CN108369231A - 微生物肽的检测 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于检测、鉴定和/或定量一种或更多种微生物、微生物肽、或微生物起源的化合物的方法，所述方法包括步骤：(a).将物品、物质、或样品与发光的缀合低聚噻吩(LCO)接触；(b).检测a)的发光的缀合低聚噻吩(LCO)的至少一个信号；和(c).基于b)中的所述至少一个检测到的信号，确定所述物品上或所述样品中一种或更多种微生物、微生物肽、或微生物起源的化合物的存在、身份和/或量。本发明还涉及微生物、微生物肽、或微生物起源的化合物的诊断剂和诊断方法。

Description

微生物肽的检测
发明领域
本发明涉及用于检测、鉴定和定量微生物、微生物肽或微生物起源的化合物的方法，实现诊断学的方法和诊断感染的方法。
技术背景
生物大分子被归类为蛋白、碳水化合物、核酸和脂质的类别。每个类别在化学上和结构上不同，并且执行对生命至关重要的独特功能。蛋白由氨基酸构成，其经由肽(酰胺)键彼此连接，形成聚合物链。一级序列按复杂程度更高的层级组织，产生二级、三级和最终的四级结构，四级结构是指聚集的蛋白亚基的数量和相互之间的排列。由肽键连接的氨基酸单体的短链被称为肽。由微生物产生的肽被称为微生物肽。碳水化合物主要由碳、氢和氧原子构成。基于其聚合的程度，碳水化合物可以被归类为糖、寡糖和多糖。核酸，诸如DNA和RNA，由核苷酸单体构成，每一个由糖、磷酸基团和含氮碱基组成。与以上提及的大分子不同，脂质是在有机溶剂中可溶的分子。脂质是生物膜，诸如包被细胞的质膜中的主要组分。
微生物可以产生上述所有类别的分子。一些充当用于目标为微生物鉴定的方法的靶。抗体基于微生物的蛋白组成鉴定微生物，而凝集素鉴定碳水化合物。包括聚合酶链式反应(PCR)和下一代测序的方法可以基于核酸的序列鉴定微生物。由于每个分子类别的化学组成和结构的不同，这些方法不会重叠。
微生物在其外表面上表达各种分子用于多种功能。这些分子可以充当稳定性、定殖或表面黏附、酶促反应、免疫逃避、分子运输等的结构组分。通过传统微生物学方法诊断由微生物引起的疾病及其在疾病中的鉴定通常需要最少2至3天(图7B)。感染的诊断需要基于患者病史、患者检查和实验室数据的综合发现。从临床样品分离微生物用于诊断是一项艰巨的任务。在微生物可以被分离并扩增到足够数量的情况下，微生物需要经历大量的生物化学测试。结果的消除和排除最终导致鉴定致病原(causative agent)。通常使用的生物化学测试涉及指示周知的病原体的特定酶的存在。然而，测试经常是不确定的。医生被迫用通用方案和广谱作用药物治疗患者，这会推动抗生素耐药性的发展，并可能引起其他并发症。研究已经表明这是一种非常有害的方法。许多诊断方法仅可用于可以培养的生物体，这是耗时且昂贵的。需要缩短诊断时间并提高诊断的准确性，并间接控制治疗成本的方法和技术。方法需要简单且快速。
发光的缀合低聚噻吩(LCO)是当与靶相互作用时经历分子几何结构的变化的一组荧光化合物(fluorophore)。靶结合诱导荧光信号的变化，产生对靶独特的光学特征。在一些情况下，该光学信号是开/关，并且在其他情况下，信号可以是激发和/或发射光谱或信号强度的变化。LCO已经用于或被提议用于多个不同的领域。大多数工作使用LCO作为标志物和成像剂进行。Klingstedt等人(Klingstedt T,Blechschmidt C,Nogalska A,Prokop S,Hggqvist B,Danielsson O,Engel WK,Askanas V,Heppner FL,NilssonKP.Chembiochem.2013；14(5):607-16.doi:10.1002/cbic.201200731)描述了LCO用于检测包含体蛋白(inclusion protein)的用途，而Klingstedt和Nilsson(Klingstedt T,Nilsson KP.Biochem Soc Trans.2012；40(4):704-10.doi:10.1042/BST20120009)阐释了发光物缀合的多聚噻吩和低聚噻吩用于成像蛋白聚集体的用途。
Nilsson等人(Nilsson KP,Lindgren M,Hammarstrm P.Methods MolBiol.2012；849:425-34.doi:10.1007/978-1-61779-551-0_29)已经使用了五聚LCO作为阴离子探针用于蛋白聚集体染色。US20140273000提供了使用将与蛋白聚集体(β-淀粉样物质、α-共核蛋白(synuclein)、亨廷素(huntingtin)、tau蛋白、超磷酸化的tau蛋白(pTau),朊病毒蛋白、αB-晶状体蛋白(CRYAB)、结蛋白(desmin)、含硒蛋白、肌动蛋白和/或肌球蛋白)结合的p-FTAA或发光物缀合的多聚噻吩(LCP)或与p-FTAA相关的LCO检测与异常蛋白聚集相关的疾病的方法，而WO2014125321涉及用于成像缀合至磁性纳米颗粒的LCO(q-FTAA)多模态剂用于检测错误折叠的蛋白。WO2013036196涉及用于在活的患者中成像淀粉样物质沉淀和聚集的蛋白中使用的噻吩化合物，且US2014135322涉及作为用于治疗由错误折叠或聚集的蛋白引起的疾病的治疗组合物的噻吩化合物。如可见的，以上出版物和专利申请涉及鉴定或治疗错误折叠的蛋白或聚集的蛋白。
美国专利US6841669提供官能化的噻吩低聚物作为蛋白、多克隆抗体或单克隆抗体或两者及其部分(fractions)、核酸、寡核苷酸、激素、药品(medicine)、药物(drug)、和非蛋白化学神经递质的荧光标记物。Bjork等人开发了基于具有两性离子肽样侧链的水溶性多聚噻吩POWT的生物传感器用于检测DNA和抗体抗原相互作用。(Bjrk P,Persson NK,Nilsson KPR,sberg P,Ingans O.Biosens Bioelectron.2005；20(9):1764-71)。类似地，WO2011102789描述了特异性结合神经干细胞和神经癌干细胞的低聚噻吩衍生物，然而该专利申请没有详细列出低聚噻吩结合的组分。
WO2010044744涉及用于在活的患者中成像淀粉样沉积和聚集蛋白的新的取代的噻吩衍生物。它还延伸到一些在生物体中天然的非疾病的淀粉样物质，诸如酵母朊病毒(Sup35)、Podospora anserina朊病毒(Het-s)、大肠杆菌蛋白(curlin)、疟疾包衣蛋白(malarial coat protein)、蜘蛛丝、哺乳动物的黑素体(pMel)、组织型纤溶酶原激活物(tPA)、降钙素以及经工程化以制造淀粉样物质的蛋白和肽。WO2014007730公开了用LCO检测碳水化合物的方法，然而WO2014007730没有提供任何感染诊断的方法。上述出版物或专利申请均未提供用于鉴定微生物肽或基于微生物肽或基于碳水化合物的结构诊断的解决方案。
本发明旨在通过使用特定的LCO来通过快速且简单的方法来精确检测和定量微生物靶来克服上述缺点。本发明填补了在WO2010044744中未鉴定的知识的新的空白，其中LCO仅靶向淀粉样物质蛋白。在非淀粉样物质靶上使用LCO不是寻常的且是在本发明中鉴定的新领域。在WO2014007730中公开了使用LCO检测碳水化合物的方法，然而WO2014007730没有提及检测微生物蛋白或肽。由于包含氨基酸的蛋白/肽和包含糖的碳水化合物的截然不同的化学组成和结构，没有预期LCO可应用于蛋白/肽。相对于依赖在测试的数天内持续表达微生物因子用于其检测的传统方法，根据本发明的方法将还降低与诊断和治疗相关的费用。根据本发明的方法还展示了可以用于检测特定细菌组分的新的结合靶。
发明概述
本发明的一个目标是提供用于检测微生物肽、微生物或微生物起源的化合物的方法。本发明的另一个目的是提供鉴定微生物肽、微生物或微生物起源的化合物的方法。本发明的又另一个目的是提供用于诊断来自任何样品的微生物、微生物肽或微生物起源的化合物的方法。本发明的仍另一个目的是提供用于定量微生物肽、微生物或微生物起源的化合物的方法。本发明的另一个目的是提供能够检测或鉴定或诊断或定量微生物、微生物肽或微生物起源的化合物的界面(interface)。
以上目的通过用于检测、鉴定和/或定量一种或更多种微生物、微生物肽或微生物起源的化合物的方法实现，所述方法包括步骤：
(a).使物品、物质或样品与LCO接触；
(b).检测a)的LCO的至少一个信号；
(c).基于b)中的所述检测到的信号，确定所述物品上或所述样品中所述一种或更多种微生物肽或微生物的存在、身份和/或量。
本发明存在多个优势，并且其中提供了能够容易地鉴定微生物肽和微生物、缩短检测和诊断时间、提供鉴定未培养的细菌的方法和另外提供降低诊断的主观方面的分析方法的方法。
附图简述
图1：使用LCO探针h-HTA-Glu检测微生物肽和区分来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，S.aureus)的两种微生物肽。
图2：使用LCO探针h-HTA-Glu检测微生物肽聚糖和区分来自两种革兰氏阳性微生物物种的肽聚糖。
图3：使用LCO探针h-HTA-Glu检测来自革兰氏阴性细菌中的肽聚糖的微生物肽。
图4：使用LCO探针p-HTEA检测真菌。
图5：使用LCO探针h-HTA-Glu检测和鉴定多个细菌物种。
图6：使用LCO探针h-FTAA检测肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis，S.enteritidis)的一个细菌菌株的变体。
图7：用于探查(profiling)、预测和诊断的LCO方法(图7A)和用于诊断的传统方法(图7B)。
详细描述
以下描述本发明的具体实施方案。在一个实施方案中，本发明是用于检测、鉴定和/或定量一种或更多种微生物、微生物肽、或微生物起源的化合物的方法，所述方法包括步骤：
(a).将物品、物质、或样品与LCO接触；
(b).检测a)的所述LCO的至少一个信号；以及
(c).基于b)中的所述检测到的至少一个信号，确定所述物品上或所述物质或样品中一种或更多种微生物肽、微生物、或微生物起源的化合物的存在、身份和/或量。
在一个实施方案中，以上方法还可以用于鉴定微生物和微生物肽以及用于诊断感染。在另一个方面，本发明因此涉及用于诊断感染和鉴定致病微生物的方法，所述感染产生一种或更多种微生物、微生物肽或微生物起源的化合物，所述方法包括步骤：
(a').将物品、物质或样品与LCO接触；
(b').检测a')的所述LCO的至少一个信号；以及
(c').将b’)中获得的所述检测到的至少一个信号与数据库进行比较，其中所述数据库包括来自之前已知的微生物肽的样品的检测到的信号的数据。
在一个实施方案中，本发明是用于检测、鉴定、和/或定量微生物肽的方法。在一个实施方案中，本发明是用于检测、鉴定和/或定量微生物的方法。在一个实施方案中，所述微生物肽已经与微生物、微生物肽或微生物起源的化合物结合或者接触，所述LCO结合或接触产生可以与数据库进行比较用于鉴定和诊断的独特信号。在一个实施方案中，产生的独特的信号由于LCO结合产生。在另一个实施方案中，发光的缀合低聚噻吩(LCO)已经与微生物、微生物肽或微生物起源的化合物结合或者接触，其产生可以与数据库进行比较用于鉴定和诊断感染的独特的信号。
在一个实施方案中，数据库包括来自至少一种微生物、微生物肽、或微生物起源的化合物的较早获得的样品的数据，其中所述数据包括至少一种微生物、微生物肽、或微生物起源的化合物的所述较早获得的样品的检测信号。在一个实施方案中，微生物起源的化合物可以是微生物碳水化合物。优选地所述数据是多于一个较早获得的样品的平均值或者单个样品的数据。所述数据可以是多于一个较早获得的样品的汇编或者单个样品的数据。在另一个实施方案中，数据库包括原始形式和分析形式二者的数据，所述数据已经被整理和/或呈现用于系统比较或存储。数据可以使用比率分析或多变量分析，例如聚类分析、主成分分析(PCA)、因素分析和层级聚类，来解释或分析。数据还可以使用更复杂的机器学习方法，诸如线性判别分析，来解释或分析。在另一个实施方案中，本发明的方法另外包括步骤：
(a").将所述样品、物品或物质的所述至少一个检测到的信号与包括已知样品的检测到的信号的数据的数据库进行比较；
(b").对所述检测到的信号关于所述数据库中的之前样品的数据进行统计学分析；以及
(c").基于从步骤(b")获得的结果鉴定和/或定量。
所述方法的步骤的任一个可以在体外、在体内或原位进行，并且可以依序地或连续地进行。这些步骤可以是人工的或自动化的。在一个实施方案中，至少步骤a)和/或步骤b)在体内、在体外或原位进行。在另一个实施方案中，至少步骤a')和/或步骤b')在体内、在体外或原位进行。在另一个实施方案中，至少步骤a")和/或步骤b")在体内、在体外或原位进行。并且在又另一个实施方案中，至少一个或全部步骤在体内、在体外或原位进行。
在所述方法中，物品、物质或样品可以来自人类、动物或环境起源，或者从可以“独立”的物品或已经被置于与人类受试者、动物、生物或环境起源相互作用的物品获得，所述物品另外被置于与在溶液中自由可得的或与表面附接的LCO相接触。在一个实施方案中，所述物品、物质或样品/较早获得的样品是人类、动物、生物或环境起源的。在另一个实施方案中，所述物品、物质或样品/较早获得的样品来自物品，优选地所述物品可以“独立”或者已经被置于与人类受试者、动物、生物或环境起源相互作用。例如，样品可以起源自身体中的物品诸如植入物。样品、物质或物品可以被另外处理以收集或去除附接的LCO。
根据本发明使用的LCO的长度在从四聚体至十二聚体的范围，并且优选地长度为五聚体或七聚体。在一个实施方案中，所述LCO是四聚体至十二聚体LCO。在另一个实施方案中，所述LCO是四聚体至十五聚体LCO。在另一个实施方案中，所述LCO是五聚体或七聚体LCO。一个实施方案包括不同长度的混合物。
LCO可以根据本发明用选自包括诸如但不限于以下的组的侧链修饰：羧酸、乙酸、丙酸、氨基酸、氨基酸衍生物、神经递质、单糖、多糖、核酸和衍生物以及其组合。在一个实施方案中，所述LCO包含噻吩单体和/或具有一个或更多个官能基团或侧链的噻吩单体。在另一个实施方案中，所述官能基团或侧链选自由以下组成的组：羧酸、乙酸、丙酸、氨基酸、氨基酸衍生物、神经递质、单糖、多糖、核酸和衍生物以及其组合。但是本发明不应被视为受这些官能基团或侧链限制，其他变体是可能的。在另一个实施方案中，所述LCO包含至少一种噻吩聚物(thiophene-mer)并且所述噻吩聚物与选自由以下组成的组的其他杂环聚物(heterocyclic mer)交换：吲哚、硒吩、噻唑、亚苯基、芴、吡咯、喹喔啉或苯并二噻唑。
所述LCO中的修饰可以是末端的或者在LCO的主链/骨架中。七聚体LCO的实例是h-FTAA、h-HTAA和h-HTA-Glu，并且所述五聚体LCO是p-HTA-His、p-HTA-Lys、p-HTEA、p-HTIm、p-HTA-Tyr、p-HTA-Arg、p-HTA-Asp和p-HTA-Glu中的任一种。在一个实施方案中，所述七聚体LCO是h-FTAA、h-HTAA和h-HTA-Glu，并且所述五聚体LCO是p-HTA-His、p-HTA-Lys、p-HTEA、p-HTIm、p-HTA-Tyr、p-HTA-Arg、p-HTA-Asp和p-HTA-Glu中的任一种。
在本发明中，信号在LCO与靶相互作用时检测，所述靶是可被分泌、定位在细胞内、或定位至微生物的膜或细胞壁的微生物肽、微生物或微生物起源的化合物。所述方法还检测微生物起源的碳水化合物和肽的组合。信号可以使用不同的方法评估。在一个实施方案中，所述至少一个检测到的信号是光学信号、电信号、电化学信号或磁信号。在一个实施方案中，检测信号是由以下组成的组中的至少两个信号的组合：光学信号、电信号、电化学信号和磁信号。在另一个实施方案中，所述检测信号是光学信号，诸如荧光或比色信号；用基于电性质诸如导电率、电阻率或电容率检测的电信号；用基于电化学性质诸如电荷存储能力、阻抗和氧化还原电势检测的电化学信号；或者如在基于霍尔效应的和基于线圈的磁性检测器或其组合中检测的磁信号。只要获得了至少一个信号，它可以被进一步分析和与从靶和LCO之间的较早的相互作用的较早获得的信号进行比较。这些信号可以被归档为可以远程评估的数据库。但是，无论比较数据库中的数据是如何收集的，本发明都起作用。所述方法是强有力的并且能够在微生物肽之间、微生物起源的化合物之间和一种微生物和其他微生物之间彼此区分。可以使用本发明方法检测的微生物、微生物起源的化合物、或微生物肽是细菌、病毒、藻类或真菌。在一个实施方案中，描述了用于检测、鉴定和/或定量来自细菌、病毒、藻类或真菌的微生物肽的方法。在另一个实施方案中，方法能够区分至少两种不同的微生物、微生物肽、微生物起源的化合物、细菌、病毒、藻类或真菌。所述方法提供了区分革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌的机会。在一个实施方案中，所述方法区分革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌。在一个实施方案中，所述方法检测、鉴定和/或定量硬壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、衣原体门(Chlamydiae)、放线菌门(Actinobacteria)和螺旋体门(Spirochaetes)中的至少一种。在一个实施方案中，所述方法检测、鉴定和/或定量病毒蛋白的片段诸如肽。在另一个实施方案中，方法能够区分硬壁菌门和变形菌门。其中所述方法可以检测、鉴定和/或定量微生物或微生物肽的感兴趣的肽是结构肽诸如柄状肽(stem peptide)和接头肽(linker peptide)或桥肽(bridgepeptide)、抗微生物肽诸如细菌素、信号传送肽(signalling peptides)诸如群体感应分子例如葡萄球菌群体感应自诱导肽(AIP)。在此情况中，信号传送肽可以是调节性的和/或分泌性的。
在一个实施方案中，所述方法检测、鉴定和/或定量选自由以下组成的组的属的细菌：博代氏杆菌属(Bordetella)、包柔螺旋体属(Borrelia)、布鲁氏属菌(Brucella)、弯曲菌属(Campylobacter)、埃希氏菌属(Escherichia)、弗朗西斯氏菌属(Francisella)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、螺旋杆菌属(Helicobacter)、军团菌属(Legionella)、钩端螺旋体属(Leptospira)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、假单胞菌属(Pseudomonas)、立克次氏体属(Rickettsia)、沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、希瓦氏菌属(Shewanella)、尿素支原体属(Ureaplasma)、密螺旋体属(Treponema)、弧菌属(Vibrio)、耶尔森菌属(Yersinia)、链球菌属(Streptococcus)、衣原体属(Chlamydia)、梭菌属(Clostridium)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、肠球菌属(Enterococcus)、李斯特菌属(Listeria)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、微球菌属(Micrococcus)、念珠菌属(Candida)、分枝杆菌属(Mycobacterium)或支原体属(Mycoplasma)。但是本发明不被视为由这些细菌限制，其他细菌是可以设想的。所述方法优选地检测、鉴定、定量或诊断选自由以下组成的组的细菌：百日咳博代氏杆菌(Bordetella pertussis)、伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、流产布鲁氏菌(Brucella abortus)、犬布鲁氏菌(Brucellacanis)、羊布鲁氏菌(Brucella melitensis)、猪布鲁氏菌(Brucella suis)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、白色念珠菌(Candida albicans)、光滑念珠菌(Candidaglabrata)、大肠杆菌(Escherichia coli)、土拉热弗朗西斯氏菌(Francisellatularensis)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza)、幽门螺杆菌(Helicobacterpylori)、嗜肺军团杆菌(Legionella pneumophila)、肾脏钩端螺旋体(Leptospirainterrogans)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)、淋病奈瑟氏菌(Neisseriagonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitides)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、立氏立克次体(Rickettsia rickettsia)、肠炎沙门氏菌(Salmonellaenteritidis)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)、宋内志贺氏菌(Shigella sonnei)、梅毒螺旋体(Treponema palladium)、霍乱弧菌(Vibrio cholera)、鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)、肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)、艰难梭菌(Clostridium difficile)、产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、白喉棒状杆菌(Corynebacteriumdiphtheria)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、屎肠球菌(Enterococcus faecum)、单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)、化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)、肺炎衣原体(Chlamydiapneumoniae)、鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci)、沙眼衣原体(Chlamydiatrachomatis)、麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、结核分支杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)和肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)。
在另一个实施方案中，在本发明中使用的LCO呈静止的形式(immobile format)。LCO和所述物品、样品或物质之间的相互作用可以是液体:液体、液体:固体、固体:液体和/或固体:固体相互作用的形式。在一个实施方案中，方法可以连续地运行。在一个实施方案中，LCO以固定的方式布置在表面上，并且其中允许所述样品、物品或物质通过并与LCO在连续流中反应；或者所述样品以固定的方式布置在表面上，并且其中允许LCO通过并且与样品在连续流中接触。本发明方法的一个实施例可以是在导管中，其中LCO在表面上以固定的方式布置，并且其中允许所述样品、物品或物质通过并且与LCO在连续流中接触。另一个可选择的布置可以是其中所述样品、物品或物质以固定的方式布置在表面上，并且允许LCO通过并与样品、物品或物质在连续流中接触。当允许样品、物品或物质与LCO接触时，任何类型的化学相互作用是可设想的，诸如但不限于范德瓦尔斯结合、氢键合、疏水和静电相互所用和共价相互作用。
在一个实施方案中，LCO包含至少一个间隔物。在另一个实施方案中，间隔物选自由以下组成的组：聚乙二醇、聚乙烯醇、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚丙烯酰胺和聚乙烯吡咯烷酮。在一个实施方案中，LCO通过至少一个间隔物被附接到表面。然而本发明不应被视为受这些间隔物限制，其他间隔物是可能的。
在一个实施方案中，LCO被连接至至少一种有机或无机材料，所述有机或无机材料包括选自由金属、半导体材料和聚合物化合物组成的组中的一种或更多种。在一个实施方案中，LCO被连接至包括选自由金属、半导体材料和聚合物化合物组成的组的一种或更多种的纳米颗粒。
在一个实施方案中，根据本发明的方法可以用于从样品或物品收集或去除所有上述形式的LCO。在一个实施方案中，方法适合于去除或收集探针。当LCO被缀合至运载体或纳米颗粒时，一个可能的感兴趣的领域是样品收集/浓缩。
本发明的一个方面是包含如之前提及的LCO的试剂盒，以及其在检测、鉴定和/或定量一种或更多种微生物、微生物肽或微生物起源的化合物以及感染的诊断中使用的说明书。在一个实施方案中，试剂盒可以是但不限于以下形式：乳液例如乳膏剂、洗剂、软膏剂，或者织物例如创可贴、垫、衣物或结合例如固定在管、盘、烧瓶中或类似的工具(means)中的表面；固定至多孔板、固定至金属表面或者在溶液中例如喷雾、小瓶、液体等。在又另一个实施方案中，本发明提供了试剂盒或商业包装，所述试剂盒或商业包装包含检测、鉴定或定量微生物肽和微生物的LCO以及LCO的已知的结合靶，和用于使用包装内容物作为用于校正目的的测试参考的说明。试剂盒还可以用于不同目的包括但不限于教育或训练。
在仍另一个实施方案中，本发明提供了用户界面以组织和/或进行从LCO收集的信号的算法/数学/统计变换和/或将来自LCO的信号呈现给用户。所述用户界面可以另外包括数据输出功能和数据比较功能。所述数据输出功能和数据比较功能可以允许输出收集的数据并然后与包含LCO相互作用的知识的所述数据库中的已知数据进行比较。界面具有归档的数据库或远程接入数据库。
本发明的另一个方面涉及包括计算机可读的存储介质的计算机程序产品，所述计算机可读的存储介质具有当被具有处理能力的设备执行时适于进行之前提及的分析的指令，所述分析优选地统计分析，优选地比率分析或多变量分析，例如聚类分析、主成分分析(PCA)、因素分析和层级聚类。在另一个实施方案中，所述计算机程序产品适于对获得的结果进行比率分析或多变量分析。
在另一个实施方案中，所述多变量分析选自由PCA和层级聚类组成的组。在一个实施方案中，分析可以是机器学习的形式。在一个实施方案中，机器学习是回归方法，优选地线性判别分析。在另一个实施方案中，计算机程序产品包括计算机可读的存储介质，所述计算机可读的存储介质具有适于对从与LCO接触的样品收集的检测信号的算法/数学/统计变换和/或将与LCO接触的样品的检测信号呈现给用户的指令，其中所述计算机程序产品优选地包括：
a″′)数据输出功能
b″′)与包含根据本发明的LCO相互作用的数据的数据库的数据比较功能；以及
c″′)用于绘制图和/或数据呈现的功能。
本发明的另一个方面涉及至少一种LCO用于检测、鉴定和/或定量一种或更多种微生物、微生物肽或微生物起源的化合物以及用于感染的诊断的用途。
实施例：
实施例1：微生物肽的检测
a.微生物肽的检测和两种微生物肽之间的区别。
制备包含1ml的以下的试管：i)金黄色葡萄球菌柄状肽(Sigma，2mM在30％v/v乙腈/PBS中)；ii)金黄色葡萄球菌五甘氨酸肽(Sigma，2mM在100％v/v甲酸/PBS中)；iii)PBS中金黄色葡萄球菌菌株8325-4的细胞(Novick，R.1967Virology.33∶1，p155-66)(通过离心1ml胰酶大豆肉汤(TSB)中的过夜培养物制备)；和iv)PBS，pH 7.4。图1示出了向提取的柄状肽(--)、提取的五甘氨酸肽(-)、金黄色葡萄球菌细胞(--)和PBS(----)添加h-HTA-Glu(3μM终浓度)后记录的激发光谱(300nm-550nm)。与PBS对照相比，柄状肽、五甘氨酸肽和完整的金黄色葡萄球菌细胞全部示出了改变的光学特征，其可以用于区分不同的微生物肽。RFU＝相对荧光单位。
b.微生物肽聚糖的检测和来自两种革兰氏阳性微生物物种的肽聚糖之间的区分。
将包含从金黄色葡萄球菌(Sigma)和藤黄微球菌(Sigma)提取的肽聚糖的1ml悬浮液(1mg/ml)的冷冻的试管解冻。在加入h-HTA-Glu(3μM终浓度)后，将管孵育(37℃，1h)，然后记录激发光谱(300nm-550nm)(图2A)。与来自金黄色葡萄球菌(----)和藤黄微球菌(M.luteus)的肽聚糖混合的h-HTA-Glu的峰RFU彼此完全不同并且与阴性对照(3μM h-HTA-Glu于蒸馏水中)(--)完全不同。通过绘制归一化光谱，将每个光谱的最大值设置为1.0，来自金黄色葡萄球菌和藤黄微球菌的肽聚糖的光谱的改变的性质与阴性对照相比是明显的(图2B)。因此荧光光谱提供了用于区分来自不同物种的肽聚糖的方法。
c.来自革兰氏阴性细菌的微生物肽的检测。
尽管革兰氏阳性细菌的细胞壁可以充当用于提取肽聚糖肽的优良来源，但革兰氏阴性细菌周质中的薄肽聚糖层不易纯化。在没有商购可得的来自革兰氏阴性细菌的肽聚糖的情况下，因为氨苄青霉素对肽聚糖肽交联的影响，用氨苄青霉素处理可用于改变肽聚糖结构。本实验利用未经处理的或用不同浓度的氨苄青霉素处理以代表正常和改变的肽聚糖结构的大肠杆菌(E.coli)细菌来分析h-HTA-Glu是否结合i)革兰氏阴性菌和ii)来自革兰氏阴性细菌的肽聚糖肽。在96孔板中制备从100μg/ml氨苄青霉素(Sigma)开始的连续稀释液(在100μl LB培养基中1∶1)。向每个孔中加入100μl在含6μM h-HTA-Glu的LB中以1∶50v/v稀释的大肠杆菌分离株编号12的过夜培养物(从Karolinska University Hospital的患肾盂肾炎的儿童获得，发表于Kai-Larsen等人.2010PLoS Pathogens 6∶7，e1001010)。将大肠杆菌加入到96孔板中的氨苄青霉素的稀释效应产生50μg/ml的最大氨苄青霉素浓度。也包括空白(含3μM h-HTA-Glu的LB中的100μg/ml氨苄青霉素，无细菌)。在37℃孵育20小时后，记录激发光谱(300nm-550nm)。图3A示出了与经历50μg/ml(-----)、25μg/ml(--)、12.5μg/ml(----)、6.25μg/ml(----)和3.13μg/ml(--)氨苄青霉素的大肠杆菌细胞以及空白(-)混合的h-HTA-Glu的归一化激发光谱。激发峰向更长波长的移动表明h-HTA-Glu能够结合大肠杆菌细菌。
为了获得更详细的信息，通过绘制归一化光谱中的每个点除以空白中的相应点(图3B)来量化移动的变异。变换图示出了暴露于不同浓度的氨苄青霉素的大肠杆菌细菌的归一化RFU比率，12.5μg/ml给出最大信号。由于肽聚糖结构被氨苄青霉素改变，并且归一化RFU比率在不同氨苄青霉素浓度变化，所以本实验示出了h-HTA-Glu结合大肠杆菌肽聚糖。
在图3C中示出了氨苄青霉素的杀伤作用，其中将细菌生长(-)对氨苄青霉素的增加的浓度作图。在允许细菌生长的足够低的抗生素浓度，从将(B)中每条曲线的最大归一化RFU比率对相应的氨苄青霉素浓度作图得到的峰归一化RFU比率(--)是空白的2.5倍。这证实了h-HTA-Glu与大肠杆菌细菌的结合。有趣的是，随着光密度的下降，发生在12.5μg/ml的增加。这代表当肽聚糖被抗生素显著改变但不足以杀死细菌时的中间状态。总的来说，这些实验说明了LCO结合来自革兰氏阴性细菌的肽聚糖肽的能力。RFU＝相对荧光单位，OD＝光密度，误差棒＝来自3次实验的标准偏差。图3C中的x轴是对数缩放的。
d.真菌的检测。
为了分析LCO用于真菌检测的用途，向含白色念珠菌(C.albicans，ATCC菌株MYA-2876)的过夜培养物的1％v/v接种物的2ml酵母马铃薯葡萄糖(YPD)培养基添加p-HTEA(3μM终浓度)。涡旋后，200μl等分试样与阴性对照(具有3μM p-HTEA的YPD，无白色念珠菌)被转移到96孔板。将板在潮湿气氛中在37℃孵育48h，同时记录激发光谱(300nm-500nm)。图4A示出了与无真菌的YPD(--)相比，与YPD培养基中的白色念珠菌混合的p-HTEA(-----)的微小但是明确的光谱位移。接下来，将培养基从每个孔小心地去除，不干扰真菌细胞层，并加入200μl人血液/孔，除了阳性对照接受新鲜YPD培养基。再次记录激发光谱。图4B示出了来自与血液中的白色念珠菌混合的p-HTEA(-----)的显著信号，而来自不含白色念珠菌的血液中的p-HTEA(-)的信号非常低。总体来说，这表明LCO p-HTEA在实验室条件下和用人类样品检测酵母白色念珠菌的用途。
实施例2：检测和鉴定多个细菌物种用于诊断
LCO用于检测和鉴定细菌菌株的用途使用密切相关的葡萄球菌物种的分离株证明。将来自从Karolinska University Hospital获得的金黄色葡萄球菌(菌株HY-886、HY-836/91、HY-686、HY-834、HY-842)和表皮葡萄球菌(S.epidermidis，菌株HY-840、HY-822/1、HY-839/91、HY-844/1、HY-842/1、HY-829、HY-832/10)的临床分离株在胰酶大豆肉汤中的过夜培养物的100μl在10ml TSB中稀释，然后以1ml等分试样分装在试管中，向其中加入h-HTA-Glu至最终浓度为2μM。混合后，将200μl的各培养物一式三份地加入到96孔板中，将板在37℃孵育18-24h，然后记录激发光谱(300nm-550nm)。图5A示出了激发光谱的热图表示和Bray-Curtis层级聚类分析，后者清楚地区分了两种葡萄球菌物种：表皮葡萄球菌菌株聚类到左侧(-)且金黄色葡萄球菌菌株聚类到右侧(----)。图5B示出了激发光谱的主成分分析(PCA)，揭示了金黄色葡萄球菌(○)菌株在图的上部的聚类和表皮葡萄球菌(●)在图的下部的聚类。因此，层级聚类分析和PCA代表了基于LCO的细菌物种鉴别的两种独立分析方法。图5C示出了机器学习可以用于预测从住院患者分离的未知细菌菌株的鉴定。显示用于已知的金黄色葡萄球菌菌株和已知的凝固酶阴性葡萄球菌(CNS)菌株的从机器学习过程衍生的线性判别预测。当将来衍生自未知菌株的机器学习过程的线性判别预测添加到与金黄色葡萄球菌和CNS相同的曲线图中时，我们发现未知菌株具有阳性线性判别投影，其被归类为CNS菌株，以及具有阴性线性判别投影的菌株，其被归类为金黄色葡萄球菌。
为了证明LCO用于鉴定混合样品中的细菌菌株的用途，将金黄色葡萄球菌菌株HY-834和表皮葡萄球菌菌株HY-840的过夜培养物以100∶0(●)、75：25(■)、50∶50、25∶75(口)和0∶100(○)的比率混合，并加入h-HTA-Glu(3μM终浓度)。在37℃孵育30分钟后，将200μl的各样品转移至96孔板中。记录激发光谱(300nm-550nm)并进行PCA分析。图5D示出了具有纯金黄色葡萄球菌的样品位于PCA图的底部。随着表皮葡萄球菌在混合培养物中数量的增加，点沿着PC2轴以可预测的模式向上移动，到达纯表皮葡萄球菌样品中的顶部位置。这证明了h-HTA-Glu鉴定存在于混合样品的细菌并确定其相对浓度的可行性。
实施例3：检测一个细菌菌株的变体
由于遗传差异，存在一个细菌菌株的多种变体。这些菌株，除了在特定基因中的确定突变以外具有相同的基因型，表现出蛋白质、微生物化合物和毒力因子的不同的表达模式，这可能深刻地影响感染的病理生理学。图6A示出了在28℃孵育的、在含刚果红的不含盐的LB琼脂板上观察到的肠炎沙门氏菌(S.enteritidis)菌株3934(Solano等人.1998J ClinMicrobiol.36(3)：674-8)的红色、干燥且粗糙(rdar)的菌落形态。这是表达curli和纤维素的细菌的特征形态。不能表达curli(3934ΔcsgA)、纤维素(3934ΔbcsA)或二者(3934ΔcsgD)(Latasa等人.2005Mol Microbiol.58(5)：1322-39)的突变菌株显示明显不同的菌落形态。
为了测试LCO是否可用于鉴定四种不同的菌株，使用无菌环收获在28℃在不含盐的Luria-Bertani(LB)琼脂板上生长48小时的各菌株的菌落，并重悬于0.5ml PBS，pH 7.4中。超声处理悬浮液，然后在PBS中稀释至约OD600＝0.2。将每种悬浮液的180μl等分试样转移至96孔板，并向每个孔中加入20μl h-FTAA(1μM终浓度)。还包括阴性对照(含有h-FTAA的PBS，无细菌)。记录激发光谱(300nm-600nm)，并且对在450nm-520nm区间收集的数据进行PCA分析。图6B示出了缺乏纤维素生产的菌株(3934ΔbcsA(■)、3934ΔcsgD(●))聚类在图的底部，而产生纤维素的菌株(3934(○)和3934ΔcsgA(口))位于图的顶部。总的来说，这表明LCO从表型上区分相同物种的菌株，和预测/确定蛋白、微生物化合物和毒力因子表达的用途。

Claims (28)

1.用于检测、鉴定和/或定量一种或更多种微生物、微生物肽、或微生物起源的化合物的方法，所述方法包括步骤：
(a).将物品、物质、或样品与发光的缀合低聚噻吩(LCO)接触；
(b).检测a)的所述发光的缀合低聚噻吩(LCO)的至少一个信号；以及
(c).基于b)中的所述检测到的至少一个信号，确定所述物品上或所述物质或样品中一种或更多种微生物肽、微生物、或微生物起源的化合物的存在、身份和/或量。
2.用于诊断感染和鉴定致病微生物的方法，所述感染产生一种或更多种微生物、微生物肽、或微生物起源的化合物，所述方法包括步骤：
(a').将物品、物质、或样品与发光的缀合低聚噻吩(LCO)接触；
(b').检测a')的所述发光的缀合低聚噻吩(LCO)的至少一个信号；以及
(c').将b')中获得的所述检测到的至少一个信号与数据库进行比较，其中所述数据库包括来自之前已知的微生物肽的样品的检测到的信号的数据。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述发光的缀合低聚噻吩(LCO)已经与微生物、微生物肽或微生物起源的化合物结合或者接触，所述LCO结合或接触产生可以与数据库比较的独特的信号，用于感染的鉴定和诊断。
4.根据权利要求2-3所述的方法，其中所述数据库包括来自至少一种微生物、微生物肽或微生物起源的化合物的较早获得的样品的数据，其中所述数据包括所述至少一种微生物、微生物肽或微生物起源的化合物的较早获得的样品的检测信号，其中所述数据是多于一个较早获得的样品的平均值或者单个样品的数据。
5.根据权利要求1-3所述的方法，所述方法还包括步骤：
(a").将所述物品、物质或样品的所述至少一个检测到的信号与包括已知样品的检测到的信号的数据的数据库进行比较；
(b").对所述检测到的信号关于所述数据库中的之前的样品的数据进行统计学分析；以及
(c").基于从步骤(b")获得的结果鉴定和/或定量。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述发光的缀合低聚噻吩(LCO)是四聚体至15聚体发光的缀合低聚噻吩(LCO)。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述发光的缀合低聚噻吩(LCO)是五聚体或七聚体发光的缀合低聚噻吩(LCO)。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述发光的缀合低聚噻吩(LCO)包含噻吩单体和/或具有一个或更多个官能基团或侧链的噻吩单体。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述官能基团或侧链选自由以下组成的组：羧酸、乙酸、丙酸、氨基酸、氨基酸衍生物、神经递质、单糖、多糖、核酸和衍生物以及其组合。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述发光的缀合低聚噻吩(LCO)包括至少一种噻吩聚物并且其中所述噻吩聚物与选自由以下组成的组的其他杂环聚物交换：吲哚、硒吩、噻唑、亚苯基、芴、吡咯、喹喔啉、或苯并二噻唑。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述至少一个检测到的信号是光学信号、电信号、电化学信号或磁信号。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，用于检测、鉴定和/或定量来自细菌、病毒、藻类或真菌的微生物肽。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法能够区分至少两种不同的微生物、微生物肽、微生物起源的化合物、细菌、病毒、藻类或真菌。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法能够区分革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法检测、鉴定和/或定量硬壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、衣原体门(Chlamydiae)、放线菌门(Actinobacteria)和螺旋体门(Spirochaetes)中的至少一种。
16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法能够区分硬壁菌门和变形菌门。
17.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法检测、鉴定和/或定量选自由以下组成的属的细菌：博代氏杆菌属(Bordetella)、包柔螺旋体属(Borrelia)、布鲁氏菌属(Brucella)、弯曲菌属(Campylobacter)、埃希氏菌属(Escherichia)、弗朗西斯氏菌属(Francisella)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、螺旋杆菌属(Helicobacter)、军团菌属(Legionella)、钩端螺旋体属(Leptospira)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、假单胞菌属(Pseudomonas)、立克次氏体属(Rickettsia)、沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、希瓦氏菌属(Shewanella)、尿素支原体属(Ureaplasma)、密螺旋体属(Treponema)、弧菌属(Vibrio)、耶尔森菌属(Yersinia)、链球菌属(Streptococcus)、衣原体属(Chlamydia)、梭菌属(Clostridium)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、肠球菌属(Enterococcus)、李斯特菌属(Listeria)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、微球菌属(Micrococcus)、念珠菌属(Candida)、分枝杆菌属(Mycobacterium)或支原体属(Mycoplasma)。
18.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法检测、鉴定和/或定量选自由以下组成的组的细菌：百日咳博代氏杆菌(Bordetella pertussis)、伯氏疏螺旋体(Borreliaburgdorferi)、流产布鲁氏菌(Brucella abortus)、犬布鲁氏菌(Brucella canis)、羊布鲁氏菌(Brucella melitensis)、猪布鲁氏菌(Brucella suis)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、白色念珠菌(Candida albicans)、光滑念珠菌(Candidaglabrata)、大肠杆菌(Escherichia coli)、土拉热弗朗西斯氏菌(Francisellatularensis)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza)、幽门螺杆菌(Helicobacterpylori)、嗜肺军团杆菌(Legionella pneumophila)、肾脏钩端螺旋体(Leptospirainterrogans)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)、淋病奈瑟氏菌(Neisseriagonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitides)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、立氏立克次体(Rickettsia rickettsia)、肠炎沙门氏菌(Salmonellaenteritidis)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)、宋内志贺氏菌(Shigella sonnei)、梅毒螺旋体(Treponema palladium)、霍乱弧菌(Vibrio cholera)、鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)、肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)、艰难梭菌(Clostridium difficile)、产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、白喉棒状杆菌(Corynebacteriumdiphtheriae)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、屎肠球菌(Enterococcus faecum)、单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)、化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)、肺炎衣原体(Chlamydiapneumoniae)、鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci)、沙眼衣原体(Chlamydiatrachomatis)、麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、结核分支杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)和肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)。
19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中至少一个或全部步骤在体内、在体外或原位进行。
20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法可以连续地运行。
21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述发光的缀合低聚噻吩(LCO)包含至少一个间隔物，所述间隔物进一步包括选自由以下组成的组的一种或更多种：聚乙二醇、聚乙烯醇、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚丙烯酰胺和聚乙烯吡咯烷酮。
22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述发光的缀合低聚噻吩(LCO)连接至包括选自由以下组成的组的一种或更多种的至少一种有机或无机材料：金属、半导体材料和聚合物化合物。
23.一种计算机程序产品，所述计算机程序产品包括计算机可读的存储介质，所述计算机可读的存储介质具有当被具有处理能力的设备执行时适于进行权利要求5中的步骤b'")的分析的指令。
24.根据权利要求23所述的计算机程序产品，其中所述计算机程序产品适于对所获得的结果执行比率分析或多变量分析或机器学习。
25.根据权利要求23-24所述的计算机程序产品，其中所述基础多变量分析选自由主成分分析(PCA)和层级聚类组成的组；和/或机器学习是回归方法，优选地线性判别分析。
26.根据权利要求23-25所述的计算机程序产品，所述计算机程序产品包含计算机可读的存储介质，所述计算机可读的存储介质具有适于对从与发光的缀合低聚噻吩(LCO)接触的样品收集的检测信号进行算法/数学/统计变换和/或将来自与发光的缀合低聚噻吩(LCO)接触的样品的检测信号呈现给用户的指令，其中所述计算机程序产品优选包括：
a'")数据输出功能；
b'")与包含根据前述权利要求中任一项所述的发光的缀合低聚噻吩(LCO)相互作用的数据的数据库进行数据比较的功能；
c'")用于绘制曲线图和/或数据呈现的功能。
27.一种试剂盒，所述试剂盒包含如权利要求1-22中任一项所提及的发光的缀合低聚噻吩(LCO)以及其用于检测、鉴定和/或定量一种或更多种微生物、微生物肽或为生物起源的化合物以及感染的诊断的说明。
28.至少一种发光的缀合低聚噻吩LCO用于检测、鉴定和/或定量一种或更多种微生物、微生物肽、或微生物起源的化合物的用途和/或用于感染的诊断的用途。
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