CN108359659B - 一种热稳定性高的碱性蛋白酶BmP突变体及其编码基因 - Google Patents

一种热稳定性高的碱性蛋白酶BmP突变体及其编码基因 Download PDF

Info

Publication number
CN108359659B
CN108359659B CN201810118581.7A CN201810118581A CN108359659B CN 108359659 B CN108359659 B CN 108359659B CN 201810118581 A CN201810118581 A CN 201810118581A CN 108359659 B CN108359659 B CN 108359659B
Authority
CN
China
Prior art keywords
bmp
mutant
alkali protease
ala
val
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201810118581.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108359659A (zh
Inventor
刘丹妮
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hengqin Zhong Tai Biology And Medicine Co Ltd
Original Assignee
Hengqin Zhong Tai Biology And Medicine Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hengqin Zhong Tai Biology And Medicine Co Ltd filed Critical Hengqin Zhong Tai Biology And Medicine Co Ltd
Priority to CN201810118581.7A priority Critical patent/CN108359659B/zh
Publication of CN108359659A publication Critical patent/CN108359659A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108359659B publication Critical patent/CN108359659B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
    • C12N9/54—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea bacteria being Bacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21106—Hepsin (3.4.21.106)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及蛋白质分子改造领域，具体涉及一种热稳定性高的碱性蛋白酶BmP突变体及其编码基因和应用。本发明所述的碱性蛋白酶BmP突变体的突变位点为：T175I、G210Q和G270S。本发明突变体BmP‑mut在75℃水浴5min后的酶活保留率为70％，而碱性蛋白酶BmP在75℃水浴5min后的酶活保留率仅为9％。因此，本发明的获得的碱性蛋白酶突变体BmP‑mut具有良好的热稳定性，为其产业化应用奠定基础。

Description

一种热稳定性高的碱性蛋白酶BmP突变体及其编码基因
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种热稳定性高的碱性蛋白酶BmP突变体及其编码基因和应用。
背景技术
蛋白酶能使蛋白质降解生成氨基酸、多肽，因其也能够分解多肽，所以也称为肽酶。由于蛋白酶具有的水解作用，蛋白酶被广泛用于食品、洗涤、饲料等工业领域。蛋白酶根据作用pH环境，可以分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶以及碱性蛋白酶。酸性蛋白酶主要来源于曲霉、木霉等丝状真菌，中性和碱性蛋白酶主要来源于芽孢杆菌。
目前芽孢杆菌属蛋白酶的研究主要集中于枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌蛋白酶，其他芽孢杆菌类的蛋白酶研究相对较少。本实验室前期通过克隆表达得到了莫海威芽孢杆菌(Bacillus mojavensis)的碱性蛋白酶简称BmP，通过对不同蛋白质原料(包括豆粕、羽毛等)的分解实验，发现BmP具有很好的分解能力，在食品及饲料等工业领域具有很大的应用潜力。但是BmP热稳定性差，在高温(温度大于70℃)下容易分解失活，限制了其产业化应用。因此提高BmP的热稳定性，是BmP产业化应用急需解决的问题。
中国专利申请201110220386.3从微生物特别是嗜碱芽孢杆菌分离野生型碱性蛋白酶基因，对其Glu110、Glu134的氨基酸残基进行突变，经在枯草芽孢杆菌中高效表达，检测其发酵液酶活力达到1985U/mL，在40℃下，该低温碱性蛋白酶(Glu110&134Ala)比野生型碱性蛋白酶活力提高了28％；在10℃下，比野生型碱性蛋白酶活力提高了62％。
中国专利申请201080019156.4提供一种碱性蛋白酶变体，其源自于由SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列构成的或由与其具有90％或更高一致性的氨基酸序列构成的碱性蛋白酶，该变体具有突变，其中一个或多个选自于所述SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列的(a)位点6、(b)位点15、(c)位点16、(d)位点65、(e)位点66、(f)位点82、(g)位点83、(h)位点204、(i)位点319和(j)位点337或其对应位点的氨基酸残基被取代。
201310243800.1涉及一种耐有机溶剂蛋白酶，具体涉及其突变基因及其编码的蛋白质。从序列表的SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3可见，本发明所述耐有机溶剂碱性蛋白酶在原核苷酸序列的第385或第436发生了定点突变，即其成熟肽段的第24位突变氨基酸为谷氨酸或者谷氨酰胺；第41位氨基酸为丙氨酸或者赖氨酸。突变后的四种编码后的蛋白质的有机溶剂，特别是亲水性有机溶剂的耐受性明显大大加强。
发明内容
本发明对来源于莫海威芽孢杆菌(Bacillus mojavensis)碱性蛋白酶BmP进行蛋白质分子改造，从而提高BmP在高温环境下的稳定性，为BmP的产业化应用奠定基础。
本发明的目的是提供一种热稳定性高的BmP的突变体BmP-mut。
本发明的再一目的是提供提高热稳定性BmP突变体BmP-mut的编码基因。
一种热稳定性高的碱性蛋白酶BmP突变体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
原始碱性蛋白酶BmP的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示。与碱性蛋白酶BmP相比，突变体BmP-mut包含的突变位点为T175I、G210Q和G270S。突变体BmP-mut在75℃水浴5min后的酶活保留率为70％，而碱性蛋白酶BmP在75℃水浴5min后的酶活保留率仅为9％。因此，本发明的获得的碱性蛋白酶突变体BmP-mut具有良好的热稳定性，为其产业化应用奠定基础。
上述所述的热稳定性高的碱性蛋白酶BmP突变体，其最适反应pH为10.0，最适反应温度为75℃。
一种获得上述热稳定性高的碱性蛋白酶BmP突变体的突变方法，其包括如下步骤：
1)碱性蛋白酶BmP基因合成及克隆：根据已报道莫海威芽孢杆菌碱性蛋白酶基因序列直接合成目的基因，然后以合成基因为模板，进行PCR扩增，将扩增得到的片段克隆到载体phyP43L，得到表达载体phyP43L-BmP；
2)理性设计定点饱和突变：以构建好的phyP43L-BmP为模板，以相应的突变引物进行PCR扩增；将扩增好的PCR产物进行琼脂糖电泳并纯化回收PCR产物。用限制性内切酶DpnI将原始质粒分解，将分解完的产物用热激法转入大肠杆菌Top10，通过菌液PCR验证重组转化子，提取验证正确转化子的质粒进行测序，从而确定相应的突变体。将测序正确的突变体，通过电转化转入枯草芽孢杆菌WB600。
如上所述的获得上述热稳定性高的碱性蛋白酶BmP突变体的突变方法，所述步骤1)中PCR扩增引物为R：
5'-ATCGGGATCCGCTCAACCGGCGAAAAATGTT-3'和F：
5'-TCTAGCGGCCGCTTATTGAGCGGCAGCTTCGAC-3'。
本发明还请求保护一种包含SEQ ID NO：2核苷酸序列的TDL-mut基因。
本发明还请求保护一种包含所述的碱性蛋白酶BmP突变体基因的重组载体。
本发明还请求保护一种所述的碱性蛋白酶BmP突变体基因的重组菌株。
本发明还请求保护一种所述的碱性蛋白酶BmP突变体在制备去污剂、洗涤剂、化妆品、食品、饲料和药品中的应用。
本发明突变体BmP-mut在75℃水浴5min后的酶活保留率为70％，而碱性蛋白酶BmP在75℃水浴5min后的酶活保留率仅为9％。因此，本发明的获得的碱性蛋白酶突变体BmP-mut具有良好的热稳定性，为其产业化应用奠定基础。
附图说明
图1碱性蛋白酶BmP三维结构图。
图2碱性蛋白酶BmP和突变体BmP-mut的最适反应pH。
图3碱性蛋白酶BmP和突变体BmP-mut的pH稳定性。
图4碱性蛋白酶BmP和突变体BmP-mut的最适反应温度。
具体实施方式
以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。实验材料和试剂：
1、菌株与载体
大肠杆菌菌株Topl0、枯草芽孢杆菌WB600、表达载体phyP43L均由本实验室保藏。
2、酶与试剂盒
Q5高保真Taq酶MIX购自NEB公司，质粒提取，胶纯化，限制性内切酶、试剂盒购自上海生工公司。
3、培养基
大肠杆菌培养基为LB(1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl，pH7.0)。枯草芽孢培养基为LBK，即LB培养基加卡那霉素。
实施例1、莫海威芽孢杆菌(Bacillus mojavensis)碱性蛋白酶BmP基因的克隆
根据已报道莫海威芽孢杆菌碱性蛋白酶基因序列(Genebank:AY665611.1)直接合成目的基因。根据合成的目的基因设计两条引物(R：5'-ATCGGGATCCGCTCAACCGGCGAAAAATGTT-3'和F：5'-TCTAGCGGCCGCTTATTGAGCG GCAGCTTCGAC-3')用于扩增莫海威芽孢杆菌碱性蛋白酶BmP基因。将扩增的PCR产物纯化回收，连接到表达载体phyP43L，得到表达载体phyP43L-BmP。
实施例2、理性设计定点饱和突变
通过同源建模软件对碱性蛋白酶BmP进行建模，得到BmP三维空间构象图(如图1所示)。通过生物信息学软件对构建后的BmP模型进行蛋白最小能量化计算，找到关键氨基酸位点第175位、第210位和第270位。通过饱和突变研究第175位、第210位和第270位对碱性蛋白酶BmP热稳定性的影响。
定点饱和突变的过程如下：以构建好的phyP43L-BmP为模板，以相应的突变引物进行PCR扩增；将扩增好的PCR产物进行琼脂糖电泳并纯化回收PCR产物。用限制性内切酶DpnI将原始质粒分解，将分解完的产物用热激法转入大肠杆菌Top10，通过菌液PCR验证重组转化子，提取验证正确转化子的质粒进行测序，从而确定相应的突变体。将测序正确的突变体，通过电转化转入枯草芽孢杆菌WB600。
重组转化子的筛选如下：首先将在卡那霉素抗性板上生长的重组菌接入LBK培养基中，37℃，200rpm培养24小时；将培养后的菌液离心取上清，进行酶活测定，酶活测定方法参照国标GBT/28715-2012进行；在75℃，水浴处理5分钟条件下测定突变体的热稳定性。实验结果如表1所示，由表1可知：175位饱和突变后只有2个突变氨基酸可提高热稳定性，其中T175I保留率为30％，T175Q保留率为14％；210位饱和突变后只有3个突变氨基酸可提高热稳定性，其中G210Q保留率为36％，G210M保留率为12％，G210W保留率为18％；270位饱和突变后只有3个突变氨基酸可提高热稳定性，其中G270S保留率为48％，G270T保留率为13％，G270I保留率为15％。
表1原始碱性蛋白酶BmP和突变体热稳定性
编号 保留率(％)
原始碱性蛋白酶BmP 8
T175I 30
T175Q 14
G210Q 36
G210M 12
G210W 18
G270S 48
G270T 13
G270I 15
实施例3、组合突变及突变体热稳定性分析
通过组合单点突变最终得到一个突变体命名为BmP-mut，其包含的突变位点为T175I、G210Q和G270S。为了精确比较原始碱性蛋白酶BmP和突变体BmP-mut的热稳定性，首先对相应的蛋白酶进行纯化，纯化方法为镍柱纯化。将纯化好的碱性蛋白酶BmP和突变体BmP-mut，在75℃，水浴处理5分钟条件下测定热稳定性。通过实验最终确定突变体BmP-mut在该条件下的保留率为70％。
表2原始碱性蛋白酶BmP和组合突变体热稳定性
编号 保留率(％)
原始碱性蛋白酶BmP 9
BmP-mut 70
实施例5、碱性蛋白酶BmP及突变体BmP-mut的最适反应pH及pH稳定性
参照国标方法测定碱性蛋白酶BmP及突变体BmP-mut的最适反应pH。碱性蛋白酶BmP及突变体BmP-mut的最适反应pH如图2所示。由图2可知，突变体BmP-mut的最适pH几乎和原始碱性蛋白酶BmP一样，均为10.0。
将碱性蛋白酶BmP及突变体BmP-mut分别在pH6-11条件下室温处理2小时，然后参照国标的方法测定酶活，结果如图3所示。由图3可知突变体BmP-mut在酸性条件下的稳定性要好于原始碱性蛋白酶BmP。
实施例6、碱性蛋白酶BmP及突变体BmP-mut的最适反应温度
参照国标方法测定碱性蛋白酶BmP及突变体BmP-mut的最适反应温度，结果如图4所示。由图4可知，碱性蛋白酶BmP的最适反应温度为65℃，而突变体BmP-mut的最适反应温度为75℃。
序列表
<110> 横琴仲泰生物医药有限公司
<120> 一种热稳定性高的碱性蛋白酶BmP突变体及其编码基因
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1140
<212> DNA
<213> Bacillus mojavensis
<400> 1
atgatgagga aaaagagttt ttggcttggg atgctgacgg ccttcatgct cgtgttcacg 60
atggcattcg gcgattccgc ttctgctgct caaccggcga aaaatgttga aaaggattat 120
attgtcggat ttaagtcagg agtgaaaacc gcatctgtca aaaaggacat catcaaagag 180
agcggcggaa aagtggacaa gcagtttaga atcatcaacg cggcaaaagc gaagctagac 240
aaagaagcgc ttaaggaagt caaaaatgat ccggatgtcg cttatgtgga agaggatcat 300
gtggcccatg ccttggcgca aaccgttcct tacggcattc ctctcattaa agcggacaaa 360
gtgcaggctc aaggctttaa gggagcgaat gtaaaagtag ccgtcctgga tacaggaatc 420
caagcttctc atccggactt gaacgtagtc ggcggagcaa gctttgtggc tggcgaagct 480
tataacaccg acggcaacgg acacggcacg catgttgccg gtacagtagc tgcgcttgac 540
aatacaacgg gtgtattagg cgttgcgcca agcgtatcct tgtacgcggt taaagtactg 600
aattcaagcg gaagcggatc atacagcggc attgtaagcg gaatcgagtg ggcgacaaca 660
aacggcatgg atgttatcaa tatgagcctt gggggagcat caggctcgac agcgatgaaa 720
caggcagtcg acaatgcata tgcaagaggg gttgtcgttg tagctgcagc agggaacagc 780
ggatcttcag gaaacacgaa tacaattggc tatcctgcga aatacgattc tgtcatcgct 840
gttggtgcgg tagactctaa cagcaacaga gcttcatttt ccagtgtggg agcagagctt 900
gaagtcatgg ctcctggcgc aggcgtatac agcacttacc caacgaacac ttatgcaaca 960
ttgaacggaa cgtcaatggc ttctcctcat gtagcgggag cagcagcttt gatcttgtca 1020
aaacatccga acctttcagc ttcacaagtc cgcaaccgtc tctccagcac ggcgacttat 1080
ttgggaagct ccttctacta tgggaaaggt ctgatcaatg tcgaagctgc cgctcaataa 1140
<210> 2
<211> 1140
<212> DNA
<213> Bacillus mojavensis
<400> 2
atgatgagga aaaagagttt ttggcttggg atgctgacgg ccttcatgct cgtgttcacg 60
atggcattcg gcgattccgc ttctgctgct caaccggcga aaaatgttga aaaggattat 120
attgtcggat ttaagtcagg agtgaaaacc gcatctgtca aaaaggacat catcaaagag 180
agcggcggaa aagtggacaa gcagtttaga atcatcaacg cggcaaaagc gaagctagac 240
aaagaagcgc ttaaggaagt caaaaatgat ccggatgtcg cttatgtgga agaggatcat 300
gtggcccatg ccttggcgca aaccgttcct tacggcattc ctctcattaa agcggacaaa 360
gtgcaggctc aaggctttaa gggagcgaat gtaaaagtag ccgtcctgga tacaggaatc 420
caagcttctc atccggactt gaacgtagtc ggcggagcaa gctttgtggc tggcgaagct 480
tataacaccg acggcaacgg acacggcacg catgttgccg gtattgtagc tgcgcttgac 540
aatacaacgg gtgtattagg cgttgcgcca agcgtatcct tgtacgcggt taaagtactg 600
aattcaagcg gaagcggatc atacagccaa attgtaagcg gaatcgagtg ggcgacaaca 660
aacggcatgg atgttatcaa tatgagcctt gggggagcat caggctcgac agcgatgaaa 720
caggcagtcg acaatgcata tgcaagaggg gttgtcgttg tagctgcagc agggaacagc 780
ggatcttcag gaaacacgaa tacaatttct tatcctgcga aatacgattc tgtcatcgct 840
gttggtgcgg tagactctaa cagcaacaga gcttcatttt ccagtgtggg agcagagctt 900
gaagtcatgg ctcctggcgc aggcgtatac agcacttacc caacgaacac ttatgcaaca 960
ttgaacggaa cgtcaatggc ttctcctcat gtagcgggag cagcagcttt gatcttgtca 1020
aaacatccga acctttcagc ttcacaagtc cgcaaccgtc tctccagcac ggcgacttat 1080
ttgggaagct ccttctacta tgggaaaggt ctgatcaatg tcgaagctgc cgctcaataa 1140
<210> 3
<211> 379
<212> PRT
<213> Bacillus mojavensis
<400> 3
Met Met Arg Lys Lys Ser Phe Trp Leu Gly Met Leu Thr Ala Phe Met
1 5 10 15
Leu Val Phe Thr Met Ala Phe Gly Asp Ser Ala Ser Ala Ala Gln Pro
20 25 30
Ala Lys Asn Val Glu Lys Asp Tyr Ile Val Gly Phe Lys Ser Gly Val
35 40 45
Lys Thr Ala Ser Val Lys Lys Asp Ile Ile Lys Glu Ser Gly Gly Lys
50 55 60
Val Asp Lys Gln Phe Arg Ile Ile Asn Ala Ala Lys Ala Lys Leu Asp
65 70 75 80
Lys Glu Ala Leu Lys Glu Val Lys Asn Asp Pro Asp Val Ala Tyr Val
85 90 95
Glu Glu Asp His Val Ala His Ala Leu Ala Gln Thr Val Pro Tyr Gly
100 105 110
Ile Pro Leu Ile Lys Ala Asp Lys Val Gln Ala Gln Gly Phe Lys Gly
115 120 125
Ala Asn Val Lys Val Ala Val Leu Asp Thr Gly Ile Gln Ala Ser His
130 135 140
Pro Asp Leu Asn Val Val Gly Gly Ala Ser Phe Val Ala Gly Glu Ala
145 150 155 160
Tyr Asn Thr Asp Gly Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val
165 170 175
Ala Ala Leu Asp Asn Thr Thr Gly Val Leu Gly Val Ala Pro Ser Val
180 185 190
Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Asn Ser Ser Gly Ser Gly Ser Tyr
195 200 205
Ser Gly Ile Val Ser Gly Ile Glu Trp Ala Thr Thr Asn Gly Met Asp
210 215 220
Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly Ala Ser Gly Ser Thr Ala Met Lys
225 230 235 240
Gln Ala Val Asp Asn Ala Tyr Ala Arg Gly Val Val Val Val Ala Ala
245 250 255
Ala Gly Asn Ser Gly Ser Ser Gly Asn Thr Asn Thr Ile Gly Tyr Pro
260 265 270
Ala Lys Tyr Asp Ser Val Ile Ala Val Gly Ala Val Asp Ser Asn Ser
275 280 285
Asn Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val Gly Ala Glu Leu Glu Val Met Ala
290 295 300
Pro Gly Ala Gly Val Tyr Ser Thr Tyr Pro Thr Asn Thr Tyr Ala Thr
305 310 315 320
Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala
325 330 335
Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Asn Leu Ser Ala Ser Gln Val Arg Asn
340 345 350
Arg Leu Ser Ser Thr Ala Thr Tyr Leu Gly Ser Ser Phe Tyr Tyr Gly
355 360 365
Lys Gly Leu Ile Asn Val Glu Ala Ala Ala Gln
370 375
<210> 4
<211> 379
<212> PRT
<213> Bacillus mojavensis
<400> 4
Met Met Arg Lys Lys Ser Phe Trp Leu Gly Met Leu Thr Ala Phe Met
1 5 10 15
Leu Val Phe Thr Met Ala Phe Gly Asp Ser Ala Ser Ala Ala Gln Pro
20 25 30
Ala Lys Asn Val Glu Lys Asp Tyr Ile Val Gly Phe Lys Ser Gly Val
35 40 45
Lys Thr Ala Ser Val Lys Lys Asp Ile Ile Lys Glu Ser Gly Gly Lys
50 55 60
Val Asp Lys Gln Phe Arg Ile Ile Asn Ala Ala Lys Ala Lys Leu Asp
65 70 75 80
Lys Glu Ala Leu Lys Glu Val Lys Asn Asp Pro Asp Val Ala Tyr Val
85 90 95
Glu Glu Asp His Val Ala His Ala Leu Ala Gln Thr Val Pro Tyr Gly
100 105 110
Ile Pro Leu Ile Lys Ala Asp Lys Val Gln Ala Gln Gly Phe Lys Gly
115 120 125
Ala Asn Val Lys Val Ala Val Leu Asp Thr Gly Ile Gln Ala Ser His
130 135 140
Pro Asp Leu Asn Val Val Gly Gly Ala Ser Phe Val Ala Gly Glu Ala
145 150 155 160
Tyr Asn Thr Asp Gly Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Ile Val
165 170 175
Ala Ala Leu Asp Asn Thr Thr Gly Val Leu Gly Val Ala Pro Ser Val
180 185 190
Lys Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Asn Ser Ser Gly Ser Gly Ser Tyr
195 200 205
Ser Gln Ile Val Ser Gly Ile Glu Trp Ala Thr Thr Asn Gly Met Asp
210 215 220
Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly Ala Ser Gly Ser Thr Ala Met Lys
225 230 235 240
Gln Ala Val Asp Asn Ala Tyr Ala Arg Gly Val Val Val Val Ala Ala
245 250 255
Ala Gly Asn Ser Gly Ser Ser Gly Asn Thr Asn Thr Ile Ser Tyr Pro
260 265 270
Ala Lys Tyr Asp Ser Val Ile Ala Val Gly Ala Val Asp Ser Asn Met
275 280 285
Asn Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val Gly Ala Glu Leu Glu Val Met Ala
290 295 300
Pro Gly Ala Gly Val Tyr Ser Thr Tyr Pro Thr Asn Thr Tyr Ala Thr
305 310 315 320
Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala
325 330 335
Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Asn Leu Ser Ala Ser Gln Val Arg Asn
340 345 350
Arg Leu Ser Ser Thr Ala Thr Tyr Leu Gly Ser Ser Phe Tyr Tyr Gly
355 360 365
Lys Gly Leu Ile Asn Val Glu Ala Ala Ala Gln
370 375

Claims (9)

1.一种热稳定性高的碱性蛋白酶BmP突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示。
2.根据权利要求1所述的热稳定性高的碱性蛋白酶BmP突变体 ，其特征在于，所述的碱性蛋白酶BmP突变体包含的突变位点为：T175I、G210Q和G270S。
3.根据权利要求1所述的热稳定性高的碱性蛋白酶BmP突变体，其特征在于，其最适反应pH为10.0，最适反应温度为75℃。
4.一种获得权利要求1-3任意一项所述热稳定性高的碱性蛋白酶BmP突变体的突变方法，其包括如下步骤：
1）碱性蛋白酶BmP基因合成及克隆：根据已报道莫海威芽孢杆菌碱性蛋白酶基因序列直接合成目的基因，然后以合成基因为模板，进行PCR扩增，将扩增得到的片段克隆到载体phyP43L，得到表达载体phyP43L-BmP；
2）理性设计定点饱和突变：以构建好的phyP43L-BmP为模板，以相应的突变引物进行PCR扩增；将扩增好的PCR产物进行琼脂糖电泳并纯化回收PCR产物；用限制性内切酶DpnI将phyP43L-BmP质粒分解，将分解完的产物用热激法转入大肠杆菌Top10，通过菌液PCR验证重组转化子，提取验证正确转化子的质粒进行测序，从而确定相应的突变体；将测序正确的突变体，通过电转化转入枯草芽孢杆菌WB600。
5.根据权利要求4所述的获得热稳定性高的碱性蛋白酶BmP突变体的突变方法，其特征在于，所述步骤1）中PCR扩增引物为：
R：5'-ATCGGGATCCGCTCAACCGGCGAAAAATGTT-3'；
F：5'-TCTAGCGGCCGC TTATTGAGCGGCAGCTTCGAC-3'。
6.一种包含SEQ ID NO：2核苷酸序列的碱性蛋白酶BmP突变体基因。
7.一种包含权利要求6所述的碱性蛋白酶BmP突变体基因的重组载体。
8.一种包含权利要求6所述的碱性蛋白酶BmP突变体基因的重组菌株。
9.权利要求2所述的碱性蛋白酶BmP突变体在制备去污剂、洗涤剂、化妆品、食品、饲料和药品中的应用。
CN201810118581.7A 2018-02-06 2018-02-06 一种热稳定性高的碱性蛋白酶BmP突变体及其编码基因 Active CN108359659B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810118581.7A CN108359659B (zh) 2018-02-06 2018-02-06 一种热稳定性高的碱性蛋白酶BmP突变体及其编码基因

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810118581.7A CN108359659B (zh) 2018-02-06 2018-02-06 一种热稳定性高的碱性蛋白酶BmP突变体及其编码基因

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108359659A CN108359659A (zh) 2018-08-03
CN108359659B true CN108359659B (zh) 2018-12-14

Family

ID=63004635

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810118581.7A Active CN108359659B (zh) 2018-02-06 2018-02-06 一种热稳定性高的碱性蛋白酶BmP突变体及其编码基因

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108359659B (zh)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108570461B (zh) * 2018-04-17 2020-08-11 横琴仲泰生物医药有限公司 一种提高比活力的碱性蛋白酶BmP突变体及其编码基因
CN109722428B (zh) * 2018-12-11 2022-05-31 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 比活和热稳定性提高的碱性蛋白酶突变体prok-m及其编码基因和应用
CN114591935B (zh) * 2020-04-27 2023-06-20 青岛根源生物技术集团有限公司 一种热稳定性提高的蛋白酶突变体blapr3及其编码基因和应用
WO2023225459A2 (en) 2022-05-14 2023-11-23 Novozymes A/S Compositions and methods for preventing, treating, supressing and/or eliminating phytopathogenic infestations and infections
CN118147117B (zh) * 2024-05-11 2024-07-12 中国农业科学院生物技术研究所 耐热型饲用蛋白酶突变体及其应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008079895A2 (en) * 2006-12-21 2008-07-03 Novozymes, Inc. Methods of obtaining genetic competence in bacillus cells

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008079895A2 (en) * 2006-12-21 2008-07-03 Novozymes, Inc. Methods of obtaining genetic competence in bacillus cells

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AY665611.1;GenBank;《NCBI》;20040724;第1页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN108359659A (zh) 2018-08-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108359659B (zh) 一种热稳定性高的碱性蛋白酶BmP突变体及其编码基因
US10774315B2 (en) Engineered glucosyltransferases
CN106591271B (zh) 一株酶活和温度稳定性提高的精氨酸脱亚胺酶突变体及其应用
CN107475229B (zh) 一种底物特异性提高的角蛋白酶突变体及其制备方法
CN108570461B (zh) 一种提高比活力的碱性蛋白酶BmP突变体及其编码基因
CN112501149B (zh) 一种碱性蛋白酶突变体及其基因、工程菌、制备方法和应用
CN114561375B (zh) 一种热稳定性提高的蛋白酶突变体blapr2及其编码基因和应用
CN108384771A (zh) 一种提高比活力的碱性蛋白酶突变体及其编码基因
CN114480352B (zh) 一种碱性蛋白酶突变体及其用途
CN110923221B (zh) 一种来源于地衣芽孢杆菌的碱性蛋白酶高温突变体
CN107400666B (zh) 一种氨肽酶及其编码基因和应用
CN108004220B (zh) 提高热稳定性的碱性蛋白酶BmP突变体及其基因和应用
CN101918551B (zh) 草酸脱羧酶的生产中利用的重组表达质粒载体及重组菌、以及重组草酸脱羧酶的生产方法
CN111153968B (zh) 一种提高外源碱性蛋白酶表达量的信号肽突变体及其构建方法与用途
CN114107266B (zh) 耐热性提高的蛋白酶突变体及其编码基因和应用
CN112662652A (zh) 一种胶原降解活力降低的碱性蛋白酶突变体
CN117769596A (zh) 具有改善的性质的淀粉酶多肽
CN101597614A (zh) 编码β-半乳糖苷酶的基因及其表达和应用
CN111944790B (zh) 中性蛋白酶基因、中性蛋白酶及其制备方法和应用
CN116790564A (zh) 一种耐热型蛋白酶突变体及其编码基因和应用
CN112725315B (zh) 一种壳聚糖酶及其突变体在制备壳寡糖中的应用
CN110628745B (zh) 一种突变酶Xynh31-K210R及其应用
CN116829719A (zh) 蛋白质脱酰胺酶
CN113699129B (zh) 一种热稳定性和催化活性提高的谷氨酰胺转氨酶变体
CN115927264B (zh) 角蛋白酶及其与杜仲叶提取物、胆汁酸的复配酶制剂和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant