CN108348582B - 用于使用胰高血糖素受体拮抗性抗体治疗心力衰竭的方法 - Google Patents

用于使用胰高血糖素受体拮抗性抗体治疗心力衰竭的方法 Download PDF

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Abstract

本公开内容涉及用于使用胰高血糖素受体阻断剂治疗或预防心力衰竭的方法。在多种实施方案中，本公开内容涉及用于使用特异性结合并拮抗人胰高血糖素受体的功能的抗原结合和拮抗性蛋白，例如完全人类抗体，治疗或预防心力衰竭(例如心肌梗塞后心力衰竭)、糖尿病心肌病心力衰竭)、和侧心室(LV)重构的方法。

Description

用于使用胰高血糖素受体拮抗性抗体治疗心力衰竭的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2015年9月4日提交的临时申请美国序列号62/214,449和2015年11月24日提交的临时申请美国序列号62/259,061的优先权，每一篇特此通过引用以其整体并入。
背景
心力衰竭(HF)是一个全球性问题，估计全球有3800万患者，包括美国的600万患者和每年在美国被诊断患有这种状况的多于550,000例新患者。HF是65岁或以上患者入院时最常见的诊断，并且是发达国家发病率和死亡率最重要的原因之一。
心力衰竭是一种临床综合征，其特征是心脏未能泵出足够的血液来满足身体的系统需求。心脏随着每次心跳收缩和松弛--这些阶段被称为收缩期(收缩阶段)和舒张期(松弛阶段)。收缩性心力衰竭(SHF)的特征是射血分数低。在舒张性心力衰竭(DHF)患者中，收缩可能是正常的，但心脏松弛可能受损。这种受损通常是由于心室变硬引起的。这种受损称为舒张功能障碍，并且如果严重到足以引起肺充血(肺部血管中的压力和流体增加)，则称为舒张性心力衰竭。DHF患者与SHF患者不同，因为DHF患者可能具有“正常的”射血分数。然而，由于心室不能正常松弛，心室内的压力增加，并且充入心室的血液超过了“正常”。有某些类型心肌病的人群也可能有舒张功能障碍。
左心室肥大(LVH)是指左心室负荷增加导致的左心室增厚。LVH可以是心血管紊乱的重要标志，并且最常见的并发症包括心律失常、心力衰竭、缺血性心脏病和猝死。尽管LVH随着年龄而自然增加，但在具有高血压或具有其他心脏问题的人群中更常见。由于LVH通常响应于高血压发展，目前的治疗和预防主要包括管理高血压。典型的诊断包括使用超声波心动描记术(ECHO)和心电图(ECG)。
心肌梗塞(MI)是心力衰竭的主要原因。MI的机制通常包括动脉粥样硬化斑块的破裂导致冠状动脉完全堵塞，因为心肌细胞没有获得足够的氧气而导致心肌细胞的死亡或损伤。糖尿病(1型或2型)、高血压、血脂障碍/高血液胆固醇水平，特别是低密度脂蛋白高、高密度脂蛋白低、高甘油三酯和肥胖都与心肌梗塞有关(Jay N.Cohn等人,Journal of theAmerican College of Cardiology,35(3),569–82,2000)。MI后的长期结局可以在很大程度上根据其对左心室大小和形状的影响(即，LV重构)来定义。三种主要机制有助于LV重构：i)早期梗死扩展，ii)随后的梗塞延伸至相邻的未梗塞心肌，以及iii)远端LV中的晚期肥大(同上)。随着心脏重构，它不仅变大，而且心脏壁变薄，且心脏的泵送能力下降。心脏重构通常被认为是MI恢复后生存的决定因素。虽然重构作为致病机制的重要性尚未完全了解，但心脏重构被认为是HF疾病进展的一个重要方面，无论原因如何(同上)。左心室重构是由机械、神经-激素和遗传因素调节心室大小、形状和功能的过程。重构在正常生长或由于MI、心肌病、高血压或心脏瓣膜病的病理学期间可以是生理性的和适应性的(French和Kramer,Drug Discov.Today Dis Mech.,4(3):185–196,2007)。
最近报道，心肌细胞中的胰高血糖素受体信号传导调节具有实验性心肌梗塞的非糖尿病小鼠的结局(Ali等人,Molecular Metabolism,4:132-143,2015)。具体地，外源性胰高血糖素施用离体地直接损害缺血小鼠心脏中心室压力的恢复，并且以p38MAPK依赖性方式增加了小鼠LAD冠状动脉结扎后心肌梗塞的死亡率。相比之下，成年GCGRCM-/-小鼠(具有GCGR灭活的小鼠)中胰高血糖素作用的心肌细胞特异性降低显著改善了存活，并且减少了心肌梗塞后的肥大和梗塞大小(infarct size)(同上)。作者得出结论，操纵胰高血糖素作用的心血管后果仍然知之甚少，并强调需要获取这种后果的进一步了解(同上)。
目前可用于管理心力衰竭和其他心血管紊乱的药物治疗包括用于降低血压和缓解心脏负荷的血管扩张剂、用于减少流体超负荷的利尿剂、身体神经-激素响应的抑制剂和阻断剂(例如，血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂和β-肾上腺素能阻断剂)、和其他药物。这种药物治疗尽管短时间有效，但由于副作用而通常不能长期使用。对于罹患严重、难治性心力衰竭的患者，也已经提出了各种外科手术诸如心脏移植。可选地，诸如心室辅助装置(VAD)的可植入医疗装置可以被植入胸腔中以增加心脏的泵送作用，或者可以使用主动脉内气囊泵(IABP)来短时间维持心脏功能，但通常不超过一个月。尽管这些方法中的每一种都证明对患者至少部分地有益，但它们各自都有缺陷，这限制了它们的总体有效性。例如，药物治疗通常涉及不需要的副作用和复杂的疗法方案，这导致患者依从性差。而且药物治疗和手术方法都非常昂贵，增加了与心力衰竭相关的医疗保健成本。尽管正在进行心力衰竭治疗的研究和开发，对改进的和替代的治疗仍存在巨大需求。
发明概述
本公开内容部分地基于发明人的独特见解：特异性结合至人胰高血糖素受体的分离的抗原结合和拮抗性蛋白(isolated antigen binding and antagonizing proteins)可以提供用于在心肌梗塞后治疗和预防心力衰竭和预防与糖尿病和高血糖相关的心力衰竭的改进的、有效的疗法。本发明人提出，通过阻断心肌梗塞诱导的心力衰竭受试者(或所有其他心力衰竭受试者)中的胰高血糖素受体所提供的有益治疗效果涉及左心室(LV)重构的防止或减弱，其可包括：增加缩短分数(fractional shortening)(FS)，减少LV扩张(LVESD)；保持LV壁厚；增加LV发展的压力和心室收缩力；降低心脏重量与体重的比率(梗塞大小)；减少纤维化过程；降低缺血条件下心脏中不完全氧化的脂肪酸代谢物的水平；并降低MI诱发的死亡率。
因此，在一方面，本公开内容包括用于治疗或预防受试者中的心力衰竭和相关状况的方法，包括对被诊断患有心力衰竭的受试者或处于感染心力衰竭的风险的受试者施用治疗有效量的与人胰高血糖素受体特异性结合的分离的拮抗性抗原结合蛋白。在多种实施方案中，本公开内容包括用于治疗或预防心肌梗塞后的心力衰竭的方法。在多种实施方案中，本公开内容包括用于治疗或预防与糖尿病相关的心力衰竭的方法。在多种实施方案中，本公开内容包括用于治疗或预防与糖尿病心肌病相关的心力衰竭的方法。
在多种实施方案中，分离的拮抗性抗原结合蛋白包括选自以下的抗体：完全人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、结合抗原的抗体片段、Fab、Fab’、Fab2、Fab’2、IgG、IgM、IgA、IgE、scFv、dsFv、dAb、纳米抗体、单抗体或双抗体。在多种实施方案中，抗体是完全人单克隆抗体。在多种实施方案中，所述分离的抗体或抗原结合性抗体片段以至少约1x10-7M、至少约1x10-8M、至少约1x10-9M、至少约1x10-10M、至少约1x10-11M或至少约1x10-12M的解离常数(KD)与人胰高血糖素受体特异性结合。
在多种实施方案中，分离的拮抗性抗原结合蛋白包括包含编码SEQ ID NO:2的重链可变区的氨基酸序列和编码SEQ ID NO:3的轻链可变区的氨基酸序列的抗体。在多种实施方案中，分离的拮抗性抗原结合蛋白包括包含编码SEQ ID NO:4的重链可变区的氨基酸序列和编码SEQ ID NO:5的轻链可变区的氨基酸序列的抗体。在多种实施方案中，分离的拮抗性抗原结合蛋白包括包含编码SEQ ID NO:6的重链可变区的氨基酸序列和编码SEQ IDNO:7的轻链可变区的氨基酸序列的抗体。在多种实施方案中，分离的拮抗性抗原结合蛋白包括包含编码SEQ ID NO:8的重链的氨基酸序列和编码SEQ ID NO:9的轻链的氨基酸序列的抗体。在多种实施方案中，分离的拮抗性抗原结合蛋白包括包含编码选自由SEQ ID NO:10-28组成的组的重链可变区的氨基酸序列和编码选自由SEQ ID NO:29-47的轻链可变区的氨基酸序列的抗体。在多种实施方案中，分离的拮抗性抗原结合蛋白包括包含编码SEQID NO:51的重链的氨基酸序列和编码SEQ ID NO:52的轻链的氨基酸序列的抗体。
在多种实施方案中，本公开内容包括：用于治疗或预防受试者中的心力衰竭和相关状况的方法，包括对被诊断患有心力衰竭的受试者或处于发展心力衰竭的风险的受试者施用治疗有效量的与人胰高血糖素受体特异性结合的分离的拮抗性抗原结合蛋白；和(b)第二剂组合物。在多种实施方案中，第二剂组合物选自由以下组成的组：血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂、β-肾上腺素能阻断剂、血管紧张肽II受体阻断剂(ARB)、利尿剂和洋地黄(digitalis)。在多种实施方案中，分离的拮抗性抗原结合蛋白包括包含编码SEQ ID NO:51的重链的氨基酸序列和编码SEQ ID NO:52的轻链的氨基酸序列的抗体。
在多种实施方案中，本公开内容包括：用于治疗或预防受试者中的糖尿病引起的心肌病的方法，包括对被诊断患有糖尿病的受试者或处于发展糖尿病的风险的受试者施用治疗有效量的与人胰高血糖素受体特异性结合的分离的拮抗性抗原结合蛋白；和(b)第二剂组合物。在多种实施方案中，第二剂组合物选自由以下组成的组：血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂、β-肾上腺素能阻断剂、血管紧张肽II受体阻断剂(ARB)、利尿剂和洋地黄。在多种实施方案中，分离的拮抗性抗原结合蛋白包括包含编码SEQ ID NO:51的重链的氨基酸序列和编码SEQ ID NO:52的轻链的氨基酸序列的抗体。
在多种实施方案中，特异性结合人胰高血糖素受体的分离的拮抗性抗原结合蛋白将与药学上可接受的载体混合以形成药物组合物，所述药物组合物可以经由静脉注射、肌肉注射、皮下注射、腹膜内注射、经皮注射、动脉内注射、胸骨内注射(intrasternalinjection)、鞘内注射、心室内注射、尿道内注射、颅内注射、滑膜内注射(intrasynovialinjection)或经由输注被全身施用至受试者。
附图简述
图1是描绘针对对照(CON)组(n＝18)、REMD2.59(mAb)处理组(n＝18)和胰高血糖素(GLC)处理组(n＝28)，28天研究期间对死亡率的体内影响的线图，其中在54只C57BL6雄性小鼠中诱导心肌梗塞(MI)。将存活比例对时间(天数)绘图。
图2是描绘针对对照(CON)组(n＝10)、REMD2.59(mAb)处理组(n＝11)和胰高血糖素(GLC)处理组(n＝6)，28天研究期间对左心室缩短分数(FS)的体内影响的线图，其中在54只C57BL6雄性小鼠中诱导心肌梗塞(MI)。将％FS对时间(周)绘图。#：P<0.05Con vsGLC，**：P<0.01mAb vs GLC，***：P<0.001mAb vs CON或GLC。
图3是描绘针对对照(CON)组(n＝10)、REMD2.59(mAb)处理组(n＝11)和胰高血糖素(GLC)处理组(n＝6)，28天研究期间对左心室收缩末期直径(LVESD)的体内影响的线图，其中在54只C57BL6雄性小鼠中诱导心肌梗塞(MI)。将LVESD(mm)对时间(周)绘图。#：p<0.05vs GLC，*：p<0.05vs CON，**：p<0.01vs GLC。
图4是描绘针对对照(CON)组(n＝10)、REMD2.59(mAb)处理组(n＝11)和胰高血糖素(GLC)处理组(n＝6)，28天研究期间对左心室舒张末期体积(LVEDD)的体内影响的线图，其中在54只C57BL6雄性小鼠中诱导心肌梗塞(MI)。将LVEDD(mm)对时间(周)绘图。
图5是描绘针对对照(CON)组(n＝10)、REMD2.59(mAb)处理组(n＝11)和胰高血糖素(GLC)处理组(n＝6)，28天研究期间对缺血左心室壁厚度(IVSd)的体内影响的线图，其中在54只C57BL6雄性小鼠中诱导心肌梗塞(MI)。将IVEDD(mm)对时间(周)绘图。**：P<0.01vsCON或GLC，***：P<0.001vs CON或GLC，#：P<0.05Con vs GLC。
图6是描绘针对对照(CON)组、REMD2.59(mAb)处理组和胰高血糖素(GLC)处理组，研究中对左心室舒张压(LVDP)的体内影响的柱状图，其中在54只C57BL6雄性小鼠中诱导心肌梗塞(MI)。描绘了在28天的LVDP(mm Hg)。
图7包含描绘研究中针对对照(CON)组、REMD2.59(mAb)处理组和胰高血糖素(GLC)处理组，对心脏收缩力(+dp/dtm–mm Hg/s)(左图)和松弛(-dp/dtm–mm Hg/s)(右图)的体内影响的柱状图，其中在54只C57BL6雄性小鼠中诱导心肌梗塞(MI)。描绘了在28天的心脏收缩力(+dp/dtm–mm Hg/s)(左图)和松弛(-dp/dtm–mm Hg/s)(右图)。
图8是描绘在研究的第28天，针对对照(CON)组、REMD2.59(mAb)处理组和胰高血糖素(GLC)处理组，对心脏重构的体内影响的回声读出和相应的图片，其中在54只C57BL6雄性小鼠中诱导心肌梗塞(MI)。
图9是描绘在研究的第28天，针对对照(CON)组、REMD2.59(mAb)处理组和胰高血糖素(GLC)处理组，对心脏重构的体内影响的柱状图，其中在54只C57BL6雄性小鼠中诱导心肌梗塞(MI)。描绘了在28天，心脏重量(HW)(mg)vs.体重(BW)(g)的比率。
图10是描绘在研究的第14天，针对对照(CON)组和REMD2.59(mAb)处理组，对血液葡萄糖水平的体内影响的柱状图，其中在54只C57BL6雄性小鼠中诱导心肌梗塞(MI)。描绘了在14天的血液葡萄糖水平(mg/dl)(空腹4小时)。*：P<0.01。
图11是描绘在研究的第28天，针对对照(CON)组、REMD2.59(mAb)处理组和胰高血糖素(GLC)处理组，对梗塞区域中的凋亡的体内影响的柱状图，其中在54只C57BL6雄性小鼠中诱导心肌梗塞(MI)。计数了每只小鼠中的8个视野。描绘了在28天的％TUNEL阳性细胞。
图12描绘各个切片的组织学H&E染色，其描绘了在研究的第28天，针对对照(CON)组、REMD2.59(mAb)处理组和胰高血糖素(GLC)处理组，对非梗塞区域中的纤维化的体内影响，其中在54只C57BL6雄性小鼠中诱导心肌梗塞(MI)。
图13是描绘在研究的第28天，针对对照(CON)组、REMD2.59(mAb)处理组和胰高血糖素(GLC)处理组，对非梗塞区域中的纤维化的体内影响的柱状图，其中在54只C57BL6雄性小鼠中诱导心肌梗塞(MI)。计数了每只小鼠中的8个视野。描绘了在28天的％纤维化面积。
图14描绘各个切片的组织学H&E染色，其描绘了在研究的第28天，针对对照(CON)组、REMD2.59(mAb)处理组和胰高血糖素(GLC)处理组，对非梗塞区域中的肌细胞肥大的体内影响的，其中在54只C57BL6雄性小鼠中诱导心肌梗塞(MI)。放大率40X10。
图15是描绘在研究的第28天，针对对照(CON)组、REMD2.59(mAb)处理组和胰高血糖素(GLC)处理组，对非梗塞区域中的肌细胞肥大的体内影响的柱状图，其中在54只C57BL6雄性小鼠中诱导心肌梗塞(MI)。计数了每只小鼠中的8个视野。描绘了在28天的肌细胞CSA(μm2)。
图16是描绘在研究的第28天，针对对照(CON)组、REMD2.59(mAb)处理组和胰高血糖素(GLC)，对梗塞大小的体内影响的柱状图和相应的图片，其中在54只C57BL6雄性小鼠中诱导心肌梗塞(MI)。描绘了在28天，梗塞壁的长度对LV壁的比率(％)。
图17是描绘在研究的第28天，针对对照(CON)组、REMD2.59(mAb)处理组和胰高血糖素(GLC)，对梗塞面积的体内影响的柱状图和相应的图片，其中在54只C57BL6雄性小鼠中诱导心肌梗塞(MI)。描绘了在28天，梗塞面积的长度对总的心室区域的比率(％)。
图18是描绘18周研究期间，对于db/db(PBS)、db/db(mAb)、db/+(PBS)和db/+(mAb)组的血液葡萄糖水平(mg/dl)的线图。每只小鼠空腹6小时，且重复测量ANOVA用于统计分析。***：p<0.0001，比较db/db(mAb)vs db/db(PBS)；###：p<0.0001，比较db/+(PBS)或db/+(mAb)vs db/db(PBS)。
图19是描绘在用mAb或PBS处理后第18周，对于db/db(PBS)、db/db(mAb)、db/+(PBS)和db/+(mAb)组，口服葡萄糖耐量实验(OGTT)结果的线图。每只小鼠用管饲接受2.0g/kg葡萄糖。口服施用2g/kg葡萄糖后，通过使用Accu-Chek Performa System在不同的时间点(30min、60min、120min)测量血液葡萄糖水平。将血清葡萄糖水平(mg/dl)对时间(分钟)绘图，使用重复测量ANOVA用于统计分析。***：p<0.0001，比较db/db(mAb)vs db/db(PBS)；###：p<0.0001，比较db/+(PBS)或db/+(mAb)vs db/db(PBS)。
图20是描绘18周研究期间，对于db/db(PBS)、db/db(mAb)、db/+(PBS)和db/+(mAb)组，对左心室收缩末期直径(LVESD)的体内影响的线图。将LVESD(mm)对时间(周)绘图，使用重复测量ANOVA用于统计分析。***：p<0.0001，比较db/db(mAb)vs db/db(PBS)；###：p<0.0001，比较db/+(PBS)或db/+(mAb)vs db/db(PBS)。
图21是描绘18周研究期间，对于db/db(PBS)、db/db(mAb)、db/+(PBS)和db/+(mAb)组，对左心室舒张末期体积(LVEDD)的体内影响的线图。将LVEDD(mm)对时间(周)绘图。P值，##：p<0.01，比较db/+(mAb)vs.db/db(PBS)；N.S：与db/db(PBS)组相比无显著差异，基于重复测量ANOVA,Bonferroni/Dunn方法。
图22是描绘18周研究期间，对于db/db(PBS)、db/db(mAb)、db/+(PBS)和db/+(mAb)组，对左心室缩短分数(FS)的体内影响的线图，使用重复测量ANOVA比较各组之间的全部时间点。***：p<0.0001，比较db/db(mAb)vs.db/db(PBS)；###：p<0.0001，比较db/+(PBS)或db/+(mAb)vs.db/db(PBS)。
图23是描绘18周研究期间，对于db/db(PBS)、db/db(mAb)、db/+(PBS)和db/+(mAb)组，对心室间隔舒张末期(IVSD)的体内影响的线图，使用重复测量ANOVA用于统计分析。P值，***：p<0.0001，比较db/db(mAb)vs db/db(PBS)；###：p<0.0001，比较db/+(PBS)或db/+(mAb)vs db/db(PBS)。
图24是描绘18周研究期间，对于db/db(PBS)、db/db(mAb)、db/+(PBS)和db/+(mAb)组，对早期(E)与晚期(A)心室充盈速度比率(E/A)的体内影响的线图，使用重复测量ANOVA用于统计分析。***：p<0.0001，比较db/db(mAb)vs db/db(PBS)；###：p<0.0001，比较db/+(PBS)或db/+(mAb)vs db/db(PBS)。
图25是描绘18周研究期间，对于db/db(PBS)、db/db(mAb)、db/+(PBS)和db/+(mAb)组，对心输出量(CO,ml/min)的体内影响的线图，使用重复测量ANOVA用于统计分析。***：p<0.0001，比较db/db(mAb)vs db/db(PBS)；###：p<0.0001，比较db/+(PBS)或db/+(mAb)vsdb/db(PBS)。
图26是描绘18周研究期间，对于db/db(PBS)、db/db(mAb)、db/+(PBS)和db/+(mAb)组，对等容舒张时间(IVRT,ms)的体内影响的线图，使用重复测量ANOVA用于统计分析。***：p<0.0001，比较db/db(mAb)vs db/db(PBS)；###：p<0.0001，比较db/+(PBS)或db/+(mAb)vsdb/db(PBS)。
图27是描绘18周研究期间，对于db/db(PBS)、db/db(mAb)、db/+(PBS)和db/+(mAb)组，对心搏率(HR,次/分的体内影响的线图，使用重复测量ANOVA方法。P值：N.S：比较db/db(mAb)vs.db/db(PBS)组不存在统计显著差异；###：p<0.0001，比较db/+(PBS)或db/+(mAb)vs.db/db(PBS)组；**：比较db/+(PBS)或db/+(mAb)vs.db/db(mAb)组。
图28是描绘在第18周，对于db/db(PBS)、db/db(mAb)、db/+(PBS)和db/+(mAb)组，对由Mikro-tip导管测量的左心室舒张压(LVDP,mmHg)的体内影响的柱状图。***：p<0.0001，与db/db(PBS)相比；###：p<0.001，与db/db(PBS)相比。
图29是描绘在第18周，对于db/db(PBS)、db/db(mAb)、db/+(PBS)和db/+(mAb)组，对+dp/dtm和–dp/dtm值(由Mikro-tip导管测量)的体内影响的柱状图，使用重复测量ANOVA方法。***：p<0.0001。**：p<0.01，与db/db(PBS)相比；#：p<0.05:，###：p<0.001，与db/db(PBS)相比。
图30是描绘在第18周，对于db/db(PBS)、db/db(mAb)、db/+(PBS)和db/+(mAb)组，对血清活性GLP-1和GHbAc1水平的体内影响的柱状图，使用重复测量ANOVA方法。P值，*p<0.05；***：p<0.001。
图31是描绘在第18周，对于db/db(PBS)、db/db(mAb)、db/+(PBS)和db/+(mAb)组，对心脏重量和体重的体内影响的柱状图，使用重复测量ANOVA方法。P值：**：p<0.01，N.S：无显著差异。
图32是描绘在第18周，对于db/db(PBS)、db/db(mAb)、db/+(PBS)和db/+(mAb)组，对处理后血液胰岛素水平(ng/ml)的体内影响的柱状图，使用重复测量ANOVA方法。
用于进行本发明的模式
除非本文中另有定义，与本公开内容关联使用的科技术语将具有本领域普通技术人员通常理解的含义。另外，除非上下文另外要求，单数术语将包括复数形式，并且复数术语将包括单数形式。通常，本文描述的与细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学和蛋白和核酸化学和杂交关联使用的命名和技术是本领域常用且公知的那些。除非另有说明，本公开内容的方法和技术通常根据本领域公知的常规方法和如在本说明书中引用和讨论的多种一般和更具体的参考文献中描述地进行。参见例如Green和Sambrook等Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第4版,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,N.Y.(2012)，通过引用并入本文，和Ausubel等,CurrentProtocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates(1992)以及Harlowand Lane Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1990)，通过引用并入本文。酶促反应和纯化技术根据生产商的说明进行，如本领域通常完成或如本文描述的。本文描述的与分析化学、合成有机化学和药学和制药化学关联使用的命名以及实验操作和技术是本领域通常使用且公知的那些。对于化学合成、化学分析、药物制备、制剂和递送以及受试者治疗使用标准技术。
定义
术语“肽”、“多肽”和“蛋白”各自指包含通过肽键彼此连接的两个或更多个氨基酸残基的分子。这些术语包括，例如，蛋白序列的天然和人工蛋白、蛋白片段和多肽类似物(诸如突变蛋白、变体和融合蛋白)，以及翻译后、或以其他方式共价或非共价地修饰的蛋白。肽、多肽或蛋白可以是单体或多聚体。在某些实施方案中，“肽”、“多肽”和“蛋白”是其α碳通过肽键连接的氨基酸链。因此链的一个末尾(氨基末端)的末端氨基酸具有游离氨基，而链的另一个末尾(羧基末端)的末端氨基酸具有游离羧基。如本文使用的，术语“氨基末端”(缩写为N-末端)指肽的氨基末端的氨基酸上的游离α-氨基，或该肽中任何其他位置的氨基酸的α-氨基(当参与肽键时为亚氨基)。类似地，术语“羧基末端”指肽的羧基末端上的游离羧基，或该肽中任何其他位置的氨基酸的羧基。肽还包括基本上任何多氨基酸，包括但不限于肽模拟物(peptide mimetic)诸如通过醚键而非酰胺键连接的氨基酸。
术语“治疗蛋白”是指具有一种或更多种治疗和/或生物活性的蛋白、多肽、抗体、肽、或其片段或变体。本发明涵盖的治疗蛋白包括但不限于，蛋白、多肽、肽、抗体和生物制品。(术语肽、蛋白和多肽在本文可互换使用。)特别地设想，术语“治疗蛋白”涵盖抗体和其片段及变体。
使用标准单字母缩写或三字母缩写表示多核苷酸和多肽序列。除非另有说明，多肽序列在左侧具有它们的氨基末端并在右侧具有它们的羧基末端，并且单链核酸序列和双链核酸序列的上方的链在左侧具有它们的5’末端并且在右侧具有它们的3’末端。多肽的特定部分可以由氨基酸残基编号诸如氨基酸80至119表示，或由该位点的实际的残基诸如Ser80至Ser119表示。特定多肽或多核苷酸序列也可以通过解释它与参考序列的区别来描述。
本公开内容的多肽包括已经以任何方式和由于任何理由被修饰的多肽，例如以(1)降低对蛋白水解作用的敏感性，(2)降低对氧化的敏感性，(3)改变用于形成蛋白复合体的结合亲和力，(4)改变结合亲和力，以及(5)赋予或改变其他的物理化学或功能特性。例如，单氨基酸置换或多氨基酸置换(例如，保守氨基酸置换)可以在天然存在的序列中进行(例如，在形成分子间接触的结构域以外的多肽部分中)。“保守氨基酸置换”指多肽中氨基酸被功能上相似的氨基酸置换。以下六组各自包含互相为保守置换的氨基酸：
丙氨酸(A)、丝氨酸(S)和苏氨酸(T)
天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)
天冬酰胺(N)和谷氨酰胺(Q)
精氨酸(R)和赖氨酸(K)
异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)和缬氨酸(V)
苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)
“非保守氨基酸置换”指这些类别中的一个的成员置换为来自另一个类别的成员。在进行此类改变时，根据某些实施方案，可以考虑氨基酸的亲水指数(hydropathicindex)。基于氨基酸的疏水性和荷电性质，每个氨基酸被指定亲水指数。它们是：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)和精氨酸(-4.5)。
本领域了解亲水氨基酸指数在赋予蛋白相互作用的生物功能中的重要性(参见例如，Kyte等人,1982,J.Mol.Biol.157:105-131)。已知，某些氨基酸可以被具有相似亲水指数或分数的其他氨基酸置换，并且仍保持相似的生物活性。在基于亲水指数进行改变时，在某些实施方案中，包括亲水指数在±2以内的氨基酸的置换。在某些实施方案中，包括在±1以内的那些，并且在某些实施方案中，包括在±0.5以内的那些。
本领域还理解，可以基于亲水性有效地进行相似氨基酸的置换，特别是当从而产生的生物功能蛋白或肽被意图用于在如本文公开的免疫学实施方案中使用时。在某些实施方案中，如被其相邻氨基酸的亲水性控制的，蛋白的最大局部平均亲水性与其免疫原性和抗原性相关，即与该蛋白的生物学性质相关。
以下亲水性值被指定至这些氨基酸残基：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0.+-.1)；谷氨酸(+3.0.+-.1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5.+-.1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)和色氨酸(-3.4)。在基于相似亲水性值进行改变时，在某些实施方案中，包括亲水性值在±2以内的氨基酸置换，在某些实施方案中，包括在±1以内的那些，并且在某些实施方案中，包括在±0.5以内的那些。示例性的氨基酸置换在表1中列出。
表1
Figure BDA0001636141400000131
Figure BDA0001636141400000141
技术人员能够使用公知技术确定如本文列出的适当的多肽变体。在某些实施方案中，本领域技术人员可以通过靶向被认为对于活性不重要的区域鉴定可以被改变而不破坏活性的分子的适当区域。在其他实施方案中，技术人员可以鉴定在相似多肽间保守的分子的残基和部分。在另外的实施方案中，即使可能对生物活性或对结构重要的区域也可以经历保守氨基酸置换，而不破坏生物活性或不会不利地影响多肽结构。
另外，本领域技术人员可以回顾鉴定相似多肽中对活性或结构重要的残基的结构-功能研究。鉴于这样的比较，技术人员可以预测相应于相似多肽中对活性或结构重要的氨基酸残基的多肽中氨基酸残基的重要性。本领域技术人员可以选择对此类预测的重要氨基酸残基进行化学上相似的氨基酸置换。
本领域技术人员还可以在相似多肽中分析与该结构相关的三维结构和氨基酸序列。鉴于这样的信息，本领域技术人员可以对于多肽的三维结构预测其氨基酸残基的排列。在某些实施方案中，本领域技术人员可以选择不对被预测处于多肽表面的氨基酸残基进行基团改变(radical changes)，因为此类残基可参与与其他分子的重要相互作用。并且，本领域技术人员可以生成在每个期望的氨基酸残基处包含单氨基酸置换的测试变体。然后可使用本领域技术人员已知的活性测定筛选变体。此类变体可以被用于收集关于合适的变体的信息。例如，如果人们发现，特定氨基酸残基的改变导致受损的、不期望地减少的或不适合的活性，则可以避免具有此类改变的变体。换句话说，基于从此类常规试验收集的信息，本领域技术人员可以容易地确定应避免在该处单独的或与其他突变组合的进一步置换的氨基酸。
本文中使用的术语“多肽片段”和“截短的多肽”指与相应全长蛋白相比具有氨基末端缺失和/或羧基末端缺失的多肽。在某些实施方案中，片段可以为，例如至少5个、至少10个、至少25个、至少50个、至少100个、至少150个、至少200个、至少250个、至少300个、至少350个、至少400个、至少450个、至少500个、至少600个、至少700个、至少800个、至少900个或至少1000个氨基酸的长度。在某些实施方案中，片段还可以为，例如最多1000个、最多900个、最多800个、最多700个、最多600个、最多500个、最多450个、最多400个、最多350个、最多300个、最多250个、最多200个、最多150个、最多100个、最多50个、最多25个、最多10个或最多5个氨基酸的长度。片段还可以在其任一个或两个末端包含一个或更多个另外的氨基酸，例如，来自不同天然存在的蛋白的氨基酸序列(例如，Fc或亮氨酸拉链结构域)或人工氨基酸序列(例如，人工接头序列)。
本文使用的术语“多肽变体”和“多肽突变体”指包含以下氨基酸序列的多肽，其中相对于另一个多肽序列，一个或更多个氨基酸残基被插入至该氨基酸序列、从其中缺失和/或被置换到该氨基酸序列中。在某些实施方案中，待被插入、缺失或置换的氨基酸残基的数量可以是例如，至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少10个、至少25个、至少50个、至少75个、至少100个、至少125个、至少150个、至少175个、至少200个、至少225个、至少250个、至少275个、至少300个、至少350个、至少400个、至少450个或至少500个氨基酸的长度。本公开内容的变体包括融合蛋白。
多肽的“衍生物”是被化学修饰的多肽，所述化学修饰例如缀合至另一个化学部分诸如例如聚乙二醇、白蛋白(例如人血清白蛋白)，磷酸化和糖基化。
本文中术语“％序列同一性”与术语“％同一性”可互换使用并且指当使用序列比对程序比对时，两个或更多个肽序列之间的氨基酸序列同一性的水平或两个或更多个核苷酸序列之间的核苷酸序列同一性的水平。例如，如本文使用的，80％同一性与由定义的算法确定的80％序列同一性指相同的事物，并且指的是，给定序列与另一个序列的另一长度至少80％相同。在某些实施方案中，％同一性选自例如，与给定序列至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％或更大的序列同一性。在某些实施方案中，％同一性在例如约60％至约70％、约70％至约80％、约80％至约85％、约85％至约90％、约90％至约95％或约95％至约99％的范围内。
本文中术语“％序列同源性”与术语“％同源性”可互换使用并且指当使用序列比对程序比对时，两个或更多个肽序列之间的氨基酸序列同源性的水平或两个或更多个核苷酸序列之间的核苷酸序列同源性的水平。例如，如本文使用的，80％同源性与由定义的算法确定的80％序列同源性指相同的事物，并且相应地，给定序列的同源物相对于给定序列的长度具有大于80％的序列同源性。在某些实施方案中，％同源性选自例如，与给定序列至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％或更大的序列同源性。在某些实施方案中，％同源性在例如约60％至约70％、约70％至约80％、约80％至约85％、约85％至约90％、约90％至约95％或约95％至约99％的范围内。
可以被用于确定两个序列之间的同一性的示例性计算机程序包括但不限于，BLAST程序的套件，例如BLASTN、BLASTX和TBLASTX、BLASTP以及TBLASTN，其在互联网在NCBI的网站上可公开获得。还参见Altschul等,1990,J.Mol.Biol.215:403-10(特别参见公开的默认设定，即参数w＝4、t＝17)和Altschul等,1997,Nucleic Acids Res.,25:3389-3402。当相对于GenBank蛋白序列和其他公开数据库中的氨基酸序列评价给定氨基酸序列时，通常使用BLASTP程序进行序列检索。BLASTX程序优选用于相对于GenBank蛋白序列和其他公开数据库中的氨基酸序列检索在所有阅读框已经被翻译的核酸序列。使用开放缺口罚分11.0和延伸缺口罚分1.0的默认参数并使用BLOSUM-62矩阵运行BLASTP和BLASTX。(同上)。
除了计算序列同一性百分比以外，BLAST算法还进行两个序列之间相似性的统计分析(参见，例如，Karlin&Altschul,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA,90:5873-5787(1993))。由BLAST算法提供的相似性的一个测量值是最小总概率(P(N))，所述最小总概率提供两个核苷酸序列或氨基酸序列之间的匹配偶然发生的概率的指示。例如，如果在测试核酸与参考核酸的比较中，最小总概率为，例如小于约0.1、小于约0.01或小于约0.001，该核酸被认为与参考序列相似。
术语“分离的分子”(其中分子为例如多肽、多核苷酸或抗体)是以下的分子，该分子由于其起源或衍生来源：(1)与在其天然状态下伴随的天然相关的组分不相关，(2)基本上不含来自相同物种的其他分子；(3)由来自不同物种的细胞表达，或(4)在自然中不存在。因此，化学合成的、或在与其原始起源的细胞不同的细胞系统中表达的分子，将是与其天然缔合的组分“分离”的。还可以利用本领域众所周知的纯化技术通过分离使分子基本上不含天然地缔合的组分。可以通过本领域众所周知的很多手段测定分子纯度或均一性。例如，多肽样品的纯度可以使用本领域公知的技术使用聚丙烯酰胺凝胶电泳和使多肽可视化的凝胶染色测定。为了某些目的，可通过使用HPLC或本领域公知的用于纯化的其他手段提供更高的分辨率。
当样品的至少约60％至75％表现为单一种类的多肽时，蛋白或多肽是“基本纯”、“基本均一”或“基本纯化”的。基本纯的多肽或蛋白将通常构成蛋白样品的约50％、60％、70％、80％或90％W/W，更通常约95％，并且例如，将超过99％纯。蛋白纯度或均一性可通过本领域公知的许多手段来指示，所述手段诸如蛋白样品的聚丙烯酰胺凝胶电泳，随后在用本领域公知的染色剂染色凝胶之后可视化单一多肽条带。为了某些目的，可通过使用HPLC或本领域公知的用于纯化的其他手段提供更高的分辨率。
“抗原结合和拮抗性蛋白”是包含结合至抗原的部分并且任选地包含支架或框架部分的蛋白，所述支架或框架部分允许抗原结合部分采取促进所分离的拮抗性抗原结合蛋白结合至该抗原的构象。抗原结合和拮抗性蛋白的实例包括抗体、抗体片段(例如，抗体的抗原结合部分)、抗体衍生物和抗体类似物。分离的拮抗性抗原结合蛋白可以包含，例如，替代的蛋白支架或具有接枝的CDR或CDR衍生物的人工支架。此类支架包括但不限于，包含突变的衍生自抗体的支架以及全合成支架，所述突变被引入以，例如，稳定分离的拮抗性抗原结合蛋白的三维结构，所述全合成支架包括，例如，生物相容的聚合物。参见，例如，Korndorfer等,2003,Proteins:Structure,Function,and Bioinformatics,第53卷,1期:121-129(2003)；Roque等,Biotechnol.Prog.20:639-654(2004)。另外，可以使用肽抗体模拟物(“PAM”)以及基于利用纤连蛋白组分的抗体模拟物的支架作为支架。
分离的拮抗性抗原结合蛋白可以具有，例如，天然存在的免疫球蛋白的结构。“免疫球蛋白”是四聚体分子。在天然存在的免疫球蛋白中，每个四聚体由相同的两对多肽链组成，每对具有一条“轻链”(约25kDa)和一条“重链”(约50-70kDa)。每条链的氨基末端部分包括主要负责抗原识别的约100至110或更多个氨基酸的可变区。每条链的羧基末端部分限定了主要负责效应物功能的恒定区。人轻链被分类为κ和λ轻链。重链被分类为μ、δ、γ、α或ε，并且将抗体的同种型分别定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链中，可变区和恒定区由约12个或更多个氨基酸的“J”区连接，重链还包括约10个或更多个氨基酸的“D”区。大体上参见Fundamental Immunology第7章(Paul,W.,编辑,第2版，Raven Press,N.Y.(1989))(为了所有的目的通过引用以其整体并入)。每个轻链/重链对的可变区形成抗原结合位点，使得完整的免疫球蛋白具有两个结合位点。
“抗体”指包含一个或更多个多肽并且具有对肿瘤抗原的特异性或具有对在病理状态过表达的分子的特异性的蛋白，所述多肽基本上或部分地由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因的片段编码。公认的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及这些基因的亚型和大量免疫球蛋白可变区基因。轻链(LC)被分类为κ或λ。重链(HC)被分类为γ、μ、α、δ或ε，其继而分别定义免疫球蛋白类型IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。典型的免疫球蛋白(例如抗体)结构单元包含四聚体。每个四聚体由相同的两对多肽链组成，每对具有一条“轻链”(约25kDa)和一条“重链”(约50-70kDa)。每条链的N-末端定义主要负责抗原识别的约100个至110个或更多个氨基酸的可变区。
在全长抗体中，每条重链包含重链可变区(在本文中被缩写为HCVR或VH)和重链恒定区。重链恒定区包含3个结构域，CH1、CH2和CH3(并且在一些例子中，CH4)。每条轻链包含轻链可变区(在本文中被缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域，CL。VH和VL区可以被进一步细分为被称为互补决定区(CDR)的高变区，其散布着被称为框架区(FR)的更保守的区域。每个VH和VL包含3个CDR和4个FR，从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。已经定义了框架区和CDR的范围。不同轻链或重链的框架区的序列在物种，例如人内是相对保守的。抗体的框架区，即组成型轻链和重链的组合的框架区，起在三维空间定位和排列CDR的作用。免疫球蛋白分子可以是任何类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。
抗体以完整的免疫球蛋白或以大量良好表征的片段存在。这样的片段包括结合至靶抗原的Fab片段、Fab’片段、Fab2、F(ab)’2片段、单链Fv蛋白(“scFv”)和由二硫键稳定的Fv蛋白(“dsFv”)。scFv蛋白是融合蛋白，其中免疫球蛋白的轻链可变区和免疫球蛋白的重链可变区由接头结合，而在dsFv中，链已经被突变以引入二硫键来稳定所述链的结合。尽管已经关于完整抗体的消化定义了多种抗体片段，技术人员将理解，这样的片段可以化学地或通过利用重组DNA方法被从头合成。因此，如本文使用的，术语抗体包括，例如单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、从至少2个完整抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)、人抗体、人源化抗体、骆驼源化抗体(camelised antibodies)、嵌合抗体、单链Fv(scFv)、单链抗体、单结构域抗体、结构域抗体、Fab片段、F(ab’)2片段、表现出期望的生物学活性的抗体片段、二硫键连接的Fv(sdFv)、细胞内抗体(intrabody)和表位结合片段或以上任一个的抗原结合片段。
Fab片段是具有VL、VH、CL和CH1结构域的单价片段；F(ab’)2片段是具有两个Fab片段的二价片段，所述两个Fab片段在铰链区通过二硫桥连接；Fd片段具有VH和C.sub.H1结构域；Fv片段具有抗体的单臂的VL和VH结构域；并且dAb片段具有VH结构域、VL结构域或者VH或VL结构域的抗原结合片段(美国专利第6,846,634号、第6,696,245号，美国申请公布第05/0202512号、第04/0202995号、第04/0038291号、第04/0009507号、第03/0039958号、Ward等,Nature 341:544-546(1989))。
单链抗体(scFv)是其中VL和VH区经由接头(例如，氨基酸残基的合成序列)连接以形成连续蛋白链的抗体，其中接头足够长以允许蛋白链自身折叠并形成单价抗原结合位点(参见，例如Bird等人,Science 242:423-26(1988)和Huston等人,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-83(1988))。双抗体是包含两条多肽链的二价抗体，其中每个多肽链包含由接头连接的VH和VL结构域，所述接头太短以至于不允许相同链上的两个结构域之间配对，从而允许每个结构域与另一条多肽链上的互补结构域配对(参见，例如Holliger等人,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-48(1993)，和Poljak等人,Structure 2:1121-23(1994))。如果双抗体的两条多肽链是相同的，那么由它们的配对产生的双抗体将具有两个相同的抗原结合位点。具有不同序列的多肽链可以被使用以产生具有两个不同抗原结合位点的双抗体。类似地，三抗体和四抗体分别是包含三条和四条多肽链并且分别形成三个和四个抗原结合位点的抗体，所述抗原结合位点可以是相同的或不同的。
分离的拮抗性抗原结合蛋白可以具有一个或更多个结合位点。如果存在多于一个结合位点，则结合位点可以彼此相同或可以不同。例如，天然存在的人免疫球蛋白通常具有两个相同的结合位点，而“双特异性”或“双功能”抗体具有两个不同的结合位点。
术语“人抗体”包括具有一个或更多个衍生自人免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的所有抗体。在一种实施方案中，所有可变结构域和恒定结构域衍生自人免疫球蛋白序列(完全人抗体(fully human antibody))。这些抗体可以以多种方法制备，所述方法的实例在以下描述，包括通过用感兴趣的抗原免疫接种被遗传修饰以表达源自人重链编码基因和/或轻链编码基因的小鼠。
“人源化抗体”具有以一个或更多个氨基酸置换、缺失和/或添加与源自非人物种的抗体的序列不同的序列，使得当被施用至人受试者时，人源化抗体与非人物种抗体相比不太可能诱导免疫应答和/或诱导不太严重的免疫应答。在一种实施方案中，非人物种抗体的重链和/或轻链的框架结构域和恒定结构域中的某些氨基酸被突变以产生人源化抗体。在另一种实施方案中，来自人抗体的恒定结构域被融合至非人物种的可变结构域。在另一种实施方案中，非人抗体的一个或更多个CDR序列中的一个或更多个氨基酸残基被改变以减少当该非人抗体被施用至人受试者时其可能的免疫原性，其中改变的氨基酸残基对该抗体与其抗原的免疫特异性结合不重要，或对氨基酸序列所做的改变是保守改变，使得人源化抗体与抗原的结合不显著差于非人抗体与该抗原的结合。如何制备人源化抗体的实例可以在美国专利第6,054,297号、第5,886,152号和第5,877,293号中找到。
如果本公开内容的分离的拮抗性抗原结合蛋白(包括抗体)以如由10-7M或更低的解离常数(Kd或相应的Kb，如以下定义的)值确定的高结合亲和力结合至抗原(诸如人胰高血糖素受体)，则本公开内容的分离的拮抗性抗原结合蛋白“特异性结合至”该抗原。特异性结合至人胰高血糖素受体的分离的拮抗性抗原结合蛋白可能能够以相同或不同亲和力结合至来自其他物种的胰高血糖素受体。
“表位”是被分离的拮抗性抗原结合蛋白(例如，被抗体)结合的分子的一部分。表位可以包含分子的不连续部分(例如，在多肽中，在该多肽的一级序列中不连续的氨基酸残基，但在多肽的三级和四级结构中，所述氨基酸残基彼此足够靠近以被抗原结合和拮抗性蛋白结合)。
术语“血液葡萄糖水平”或“血液葡萄糖的水平”应意指血液葡萄糖浓度。在某些实施方案中，血液葡萄糖水平为血浆葡萄糖水平。血浆葡萄糖可以根据例如Etgen等,Metabolism,49(5):684-688,2000)确定，或根据D’Orazio等,Clin.Chem.Lab.Med.,44(12):1486-1490,2006从全血葡萄糖浓度的转换来计算。
术语“正常葡萄糖水平”指小于约100mg/dL的空腹水平的人平均血浆葡萄糖值和小于约145mg/dL的餐后2小时水平的人平均血浆葡萄糖值或小于125mg/dL的随机葡萄糖的人平均血浆葡萄糖值。术语“升高的血液葡萄糖水平”或“升高的血液葡萄糖的水平”应意指升高的血液葡萄糖水平，诸如在临床上显示出不合适的基础和餐后高血糖症的受试者中发现的升高的血液葡萄糖水平，或者诸如在口服葡萄糖耐量试验(oGTT)中在受试者中发现的升高的血液葡萄糖水平，“升高的血液葡萄糖的水平”为当在空腹条件下测试时高于约100mg/dL，并且在1小时测试时高于约200mg/dL。
术语“胰高血糖素抑制剂(glucagon inhibitor)”、“胰高血糖素抑制剂(glucagonsuppressor)”和“胰高血糖素拮抗剂”可互换使用。每一种均是可检测地抑制胰高血糖素信号传导的分子。由抑制剂(inhibitor)引起的抑制不需要是完全的，只要所述抑制可由使用在本领域被公认并被理解为胰高血糖素信号传导抑制的决定因素的测定检测。
如本文使用的，“心力衰竭”指心脏功能异常，其中心脏不以代谢组织需要的速率泵血。心力衰竭包括多种疾病状态，诸如充血性心力衰竭、心肌梗塞、快速性心律失常、家族性肥大性心肌病、缺血性心脏病、特发性扩张性心肌病、心肌炎等。心力衰竭可由任何多种因素引起，包括但不限于缺血性、先天性、风湿性、病毒性、毒性或特发性形式。慢性心脏肥大是为充血性心力衰竭和心脏骤停的先兆的一种显著的疾病状态。
“药物组合物”指适用于动物和人中的药学应用的组合物。药物组合物包含药理有效量和/或治疗有效量的活性剂和药学上可接受的载体。“药学上可接受的载体”指当被施用至动物或人时不产生不利、过敏或其他不良(untoward)反应的组合物。如本文使用的，“药学上可接受的载体”指任何标准药学载体、媒介物、缓冲液和载体，诸如磷酸盐缓冲的盐水溶液、右旋糖的5％水溶液和乳液，诸如油/水乳液或水/油乳液，以及多种类型的润湿剂和/或佐剂。适当的药学载体和制剂在Remington’s Pharmaceutical Sciences,第21版2005,Mack Publishing Co,Easton中描述。“药学上可接受的盐”指可以被配制成用于药学应用的化合物的盐，包括例如金属盐(钠、钾、镁、钙等)和氨的盐或有机胺的盐。
如本文使用的术语“免疫缀合物”或“融合蛋白”是指包含与效应分子直接或间接缀合(或连接)的抗体或其抗原结合片段的分子。效应分子可以是可检测标记物、免疫毒素、细胞因子、趋化因子、治疗剂或化学治疗剂。抗体或其抗原结合片段可经由肽接头缀合至效应分子。免疫缀合物和/或融合蛋白保留了抗体或抗原结合片段的免疫反应性，例如，抗体或抗原结合片段与在缀合后具有与缀合之前结合抗原的能力大致相同或仅稍微降低的能力。如本文使用的，免疫缀合物也可被称为抗体药物缀合物(ADC)。由于免疫缀合物和/或融合蛋白最初从具有不同功能的两种分子诸如抗体和效应分子制备，它们有时也被称为“嵌合分子”。
如本文使用的，“治疗有效量”的与人胰高血糖素受体特异性结合的分离的拮抗性抗原结合蛋白指当根据所公开并请求保护的方法提供给受试者时，实现以下生物活性之一的此类蛋白的量：治疗心力衰竭；或减少、抑制(suppresses)、缓解或抑制(inhibits)心力衰竭的一种或更多种症状。
术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”指用于获得有益或期望的临床结果的方法。另外，本文中对“治疗”的提及包括对治愈性、缓解性和预防性治疗的提及。为了本公开内容的目的，有益或期望的临床结果包括但不限于以下中的一种或更多种：将血液葡萄糖改善至在约80-180mg/dL内、或约80-170mg/dL内、或约80-160mg/dL内、或约80-150mg/dL内、或约80-140mg/dL内，或者改善与升高的血液葡萄糖的水平有关或由升高的血液葡萄糖的水平导致的任一种或更多种状况、疾病或症状，包括但不限于高血糖症、高葡聚糖血症(hyperglucanemia)和高胰岛素血症。
应理解，本文描述的本发明的方面和实施方案包括“由这些方面和实施方案组成”和/或“主要由这些方面和实施方案组成”。
除非上下文另外明确指出，如本文和所附的权利要求中使用的单数形式“一种”、“或”和“该”包含复数指代物。应理解，本文描述的公开内容的方面和变化包括“由方面和变化组成”和/或“主要由方面和/或变化组成”。
本文中，提及“约”值或参数包括(并描述)针对该值或参数本身的变异。例如，提及“约X”的描述包括对“X”的描述。
胰高血糖素受体和抗原结合和拮抗性蛋白
胰高血糖素是29个氨基酸的激素，在胰腺α细胞中由激素原转化酶2(PC2)的细胞特异性表达从其前-原形式(pre-pro-form)加工而成，激素原转化酶2是一种参与激素原和神经肽原的细胞内成熟的神经内分泌特异性蛋白酶(Furuta等人,J.Biol.Chem.276:27197-27202(2001))。在体内，胰高血糖素是胰岛素作用的主要反调节激素。在禁食期间，响应于降低的葡萄糖水平，胰高血糖素分泌增加。增加的胰高血糖素分泌通过促进肝糖原分解和糖异生刺激葡萄糖产生(Dunning和Gerich,Endocrine Reviews,28:253-283(2007))。因此，胰高血糖素在保持动物的正常葡萄糖水平方面平衡胰岛素的作用。
胰高血糖素的生物作用通过结合和随后活化特异性细胞受体——胰高血糖素受体——介导。胰高血糖素受体(GCGR)是G蛋白偶联受体的促胰液素亚家族(家族B)的成员。人GCGR是477个氨基酸序列GPCR，并且GCGR的氨基酸序列在物种之间高度保守(Mayo等人,Pharmacological Rev.,55:167-194,(2003))。胰高血糖素受体主要在肝中表达，在肝中它调节肝葡萄糖输出；在肾和胰岛β细胞上表达，反映其在糖异生中的作用。肝中的胰高血糖素受体的活化刺激腺苷酸环化酶的活性和磷脂酰肌醇z，其随后导致糖异生酶的表达增加，所述糖异生酶包括磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶(PEPCK)、果糖-1,6-二磷酸酶(FBPase-1)和葡萄糖-6-磷酸酯酶(G-6-Pase)。另外，胰高血糖素信号传导激活糖原磷酸化酶并抑制糖原合酶。研究已经表明，较高的基底胰高血糖素水平和缺乏餐后胰高血糖素分泌的抑制促成人的糖尿病状况(Muller等人,N Eng J Med,283:109-115(1970))。因此，探索了使用GCGR拮抗剂通过靶向胰高血糖素产生或功能控制和降低血液葡萄糖的方法。
在多种实施方案中，本公开内容的抗原结合和拮抗性蛋白可以被选择以结合至在如细胞上表达的膜结合的胰高血糖素受体，并抑制或阻断通过胰高血糖素受体的信号传导。在多种实施方案中，本公开内容的抗原结合和拮抗性蛋白特异性结合至人胰高血糖素受体。在多种实施方案中，结合至人胰高血糖素受体的抗原结合和拮抗性蛋白还可以结合至其他物种的胰高血糖素受体。若干物种的胰高血糖素受体的多核苷酸和多肽序列是已知的(参见例如美国专利第7,947,809号，由于其对人、大鼠、小鼠和猕猴胰高血糖素受体的多核苷酸和多肽序列的具体教导，通过引用以其整体并入本文)。在本公开内容的多种实施方案中，抗原结合和拮抗性蛋白特异性结合具有SEQ ID NO：1列出的氨基酸序列的人胰高血糖素受体：
胰高血糖素受体人(智人(Homo sapiens))氨基酸序列
(登录号AAI04855)
MPPCQPQRPLLLLLLLLACQPQVPSAQVMDFLFEKWKLYGDQCHHNLSLLPPPTELVCNRTFDKYSCWPDTPANTTANISCPWYLPWHHKVQHRFVFKRCGPDGQWVRGPRGQPWRDASQCQMDGEEIEVQKEVAKMYSSFQVMYTVGYSLSLGALLLALAILGGLSKLHCTRNAIHANLFASFVLKASSVLVIDGLLRTRYSQKIGDDLSVSTWLSDGAVAGCRVAAVFMQYGIVANYCWLLVEGLYLHNLLGLATLPERSFFSLYLGIGWGAPMLFVVPWAVVKCLFENVQCWTSNDNMGFWWILRFPVFLAILINFFIFVRIVQLLVAKLRARQMHHTDYKFRLAKSTLTLIPLLGVHEVVFAFVTDEHAQGTLRSAKLFFDLFLSSFQGLLVAVLYCFLNKEVQSELRRRWHRWRLGKVLWEERNTSNHRASSSPGHGPPSKELQFGRGGGSQDSSAETPLAGGLPRLAESPF(SEQ ID NO：1)
在多种实施方案中，特异性结合与引用的参考文献中描述的胰高血糖素受体具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性(如使用本领域已知和在本文描述的方法计算的)的胰高血糖素受体的本公开内容的抗原结合和拮抗性蛋白也被包括在本公开内容中。
本公开内容的抗原结合和拮抗性蛋白发挥阻断胰高血糖素及其受体之间的相互作用的作用，从而抑制胰高血糖素的葡萄糖升高作用。因此，本公开内容的抗原结合和拮抗性蛋白的使用是实现正常葡萄糖水平，从而缓解或预防糖尿病的一种或更多种症状或由糖尿病导致的长期并发症，包括但不限于高血糖症、高葡聚糖血症和高胰岛素血症的有效手段。本公开内容的抗原结合和拮抗性蛋白的使用还是实现非糖尿病患者中的正常葡萄糖水平，从而降低患有包含但不限于T1D、T2D、肥胖症、NAFLD、NASH的紊乱的受试者中的高血糖症、高葡聚糖血症和高胰岛素血症的风险，以及用于治疗此类非糖尿病紊乱的有效手段。本公开内容部分地基于发明人的独特见解：特异性结合至人胰高血糖素受体的分离的抗原结合和拮抗性蛋白(isolated antigen binding and antagonizing proteins)可以提供用于在心肌梗塞后治疗和预防心力衰竭的改进的、有效的疗法。本发明人提出，通过阻断心肌梗塞诱导的心力衰竭受试者(或所有其他心力衰竭受试者)中的胰高血糖素受体所提供的有益治疗效果涉及左心室(LV)重构的防止或减弱，其可包括：增加缩短分数(fractionalshortening)(FS)，减少LV扩张(LVESD)；保持LV壁厚；增加LV发展的压力和心室收缩力；降低心脏重量与体重的比率(梗塞大小)；减少纤维化过程；降低缺血条件下心脏中不完全氧化的脂肪酸代谢物的水平；并降低MI诱发的死亡率。
产生结合至抗原诸如人胰高血糖素受体的抗体的方法是本领域技术人员已知的。例如，产生特异性结合至靶抗原多肽的单克隆抗体的方法可以包括：向小鼠施用一定量的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含有效刺激可检测的免疫应答的靶抗原多肽；从小鼠获得产生抗体的细胞(例如，来自脾的细胞)并使产生抗体的细胞与骨髓瘤细胞融合以获得产生抗体的杂交瘤；以及测试产生抗体的杂交瘤以鉴定产生特异性结合至靶抗原多肽的单克隆抗体的杂交瘤。一旦获得，可以在细胞培养中繁殖杂交瘤，任选地在其中源自杂交瘤的细胞产生特异性结合至靶抗原多肽的单克隆抗体的培养条件下繁殖。单克隆抗体可以从细胞培养物纯化。然后，用于测试抗原/抗体相互作用以鉴定特定期望的抗体的多种不同的技术是可获得的。
可以使用产生或分离具有必需的特异性的抗体的其他合适的方法，包括例如，从文库选择重组抗体的方法，或依赖于对能够产生人抗体的完整库的转基因动物(例如小鼠)进行免疫的方法。参见，例如Jakobovits等,Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.),90:2551-2555,1993；Jakobovits等,Nature,362:255-258,1993；Lonberg等,美国专利第5,545,806号；和Surani等,美国专利第5,545,807号。
抗体可以以多种方法被工程化。它们可以作为单链抗体(包括小模块免疫药物(small modular immunopharmaceutical)或SMIPsTM)、Fab和F(ab’)2片段等产生。抗体可以为人源化的、嵌合的、去免疫的(deimmunized)或完全人抗体。许多公开物列出了许多类型的抗体和工程化此类抗体的方法。例如，参见美国专利第6,355,245号、第6,180,370号、第5,693,762号、第6,407,213号、第6,548,640号、第5,565,332号、第5,225,539号、第6,103,889号、和第5,260,203号。
通过本领域已知的重组DNA技术可以产生嵌合抗体。例如，用限制性酶消化编码鼠(或其他物种)单克隆抗体分子的Fc恒定区的基因以去除编码鼠Fc的区域，并置换编码人Fc恒定区的基因的等同部分(参见Robinson等,国际专利公布PCT/US86/02269；Akira等,欧洲专利申请184,187；Taniguchi,M.,欧洲专利申请171,496；Morrison等,欧洲专利申请173,494；Neuberger等,国际申请WO 86/01533；Cabilly等美国专利第4,816,567号；Cabilly等,欧洲专利申请125,023；Better等,Science,240:1041-1043,1988；Liu等,Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.),84:3439-3443,1987；Liu等,J.Immunol.,139:3521-3526,1987；Sun等,Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.),84:214-218,1987；Nishimura等,Canc.Res.,47:999-1005,1987；Wood等人,Nature,314:446-449,1985；和Shaw等人,J.Natl CancerInst.,80:1553-1559,1988)。
本领域已经描述了用于人源化抗体的方法。在一些实施方案中，除了非人CDR以外，人源化抗体具有从非人来源引入的一个或更多个氨基酸残基。人源化可以基本上按照Winter和同事的方法执行(Jones等人,Nature,321:522-525,1986；Riechmann等人,Nature,332:323-327,1988；Verhoeyen等人,Science,239:1534-1536,1988)，通过用人抗体的对应序列置换高变区序列。因此，这样的“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利号4,816,567)，其中大体上少于一个完整人可变区已被来自非人物种的相应序列置换。在实践中，人源化抗体通常是其中一些高变区残基和可能地一些框架区残基被来自啮齿动物抗体的类似位点的残基置换的人抗体。
Queen等人的美国专利号5,693,761公开了对Winter等人对于人源化抗体的改进，并且基于这样的前提：将亲和力损失归因于人源化框架内的结构基序的问题，其由于空间或其他化学不相容性，影响CDR折叠成在小鼠抗体中发现的能够结合的构象。为了解决此问题，Queen教导了使用在线性肽序列上与待被人源化的小鼠抗体的框架序列密切同源的人框架序列。因此，Queen的方法关注比较物种之间的框架序列。通常，比较所有可获得的人可变区序列和特定小鼠序列，并计算对应框架残基之间的同一性百分比。选择具有最高百分比的人可变区以为人源化项目提供框架序列。Queen还教导了，在人源化框架中保留对支持能够结合的构象中的CDR至关重要的来自小鼠框架的某些氨基酸残基是重要的。从分子模型评价潜在的重要性。保留的候选残基通常是在线性序列中邻近CDR或物理上在任何CDR残基的
Figure BDA0001636141400000281
以内的那些。
在其他方法中，一旦获得低亲合力人源化构建体，特定框架氨基酸残基的重要性由实验确定，如Riechmann等人,1988所描述的，通过恢复单个残基至小鼠序列并测定抗原结合。用于鉴定框架序列中重要氨基酸的另一个示例方法由Carter等人,美国专利号5,821,337和Adair等人,美国专利号5,859,205公开。这些参考文献公开了框架中具体Kabat残基位置，其在人源化抗体中可能需要被对应的小鼠氨基酸置换以保持亲合力。
人源化抗体的另一个方法，被称为“框架改组(framework shuffling)”，依赖于产生组合文库，所述组合文库具有符合读框地(in frame)融合至单个人种系框架的池的非人CDR可变区(Dall’Acqua等人,Methods,36:43,2005)。随后，筛选文库以鉴定编码保持良好结合的人源化抗体的克隆。
在产生人源化抗体中待被使用的人可变区的选择(轻链和重链二者)对降低抗原性是非常重要的。根据所谓的“最佳拟合”法，针对已知的人可变结构域序列的整个文库筛选啮齿动物抗体的可变区的序列。然后，接受最接近啮齿动物的人序列作为用于人源化抗体的人框架区(框架区)(Sims等人,J.Immunol.,151:2296,1993；Chothia等人,J.Mol.Biol.,196:901,1987)。另一个方法使用源自所有人抗体的特定亚组的轻链可变区或重链可变区的共有序列的特定框架区。相同的框架可以用于若干种不同的人源化抗体(Carter等,Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.),89:4285,1992；Presta等,J.Immunol.,151:2623,1993)。
置换到人可变区内的非人残基的选择可以被多种因素影响。这些因素包括例如，氨基酸在特定位置的稀有性、与CDR或抗原相互作用的可能性以及参与轻链可变结构域界面和重链可变结构域界面之间的界面的可能性。(参见，例如美国专利第5,693,761号、第6,632,927号和第6,639,055号)。分析这些因素的一个方法是通过使用非人序列和人源化序列的三维模型。三维免疫球蛋白模型是本领域技术人员通常可得并且熟悉的。说明并展示所选择的候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构的计算机程序是可得的。对这些展示的检查允许分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能中可能的作用，例如，分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。以此方式，非人残基可以被选择并置换人可变区残基以获得期望的抗体性质，诸如对靶抗原的增加的亲和力。
本领域已经描述了用于产生完全人抗体的方法。以举例的方式，用于产生抗-GCGR抗体或其结合抗原的抗体片段的方法包括以下步骤：在噬菌体上合成人抗体文库，用GCGE或其抗体结合部分筛选文库，分离结合GCGR的噬菌体和从噬菌体收获抗体。以另一个实例的方式，用于制备用于在噬菌体展示技术中使用的抗体文库的一种方法包括以下步骤：用GCGR或其抗原性部分免疫接种包括人免疫球蛋白基因座的非人动物以产生免疫应答，从经免疫接种的动物提取产生抗体的细胞，从所提取的细胞分离编码本公开内容的抗体的重链和轻链的RNA，逆转录RNA以产生cDNA，使用引物扩增cDNA并将cDNA插入到噬菌体展示载体，使得抗体在噬菌体上表达。本公开内容的重组抗-GCGR抗体可以以此方式获得。
再一次，以举例的方式，本公开内容的重组人抗-GCGR抗体也可以通过筛选重组组合抗体文库分离。优选地，文库是使用从B细胞分离的mRNA制备的人VL和VH cDNA产生的scFv噬菌体展示文库。用于制备并筛选此类文库的方法是本领域已知的。用于产生噬菌体展示文库的试剂盒是商购可得的(例如，Pharmacia重组噬菌体抗体系统，目录号27-9400-01；和Stratagene SurfZAPTM噬菌体展示试剂盒，目录号240612)。还存在可以用于生成并筛选抗体展示文库的其他的方法和试剂(参见，例如美国专利第5,223,409号；PCT公布第WO 92/18619号、第WO 91/17271号、第WO 92/20791号、第WO 92/15679号、第WO 93/01288号、第WO92/01047号、第WO 92/09690号；Fuchs等,Bio/Technology,9:1370-1372(1991)；Hay等,Hum.Antibod.Hybridomas,3:81-85,1992；Huse等,Science,246:1275-1281,1989；McCafferty等,Nature,348:552-554,1990；Griffiths等,EMBO J.,12:725-734,1993；Hawkins等,J.Mol.Biotechnol.,17:259-896[1992]；Crameri等,Nature,352:624-628[1991]；Crameri,等,Nat.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.),89:3576-3580,1992；Garrad等,Bio/Technology,9:1373-1377,1991；Hoogenboom等,Nuc.Acid Res.,19:4133-4137,1991；以及Barbas等,Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.),88:7978-7982,1991)，所有文献通过引用并入本文。
人抗体还通过用人IgE抗原免疫接种在其基因组内包含一些或所有的人免疫球蛋白重链和轻链基因座的非人、转基因动物，例如XenoMouseTM动物(Abgenix,Inc./Amgen,Inc.-Fremont,Calif.)来产生。XenoMouseTM小鼠是工程化的小鼠品系，该小鼠品系包含人免疫球蛋白重链和轻链基因座的大的片段，并且缺乏小鼠抗体产生。参见例如Green等,Nature Genetics,7:13-21,1994和美国专利第5,916,771号、第5,939,598号、第5,985,615号、第5,998,209号、第6,075,181号、第6,091,001号、第6,114,598号、第6,130,364号、第6,162,963号和第6,150,584号。XenoMouseTM小鼠产生完全人抗体的成人样人库(adult-likehuman repertoire)，并且产生抗原特异性人抗体。在一些实施方案中，通过在酵母人工染色体(YAC)中引入人重链基因座和κ轻链基因座的兆碱基大小的、种系配置片段，XenoMouseTM小鼠含有人抗体V基因库的大约80％。在其他实施方案中，XenoMouseTM小鼠还包含大约全部人λ轻链基因座。参见Mendez等人,Nature Genetics,15:146-156,1997；Green和Jakobovits,J.Exp.Med.,188:483-495,1998；以及WO 98/24893。
在多种实施方案中，本公开内容的分离的拮抗性抗原结合蛋白利用是以下的抗体或其结合抗原的抗体片段：多克隆抗体、单克隆抗体或其抗原结合片段、重组抗体、双抗体、嵌合化的或嵌合抗体或其抗原结合片段、人源化抗体或其抗原结合片段、完全人抗体或其抗原结合片段、CDR-接枝抗体或其抗原结合片段、单链抗体、Fv、Fd、Fab、Fab’或F(ab’)2以及合成或半合成抗体。
在多种实施方案中，本公开内容的分离的拮抗性抗原结合蛋白利用以例如以下的解离常数(KD)与免疫检查点蛋白抗原结合的抗体或抗原结合片段：至少约1x10-7M、至少约1x10-8M、至少约1x10-9M、至少约1x10-10M、至少约1x10-11M、或至少约1x10-12M。在多种实施方案中，本公开内容的分离的拮抗性抗原结合蛋白利用以在例如以下的范围的解离常数(KD)与免疫检查点蛋白抗原结合的抗体或抗原结合片段：至少约1x10-7M至至少约1x10-8M、至少约1x10-8M至至少约1x10-9M、至少约1x10-9M至至少约1x10-10M、至少约1x10-10M至至少约1x10-11M、或至少约1x10-11M至至少约1x10-12M。
在本发明的多种实施方案中，分离的拮抗性抗原结合蛋白是包含在以下中列出的多核苷酸和多肽序列的抗GCGR(“拮抗性”)抗体或抗原结合片段：例如美国专利第7,947,809、8,158,759、5,770,445、7,947,809、7,968,686、8,545,847和8,771,696号；美国专利公布2009/0041784；2009/0252727；2013/0344538和2014/0335091；以及PCT公布WO2008/036341，由于其对多种抗-GCGR抗体或抗原结合片段的多核苷酸和多肽序列的具体教导，其每个通过引用以其整体并入本文。在本发明的多种实施方案中，分离的拮抗性抗原结合蛋白是本领域中描述的任何抗-GCGR抗体的任何生物相似的、生物仿制的(biogeneric)、改进型的生物的(follow-on biologic)、或改进型的蛋白版本。
在本公开内容的多种实施方案中，抗体可以是具有与包含SEQ ID NO：2列出的重链可变区序列的抗体相同或更高的抗原-结合亲和力的抗-GCGR抗体。在多种实施方案中，抗体可以是与包含SEQ ID NO：2列出的重链可变区序列的抗体结合至相同的表位的抗-GCGR抗体。在多种实施方案中，抗体是与包含SEQ ID NO：2列出的重链可变区序列的抗体竞争的抗-GCGR抗体。在多种实施方案中，抗体可以是包含SEQ ID NO：2列出的重链可变区序列的至少一个(诸如2个或3个)CDR的抗-GCGR抗体。在多种实施方案中，抗体可以是具有与SEQ ID NO：2相同、大体上相同或大体上相似的序列的抗-GCGR抗体。在多种实施方案中，抗体可以是包含SEQ ID NO：2列出的重链可变区序列的抗-GCGR抗体：
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVMWYDGSNKDYVDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNRLRAEDTAVYYCAREKDHYDILTGYN YYYGLDVWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO：2)
在本公开内容的多种实施方案中，抗体可以是具有与包含SEQ ID NO：3列出的轻链可变区序列的抗体相同或更高的抗原-结合亲和力的抗-GCGR抗体。在多种实施方案中，抗体可以是与包含SEQ ID NO：3列出的轻链可变区序列的抗体结合至相同的表位的抗-GCGR抗体。在多种实施方案中，抗体是与包含SEQ ID NO：3列出的轻链可变区序列的抗体竞争的抗-GCGR抗体。在多种实施方案中，抗体可以是包含SEQ ID NO：3列出的轻链可变区序列的至少一个(诸如2个或3个)CDR的抗-GCGR抗体。在多种实施方案中，抗体可以是具有与SEQ ID NO：3相同、大体上相同或大体上相似的序列的抗-GCGR抗体。在多种实施方案中，抗体可以是包含SEQ ID NO：3列出的轻链可变区序列的抗-GCGR抗体：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKRLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSVQPEDFVTYYCLQHNSNPLTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO：3)
在多种实施方案中，抗体包含与SEQ ID NO：2或3的序列共有例如，至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％表观同源性(observed homology)的氨基酸序列。
在本公开内容的多种实施方案中，抗体可以是具有与包含SEQ ID NO：4列出的重链可变区序列的抗体相同或更高的抗原-结合亲和力的抗-GCGR抗体。在多种实施方案中，抗体可以是与包含SEQ ID NO：4列出的重链可变区序列的抗体结合至相同的表位的抗-GCGR抗体。在多种实施方案中，抗体是与包含SEQ ID NO：4列出的重链可变区序列的抗体竞争的抗-GCGR抗体。在多种实施方案中，抗体可以是包含SEQ ID NO：4列出的重链可变区序列的至少一个(诸如2个或3个)CDR的抗-GCGR抗体。在多种实施方案中，抗体可以是具有与SEQ ID NO：4相同、大体上相同或大体上相似的序列的抗-GCGR抗体。在多种实施方案中，抗体可以是包含SEQ ID NO：4列出的重链可变区序列的抗-GCGR抗体：
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVMWYDGSNKDYVDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREKDHYDILTGYNYYYGLDVWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO：4)
在本公开内容的多种实施方案中，抗体可以是具有与包含SEQ ID NO：5列出的轻链可变区序列的抗体相同或更高的抗原-结合亲和力的抗-GCGR抗体。在多种实施方案中，抗体可以是与包含SEQ ID NO：5列出的轻链可变区序列的抗体结合至相同的表位的抗-GCGR抗体。在多种实施方案中，抗体是与包含SEQ ID NO：5列出的轻链可变区序列的抗体竞争的抗-GCGR抗体。在多种实施方案中，抗体可以是包含SEQ ID NO：5列出的轻链可变区序列的至少一个(诸如2个或3个)CDR的抗-GCGR抗体。在多种实施方案中，抗体可以是具有与SEQ ID NO：5相同、大体上相同或大体上相似的序列的抗-GCGR抗体。在多种实施方案中，抗体可以是包含SEQ ID NO：5列出的轻链可变区序列的抗-GCGR抗体：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKRLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFVTYYCLQHNSNPLTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO：5)
在多种实施方案中，抗体包含与SEQ ID NO：4或5的序列共有例如，至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％表观同源性(observed homology)的氨基酸序列。
在本公开内容的多种实施方案中，抗体可以是具有与包含SEQ ID NO：6列出的重链可变区序列的抗体相同或更高的抗原-结合亲和力的抗-GCGR抗体。在多种实施方案中，抗体可以是与包含SEQ ID NO：6列出的重链可变区序列的抗体结合至相同的表位的抗-GCGR抗体。在多种实施方案中，抗体是与包含SEQ ID NO：6列出的重链可变区序列的抗体竞争的抗-GCGR抗体。在多种实施方案中，抗体可以是包含SEQ ID NO：6列出的重链可变区序列的至少一个(诸如2个或3个)CDR的抗-GCGR抗体。在多种实施方案中，抗体可以是具有与SEQ ID NO：6相同、大体上相同或大体上相似的序列的抗-GCGR抗体。在多种实施方案中，抗体可以是包含SEQ ID NO：6列出的重链可变区序列的抗-GCGR抗体：
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVMWYDGSNKDYVDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNRLRAEDTAVYYCAREKDHYDILTGYNYYYGLDVWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO：6)
在本公开内容的多种实施方案中，抗体可以是具有与包含SEQ ID NO：7列出的轻链可变区序列的抗体相同或更高的抗原-结合亲和力的抗-GCGR抗体。在多种实施方案中，抗体可以是与包含SEQ ID NO：7列出的轻链可变区序列的抗体结合至相同的表位的抗-GCGR抗体。在多种实施方案中，抗体是与包含SEQ ID NO：7列出的轻链可变区序列的抗体竞争的抗-GCGR抗体。在多种实施方案中，抗体可以是包含SEQ ID NO：7列出的轻链可变区序列的至少一个(诸如2个或3个)CDR的抗-GCGR抗体。在多种实施方案中，抗体可以是具有与SEQ ID NO：7相同、大体上相同或大体上相似的序列的抗-GCGR抗体。在多种实施方案中，抗体可以是包含SEQ ID NO：7列出的轻链可变区序列的抗-GCGR抗体：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKRLIYAASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSVQPEDFVTYYCLQHNSNPLTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO：7)
在多种实施方案中，抗体包含与SEQ ID NO：6或7的序列共有例如，至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％表观同源性(observed homology)的氨基酸序列。
在本公开内容的多种实施方案中，抗体可以是具有与包含SEQ ID NO：8列出的重链序列的嵌合抗体相同或更高的抗原-结合亲和力的抗-GCGR抗体。在多种实施方案中，抗体可以是与包含SEQ ID NO：8列出的重链序列的抗体结合至相同的表位的抗-GCGR抗体。在多种实施方案中，抗体是与包含SEQ ID NO：8列出的重链序列的抗体竞争的抗-GCGR抗体。在多种实施方案中，抗体可以是包含SEQ ID NO：8列出的重链序列的至少一个(诸如2个或3个)CDR的抗-GCGR抗体。在多种实施方案中，抗体可以是具有与SEQ ID NO：8相同、大体上相同或大体上相似的序列的抗-GCGR抗体。在多种实施方案中，抗体可以是包含SEQ ID NO：8列出的重链序列的抗-GCGR抗体：
MEFGLSWVFLVALLRGVQCQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVMWYDGSNKDYVDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNRLRAEDTAVYYCAREKDHYDILTGYNYYYGLDVWGQGTTVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK(SEQ ID NO：8)
在本公开内容的多种实施方案中，抗体可以是具有与包含SEQ ID NO：9列出的轻链序列的嵌合抗体相同或更高的抗原-结合亲和力的抗-GCGR抗体。在多种实施方案中，抗体可以是与包含SEQ ID NO：9列出的轻链序列的抗体结合至相同的表位的抗-GCGR抗体。在多种实施方案中，抗体是与包含SEQ ID NO：9列出的轻链序列的抗体竞争的抗-GCGR抗体。在多种实施方案中，抗体可以是包含SEQ ID NO：9列出的轻链序列的至少一个(诸如2个或3个)CDR的抗-GCGR抗体。在多种实施方案中，抗体可以是具有与SEQ ID NO：9相同、大体上相同或大体上相似的序列的抗-GCGR抗体。在多种实施方案中，抗体可以是包含SEQ ID NO：9列出的轻链序列的抗-GCGR抗体：
MDMRVPAQLLGLLLLWFPGARCDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKRLIYAASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSVQPEDFVTYYCLQHNSNPLTFGGGTKVEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC(SEQ ID NO：9)
在多种实施方案中，抗体包含与SEQ ID NO：8或9的序列共有例如，至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％表观同源性(observed homology)的氨基酸序列。
在本公开内容的多种实施方案中，抗体可以是抗-GCGR抗体，所述抗-GCGR抗体包含与选自以下的序列相同、大体上相同或大体上相似的重链可变区序列：SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ IDNO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、和SEQID NO：28和与选自以下的序列相同、大体上相同或大体上相似的轻链可变区序列：SEQ IDNO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ IDNO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ IDNO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、和SEQID NO：47。在多种实施方案中，抗体包含与SEQ ID NO：10-28或SEQ ID NO：29-47的序列共有例如，至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％表观同源性(observed homology)的氨基酸序列。
抗-GCGR抗体的实例
HCVR LCVR
SEQ ID NO:2 SEQ ID NO:3
SEQ ID NO:4 SEQ ID NO:5
SEQ ID NO:6 SEQ ID NO:7
SEQ ID NO:10 SEQ ID NO:29
SEQ ID NO:11 SEQ ID NO:30
SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:31
SEQ ID NO:13 SEQ ID NO:32
SEQ ID NO:14 SEQ ID NO:33
SEQ ID NO:15 SEQ ID NO:34
SEQ ID NO:16 SEQ ID NO:35
SEQ ID NO:17 SEQ ID NO:36
SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:37
SEQ ID NO:19 SEQ ID NO:38
SEQ ID NO:20 SEQ ID NO:39
SEQ ID NO:21 SEQ ID NO:40
SEQ ID NO:22 SEQ ID NO:41
SEQ ID NO:23 SEQ ID NO:42
SEQ ID NO:24 SEQ ID NO:43
SEQ ID NO:25 SEQ ID NO:44
SEQ ID NO:26 SEQ ID NO:45
SEQ ID NO:27 SEQ ID NO:46
SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:47
本公开内容的分离的抗-GCGR抗体、抗体片段或抗体衍生物可以包含本领域已知的任何恒定区。轻链恒定区可以为，例如κ或λ型轻链恒定区，例如人κ或λ型轻链恒定区。重链恒定区可以为，例如α、δ、ε、γ或μ型重链恒定区，例如人α、δ、ε、γ或μ型重链恒定区。在多种实施方案中，轻链恒定区或重链恒定区是天然存在的恒定区的片段、衍生物、变体或突变蛋白。
用于从目标抗体衍生不同亚类或亚型的抗体，即亚类转换(subclass switching)的技术是已知的。因此，IgG抗体可以衍生自例如IgM抗体，反之亦然。这样的技术允许制备具有给定抗体(亲代抗体)的抗原结合性质，并还表现出来自与该亲代抗体不同的抗体亚型或亚类相关的生物学性质的新抗体。可以使用重组DNA技术。可以在这样的操作中使用编码特定抗体多肽的克隆DNA，例如，编码期望的亚型的抗体的恒定结构域的DNA。还参见Lanitto等,Methods Mol.Biol.178:303-16(2002)。
在多种实施方案中，本公开内容的分离的抗原结合蛋白包含SEQ ID NO:48列出的恒定轻链κ区或其片段。在多种实施方案中，本公开内容的分离的抗原结合蛋白包含SEQ IDNO:49列出的恒定轻链λ区或其片段。在多种实施方案中，本公开内容的分离的抗原结合蛋白包含SEQ ID NO:50列出的IgG2重链恒定区或其片段。
在多种实施方案中，本公开内容的分离的拮抗性抗原结合蛋白是完全人抗-GCGR抗体，所述完全人抗-GCGR抗体包含与SEQ ID NO:51相同、大体上相同或大体上相似的重链序列以及与SEQ ID NO:52相同、大体上相同或大体上相似的轻链序列。在多种实施方案中，本公开内容的分离的拮抗性抗原结合蛋白是包含SEQ ID NO:51列出的重链序列和SEQ IDNO:52列出的轻链的完全人抗-GCGR抗体。
在本公开内容的多种实施方案中，分离的拮抗性抗原结合蛋白是hemibody。“hemibody”是一种免疫功能性免疫球蛋白构建体，其包含完整重链、完整轻链和与该完整重链的Fc区配对的第二重链Fc区。可以但不必须使用接头以连接重链Fc区和第二重链Fc区。在多种实施方案中，hemibody是包含以下的单价抗原结合蛋白：(i)完整轻链，和(ii)融合至Fc区(例如IgG2Fc区)的重链。用于制备hemibody的方法在例如美国专利申请2012/0195879中描述，该文献以教导制备此类hemibody的目的通过引用整体并入本文。
药物组合物
在另一个方面，本公开内容提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含如本文所述的分离的拮抗性抗原结合蛋白和一种或更多种药学上可接受的载体。本文描述的药物组合物和使用方法还包括与其他活性剂组合(共同施用)的实施方案，如以下详述的。
通常，本公开内容的拮抗性抗原结合蛋白适合于作为与一种或更多种药学上可接受的载体结合的制剂被施用。在本文中使用术语“载体”描述除本公开内容的化合物以外的任何成分。载体的选择将很大程度上依赖于诸如特定施用方式、载体对溶解性和稳定性的作用以及剂型的性质等因素。如本文使用的，“药学上可接受的载体”包括生理学上相容的任何和全部溶剂、分散介质、包衣、抗微生物剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。药学上可接受的载体的一些实例是水、盐水、磷酸盐缓冲的盐水、右旋糖、甘油、乙醇等，以及其组合。在许多情况中，组合物将在组合物中包括等渗剂，例如糖、多元醇诸如甘露糖醇、山梨糖醇或氯化钠。药学上可接受的物质的另外的实例是润湿剂或少量辅助物质诸如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲液，其增强抗体的货架期或效力。本公开内容的药物组合物和用于其制备的方法对于本领域技术人员将是明显的。在Remington’s Pharmaceutical Sciences,第19版(Mack Publishing Company,1995)可找到此类组合物以及用于其制备的方法。药物组合物通常是无菌的、基本等渗的并且完全遵守美国食品与药物管理局的所有GMP条例配制。
本公开内容的药物组合物通常适合用于肠胃外施用。如本文使用的，药物组合物的“肠胃外施用”包括特征在于以下的任何施用途径：物理破坏(physical breaching)受试者的组织并经组织中的破坏施用药物组合物，因此通常导致直接施用至血流、肌肉或内脏中。因此，肠胃外施用包括但不限于，通过注射组合物、通过经外科手术切口应用组合物、通过经组织渗透性非外科手术伤口应用组合物等施用药物组合物。特别地，预期肠胃外施用包括但不限于皮下注射、腹膜内注射、肌肉注射、胸骨内注射、静脉注射、动脉内注射、鞘内注射、心室内注射、尿道内注射、颅内注射、滑膜内注射或输注；或肾透析输注技术。
本公开内容的药物组合物可用标准针头和注射器皮下或静脉内递送。另外，对于皮下递送，笔式递送装置(pen delivery device)容易地应用于递送本公开内容的药物组合物。此类笔式递送装置可以是可重复使用的或一次性的。可重复使用的笔式递送装置通常利用含有药物组合物的可替换的盒。盒内的所有药物组合物都已被施用并且盒为空的之后，空盒可容易地被丢弃并用含有药物组合物的新盒替换。然后笔式递送装置可被重复使用。在一次性笔式递送装置中，不存在可替换的盒。而是，一次性笔式递送装置为用容纳在装置内的库中的药物组合物预填充。在库的药物组合物被排空之后，整个装置被丢弃。很多可重复使用的笔式和自动注射器式递送装置已经在文献中描述并是市售可得的。
适用于肠胃外施用的药物组合物的制剂往往通常包括与药学上可接受的载体诸如无菌水或无菌等渗盐水组合的活性成分。这样的制剂可以以适用于团注施用(bolusadministration)或用于连续施用的形式被制备、包装或销售。可注射制剂可以以单位剂量形式被制备、包装或销售，诸如在安瓿中或在包含防腐剂的多剂量容器中。用于肠胃外施用的制剂包括但不限于悬液、溶液、油或水性媒介物中的乳液、糊剂等。这样的制剂还可以包含一种或更多种另外的成分，包括但不限于悬浮剂、稳定剂或分散剂。在用于肠胃外施用的制剂的一种实施方案中，以在肠胃外施用所重构组合物之前，用于与合适的媒介物(例如无菌的无热原水)重构的干燥(即粉末或颗粒)形式提供活性成分。肠胃外制剂还包括水性溶液，所述水性溶液可以包含载体诸如盐、碳水化合物和缓冲剂(优选至从3至9的pH)，但是，对于一些应用，它们可更适合地被配制为与合适的媒介物诸如无菌的、无热原的水一起使用的无菌的非水溶液或干燥的形式。示例性肠胃外施用形式包括于无菌水性溶液，例如水性丙二醇或右旋糖溶液中的溶液或悬液。如果需要，这样的剂量形式可以被合适的缓冲。其他有用的可肠胃外施用的制剂包括包含微晶形式的活性成分的那些，或呈脂质体制备物的那些。用于肠胃外施用的制剂可以被配制为立刻释放和/或修改释放。修改释放制剂包括延迟、持续、脉冲、受控、靶向和编程释放。
例如，在一个方面，可以通过将分离的拮抗性抗原结合蛋白以所需量掺入具有以上列举的成分的一种或其组合的适当溶剂中来制备无菌的可注射溶液，如果需要，随后过滤灭菌。通常，通过将活性化合物掺入包含基础分散介质和来自以上列举的那些的需要的其他成分的无菌媒介物来制备分散剂。在用于制备无菌的可注射溶液的无菌粉末的情况中，制备方法诸如真空干燥和冷冻干燥得到来自之前的其无菌过滤的溶液的活性成分加任何另外的所需成分的粉末。溶液的适当的流动性可以例如，通过使用包衣诸如卵磷脂、在分散剂的情况下通过保持要求的粒径和通过使用表面活性剂保持。可注射组合物的延长吸收可以由在组合物中包括延迟吸收的剂例如单硬脂酸盐和明胶引起。在多种实施方案中，将使用商购可得的一次性注射装置施用可注射组合物。
本公开内容的分离的拮抗性抗原结合蛋白可以经鼻或通过吸入施用，通常以干粉的形式(单独的、作为混合物或作为混合的组分颗粒，例如与合适的药学上可接受的载体混合)从干粉吸入器施用、作为气雾剂喷雾从压力容器、泵、喷雾器(spray)、雾化器(优选使用电水动力学产生细雾(fine mist)的雾化器)、或喷雾器(nebulizer)施用，使用或不使用合适的推进剂，或作为滴鼻液施用。
压力容器、泵、喷雾器(spray)、雾化器、或喷雾器(nebulizer)通常含有本公开内容的分离的拮抗性抗原结合蛋白的溶液或悬液，所述溶液或悬液包含例如，用于分散、溶解或延长活性剂的释放的合适的剂、作为溶剂的推进剂。
在使用之前，在粉末或悬液制剂中，药物产品通常被微粉化至适用于通过吸入递送的尺寸(通常小于5微米)。这可以通过任何适当的粉碎方法进行，诸如螺旋气流粉碎、流化床气流粉碎、超临界流体加工以形成纳米颗粒、高压匀质或喷雾干燥。
用于在吸入器或吹药器(insufflator)中使用的胶囊、泡罩和药筒可以被配制为包含本公开内容的分离的拮抗性抗原结合蛋白、合适的粉末基质和性能改性剂(performance modifier)的粉末混合物。
合适的香精诸如薄荷脑和左薄荷脑，或甜味剂诸如糖精或糖精钠，可以被添加至意图用于吸入/经鼻施用的本公开内容的那些制剂。
用于吸入/经鼻施用的制剂可以被配制为立刻释放和/或修改释放。修改释放制剂包括延迟、持续、脉冲、受控、靶向和编程释放。
在干粉吸入器和气雾剂的情况下，剂量单位借助递送计量量的阀门确定。根据本公开内容的单位通常被安排施用本公开内容的抗体的计量剂量或“喷雾(puff)”。总每日剂量将通常以单一剂量施用，或更经常地，作为分次剂量整天施用。
本公开内容的分离的拮抗性抗原结合蛋白还可以被配制用于口服施用。口服施用可以包括吞咽以使得化合物进入胃肠道、和/或含服、经舌或经舌下施用，通过这些方式化合物从口直接进入血流。适用于口服施用的制剂包括固体、半固体和液体系统，诸如片剂；含有多颗粒或纳米颗粒的软胶囊或硬胶囊、液体或粉末；锭剂(包括填充液体的)；咀嚼剂(chews)；凝胶；快速分散的剂型；薄膜；卵形剂(ovules)；喷雾剂和颊/黏膜黏附片(buccal/mucoadhesive patches)。
意图用于口服施用的药物组合物可以根据本领域已知的用于制造药物组合物的任何方法制备，并且这样的组合物可以包含选自由甜味剂组成的组的一种或更多种剂以提供药学上美观且可口的制剂。例如，为了制备可口服递送的片剂，将分离的拮抗性抗原结合蛋白与至少一种药学载体混合，并且根据已知方法压缩所述固体制剂以形成片剂，用于递送至胃肠道。片剂组合物通常与添加剂一起配制，所述添加剂例如糖类或纤维素载体、粘合剂诸如淀粉糊或甲基纤维素、填充剂、崩解剂或典型的通常用于制造医用制剂的其他添加剂。为了制备可口服递送的胶囊，将DHEA与至少一种药学载体混合，并且将固体制剂置于适用于递送至胃肠道的胶囊容器中。包含分离的拮抗性抗原结合蛋白的组合物可以如Remington’s Pharmaceutical Sciences,第18版1990(Mack Publishing Co.EastonPa.18042)中在第89章一般性地描述的制备，其通过引用被并入本文。
在多种实施方案中，药物组合物被配制为包含与适用于制造片剂的非-毒性药学上可接受的载体混合的分离的拮抗性抗原结合蛋白的可口服递送的片剂。这些载体可以是惰性稀释剂，诸如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；造粒剂和崩解剂，例如玉米淀粉、明胶或阿拉伯胶，以及润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。片剂可以是未包衣的，或者它们可以用已知技术包衣以延迟在胃肠道中的崩解和吸收并从而经更长时期提供持续作用。例如，可以使用延时材料诸如单独的单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯或与蜡一起使用。
在多种实施方案中，药物组合物被配制为硬明胶胶囊，其中将分离的拮抗性抗原结合蛋白与惰性固体稀释剂混合，所述惰性固体稀释剂例如碳酸钙、磷酸钙或高岭土，或作为软明胶胶囊配制，其中将分离的拮抗性抗原结合蛋白与水性或油介质混合，所述水性或油介质为例如花生油(arachis oil)、花生油(peanut oil)、液体石蜡或橄榄油。
液体制剂包括悬液、溶液、糖浆和酏剂。这样的制剂可以作为软胶囊或硬胶囊(从例如明胶或羟丙甲纤维素制成)中的填充剂使用，并且通常包含载体，例如水、乙醇、聚乙二醇、丙二醇、甲基纤维素或合适的油，以及一种或更多种乳化剂和/或悬浮剂。液体制剂还可以通过重构固体，例如从小袋制备。
本领域公认的用于施用肽、蛋白、或抗体的任何方法可以适当地被使用用于施用本公开内容的分离的拮抗性抗原结合蛋白。
治疗方法
由于本文的抗原结合和拮抗性蛋白与胰高血糖素受体的相互作用，其可用于通过调节糖异生和糖原分解降低血液葡萄糖水平，并且还可用于治疗其中阻断胰高血糖素与其受体的相互作用是有益的广泛的状况和紊乱，同时还可用于减少和或消除与目前的治疗有关的一种或更多种有害副作用。
根据本公开内容的拮抗性抗原结合蛋白，特别是人抗体，不需要实现完全治愈，或根除疾病的每个症状或表现，以构成可行的治疗剂。如相关领域承认的，被用作治疗剂的药物可以减轻给定疾病状态的严重性，但不需要消除疾病的每个表现以被认为是有用的治疗剂。类似地，预防性的施用治疗不需要在预防状况的发作方面完全有效以构成可行的预防剂。在受试者中简单地减少疾病的影响(例如，通过减少其症状的数量或严重性，或通过增加另一个治疗的有效性，或通过产生另一种有益效果)或减少疾病发生或恶化的可能性是足够的。本公开内容的一种实施方案涉及一种方法，所述方法包括向受试者施用分离的拮抗性抗原结合蛋白诸如人抗体，所述施用是以足以诱导相对指示物的基线的持续的改善的量并持续足以诱导相对指示物的基线的持续的改善的一段时间，所述指示物反映特定紊乱的严重性。
心血管疾病/糖尿病心肌病/心力衰竭
心血管疾病是影响心脏和/或血管的多种疾病、紊乱和状况的总称。心血管疾病的类型包括心绞痛、心脏病发作(心肌梗塞)、动脉粥样硬化、心力衰竭、心血管疾病、风湿性心脏病、心脏心律失常(心律异常)、脑血管疾病、先天性心脏病、心肌病、左心室肥大、右心室肥大、梗塞后心脏破裂、心脏感染、冠状动脉疾病、外周动脉疾病、肾动脉狭窄、主动脉瘤(aortic aneurysm)、心肌疾病、心脏瓣膜疾病(heart valve disorders)、心肌炎和心包炎。
心力衰竭是一种临床综合征，其特征是心脏未能泵出足够的血液来满足身体的系统需求。心脏随着每次心跳收缩和松弛--这些阶段被称为收缩期(收缩阶段)和舒张期(松弛阶段)。收缩性心力衰竭(SHF)的特征是射血分数低。在舒张性心力衰竭(DHF)患者中，收缩可能是正常的，但心脏松弛可能受损。这种受损通常是由于心室变硬引起的。这种受损称为舒张功能障碍，并且如果严重到足以引起肺充血(肺部血管中的压力和流体增加)，则称为舒张性心力衰竭。DHF患者与SHF患者不同，因为DHF患者可能具有“正常的”射血分数。然而，由于心室不能正常松弛，心室内的压力增加，并且充入心室的血液超过了“正常”。有某些类型心肌病的人群也可能有舒张功能障碍。左心室肥大是指左心室负荷增加导致左心室增厚。左心室肥大可以是心血管紊乱的重要标志，并且最常见的并发症包括心律失常、心力衰竭、缺血性心脏病和猝死。尽管左心室肥大(LVH)随着年龄而自然增加，但在具有高血压或具有其他心脏问题的人群中更常见。由于LVH通常响应于高血压发展，目前的治疗和预防主要包括处理高血压。典型的诊断包括使用超声波心动描记术(ECHO)和心电图(ECG)。
在一方面，本公开内容包括用于治疗或预防受试者中的心力衰竭的方法，包括对受试者施用治疗有效量的与人胰高血糖素受体特异性结合的分离的拮抗性抗原结合蛋白。在多种实施方案中，本公开内容的分离的拮抗性抗原结合蛋白是包含SEQ ID NO:51列出的重链序列和SEQ ID NO:52列出的轻链的完全人抗-GCGR抗体。
在一方面，本公开内容包括用于治疗需要其的受试者中的心肌梗塞后心力衰竭的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的与人胰高血糖素受体特异性地结合的分离的拮抗性抗原结合蛋白。在多种实施方案中，本公开内容的分离的拮抗性抗原结合蛋白是包含SEQ ID NO:51列出的重链序列和SEQ ID NO:52列出的轻链的完全人抗-GCGR抗体。
在一方面，本公开内容包括治疗受试者中的侧心室(LV)重构的方法，包括对被诊断患有心力衰竭的受试者或处于感染心力衰竭的风险的受试者施用治疗有效量的与人胰高血糖素受体特异性结合的分离的拮抗性抗原结合蛋白。在多种实施方案中，本公开内容的分离的拮抗性抗原结合蛋白是包含SEQ ID NO:51列出的重链序列和SEQ ID NO:52列出的轻链的完全人抗-GCGR抗体。
糖尿病心肌病描述了糖尿病相关的心肌结构和功能变化，其并非直接可归因于诸如冠状动脉疾病(CAD)或高血压的其他混杂因素。据报道，在许多患有2型糖尿病的患者中，糖尿病相关的变化被这些并存症的存在放大，这可能会增加左心室肥大的发展，增加心脏对缺血性损伤的易感性并增加发展心力衰竭的总体可能性(Boudina和Abel,Rev EndocrMetab Disord.,11(1):31–39,2010March)。糖尿病心肌病的发病机制涉及多种机制，并且造成糖尿病心肌病的机制仍待阐明。心肌结构、钙信号传导和代谢的变化是主要在动物模型中描述的早期缺陷，并且可能先于在临床上表现出心脏功能障碍(同上)。人类中糖尿病心肌病的特征是舒张功能障碍(DD)，这可能先于收缩功能障碍(SD)发展。
糖尿病肾病是神经损伤性疾病，是糖尿病常见的严重并发症。有四种主要类型的糖尿病神经病：外周、自主神经、神经根(radiculoplexus)和单神经病。个体可具有仅一种类型或几种类型的症状。大多数症状逐渐发展，并且在发生严重损害之前可能不会注意到问题。长期暴露于高血糖可损伤精细的神经纤维，导致糖尿病神经病。因此，通过严格控制血糖来预防糖尿病神经病或减缓其进展可以是可能的。
在多种实施方案中，本公开内容包括用于治疗或预防受试者中的心力衰竭和相关状况的方法，包括对被诊断患有糖尿病的受试者或处于发展糖尿病的风险的受试者施用治疗有效量的与人胰高血糖素受体特异性结合的分离的拮抗性抗原结合蛋白。在多种实施方案中，分离的拮抗性抗原结合蛋白包括体包含编码SEQ ID NO:51的重链的氨基酸序列和编码SEQ ID NO:52的轻链的氨基酸序列的抗体。
在一方面，本公开内容包括用于治疗需要其的受试者中的糖尿病心肌病的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的与人胰高血糖素受体特异性地结合的分离的拮抗性抗原结合蛋白。在多种实施方案中，本公开内容的分离的拮抗性抗原结合蛋白是包含SEQ ID NO:51列出的重链序列和SEQ ID NO:52列出的轻链的完全人抗-GCGR抗体。
本公开内容的特异性结合至人胰高血糖素受体的分离的拮抗性抗原结合蛋白，特别是完全人抗体可以被施用，例如一次或经一段时期以规律的间隔被施用多于一次。在多种实施方案中，完全人抗体被经一个时期，至少每月一次或更长时间，例如一个月、两个月或三个月或甚至无限期地施用。对于治疗慢性状况，长期治疗通常更有效。然而，对于治疗急性状况，短期施用，例如从1至6周，可能有效。通常，施用完全人抗体直到受试者表现出相对于所选的一种或更多种指示物的基线的医学上相关程度的改善。
本文提供的治疗方案的一个实例包括每周一次或每两周一次以适当的剂量皮下注射分离的拮抗性抗原结合蛋白，以治疗其中血糖水平起作用的状况。分离的拮抗性抗原结合蛋白的每周或每月施用将持续至获得期望的结果，例如受试者的症状消退。可以按需要继续治疗，或者可代替地，可以施用维持剂量。
可以在使用分离的拮抗性抗原结合蛋白诸如人抗体的治疗前、治疗期间和/或治疗后监测受试者的血液葡萄糖水平，以检测它们的水平变化，如果存在的话。对于一些紊乱，升高的血液葡萄糖的发生率可以根据因素诸如疾病的阶段变化。可以应用已知技术用于测量葡萄糖水平。也可以使用已知技术，例如ELISA，在受试者血液中测量胰高血糖素水平。
可以通过确定IC50从细胞培养测定初始估计治疗有效剂量。随后，可以在动物模型中配制剂量以获得包括如在细胞培养中确定的IC50的循环血浆浓度范围。这些信息可用于更精确地确定人体中的有用剂量。血浆中的水平可以通过，例如HPLC或使用对治疗药物特异性的抗独特型抗体的免疫测定测量。确切的组合物、施用途径和剂量可以由个体医师鉴于受试者的状况选择。
可以调整剂量方案以提供最适的期望应答(例如，治疗应答或预防应答)。例如，可以施用单次团注，可以随时间施用多个分次剂量(多个或重复或维持)并且剂量可以如治疗情境的迫切需要指示的按比例减少或增加。为了容易施用和剂量的一致性，配制剂量单位形式的胃肠外组合物是特别有利的。本文使用的剂量单位形式指适于作为用于待被治疗的哺乳动物受试者的单一剂量的物理上的分散单元；每一个单元含有被计算以产生期望的治疗效果的预先确定的量的活性化合物与要求的药学运载体的组合。本公开内容的剂量单位形式的规格将主要由抗体的独特性质和待被实现的特定治疗效果或预防效果决定。
因此，技术人员将理解，基于本文提供的公开内容，根据治疗领域公知的方法调整剂量和给药方案。即，最大可耐受剂量可以被容易地确定，并且向受试者提供可检测的治疗益处的有效量也可以被确定，向受试者提供可检测的治疗益处而施用每个剂的时间要求同样可以被确定。因此，尽管在本文中举例说明了某个剂量和施用方案，这些实例绝不限制在实践本公开内容时可以被提供至受试者的剂量和施用方案。
应注意到，剂量值可以随着待被改善的状况的类型和严重性变化，并且可以包括单剂量或多剂量。还应理解，对于任何特定受试者，应根据个体需要和施用或监督组合物的施用的人士的专业判断随时间调整具体剂量方案，并且本文列出的剂量范围仅是示例性的并且不意图限制所要求保护的组合物的范围或实践。另外，使用此公开内容的组合物的剂量方案可以基于多个因素，包括疾病的类型、受试者的年龄、体重、性别、医学状况、状况的严重性、施用途径和使用的特定抗体。因此，给药方案可以广泛变化，但可以使用标准方法常规地确定。例如，可以基于药代动力学或药效学参数调整剂量，所述参数可以包括临床作用诸如毒性作用和/或实验值。因此，本公开内容包括如技术人员确定的受试者内的剂量递增(intra-subject dose-escalation)。确定适当的剂量和方案是相关技术领域公知的并且可以被理解为一旦提供本文公开的教导，则由技术人员掌握。
对于施用至人受试者，当然取决于施用方式，本公开内容的分离的拮抗性抗原结合蛋白的总每月剂量可以在0.5-1200mg/受试者、0.5-1100mg/受试者、0.5-1000mg/受试者、0.5-900mg/受试者、0.5-800mg/受试者、0.5-700mg/受试者、0.5-600mg/受试者、0.5-500mg/受试者、0.5-400mg/受试者、0.5-300mg/受试者、0.5-200mg/受试者、0.5-100mg/受试者、0.5-50mg/受试者、1-1200mg/受试者、1-1100mg/受试者、1-1000mg/受试者、1-900mg/受试者、1-800mg/受试者、1-700mg/受试者、1-600mg/受试者、1-500mg/受试者、1-400mg/受试者、1-300mg/受试者、1-200mg/受试者、1-100mg/受试者或1-50mg/受试者的范围内。例如，静脉内的每月剂量可以需要约1-1000mg/受试者。在某些实施方案中，本公开内容的分离的拮抗性抗原结合蛋白可以以约1-200mg/受试者、1-150mg/受试者或1-100mg/受试者施用。总的每月剂量可以以单剂量或分开的剂量施用，并且可以依医师的自由裁量落在本文给出的通常范围外。
对于本公开内容的分离的拮抗性抗原结合蛋白的治疗有效量或预防有效量的示例性的、非限制性的每月剂量范围可以为0.001至10mg/kg体重、0.001至9mg/kg体重、0.001至8mg/kg体重、0.001至7mg/kg体重、0.001至6mg/kg体重、0.001至5mg/kg体重、0.001至4mg/kg体重、0.001至3mg/kg体重、0.001至2mg/kg体重、0.001至1mg/kg体重、0.010至10mg/kg体重、0.010至9mg/kg体重、0.010至8mg/kg体重、0.010至7mg/kg体重、0.010至6mg/kg体重、0.010至5mg/kg体重、0.010至4mg/kg体重、0.010至3mg/kg体重、0.010至2mg/kg体重、0.010至1mg/kg体重、0.1至10mg/kg体重、0.1至9mg/kg体重、0.1至8mg/kg体重、0.1至7mg/kg体重、0.1至6mg/kg体重、0.1至5mg/kg体重、0.1至4mg/kg体重、0.1至3mg/kg体重、0.1至2mg/kg体重、0.1至1mg/kg体重、1至10mg/kg体重、1至9mg/kg体重、1至8mg/kg体重、1至7mg/kg体重、1至6mg/kg体重、1至5mg/kg体重、1至4mg/kg体重、1至3mg/kg体重、1至2mg/kg体重或1至1mg/kg体重。应注意到，剂量值可以随着待被缓解的状况的类型和严重性变化。还应理解，对于任何特定受试者，应根据个体需要和施用或监督组合物的施用的人士的专业判断随时间调整具体剂量方案，并且本文列出的剂量范围仅是示例性的并且不意图限制所要求保护的组合物的范围或实践。
在多种实施方案中，施用的总剂量将获得范围在例如约1至1000μg/ml、约1至750μg/ml、约1至500μg/ml、约1至250μg/ml、约10至1000μg/ml、约10至750μg/ml、约10至500μg/ml、约10至250μg/ml、约20至1000μg/ml、约20至750μg/ml、约20至500μg/ml、约20至250μg/ml、约30至1000μg/ml、约30至750μg/ml、约30至500μg/ml、约30至250μg/ml的血浆抗体浓度。
本公开内容的药物组合物的毒性和治疗指数可在细胞培养物或实验动物中通过标准制药学过程确定，例如，用于确定LD50(对群体的50％致死的剂量)和ED50(对群体的50％治疗有效的剂量)。毒性和治疗有效剂量之间的剂量比是治疗指数，并且其可以表示为比率LD50/ED50。表现出大治疗指数的组合物通常是优选的。
在多种实施方案中，药物组合物的单次施用或多次施用取决于受试者需求和耐受的剂量和频率来施用。无论如何，组合物应当提供至少一种本文公开的分离的拮抗性抗原结合蛋白的充分量以有效治疗受试者。剂量可以被施用一次，但可以被周期性地应用直到获得治疗结果或直到副作用警告停止疗法。
分离的拮抗性抗原结合蛋白药物组合物的施用的给药频率取决于疗法的性质和被治疗的特定疾病。受试者可以以规律间隔治疗，诸如每周地或每月地，直到获得期望的治疗结果。示例性的给药频率包括但不限于：无间断地每周一次；每隔一周地每周一次；每2周一次；每3周一次；无间断地每周一次，持续2周，随后每月一次；无间断地每周一次，持续3周，随后每月一次；每月一次；每隔一个月一次；每3个月一次；每4个月一次；每5个月一次；或每6个月一次，或每年一次。
组合疗法
如本文使用的，关于本公开内容的分离的拮抗性抗原结合蛋白和一种或更多种其他治疗剂提及的术语“共同施用(co-administration)”、“共同施用的(co-administered)”和“组合(in combination with)”意图意指并且确实指的是并且包括以下：当本公开内容的分离的拮抗性抗原结合蛋白和治疗剂被一起配制成单一剂量形式时，向需要治疗的受试者同时施用这样的组分的组合，所述单一剂量形式向所述受试者基本上同时释放所述组分；当本公开内容的分离的拮抗性抗原结合蛋白和治疗剂彼此分离地被配制为单独的剂量形式时，向需要治疗的受试者基本上同时施用这样的组分的组合，所述单独的剂量形式由所述受试者基本上同时服用，于是所述组分基本上同时释放至所述受试者；当本公开内容的分离的拮抗性抗原结合蛋白和治疗剂彼此分离地被配制为单独的剂量形式时，向需要治疗的受试者依序施用这样的组分的组合，所述单独的剂量形式由所述受试者以每次施用之间的显著的时间间隔连续服用，于是所述组分基本上不同时释放至所述受试者；以及当本公开内容的分离的拮抗性抗原结合蛋白和治疗剂被一起配制为单一剂量形式时，向需要治疗的受试者依序施用这样的组分的组合，所述单一剂量形式以受控的方式释放所述组分，于是它们同时、连续地和/或重叠地以相同和/或不同时间释放至所述受试者，其中每个部分可以由相同或不同途径施用。
可以与本发明化合物组合使用的合适的药剂包括抗高血压剂和治疗慢性心力衰竭、动脉粥样硬化或相关疾病的剂。设想用于使用的此类剂包括但不限于，氯吡哌醇、血管紧张素转化酶抑制剂(诸如卡托普利、依那普利、福辛普利、赖诺普利、培哚普利、喹那普利、雷米普利等)、中性内肽酶抑制剂(诸如thiorphan、奥马曲拉、MDL-100240、法西多曲、山帕曲拉、GW-660511、mixanpril、SA-7060、E-4030、SLV-306、依卡曲尔等)、血管紧张素II受体拮抗剂(诸如坎地沙坦西来替昔酯、依普罗沙坦、厄贝沙坦、氯沙坦、奥美沙坦美索酯、替米沙坦、缬沙坦、他索沙坦、enoltasosartan等)、内皮肽-转化酶抑制剂(诸如CGS 35066、CGS26303、CGS-31447、SM-19712等)、内皮肽受体拮抗剂(诸如tracleer、西他生坦(sitaxsentan)、安贝生坦(ambrisentan)、L-749805、TBC-3214、BMS-182874、BQ-610、TA-0201、SB-215355、PD-180988、BMS-193884、达卢生坦、TBC-3711、波生坦、替唑生坦、J-104132、YM-598、S-0139、SB-234551、RPR-118031A、ATZ-1993、RO-61-1790、ABT-546、enlasentan、BMS-207940等)、利尿剂(诸如氢氯噻嗪、苄氟噻嗪、三氯噻嗪、吲达帕胺、美托拉宗、呋塞米、bumetamide、托塞米、氯噻酮、美托拉宗、环戊噻嗪、氢氟噻嗪、曲帕胺、美夫西特、苄氢氯噻嗪、戊氟噻嗪、甲氯噻嗪、阿佐塞米、依他尼酸、托拉塞米、piretamide、美替克仑、坎利酸钾、螺内酯、氨苯蝶啶、氨茶碱、西氯他宁、LLU-α、PNU-80873A、异山梨醇、D-甘露醇、D-山梨醇、果糖、甘油、乙酰唑胺、醋甲唑胺、FR-179544、OPC-31260、利希普坦、考尼伐坦等)、钙通道拮抗剂(诸如氨氯地平、苄普地尔、地尔硫卓、非洛地平、伊拉地平、尼卡地平、尼莫地平、维拉帕米、S-维拉帕米、阿雷地平、依福地平、巴尼地平、贝尼地平、马尼地平、西尼地平、尼索地平、尼群地平、硝苯地平、尼伐地平、非洛地平、普拉地平、乐卡地平、伊拉地平、依高地平、阿折地平、拉西地平、伐尼地平、来米地平、地尔硫卓、克仑硫卓、法舒地尔、苄普地尔、戈洛帕米等)、血管舒张性抗高血压剂(诸如吲达帕胺、托屈嗪、肼屈嗪、卡屈嗪、布屈嗪等)、β阻断剂(诸如醋丁洛尔、比索洛尔、艾司洛尔、普奈洛尔、阿替洛尔、拉贝洛尔、卡维地洛、美托洛尔等)、交感神经阻断剂(诸如氨磺洛尔、特拉唑嗪、布那唑嗪、哌唑嗪、多沙唑嗪、普萘洛尔、阿替洛尔、美托洛尔、卡维地洛、尼普地洛、塞利洛尔、奈必洛尔、倍他洛尔、吲哚洛尔、特他洛尔、贝凡洛尔、噻吗洛尔、卡替洛尔、比索洛尔、波吲洛尔、尼普地洛、喷布洛尔、醋丁洛尔、替利洛尔、纳多洛尔、乌拉地尔、吲哚拉明等)、α-2-肾上腺素受体激动剂(诸如可乐定、甲基多巴、CHF-1035、乙酸氯压胍、胍法辛、莫索尼定、洛非西定、他利克索等)、中枢作用抗高血压剂(诸如利舍平等)、血小板聚集抑制剂(诸如华法林、双香豆素、苯丙香豆素、醋硝香豆素、茴茚二酮、苯茚二酮、希美加群(ximelagatran)等)、抗血小板剂(诸如阿司匹林、氯吡格雷、噻氯匹定、双嘧达莫、西洛他唑、二十碳五烯酸乙酯(ethylicosapentate)、沙格雷酯、地拉卓、曲匹地尔、贝前列素等)、和神经调节因子(NRG-1、NRG-2、NRG-3和NRG-4)及其亚型。
在多种实施方案中，本公开内容包括用于治疗或预防受试者中的心力衰竭和相关状况的方法，包括对被诊断患有心力衰竭的受试者或处于感染心力衰竭的风险的受试者施用治疗有效量的与人胰高血糖素受体特异性结合的分离的拮抗性抗原结合蛋白；和(b)第二剂组合物。在多种实施方案中，本公开内容的分离的拮抗性抗原结合蛋白是包含SEQ IDNO:51列出的重链序列和SEQ ID NO:52列出的轻链的完全人抗-GCGR抗体，且第二剂组合物选自由以下组成的组：血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂、β-肾上腺素能阻断剂、血管紧张肽II受体阻断剂(ARB)、利尿剂和洋地黄。在多种实施方案中，本公开内容的分离的拮抗性抗原结合蛋白是包含SEQ ID NO:51列出的重链序列和SEQ ID NO:52列出的轻链的完全人抗-GCGR抗体，且第二剂组合物选自由以下组成的组：血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂、β-肾上腺素能阻断剂、血管紧张肽II受体阻断剂(ARB)、利尿剂和洋地黄。在多种实施方案中，本公开内容的分离的拮抗性抗原结合蛋白是包含SEQ ID NO:51列出的重链序列和SEQ ID NO:52列出的轻链的完全人抗-GCGR抗体，且第二剂组合物是血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂。在多种实施方案中，本公开内容的分离的拮抗性抗原结合蛋白是包含SEQ ID NO:51列出的重链序列和SEQ ID NO:52列出的轻链的完全人抗-GCGR抗体，且第二剂组合物是β-肾上腺素能阻断剂。在多种实施方案中，本公开内容的分离的拮抗性抗原结合蛋白是包含SEQ IDNO:51列出的重链序列和SEQ ID NO:52列出的轻链的完全人抗-GCGR抗体，且第二剂组合物是利尿剂。在多种实施方案中，本公开内容的分离的拮抗性抗原结合蛋白是包含SEQ IDNO:51列出的重链序列和SEQ ID NO:52列出的轻链的完全人抗-GCGR抗体，且第二剂组合物是洋地黄。
在多种实施方案中，联合疗法包括以相同药物组合物或以分别的药物组合物同时施用分离的拮抗性抗原结合蛋白组合物和第二剂组合物。在多种实施方案中，分离的拮抗性抗原结合蛋白组合物和第二剂组合物被依序施用，即分离的拮抗性抗原结合蛋白组合物在施用第二剂组合物之前施用，或在施用第二剂组合物之后施用。
在多种实施方案中，分离的拮抗性抗原结合蛋白组合物和第二剂组合物的施用是同时的，即分离的拮抗性抗原结合蛋白组合物和第二剂组合物的施用期彼此重叠。
在多种实施方案中，分离的拮抗性抗原结合蛋白组合物和第二剂组合物的施用不是同时的。例如，在多种实施方案中，分离的拮抗性抗原结合蛋白组合物的施用在施用第二剂组合物前被终止。在多种实施方案中，第二剂组合物的施用在施用分离的拮抗性抗原结合蛋白组合物前被终止。
已经描述了本发明，以下实施例通过说明性方式来提供，而非限制。
实施例1
在本实施例中，本发明人评价了针对胰高血糖素受体的单克隆抗体对心肌梗塞后心力衰竭中的LV重构的治疗潜力。在本实施例中，使用诱导了心肌梗塞的C57BL/6小鼠评价了包含SEQ ID NO:8列出的重链序列和SEQ ID NO:9中列出的轻链序列的抗GCGR抗体(“REMD2.59C”)。
心肌梗塞(MI)在8-10周龄的54只C57BL6雄性小鼠中通过闭塞左冠状动脉而诱导。在MI后，将小鼠随机分成三组。组1用媒介物PBS处理作为对照(CON,n＝18)；组2在MI后2小时和14天用7.5mg/kg REMD2.59C mAb,s.c.处理(mAb,n＝18)；且组3在MI后前6天每天三次用胰高血糖素(10％明胶中30ng/kg体重)处理(GLC,n＝18)。伪处理动物用作阴性对照。
每天检查梗塞小鼠的存活，持续28天。描绘随着时间的存活曲线。在MI后2周获取空腹血液葡萄糖测量值。在MI后恢复期间监测心脏功能。在28天研究结束时，使小鼠安乐死并收集心脏用于组织学研究，和确定心室收缩(回声FS/EF)、心室压力和收缩性(导管)；心室重构、室间隔和LV壁厚度(回声)、心脏指数(HW/BW)、肌细胞肥大、纤维化；梗塞大小和凋亡。
通过超声波心动描记术测量心脏功能三次，MI后第一天，然后在MI后14天和28天。第一回声用于筛选梗塞小鼠的无梗塞。研究中排除了左心室缩短分数大于40％的小鼠。在实验结束时，通过Micro-tip压力传感器(导管)测量心室功能。对于组织学研究，对心脏灌注10％福尔马林用于固定。来自心脏的顶部、中部和基部的心脏切片用于Masson’s三色染色(MTS)和TUNEL染色。在MTS切片中测量梗塞大小，且在TUNEL染色后的切片中评估凋亡。REMD2.59C mAb的保护作用基于梗塞大小和凋亡评估。在MTS切片中测量纤维化和肌细胞大小用于评估心脏重构。
如图1所示，在研究结束时，MI导致CON小鼠中55％(10/18)死亡率，而REMD2.59CmAb处理减少了死亡率(11/18或61％的小鼠存活)，且胰高血糖素处理增加了死亡率(6/18或33％的小鼠存活)。如图2所示，与CON相比mAb显著增加了左心室缩短分数(FS)，而与CON相比GLC减少了其。如图3所示，与CON相比mAb减小了左心室收缩末期直径(LVESD)，而与CON相比GLC增加了其。如图4所示，与CON相比mAb减小了左心室舒张末期体积(LVEDD)，而与CON相比GLC增加了其。如图5所示，与CON相比mAb保持了左心室缺血肌肉，而与CON相比GLC轻微减少了其。如图6所示，与CON相比mAb增加了左心室收缩，而与CON相比GLC减少了其。如图7所示，与CON相比mAb增加了心脏收缩力(左图)和松弛(右图)，而与CON相比GLC减少了二者。如图8所示，与CON相比mAb减少了心脏重构，而与CON相比GLC轻微增加了心脏重量。如图9所示，与CON相比mAb减少了心脏重构(HW/BW减小)，而与CON相比GLC轻微增加了HW/BW。如图10所示，与CON相比mAb减少了MI后2周时小鼠(空腹4小时)的血液葡萄糖水平。如图11所示，梗塞区域中的凋亡被mAb减小。如图12和图13所示，非梗塞区域中的纤维化被mAb减小。如图14和图15所示，非梗塞区域中的肌细胞肥大被mAb减小。如图16所示，MI后数周梗塞大小被mAb减少。如图17所示，MI后数周梗塞面积被mAb减少。
组织学发现强烈地支持胰高血糖素受体mAb针对MI后心室重构的保护作用。用胰高血糖素受体mAb处理减少了梗塞区域中的凋亡并减少了非梗塞区域中的肌细胞肥大和纤维化。与PBS对照相比，在MI后4周梗塞面积被胰高血糖素受体mAb减少。心脏重构被针对胰高血糖素受体的单克隆抗体减少，针对胰高血糖素受体的单克隆抗体减少了HW/BW，增加了LV收缩性(+dp/dtm)和FS，并保持了LV壁厚度。施用胰高血糖素(配体)促进了心脏重构并使心脏功能恶化，提示胰高血糖素信号传导在MI后重构中起作用。
这些研究的令人惊讶的结果提示，胰高血糖素信号传导参与MI后心室重构，并且用拮抗性mAb靶向胰高血糖素受体可以是预防心肌梗塞后心力衰竭的有效的治疗方法。胰高血糖素受体抗体可以是对抗MI后不利的心脏重构和心力衰竭的有力武器。
实施例2
在本实施例中，本发明人评价了人抗GCGR抗体对db/db小鼠中糖尿病引起的心肌病的潜在预防功效。在本实施例中，使用C57BL/6/db/db雄性糖尿病小鼠和db/+雄性对照小鼠评价了包含SEQ ID NO:51列出的重链序列和SEQ ID NO:52列出的轻链序列的人抗-GCGR抗体("REMD477")的体内活性。
在这一18周的研究中，将8-10周龄的30只C57BL6/db/db糖尿病雄性小鼠和18只db/+雄性小鼠随机分为四组。在组1中，db/+小鼠(n＝9)用媒介物PBS处理作为对照(下文“db/+(PBS)”)；在组2中，db/+小鼠(n＝9)用REMD477处理(下文“db/+(mAb)”)；在组3中，db/db糖尿病小鼠(n＝15)用媒介物PBS处理作为对照(下文“db/db(PBS)”)；和在组4中，db/db小鼠(n＝15)用REMD477处理(下文“db/db(mAb)”)。对于组2和4，REMD477在最初三周以7mg/kg每周一次SC给药，且然后以3mg/kg每周一次SC给药直到18周，共18次注射。对于组1和3,01.ml/小鼠的PBS以与处理组2和4的相同频率给药。在18周研究结束时，将小鼠安乐死并收获心脏用于组织学研究。
在处理后0、4、8、12和18周获取体重、空腹血液葡萄糖和OGTT测量值。在处理后0、6、12和18周测量血液胰岛素水平和血液胰高血糖素水平。在处理后第1天、然后在处理后6、12和18周通过超声波心动描记术测量心脏功能。第一回声用于筛选梗塞小鼠的无梗塞。研究中排除了左心室缩短分数大于40％的小鼠。在处理后0、6、12和18周监测心脏功能改变(例如，心室收缩(回声/FS/EF)和舒张(回声E/A和IRT)功能、心室压力和收缩性(导管)、和心输出量(回声))。LV重构在处理后18周通过Micro-tip压力传感器(导管)测量，例如在处理后18周通过Micro-tip导管测量左心室舒张压(mmHg)和心脏指数(HW/BW)。血清水平GLP-1和GHbAc1测量值在第0天和在处理后18周获取。
对于组织学研究，对心脏灌注10％福尔马林用于固定。来自心脏的顶部、中部和基部的心脏切片用于Masson’s三色染色(MTS)和TUNEL染色。在MTS切片中测量梗塞大小，且在TUNEL染色后的切片中评估凋亡。在MTS切片中测量纤维化和肌细胞大小用于评估心脏重构。
如图18所示，mAb在降低空腹血液葡萄糖水平上具有显著作用，并且能够早在第3-4周使血液浓度恢复至正常，并且能够保持正常水平持续14周，而不用胰岛素。如图19所示，OGTT显示，葡萄糖耐量能力已被显著改善。如图20所示，在糖尿病db/db小鼠中，与PBS相比mAb显著减小了左心室膨胀(LVESD)，恢复数值到对照db/+小鼠的数值并保持数值持续18周。如图21所示，在18周与PBS相比mAb减小了左心室舒张末期体积(LVEDD)。如图22所示，在糖尿病db/db小鼠中，与PBS相比mAb显著增加了左心室缩短分数(FS)，恢复数值到对照db/+小鼠的数值并保持数值持续18周。如图23所示，在糖尿病db/db小鼠中，与PBS相比mAb显著减小了心室间隔舒张末期(IVSD)，恢复数值到对照db/+小鼠的数值并保持数值持续18周。如图24所示，在糖尿病db/db小鼠中，与PBS相比mAb显著减少了早期(E)与晚期(A)心室充盈速度比率(E/A)，恢复数值到对照db/+小鼠的数值并保持数值持续18周。如图25所示，在糖尿病db/db小鼠中，与PBS相比mAb显著增加了心输出量(CO,ml/min)，恢复数值到对照db/+小鼠的数值并保持数值持续18周。如图26所示，在糖尿病db/db小鼠中，与PBS相比mAb显著减少了等容舒张时间(IVRT,ms)，恢复数值到对照db/+小鼠的数值并保持数值持续18周。如图27所示，mAb与PBS对照相比，心搏率不存在统计学显著的差异。如图28所示，在18周，在糖尿病db/db小鼠中，与PBS相比mAb显著增加了左心室舒张压(LVDP,mmHg,通过Mikro-tip导管测量)，并恢复数值到接近对照db/+小鼠的数值。如图29所示，在18周，与PBS相比，+dp/dtm和–dp/dtm值被mAb处理显著改善，并且mAb恢复数值到接近对照db/+小鼠的数值。如图30所示，使用mAb处理后，与PBS处理的db/db小鼠相比血液GLP-1显著升高，并且与PBS处理的db/db小鼠相比血液GHbA1c显著减少。如图31所示，在18周，与PBS相比，mAb处理导致心脏重量和体重的小的减少。如图32所示，在18周，各处理组之间血液胰岛素水平不存在显著差异。
组织学发现强烈地支持抗胰高血糖素受体mAb针对糖尿病引起的心肌病的潜在预防作用。这些研究的令人惊讶的结果提示，胰高血糖素信号传导参与糖尿病引起的心肌病，并且证明，用拮抗性mAb靶向胰高血糖素受体可以是预防糖尿病引起的心肌病的有效的治疗方法。
实施例3
在本实施例中，在小型猪心肌梗塞模型(Sinclair Research)中评价了包含SEQID NO:8列出的重链序列和SEQ ID NO:9列出的轻链序列的抗-GCGR抗体("REMD2.59C")的体内活性的效力。
对小型猪(年轻的成年/雌性)提供7天适应期并随机分为两组。在组1中，猪用单剂量的媒介物PBS处理作为对照(CON,n＝5)且在组2中，猪用单剂量的7.5mg/kg REMD2.59CmAb处理(mAb,n＝5)。在剂量施用之前，每只动物经历手术(左上行动脉结扎10-20分钟)以创建闭塞和引起心肌梗塞。20分钟后，除去闭塞并在再灌注期间施用治疗。动物在手术后的(post-op)无压力环境中维持和处理。
每天两次进行死亡率/发病率观察。在基线和在终止或尸检前进行各种评估和参数。这些包括体重、临床观察、临床病理学、临床化学、血液学和凝血参数以及ECG/心脏评估。在研究结束(28天)时，进行有限的尸检并收集有限的心脏组织用于组织病理学(评价了梗塞区域的中部、注射区域和梗塞区域每个界限(each extent)的另一处)用于组织学研究，和确定心室收缩(回声FS/EF)、心室压力和收缩性(导管)；心室重构、室间隔和LV壁厚度(回声)、心脏指数(HW/BW)、肌细胞肥大、纤维化；梗塞大小和凋亡。
肌钙蛋白水平、心室大小、心室壁厚度和超声心动图的射血分数是终点。
另外的材料和方法
梗塞小鼠的准备
如以前描述的在小鼠中引起MI(Patten RD等人,Am J Physiol.,1998；274:H1812–1820.[PubMed:9612394])。简言之，经由左胸廓切开术打开胸部。使用立体显微镜在视觉上识别左冠状动脉，并在左耳下1-2mm处在动脉周围放置7-0缝线。持续监测心电图(ECG)。由于用缝线结扎导致左冠状动脉永久闭塞。心脏缺血被心脏颜色苍白和ST段升高证实。胸部用6-0丝线缝合。一旦自发呼吸恢复，气管内管被移除。监测动物直至完全清醒。在它们回到其笼子后，提供标准的食物和水。
超声波心动描记术
如前所述，体内心脏功能由经胸超声波心动描记术(Acuson P300,18MHz转换器；Siemens)在有意识的小鼠中评估。小鼠心脏在胸骨旁短轴处在乳头水平以二维模式成像。从这个角度，测量了LV室的尺寸。缩短分数(FS)从左心室(LV)舒张末期直径(EDD)和收缩末期直径(ESD)计算。M-模式EDD和ESD从3到5次搏动平均。研究和分析由对处理不知情的研究者进行。
通过Mikro-tip导管测量LV压力
小鼠用戊巴比妥(40mg/kg,ip)麻醉。经由左胸廓切开术打开胸部。暴露梗塞的心脏。经由非梗塞心室壁将小鼠Mikro-tip导管(SPR1000)插入左心室。LV压力通过PowerLab系统(Adinstruments)测量。心室收缩性经由Chart 7软件(Adinstruments)计算。
组织学研究
心脏用10％缓冲的福尔马林固定，在石蜡中包埋，并以6μm切片。每个心脏一个中间纵向切片用Masson’s三色染色。在显微镜下检查来自左心室非梗塞区域的八个随机选择的视野(400×)的纤维化和肌细胞大小。每组包括5-6个心脏，并且通过计算机化的测面积法(NIH Image J)在每组中分析最少40个视野。为了评估纤维化，测量了纤维化的蓝色面积和整个心肌面积。纤维化面积表示为纤维化面积占心肌面积的百分比。肌细胞大小在横切的肌细胞中测量。分析了总共100-150个细胞/心脏。用两种方法评估梗塞心脏的大小。使用心脏照片的正侧和背侧，将梗塞面积计算为梗塞心室面积与总心室面积的百分比。使用心脏切片测量梗塞大小(Infarct size)作为梗塞心室壁长度与总心室壁长度的百分比。观察者不知道心脏切片的来源。
TUNEL测定
TUNEL测定用原位凋亡检测试剂盒(In Situ Apoptosis Detection Kit)进行。简言之，心脏用10％福尔马林溶液灌注固定，在石蜡中包埋，并以6μm切片。获取每个心脏一个中间纵向切片用于TUNEL染色。将蛋白酶K(20μg/ml)加入到每个载玻片。通过用2％过氧化氢覆盖切片，使内源性过氧化酶失活。固定后，将切片与TdT缓冲液在37℃孵育30分钟。反应用1×SSC终止。清洗后，将载玻片与RTU链霉抗生物素蛋白-HRP一起温育30分钟。通过添加DAB溶液形成阳性信号。用RTU苏木精复染后，用固定介质覆盖载玻片，并在显微镜下分析。每组包括5-6个心脏。使用计算机化的测面积法(NIH Image J)分析来自每个心脏的梗塞区域的八个视野(400x)的阳性细胞和总细胞。凋亡程度表示为阳性细胞与总细胞的百分比。
本文公开的和要求保护的所有物品和方法鉴于本公开内容均可被制备和执行，无需过度实验。尽管已根据优选的实施方案描述本公开内容的物品和方法，但对本领域技术人员而言明显的是，变化形式可被应用到所述物品和方法而不偏离本公开内容的精神和范围。对于本领域技术人员明显的所有这样的变化和等效物，无论是现存的或以后开发的，都被认为是在如由所附权利要求所限定的本公开内容的精神和范围之内。说明书中提及的所有专利、专利申请和出版物指示本公开内容所属领域的普通技术人员的水平。出于所有目的所有专利、专利申请和出版物通过引用整体并入本文，并且其程度如同每个单独出版物单独地且具体地被指示出于任何和所有目的通过引用整体并入本文。本文例证地表述的公开内容可在本文未具体地公开的任何一个或更多个要素不存在的条件下被合适地实践。使用的术语和表述被用作描述而非限制的术语，并且在使用此类术语和表述时不意图排除所显示和所描述的特征的任何等同物或其部分，但是认识到，多种改变在本公开内容要求的范围内是可能的。因此，应理解，尽管本公开内容已通过优选的实施方案和任选的特征被具体地公开，但是本领域技术人员可寻求本文公开的概念的改变和变化形式，并且认为此类改变和变化形式在本公开内容的如由所附的权利要求所限定的范围内。
序列表
如37C.F.R.1.822中规定的，使用氨基酸的标准三字母代码跟示出随附的序列表中列出的氨基酸序列。
SEQ ID NO:1是人胰高血糖素受体(GCGR)分子(登录号AAI04855)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:2是编码完全人抗-GCGR抗体的重链可变区的氨基酸序列。SEQ ID NO:3是编码完全人抗-GCGR抗体的轻链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:4是编码完全人抗-GCGR抗体的重链可变区的氨基酸序列。SEQ ID NO:5是编码完全人抗-GCGR抗体的轻链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:6是编码完全人抗-GCGR抗体的重链可变区的氨基酸序列。SEQ ID NO:7是编码完全人抗-GCGR抗体的轻链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:8是编码嵌合抗-GCGR抗体的重链的氨基酸序列。SEQ ID NO:9是编码嵌合抗-GCGR抗体的轻链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:10-28是编码多种完全人抗-GCGR抗体的重链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:29-47是编码多种完全人抗-GCGR抗体的轻链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:48是编码κ轻链恒定区的氨基酸序列。SEQ ID NO:49是编码λ轻链恒定区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:50是编码IgG2重链恒定区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:51是编码人抗-GCGR抗体的重链的氨基酸序列。SEQ ID NO:52是编码人抗-GCGR抗体的轻链的氨基酸序列。
序列表
SEQ ID NO：1-人胰高血糖素受体(GCGR)分子的氨基酸序列
MPPCQPQRPLLLLLLLLACQPQVPSAQVMDFLFEKWKLYGDQCHHNLSLLPPPTELVCNRTFDKYSCWPDTPANTTANISCPWYLPWHHKVQHRFVFKRCGPDGQWVRGPRGQPWRDASQCQMDGEEIEVQKEVAKMYSSFQVMYTVGYSLSLGALLLALAILGGLSKLHCTRNAIHANLFASFVLKASSVLVIDGLLRTRYSQKIGDDLSVSTWLSDGAVAGCRVAAVFMQYGIVANYCWLLVEGLYLHNLLGLATLPERSFFSLYLGIGWGAPMLFVVPWAVVKCLFENVQCWTSNDNMGFWWILRFPVFLAILINFFIFVRIVQLLVAKLRARQMHHTDYKFRLAKSTLTLIPLLGVHEVVFAFVTDEHAQGTLRSAKLFFDLFLSSFQGLLVAVLYCFLNKEVQSELRRRWHRWRLGKVLWEERNTSNHRASSSPGHGPPSKELQFGRGGGSQDSSAETPLAGGLPRLAESPF
SEQ ID NO：2-结合GCGR的人抗体的HCVR的氨基酸序列
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVMWYDGSNKDYVDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNRLRAEDTAVYYCAREKDHYDILTGYNYYYGLDVWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO：3-结合GCGR的人抗体的LCVR的氨基酸序列
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKRLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSVQPEDFVTYYCLQHNSNPLTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO：4-结合GCGR的人抗体的HCVR的氨基酸序列
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVMWYDGSNKDYVDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREKDHYDILTGYNYYYGLDVWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO：5-结合GCGR的人抗体的LCVR的氨基酸序列
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKRLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFVTYYCLQHNSNPLTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO：6-结合GCGR的人抗体的HCVR的氨基酸序列
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVMWYDGSNKDYVDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNRLRAEDTAVYYCAREKDHYDILTGYNYYYGLDVWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO：7-结合GCGR的人抗体的LCVR的氨基酸序列
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKRLIYAASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSVQPEDFVTYYCLQHNSNPLTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO：8-结合GCGR的嵌合抗体的重链的氨基酸序列
MEFGLSWVFLVALLRGVQCQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVMWYDGSNKDYVDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNRLRAEDTAVYYCAREKDHYDILTGYNYYYGLDVWGQGTTVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK
SEQ ID NO：9-结合GCGR的嵌合抗体的轻链的氨基酸序列
MDMRVPAQLLGLLLLWFPGARCDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKRLIYAASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSVQPEDFVTYYCLQHNSNPLTFGGGTKVEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC
SEQ ID NO：10-结合GCGR的人抗体的HCVR的氨基酸序列
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SEQ ID NO：11-结合GCGR的人抗体的HCVR的氨基酸序列
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SEQ ID NO：12-结合GCGR的人抗体的HCVR的氨基酸序列
QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNGAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYYDYAGSVKSRININPDTSKNQFSLQVNSVTPEDTAVYYCTRDRSSGWNEGYYYYGMDVWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO：13-结合GCGR的人抗体的HCVR的氨基酸序列
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYDIHWVRQAPGKGLEWVAVLSSDGNNKYCADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRTEDTAVYYCAREEVYYDILTGYYDYYGMDVWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO：14-结合GCGR的人抗体的HCVR的氨基酸序列
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISTYFWTWIRQFPGKGLEWIGYIFYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAREGYYDILTGEDYSYGMDVWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO：15-结合GCGR的人抗体的HCVR的氨基酸序列
QVQLQQSGPGLVKPSQILSLTCAISGDRVSSNGAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYYDYAGSVKSRININPDTSKNQFSLQVNSVTPEDTAVYYCARDRSSGWNEGYYYYGMDVWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO：16-结合GCGR的人抗体的HCVR的氨基酸序列
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISTYFWTWIRQFPGEGLEWIGYIFYSGNTNYNPSLTSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAREGYYDILTGEDYSYGIDVWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO：17-结合GCGR的人抗体的HCVR的氨基酸序列
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFIFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISNDGSNKYYADFVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREDYDILTGNGVYGMDVWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO：18-结合GCGR的人抗体的HCVR的氨基酸序列
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYTMNWVRQAPGKGLEWVSYISGSSSLIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLHMNSLRDEDTAVYYCARARYNWNDYYGMDVWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO：19-结合GCGR的人抗体的HCVR的氨基酸序列
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFAFSSYGIHWVRQAPGKGLEWVAGIWYDGSNKYYADSVKGRFTVSRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLFDAFDIWGQGTMVTVSS
SEQ ID NO：20-结合GCGR的人抗体的HCVR的氨基酸序列
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFIFSSYTMNWVRQAPGKGLEWVSYISSSSSLIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYYCARSDYYGSGSYYKGNYYGMDVWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO：21-结合GCGR的人抗体的HCVR的氨基酸序列
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVTIIWSDGINKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLNLQMNSLRAEDTAVYYCARERGLYDILTGYYDYYGIDVWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO：22-结合GCGR的人抗体的HCVR的氨基酸序列
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVTIIWSDGINKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLNLQMNSLRAEDTAVYYCARERGLYDILTGYYDYYGIDVWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO：23-结合GCGR的人抗体的HCVR的氨基酸序列
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGITFRSYSMNWVRQAPGKGLEWVSAISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSVYLQMNSLRAEDTAVYYCARGRYGMDVWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO：24-结合GCGR的人抗体的HCVR的氨基酸序列
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGSTFRSYDMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYGDSVKGRLTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDQYDILTGYSSDAFDIWGQGTMVTVSS
SEQ ID NO：25-结合GCGR的人抗体的HCVR的氨基酸序列
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSRYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSHKYYEDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRADDTGVYYCARVGYGSGWYEYYYHYGMDVWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO：26-结合GCGR的人抗体的HCVR的氨基酸序列
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVMWYDGSNKDYVDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNRLRAEDTAVYYCAREKDHYDILTGYNYYYGLDVWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO：27-结合GCGR的人抗体的HCVR的氨基酸序列
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVMWYDGSNKDYVDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNRLRAEDTAVYYCAREKDHYDILTGYNYYYGLDVWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO：28-结合GCGR的人抗体的HCVR的氨基酸序列
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGITFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVASIWYDGSNKYYVDSVKGRFTIFRDNSKKTLYLQMNRLRAEDTAVYYCARLGGGFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：29-结合GCGR的人抗体的LCVR的氨基酸序列
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLAWFQKKPGKAPKSLIYVVSSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTINNLQPEDFATYYCQQYNHYPLTFGGGTRVEIKR
SEQ ID NO：30-结合GCGR的人抗体的LCVR的氨基酸序列
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLAWFQQRPGKAPKSLIYVVSSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISNLQPEDFATYFCQQYNHYPLTFGGGTKVEIKR
SEQ ID NO：31-结合GCGR的人抗体的LCVR的氨基酸序列
DIQMTQFPSSLSASIGDRVTITCQASQDISNFLNWFQQKPGKAPKLLIYDASDLETGVPSRFSGSGAGTDFTFTISSLQPEDIATYFCQQYDDLPLTFGGGTRVDIKR
SEQ ID NO：32-结合GCGR的人抗体的LCVR的氨基酸序列
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKRLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQHNSNPLTFGGGTKVEIKR
SEQ ID NO：33-结合GCGR的人抗体的LCVR的氨基酸序列
QNVLTQSPGTLSLSPGERVTLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIFGVSSRATGIPDRFSGSGSGTDFSLTISRLEPEDFAVYYCQQYGNSPFTFGPGTKVDIKR
SEQ ID NO：34-结合GCGR的人抗体的LCVR的氨基酸序列
DIQMTQFPSSLSASIGDRVTITCQASQDISNFLNWFQQKPGKAPKLLIYDASDLETGVPSRFSGSGAGTDFTFTISSLQPEDVATYFCQQYDNLPLTFGGGTKVDIKR
SEQ ID NO：35-结合GCGR的人抗体的LCVR的氨基酸序列
ENVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVTSSYLAWYQQKPGQAPRLLIFGVSSRATGIPDRFSGSGSGTDFSLTISRLEPEDFAVYYCQQYGNSPFTFGPGTKVDIKR
SEQ ID NO：36-结合GCGR的人抗体的LCVR的氨基酸序列
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIDMYLAWFQQKPGKAPKSLIYAASSLQSGVPSKFSGSGFGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNIFPFTFGPGTKVDVKR
SEQ ID NO：37-结合GCGR的人抗体的LCVR的氨基酸序列
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKRLIYAASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQHNSYPWTFGQGTKVEIKR
SEQ ID NO：38-结合GCGR的人抗体的LCVR的氨基酸序列
KIVMTQTPLALPVIPGEPASISCRSSQSLVDSDDGDTYLDWYLQKPGQSPQVLIHRLSYRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGIYYCMHRIEFPFTFGGGTKVEIKR
SEQ ID NO：39-结合GCGR的人抗体的LCVR的氨基酸序列
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQRPGKAPKRLIYAASSLQTGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQHNSYPWTFGQGTKVEIKR
SEQ ID NO：40-结合GCGR的人抗体的LCVR的氨基酸序列
GIVLTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMEALQTMCSFGQGTKLEIKR
SEQ ID NO：41-结合GCGR的人抗体的LCVR的氨基酸序列
GIVLTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMEALQTMSSFGQGTKLEIKR
SEQ ID NO：42-结合GCGR的人抗体的LCVR的氨基酸序列
DIVMTQTPLFLPVTPGEPASISCRSSQTLLDSDDGNTYLDWYLQKPGQSPQRLIYTLSYRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGIYYCMQHIEFPSTFGQGTRLEIKR
SEQ ID NO：43-结合GCGR的人抗体的LCVR的氨基酸序列
SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDKLGDKYASWYQQKPGQSPVLVIYQSTKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQAWDSSTVVFGGGTKLTVLG
SEQ ID NO：44-结合GCGR的人抗体的LCVR的氨基酸序列
NIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLLHSDGKNYLFWYLQKPGQSPQLLIYEVSYRFSGVPDRFSGSGSGTDFSLKISRVEAEDVGVYYCMQNIQPPLTFGQGTRLEIKR
SEQ ID NO：45-结合GCGR的人抗体的LCVR的氨基酸序列
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKRLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSVQPEDFVTYYCLQHNSNPLTFGGGTKVEIKR
SEQ ID NO：46-结合GCGR的人抗体的LCVR的氨基酸序列
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKRLIYAASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSVQPEDFVTYYCLQHNSNPLTFGGGTKVEIKR
SEQ ID NO：47-结合GCGR的人抗体的LCVR的氨基酸序列
DIVLTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLDRDDGDTYLDWYLQKPGQSPQLLIYTLSYRASGVPDRFSGSGSGTDFSLKISRVEAEDVGVYYCMQRIEFPFTFGPGTKVDIKR
SEQ ID NO：48-恒定轻链κ区的氨基酸序列
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO：49-恒定轻链λ区的氨基酸序列
GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
SEQ ID NO：50-IgG2重链恒定区的氨基酸序列
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRVVQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO：51-结合GCGR的人抗体的HC的氨基酸序列
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVMWYDGSNKDYVDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNRLRAEDTAVYYCAREKDHYDILTGYNYYYGLDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO：52-结合GCGR的人抗体的LC的氨基酸序列
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKRLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSVQPEDFVTYYCLQHNSNPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
序列表
<110> 瑞美德生物医药科技有限公司
<120> 用于使用胰高血糖素受体拮抗性抗体治疗心力衰竭的方法
<130> CACRE1.0006WO
<160> 52
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 477
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
Met Pro Pro Cys Gln Pro Gln Arg Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu
1               5                   10                  15
Leu Ala Cys Gln Pro Gln Val Pro Ser Ala Gln Val Met Asp Phe Leu
            20                  25                  30
Phe Glu Lys Trp Lys Leu Tyr Gly Asp Gln Cys His His Asn Leu Ser
        35                  40                  45
Leu Leu Pro Pro Pro Thr Glu Leu Val Cys Asn Arg Thr Phe Asp Lys
    50                  55                  60
Tyr Ser Cys Trp Pro Asp Thr Pro Ala Asn Thr Thr Ala Asn Ile Ser
65                  70                  75                  80
Cys Pro Trp Tyr Leu Pro Trp His His Lys Val Gln His Arg Phe Val
                85                  90                  95
Phe Lys Arg Cys Gly Pro Asp Gly Gln Trp Val Arg Gly Pro Arg Gly
            100                 105                 110
Gln Pro Trp Arg Asp Ala Ser Gln Cys Gln Met Asp Gly Glu Glu Ile
        115                 120                 125
Glu Val Gln Lys Glu Val Ala Lys Met Tyr Ser Ser Phe Gln Val Met
    130                 135                 140
Tyr Thr Val Gly Tyr Ser Leu Ser Leu Gly Ala Leu Leu Leu Ala Leu
145                 150                 155                 160
Ala Ile Leu Gly Gly Leu Ser Lys Leu His Cys Thr Arg Asn Ala Ile
                165                 170                 175
His Ala Asn Leu Phe Ala Ser Phe Val Leu Lys Ala Ser Ser Val Leu
            180                 185                 190
Val Ile Asp Gly Leu Leu Arg Thr Arg Tyr Ser Gln Lys Ile Gly Asp
        195                 200                 205
Asp Leu Ser Val Ser Thr Trp Leu Ser Asp Gly Ala Val Ala Gly Cys
    210                 215                 220
Arg Val Ala Ala Val Phe Met Gln Tyr Gly Ile Val Ala Asn Tyr Cys
225                 230                 235                 240
Trp Leu Leu Val Glu Gly Leu Tyr Leu His Asn Leu Leu Gly Leu Ala
                245                 250                 255
Thr Leu Pro Glu Arg Ser Phe Phe Ser Leu Tyr Leu Gly Ile Gly Trp
            260                 265                 270
Gly Ala Pro Met Leu Phe Val Val Pro Trp Ala Val Val Lys Cys Leu
        275                 280                 285
Phe Glu Asn Val Gln Cys Trp Thr Ser Asn Asp Asn Met Gly Phe Trp
    290                 295                 300
Trp Ile Leu Arg Phe Pro Val Phe Leu Ala Ile Leu Ile Asn Phe Phe
305                 310                 315                 320
Ile Phe Val Arg Ile Val Gln Leu Leu Val Ala Lys Leu Arg Ala Arg
                325                 330                 335
Gln Met His His Thr Asp Tyr Lys Phe Arg Leu Ala Lys Ser Thr Leu
            340                 345                 350
Thr Leu Ile Pro Leu Leu Gly Val His Glu Val Val Phe Ala Phe Val
        355                 360                 365
Thr Asp Glu His Ala Gln Gly Thr Leu Arg Ser Ala Lys Leu Phe Phe
    370                 375                 380
Asp Leu Phe Leu Ser Ser Phe Gln Gly Leu Leu Val Ala Val Leu Tyr
385                 390                 395                 400
Cys Phe Leu Asn Lys Glu Val Gln Ser Glu Leu Arg Arg Arg Trp His
                405                 410                 415
Arg Trp Arg Leu Gly Lys Val Leu Trp Glu Glu Arg Asn Thr Ser Asn
            420                 425                 430
His Arg Ala Ser Ser Ser Pro Gly His Gly Pro Pro Ser Lys Glu Leu
        435                 440                 445
Gln Phe Gly Arg Gly Gly Gly Ser Gln Asp Ser Ser Ala Glu Thr Pro
    450                 455                 460
Leu Ala Gly Gly Leu Pro Arg Leu Ala Glu Ser Pro Phe
465                 470                 475
<210> 2
<211> 128
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 2
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Val Met Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Asp Tyr Val Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Arg Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Glu Lys Asp His Tyr Asp Ile Leu Thr Gly Tyr Asn Tyr Tyr
            100                 105                 110
Tyr Gly Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
        115                 120                 125
<210> 3
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 3
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp
            20                  25                  30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Val Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Ser Asn Pro Leu
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210> 4
<211> 128
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 4
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Val Met Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Asp Tyr Val Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Glu Lys Asp His Tyr Asp Ile Leu Thr Gly Tyr Asn Tyr Tyr
            100                 105                 110
Tyr Gly Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
        115                 120                 125
<210> 5
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 5
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp
            20                  25                  30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Val Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Ser Asn Pro Leu
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210> 6
<211> 128
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 6
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Val Met Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Asp Tyr Val Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Arg Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Glu Lys Asp His Tyr Asp Ile Leu Thr Gly Tyr Asn Tyr Tyr
            100                 105                 110
Tyr Gly Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
        115                 120                 125
<210> 7
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 7
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp
            20                  25                  30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Val Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Ser Asn Pro Leu
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210> 8
<211> 471
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 结合GCGR的嵌合抗体的重链
<400> 8
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Leu Arg Gly
1               5                   10                  15
Val Gln Cys Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln
            20                  25                  30
Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
        35                  40                  45
Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
    50                  55                  60
Glu Trp Val Ala Val Met Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Asp Tyr Val
65                  70                  75                  80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
                85                  90                  95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Arg Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
            100                 105                 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Lys Asp His Tyr Asp Ile Leu Thr Gly Tyr
        115                 120                 125
Asn Tyr Tyr Tyr Gly Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
    130                 135                 140
Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro
145                 150                 155                 160
Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val
                165                 170                 175
Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser
            180                 185                 190
Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu
        195                 200                 205
Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser
    210                 215                 220
Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val
225                 230                 235                 240
Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys
                245                 250                 255
Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys
            260                 265                 270
Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val
        275                 280                 285
Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp
    290                 295                 300
Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe
305                 310                 315                 320
Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp
                325                 330                 335
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe
            340                 345                 350
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys
        355                 360                 365
Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys
    370                 375                 380
Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp
385                 390                 395                 400
Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys
                405                 410                 415
Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser
            420                 425                 430
Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr
        435                 440                 445
Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser
    450                 455                 460
Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
465                 470
<210> 9
<211> 236
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 结合GCGR的嵌合抗体的轻链
<400> 9
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1               5                   10                  15
Phe Pro Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser
            20                  25                  30
Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser
        35                  40                  45
Gln Gly Ile Arg Asn Asp Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
    50                  55                  60
Ala Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val
65                  70                  75                  80
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr
                85                  90                  95
Ile Ser Ser Val Gln Pro Glu Asp Phe Val Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln
            100                 105                 110
His Asn Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile
        115                 120                 125
Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser
    130                 135                 140
Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn
145                 150                 155                 160
Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu
                165                 170                 175
Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp
            180                 185                 190
Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr
        195                 200                 205
Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr
    210                 215                 220
Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
225                 230                 235
<210> 10
<211> 125
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 10
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
            20                  25                  30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Val Ile Leu Ser Asp Gly Arg Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Asp Asp Tyr Glu Ile Leu Thr Gly Tyr Gly Tyr Tyr Gly Met
            100                 105                 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
        115                 120                 125
<210> 11
<211> 125
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 11
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Val Ile Leu Asn Asp Gly Arg Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Asp Asp Tyr Glu Ile Leu Thr Gly Tyr Gly Tyr Tyr Gly Met
            100                 105                 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
        115                 120                 125
<210> 12
<211> 129
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 12
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn
            20                  25                  30
Gly Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Tyr Asp Tyr Ala
    50                  55                  60
Gly Ser Val Lys Ser Arg Ile Asn Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn
65                  70                  75                  80
Gln Phe Ser Leu Gln Val Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val
                85                  90                  95
Tyr Tyr Cys Thr Arg Asp Arg Ser Ser Gly Trp Asn Glu Gly Tyr Tyr
            100                 105                 110
Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
        115                 120                 125
Ser
<210> 13
<211> 128
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 13
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Asp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Val Leu Ser Ser Asp Gly Asn Asn Lys Tyr Cys Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Glu Glu Val Tyr Tyr Asp Ile Leu Thr Gly Tyr Tyr Asp Tyr
            100                 105                 110
Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
        115                 120                 125
<210> 14
<211> 126
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 14
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Thr Tyr
            20                  25                  30
Phe Trp Thr Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Tyr Ile Phe Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
    50                  55                  60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65                  70                  75                  80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Glu Gly Tyr Tyr Asp Ile Leu Thr Gly Glu Asp Tyr Ser Tyr Gly
            100                 105                 110
Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
        115                 120                 125
<210> 15
<211> 129
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 15
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Ile Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Arg Val Ser Ser Asn
            20                  25                  30
Gly Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Tyr Asp Tyr Ala
    50                  55                  60
Gly Ser Val Lys Ser Arg Ile Asn Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn
65                  70                  75                  80
Gln Phe Ser Leu Gln Val Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val
                85                  90                  95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Ser Ser Gly Trp Asn Glu Gly Tyr Tyr
            100                 105                 110
Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
        115                 120                 125
Ser
<210> 16
<211> 126
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 16
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Thr Tyr
            20                  25                  30
Phe Trp Thr Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Tyr Ile Phe Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Thr
    50                  55                  60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65                  70                  75                  80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Glu Gly Tyr Tyr Asp Ile Leu Thr Gly Glu Asp Tyr Ser Tyr Gly
            100                 105                 110
Ile Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
        115                 120                 125
<210> 17
<211> 125
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 17
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Val Ile Ser Asn Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Phe Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Glu Asp Tyr Asp Ile Leu Thr Gly Asn Gly Val Tyr Gly Met
            100                 105                 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
        115                 120                 125
<210> 18
<211> 122
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 18
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Tyr Ile Ser Gly Ser Ser Ser Leu Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu His Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Ala Arg Tyr Asn Trp Asn Asp Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp
            100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210> 19
<211> 116
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 19
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Gly Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Leu Phe Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val
            100                 105                 110
Thr Val Ser Ser
        115
<210> 20
<211> 128
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 20
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ser Leu Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Ser Asp Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Tyr Tyr Lys Gly Asn Tyr
            100                 105                 110
Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
        115                 120                 125
<210> 21
<211> 128
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 21
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Thr Ile Ile Trp Ser Asp Gly Ile Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Asn
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Glu Arg Gly Leu Tyr Asp Ile Leu Thr Gly Tyr Tyr Asp Tyr
            100                 105                 110
Tyr Gly Ile Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
        115                 120                 125
<210> 22
<211> 128
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 22
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Thr Ile Ile Trp Ser Asp Gly Ile Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Asn
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Glu Arg Gly Leu Tyr Asp Ile Leu Thr Gly Tyr Tyr Asp Tyr
            100                 105                 110
Tyr Gly Ile Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
        115                 120                 125
<210> 23
<211> 116
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 23
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Thr Phe Arg Ser Tyr
            20                  25                  30
Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Ala Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Val Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Gly Arg Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
            100                 105                 110
Thr Val Ser Ser
        115
<210> 24
<211> 125
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 24
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe Arg Ser Tyr
            20                  25                  30
Asp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Gly Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Asp Gln Tyr Asp Ile Leu Thr Gly Tyr Ser Ser Asp Ala Phe
            100                 105                 110
Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
        115                 120                 125
<210> 25
<211> 127
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 25
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr
            20                  25                  30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser His Lys Tyr Tyr Glu Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Asp Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Val Gly Tyr Gly Ser Gly Trp Tyr Glu Tyr Tyr Tyr His Tyr
            100                 105                 110
Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
        115                 120                 125
<210> 26
<211> 128
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 26
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Val Met Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Asp Tyr Val Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Arg Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Glu Lys Asp His Tyr Asp Ile Leu Thr Gly Tyr Asn Tyr Tyr
            100                 105                 110
Tyr Gly Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
        115                 120                 125
<210> 27
<211> 128
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 27
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Val Met Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Asp Tyr Val Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Arg Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Glu Lys Asp His Tyr Asp Ile Leu Thr Gly Tyr Asn Tyr Tyr
            100                 105                 110
Tyr Gly Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
        115                 120                 125
<210> 28
<211> 116
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 28
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Ser Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Phe Arg Asp Asn Ser Lys Lys Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Arg Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Leu Gly Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
            100                 105                 110
Thr Val Ser Ser
        115
<210> 29
<211> 108
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 29
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Phe Gln Lys Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Val Val Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Asn Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn His Tyr Pro Leu
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg Val Glu Ile Lys Arg
            100                 105
<210> 30
<211> 108
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 30
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Val Val Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn His Tyr Pro Leu
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
            100                 105
<210> 31
<211> 108
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 31
Asp Ile Gln Met Thr Gln Phe Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Ile Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Phe
            20                  25                  30
Leu Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Asp Ala Ser Asp Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asp Asp Leu Pro Leu
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg Val Asp Ile Lys Arg
            100                 105
<210> 32
<211> 108
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 32
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp
            20                  25                  30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Ser Asn Pro Leu
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
            100                 105
<210> 33
<211> 109
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 33
Gln Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
            20                  25                  30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Phe Gly Val Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Asn Ser Pro
                85                  90                  95
Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg
            100                 105
<210> 34
<211> 108
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 34
Asp Ile Gln Met Thr Gln Phe Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Ile Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Phe
            20                  25                  30
Leu Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Asp Ala Ser Asp Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Pro Leu
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg
            100                 105
<210> 35
<211> 109
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 35
Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser
            20                  25                  30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Phe Gly Val Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Asn Ser Pro
                85                  90                  95
Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg
            100                 105
<210> 36
<211> 108
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 36
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Asp Met Tyr
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Lys Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Phe Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ile Phe Pro Phe
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Val Lys Arg
            100                 105
<210> 37
<211> 108
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 37
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp
            20                  25                  30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Ser Tyr Pro Trp
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
            100                 105
<210> 38
<211> 114
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 38
Lys Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ala Leu Pro Val Ile Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Asp Ser
            20                  25                  30
Asp Asp Gly Asp Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln
        35                  40                  45
Ser Pro Gln Val Leu Ile His Arg Leu Ser Tyr Arg Ala Ser Gly Val
    50                  55                  60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys
65                  70                  75                  80
Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Met His
                85                  90                  95
Arg Ile Glu Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile
            100                 105                 110
Lys Arg
<210> 39
<211> 108
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 39
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp
            20                  25                  30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Ser Tyr Pro Trp
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
            100                 105
<210> 40
<211> 113
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 40
Gly Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
            20                  25                  30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
        35                  40                  45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Glu Ala
                85                  90                  95
Leu Gln Thr Met Cys Ser Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105                 110
Arg
<210> 41
<211> 113
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 41
Gly Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
            20                  25                  30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
        35                  40                  45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Glu Ala
                85                  90                  95
Leu Gln Thr Met Ser Ser Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105                 110
Arg
<210> 42
<211> 114
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 42
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Phe Leu Pro Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Thr Leu Leu Asp Ser
            20                  25                  30
Asp Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln
        35                  40                  45
Ser Pro Gln Arg Leu Ile Tyr Thr Leu Ser Tyr Arg Ala Ser Gly Val
    50                  55                  60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys
65                  70                  75                  80
Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Met Gln
                85                  90                  95
His Ile Glu Phe Pro Ser Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile
            100                 105                 110
Lys Arg
<210> 43
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 43
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asp Lys Tyr Ala
            20                  25                  30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr
        35                  40                  45
Gln Ser Thr Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
    50                  55                  60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met
65                  70                  75                  80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Asp Ser Ser Thr Val Val
                85                  90                  95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
            100                 105
<210> 44
<211> 113
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 44
Asn Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
            20                  25                  30
Asp Gly Lys Asn Tyr Leu Phe Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
        35                  40                  45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Glu Val Ser Tyr Arg Phe Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Asn
                85                  90                  95
Ile Gln Pro Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
            100                 105                 110
Arg
<210> 45
<211> 108
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 45
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp
            20                  25                  30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Val Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Ser Asn Pro Leu
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
            100                 105
<210> 46
<211> 108
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 46
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp
            20                  25                  30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Val Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Ser Asn Pro Leu
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
            100                 105
<210> 47
<211> 114
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 47
Asp Ile Val Leu Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Arg
            20                  25                  30
Asp Asp Gly Asp Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln
        35                  40                  45
Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Leu Ser Tyr Arg Ala Ser Gly Val
    50                  55                  60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Lys
65                  70                  75                  80
Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln
                85                  90                  95
Arg Ile Glu Phe Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile
            100                 105                 110
Lys Arg
<210> 48
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 48
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1               5                   10                  15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
            20                  25                  30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
        35                  40                  45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
    50                  55                  60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65                  70                  75                  80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
                85                  90                  95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
            100                 105
<210> 49
<211> 106
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 49
Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser
1               5                   10                  15
Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp
            20                  25                  30
Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro
        35                  40                  45
Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn
    50                  55                  60
Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys
65                  70                  75                  80
Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val
                85                  90                  95
Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
            100                 105
<210> 50
<211> 326
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 50
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
            20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
        35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
    50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
                85                  90                  95
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
            100                 105                 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
        115                 120                 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
    130                 135                 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145                 150                 155                 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
                165                 170                 175
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp
            180                 185                 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
        195                 200                 205
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu
    210                 215                 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225                 230                 235                 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
                245                 250                 255
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
            260                 265                 270
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
        275                 280                 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
    290                 295                 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305                 310                 315                 320
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
                325
<210> 51
<211> 454
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 51
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Val Met Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Asp Tyr Val Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Arg Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Glu Lys Asp His Tyr Asp Ile Leu Thr Gly Tyr Asn Tyr Tyr
            100                 105                 110
Tyr Gly Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
        115                 120                 125
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
    130                 135                 140
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
145                 150                 155                 160
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
                165                 170                 175
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
            180                 185                 190
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
        195                 200                 205
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
    210                 215                 220
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
225                 230                 235                 240
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
                245                 250                 255
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
            260                 265                 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
        275                 280                 285
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
    290                 295                 300
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp
305                 310                 315                 320
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
                325                 330                 335
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu
            340                 345                 350
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
        355                 360                 365
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
    370                 375                 380
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
385                 390                 395                 400
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
                405                 410                 415
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
            420                 425                 430
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
        435                 440                 445
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
    450
<210> 52
<211> 214
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 52
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp
            20                  25                  30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Val Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Ser Asn Pro Leu
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
            100                 105                 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
        115                 120                 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
    130                 135                 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145                 150                 155                 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
                165                 170                 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
            180                 185                 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
        195                 200                 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
    210

Claims (16)

1.与人胰高血糖素受体特异性地结合的分离的拮抗性抗原结合蛋白在制备用于治疗需要其的受试者中的糖尿病心肌病心力衰竭的药物中的用途，其中所述分离的拮抗性抗原结合蛋白是完全人抗体，并且所述抗体包含抗-GCGR抗体，所述抗-GCGR抗体包含SEQ IDNO:51的重链可变区的氨基酸序列和SEQ ID NO:52的轻链可变区的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述分离的拮抗性抗原结合蛋白以至少1x10-12 M的解离常数(KD)与人胰高血糖素受体特异性结合。
3.根据权利要求2所述的用途，其中所述分离的拮抗性抗原结合蛋白以1x10-7 M、1x10-8M、1x10-9 M、1x10-10 M、1x10-11 M或1x10-12 M的解离常数(KD)与人胰高血糖素受体特异性结合。
4.根据权利要求1所述的用途，其中所述分离的拮抗性抗原结合蛋白的治疗有效量为0.001至100mg/kg体重/周。
5.根据权利要求2所述的用途，其中所述分离的拮抗性抗原结合蛋白的治疗有效量为0.001至100mg/kg体重/周。
6.根据权利要求3所述的用途，其中所述分离的拮抗性抗原结合蛋白的治疗有效量为0.001至100mg/kg体重/周。
7.根据权利要求3所述的用途，其中所述分离的拮抗性抗原结合蛋白的治疗有效量为0.001mg/kg、0.01mg/kg、0.1mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg、30mg/kg、40mg/kg、50mg/kg、60mg/kg、70mg/kg、80mg/kg、或90mg/kg体重/周。
8.根据权利要求5或6所述的用途，其中所述分离的拮抗性抗原结合蛋白的治疗有效量为0.001mg/kg、0.01mg/kg、0.1mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg、30mg/kg、40mg/kg、50mg/kg、60mg/kg、70mg/kg、80mg/kg、或90mg/kg体重/周。
9.根据权利要求1所述的用途，其中所述药物还包括选自由以下组成的组的抗心力衰竭药物：血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂、β-肾上腺素能阻断剂、血管紧张肽II受体阻断剂(ARB)、利尿剂和洋地黄。
10.根据权利要求1、5-7或9中任一项所述的用途，其中所述分离的拮抗性抗原结合蛋白与药学上可接受的载体混合以形成用于全身施用至所述受试者的药物组合物。
11.根据权利要求2所述的用途，其中所述分离的拮抗性抗原结合蛋白与药学上可接受的载体混合以形成用于全身施用至所述受试者的药物组合物。
12.根据权利要求3所述的用途，其中所述分离的拮抗性抗原结合蛋白与药学上可接受的载体混合以形成用于全身施用至所述受试者的药物组合物。
13.根据权利要求4所述的用途，其中所述分离的拮抗性抗原结合蛋白与药学上可接受的载体混合以形成用于全身施用至所述受试者的药物组合物。
14.根据权利要求8所述的用途，其中所述分离的拮抗性抗原结合蛋白与药学上可接受的载体混合以形成用于全身施用至所述受试者的药物组合物。
15.根据权利要求10所述的用途，其中所述全身施用选自：静脉注射、肌肉注射、皮下注射、腹膜内注射、经皮注射、动脉内注射、胸骨内注射、鞘内注射、心室内注射、尿道内注射、颅内注射、滑膜内注射或经由输注。
16.根据权利要求11-14中任一项所述的用途，其中所述全身施用选自：静脉注射、肌肉注射、皮下注射、腹膜内注射、经皮注射、动脉内注射、胸骨内注射、鞘内注射、心室内注射、尿道内注射、颅内注射、滑膜内注射或经由输注。
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