进行纯化，15ml色谱纯正己烷洗脱后，N₂吹干， 1ml正己烷溶解以备测定。多氯联苯同系物及其浓度采用气相色谱–质谱测定。色谱 柱为HP5-MS毛细管柱(30m×250uM×0.25uM)；载气为氦气；流速1.0mlmin^-1；进样口 温度300℃；升温程序：80℃保持0.8min，25℃min^-1速率升至140℃，保持1min，10℃ min^-1速率升至260℃，保持10min。离子源温度设置为150℃；溶剂延迟2min；选择 全离子扫描模式，扫描范围为50～450mz^-1，调谐方式为自动调谐。质量控制通过每隔9 个样品采用相同方法测定标准对照(土壤样品中加入已知浓度的多氯联苯单体，IUPACnos.31,44，以及118)和空白对照(无水硫酸钠)。分析结果表明，所有标准对照 中，多氯联苯单体的提取率为83.09±5.32％至91.95±3.45％，所有空白对照中的多 氯联苯单体含量均在检测限(0.01μgg^-1)内。所有样品十氯联苯内标的平均提取率为 82.9％，且测定重复样品之间的相对标准差小于19％。土壤微生物分析：土壤总DNA 采用DNAIsolationKit试剂盒提取，称取0.5g冻干土壤，参照试剂盒使用 说明提取DNA。土壤细菌16SrDNA基因丰度采用实时荧光定量PCR技术测定。实时荧 光定量PCR(qPCR)在CFX96TMReal-TimeSystem仪器上进行，反应体系20ul，其中土 壤总DNA1ul，50uM上游和下游引物各0.2ul，2×SYBRPremixExTaqTM10ul，灭菌水 8.6ul，每个样品3次重复。荧光定量PCR标准曲线采用已知浓度的16SrDNA基因质粒 进行梯度稀释，不同处理荧光定量PCR获得的基因拷贝数对数转换后进行比较。利用 IlluminaMiseq平台对土壤DNA进行高通量测序研究细菌群落结构，采用带barcode 的519F和907R引物对扩增长度约400bp的16SrDNA片段，采用TruSeq^TMDNAS丛枝菌 根plePrepLTKit制备样品，根据试剂盒操作说明采用MiSeqReagentKit进行高通量测 序。测序结果采用QuantitativeInsightsIntoMicrobialEcology(QIIME)1.4.0- devpipeline处理。首先，对获得序列进行质控(质量分>25，序列长度>200bp)，根 据5bp的barcode将所有序列分配到相应样品；其次，对序列进行去噪处理，以97％ 为阈值筛分OTU。选择每个OTU中丰度最高的序列作为该OTU的代表序列，根据 Silva104数据库对OTU进行分类。采用PyNAST比对各OTU的代表序列，并用QIIME 去除二聚体序列。通过FastTree2构建系统发育树。数据处理数据采用Excel2010处 理，Origion8.5作图，利用SPSS18.0软件进行统计分析，采用Duncan单因素方差分 析比较处理间差异显著性检验(p<0.05)，采用一般线性模型中单变量分析方法分析比 较各处理在施炭与接种丛枝菌根真菌双因子影响下土壤理化性质、植物生物量、细菌 丰度以及土壤中多氯联苯含量之间差异显著性检验。采用多元逐步回归分析的方法对土壤细菌种群丰度与多氯联苯含量进行回归分析。土壤养分、丛枝菌根真菌侵染率以 及植物生物量，植株收获后，土壤理化性质，pH及养分含量见表1。

各处理中碱解氮含量无显著差异(p>0.05)。与不接种丛枝菌根真菌的对照相比，接种丛枝菌根真菌对土壤有效磷含量提升效果并不显著。添加猪炭，无论是＞0.25mm 或<0.25mm粒径，均显著提高了土壤有效磷含量。接种丛枝菌根真菌的同时添加猪炭 其土壤有效磷含量高于单独添加猪炭，其中丛枝菌根+<0.25处理土壤有效磷含量显著 高于<0.25处理(p<0.05)。尽管丛枝菌根真菌及猪炭粒径均显著影响土壤有效磷含 量(p<0.05)，但是对于土壤有效磷含量的协同效应并不显著。添加两种粒径猪炭后 土壤中速效钾含量均显著增加(p<0.05)，但是接种丛枝菌根真菌对土壤速效钾含量 没有显著影响。接种丛枝菌根真菌降低了土壤有机碳含量及pH值，而添加猪炭显著提 高了土壤有机碳含量和pH值，其中丛枝菌根真菌和猪炭对降低土壤pH值具有显著的 协同效应(p<0.05)。结果表明，丛枝菌根真菌能够提高土壤中有效磷含量，降低土 壤有机碳含量和pH值，而猪炭对土壤中有效磷、速效钾、有机碳和pH值的提高均有 显著的促进作用，但不同粒径猪炭的促进效果没有显著差异。玉米根系丛枝菌根真菌 侵染率和植物收获后地上部、地下部及总生物量见表2。接种丛枝菌根真菌后，根系 丛枝菌根真菌侵染率、植物生物量(地上部、地下部和总生物量)均显著高于不接种 处理(p<0.05)。在接种情况下，与不施炭处理相比，添加猪炭显著提高了根系丛枝 菌根真菌侵染率(p<0.05)，但是也降低了植物生物量(p<0.05)，其中丛枝菌根+<0.25 显著降低了植物总生物量(p<0.05)。而在不接种情况下，添加猪炭的处理与对照相比丛枝菌根真菌侵染率与植物生物量均无显著差异(p>0.05)。总体来看，接种丛枝 菌根真菌能够显著提高植物根系丛枝菌根真菌侵染率、植物生物量，而猪炭的添加对 植物生长有明显的抑制作用，且丛枝菌根真菌与添加猪炭具有显著的协同效应，丛枝 菌根真菌侵染率和植物生物量，如表2。

接种丛枝菌根真菌及添加猪炭对土壤多氯联苯降解具有一定的促进作用，但除丛枝菌根+>0.25处理外，其它处理土壤中三氯联苯、四氯联苯以及总多氯联苯含量与无 丛枝菌根真菌及猪炭的对照(CK)相比均无显著差异(p>0.05)，如图2所示。与CK 相比，大粒径猪炭(>0.25、丛枝菌根+>0.25)添加处理下二氯联苯降解率显著提高 (p<0.05)；单独添加两种粒径猪炭能显著降低土壤五氯联苯含量。与单独接种丛枝 菌根真菌的处理(丛枝菌根)相比，丛枝菌根+>0.25处理土壤五氯联苯含量显著降低。 一般线性模型分析结果表明，如下表3所示，接种丛枝菌根真菌以及添加猪炭均能显 著提高五氯联苯的降解率(p<0.05)，总体而言，与CK相比较，接种丛枝菌根真菌的 同时添加大粒径生物质炭(丛枝菌根+>0.25)有利于促进二氯、三氯、四氯联苯及总 多氯联苯的降解率。

土壤细菌16SrDNA基因丰度测定结果，如图3所示，接种丛枝菌根真菌有利于提 高土壤中16SrDNA基因丰度，其中丛枝菌根+<0.25处理细菌丰度显著高于不接种的对 照(p<0.05)。同时，施加不同粒径猪炭的各处理间也存在显著差异(p<0.05)，具 体表现为无论接种与否，添加小粒径猪炭处理土壤16SrDNA基因丰度显著高于添加大 粒径猪炭处理。接种丛枝菌根真菌以及添加猪炭对土壤细菌16SrDNA基因丰度具有显 著的促进作用，但是两者之间没有表现出协同作用。高通量测序结果分析发现， Acidobacteria、Actinobacteria、Alphaproteobacteria、Betaproteobacteria和 Gammaproteobacteria为优势菌群，且在不同处理下存在显著差异，具体表现为接种 丛枝菌根真菌后Acidobacteria相对丰度显著提高(p<0.05)，Alphaproteobacteria、 Betaproteobacteria和G丛枝菌根maproteobacteria相对丰度显著降低(p<0.05)， 而Actinobacteria相对丰度无显著差异，如下表4、5所示。

同时，与不加猪炭的处理(CK,丛枝菌根)相比，添加大粒径猪炭显著降低了Acidobacteria在土壤中的相对丰度(p<0.05)。无论接种及施炭与否，各处理间Actinobacteria相对丰度均无显著差异。接种丛枝菌根真菌与施炭对Chloroflexi细 菌相对丰度的提高有一定协同作用。除此之外，接种丛枝菌根也显著提高了 Planctomycetes、Gemmatimonadetes、Deltaproteobacteria在土壤中的相对丰度 (p<0.05)，同时显著降低了Firmicutes在土壤中的相对丰度(p<0.05)，而猪炭的 添加对这些细菌种群的相对丰度均无显著性影响。Bacteroidetes纲在接种丛枝菌根 真菌后相对丰度有所提高，但并未达到0.05显著水平，而小粒径猪炭的添加显著提高 了Bacteroidetes纲的相对丰度(p<0.05)。逐步回归分析结果表明，Planctomycetes 相对丰度与土壤三氯联苯降解显著相关(p<0.05)，而Acidobacteria相对丰度与五 氯联苯降解显著相关p<0.01，如表6所示。

丛枝菌根真菌及猪炭对土壤养分和植物生物量具有重要的影响，生物炭作为土壤改良剂，在改善土壤营养物质状况质中有重要作用。研究表明，在酸性或碱性土壤中 添加生物质炭，能显著提高土壤pH值。本研究发现，尽管土壤本底pH值为碱性，添 加猪炭仍然显著提高其pH值，同时显著增加了土壤中速效P、K和有机碳含量，但是 对碱解氮含量没有影响。丛枝菌根真菌可以通过菌丝分泌的有机酸活化土壤中P、调 节土壤pH值，从而促进植物生长。在重度污染土壤中，接种丛枝菌根真菌的处理显著 提高了植物生物量。添加猪炭显著提高了植物根系丛枝菌根真菌侵染率，添加小粒径 的猪炭有利于土壤细菌丰度的提高，其中在接种丛枝菌根真菌条件下，添加小粒径猪 炭显著提高土壤细菌16S rDNA丰度。小粒径猪炭对Bacteroidetes纲的细菌相对丰度 有显著促进作用，而两种粒径猪炭对Actinobacteria相对丰度均没有显著影响。在接 种丛枝菌根真菌后，土壤中浮霉状菌纲(Planctomycetes)相对丰度也显著提高，且逐 步回归分析也表明该菌群的相对丰度与三氯联苯含量显著相关。丛枝菌根真菌能够提 高土壤中有效磷含量，降低土壤有机质含量和pH值，而猪炭对土壤中有效磷、速效钾、 有机碳和pH值的提高均有显著的促进作用；接种丛枝菌根真菌能够显著提高植物根系 丛枝菌根真菌侵染率、植物生物量；丛枝菌根真菌与猪炭显著改变了土壤细菌种群相 对丰度；接种丛枝菌根真菌并添加小粒径猪炭显著提高了土壤细菌16S rDNA丰度。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此， 无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范 围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义 和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所 涉及的权利要求。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人 员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领 域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (5)

1.利用丛枝菌根真菌及猪炭联合修复多氯联苯污染土壤的方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤A、选择多氯联苯污染土壤的表层土壤0-20cm，去除土壤中杂物，在自然条件下风干后充分混合备用；

步骤B、常温条件下将土壤、丛枝菌根真菌、猪炭按照质量比为35:4:1进行播撒，翻耕，混合均匀，灌水至土壤最大持水量的60％，从而实现土壤中多氯联苯的降解。

2.根据权利要求1所述的利用丛枝菌根真菌及猪炭联合修复多氯联苯污染土壤的方法，其特征在于：所述步骤B中丛枝菌根真菌的制备；将菌种以黑麦草为宿主植物在灭菌河砂中繁殖四个月后，去除黑麦草的地上部分，将黑麦草根剪碎，制成菌丝体、真菌孢子、侵染根段的混合接种物在自然条件下风干得到丛枝菌根真菌。

3.根据权利要求1所述的利用丛枝菌根真菌及猪炭联合修复多氯联苯污染土壤的方法，其特征在于：步骤B中猪炭的制备；利用热解装置将病死整猪在650℃缺氧条件下热解制成后磨碎成细小颗粒，并用粒径为0.25mm的不锈钢筛进行筛分。

4.根据权利要求3所述的利用丛枝菌根真菌及猪炭联合修复多氯联苯污染土壤的方法，其特征在于：播撒的所述猪炭粒径为小于0.25mm或大于0.25mm中的一种。

5.根据权利要求2所述的利用丛枝菌根真菌及猪炭联合修复多氯联苯污染土壤的方法，其特征在于：所述菌种为摩西管柄囊霉采用保藏号为M47V的菌株。