CN108347906A - 具有共同轻链的转基因兔 - Google Patents

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Abstract

本文报道了包含人源化轻链基因座的转基因载体，其中所述人源化轻链基因座包含(a)衍生自人轻链V区段IGKV1‑39‑01的V基因区段，(b)启动子，其3’近端连接有所述轻链基因区段，和(c)至少一个人IGKJ4 J元件的片段，其5’近端连接有所述轻链基因区段。

Description

具有共同轻链的转基因兔
本文报道了可用于产生生产人抗体的转基因兔的共同轻链基因座。本文还报道了共同轻链可变结构域氨基酸序列，包含共同轻链可变结构域的多特异性抗体和包含相应共同轻链基因座的转基因兔。
背景技术
多特异性抗体的产生受到链错配导致未配对和错配副产物形成问题的阻碍。根据所选择的形式，可以形成这些副产物的不可忽略的数目和量。
已经开发了解决这个问题的不同方法。
为了减少重链错配，已经报道了结入扣(knobs-into-hole)技术(参见例如Ridgway，JB等人，Prot.Eng.9(1996)617-621)或CrossMab形式(参见例如Schaefer，W等人，Natl.Acad.Sci USA 108(2011)11187-11192)。
为了减少轻链错配，可以使用共同轻链。这种方法固有地要求对于每个都由一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域形成的两个结合位点，必须使用相同的抗体轻链可变结构域。
包含人免疫球蛋白基因座的非人动物可以用于产生具有共同轻链的单特异性抗体。这些动物中的人免疫球蛋白基因座通常包含减少且有限数量的重链种系基因，重排的种系重链基因或重链V基因区段和单个轻链基因。当为了产生抗体而免疫这种非人动物时，引发的免疫应答包含具有多种不同重链可变结构域但仅有单一轻链可变结构域的抗体。
需要设计并开发适合于配合从头产生抗体的新型共同轻链。因此，这种方法不被认为是开发重组多特异性抗体的首选，因为很可能需要进一步优化并且不得不进行序列修饰。
例如在WO 98/50431，WO 2010/084197，US2013/045492，WO2011/097603和WO2012/148873中报道了共同轻链和产生这种共同轻链的方法。
在WO 2004/009618中，在SEQ ID NO：1中报道了共同VL(包含在UBS54和K53中)。在SEQ ID NO：18中报道了从针对CD22(克隆B28)、CD72(克隆II-2)和HLA-DR(II类；克隆I-2)的噬菌体获得的共同轻链。
在US 2007/098712中，使用抗Ob-R抗体克隆26和抗HER3抗体克隆18的共同VL序列构建双特异性抗体。还报道了抗Mpl scFv 12B5(GenBank登录号AF048775)和抗HER3scFv克隆H6(GenBank登录号AF048774)利用相同的VL序列和基本上不同的VH序列。
在WO2010/84197中报道了包含重链和轻链的重组抗体，其中轻链包含如SEQ IDNO：8所示的序列。SEQ ID NO：8是V区段VKVI-2-1-(1)-A14(IGKV6D-41*01)的氨基酸序列。共同轻链的其他氨基酸序列在SEQ ID NO：12-14中报道。
在US2010/0331527中报道了另一种共同轻链方法，其中不同特异性的两种抗体使用相同的轻链。
在WO2011/097603中报道了基于人Vκ1-39Jκ5基因座，人Vκ3-20Jκ1基因座和人VpreBJλ5基因座的工程化人Vκ和Vλ共同轻链。
在US2012/0192300，US2012/021409，US2011/0195454和US2013/0045492中报道了共同轻链及其制备方法。
在WO2012/018764中报道了遗传修饰的小鼠以及制备和使用它们的方法，其中小鼠包含用至少一个轻链V基因区段和至少一个轻链J基因区段替代全部或基本上全部的免疫球蛋白重链V基因区段、D基因区段和J基因区段。
在WO 2013/157953中报道了衍生自重排的种系人κ轻链IgVK1-39/Jκ或IGVK3-20/JK的种系样共同轻链。
在WO2014/22540中概述了通用轻链可以是选自Vκ1-39和Vκ3-20轻链的κ轻链或选自VL1-40和VL2-14轻链的λ轻链。在一个具体实施方案中，人VL基因区段是人Vκ1-39Jκ5基因区段或人Vκ3-20Jκ1基因区段。
在WO2014/51433中报道了共同轻链012，其是人重排κ轻链IgVK1-39*01/IgJK1*01。该序列是在人库中经常使用的种系序列，并且具有与许多不同VH区配对的优越能力，并且具有良好的热力学稳定性、产量和溶解性。
在US2015/037337中报道了人JH6*02是人中共同的保守变体，并因此是构建转基因IgH基因座的良好候选者。
在WO 2015/052230的SEQ ID NO：6中报道了修饰的重链CH3-CH2-CH1-VL的氨基酸序列，其中VL是共同轻链(CLC-Fc cross-MAb)的可变结构域。
在WO 2015/153765中，报道了在SEQ ID NO：78和79的N-term-VL-CK-C-term融合多肽中的共同轻链。
在WO 2000/46251，WO 2002/12437，WO 2005/007696，WO 2006/047367，US 2007/0033661和WO 2008/027986中报道了包含人免疫球蛋白基因座的转基因兔。
发明概述
本文报道的一个方面是具有以下氨基酸序列的共同抗体轻链可变结构域：
或其变体。
本文报道的一个方面是包含具有以下氨基酸序列的轻链可变结构域的共同抗体轻链
或其变体。
在一个实施方案中，共同轻链包含多达13个氨基酸突变。在一个优选实施方案中，共同轻链包含多达13个氨基酸突变，其中至多11个突变位于HVR中。
在一个实施方案中，共同轻链包含多达11个氨基酸突变。
在一个实施方案中，所述共同轻链在SEQ ID NO：01的氨基酸序列内包含1至11个氨基酸突变。在一个优选实施方案中，共同轻链在SEQ ID NO：01的氨基酸序列内包含1至13个氨基酸突变，其中至多11个突变位于HVR中。
在一个实施方案中，如本文报道的共同抗体轻链的变体包含与SEQ ID NO：01具有90％或更多的序列同一性(即包含多达11个突变)的轻链可变结构域。在一个实施方案中，序列同一性为95％或更高。在一个实施方案中，序列同一性为98％或更高。
本文报道的一个方面是包含本文报道的轻链的抗体。
本文报道的一个方面是包含如本文报道的两个或更多个不同重链可变结构域和两个或更多个共同轻链可变结构域的多特异性抗体。
在一个实施方案中，多特异性抗体是双特异性全长抗体，其包含本文报道的两个不同重链和两个共同轻链可变结构域或两个共同抗体轻链。
在一个实施方案中，多特异性抗体是三特异性抗体，其包含本文报道的三个不同的重链可变结构域和三个共同的轻链可变结构域。
在一个实施方案中，多特异性抗体是四特异性抗体，其包含本文报道的四个不同重链可变结构域和四个共同轻链可变结构域。
本文报道的一个方面是使用如本文报道的共同抗体轻链来产生双特异性抗体。
在一个实施方案中，所述用途是通过将两个共同抗体轻链与第一抗体重链和第二抗体重链组合，其中第一抗体重链与共同抗体轻链一起形成第一抗原结合位点并且第二抗体重链与共同抗体轻链一起形成第二抗原结合位点。
本文报道的一个方面是包含人源化免疫球蛋白轻链基因座的转基因载体，其中所述人源化免疫球蛋白轻链基因座包含
(a)衍生自人轻链V区段IGKV1-39-01的V基因区段，
(b)启动子，其3’近端连接有所述轻链基因区段，和
(c)至少一个人IGKJ4J元件的片段，其5’近端连接有所述轻链基因区段。
在一个实施方案中，转基因载体包含人源化轻链基因座，其中所述人源化轻链基因座包含
(a)作为V基因区段的人轻链V区段IGKV1-39-01，
(b)启动子，其3’近端连接有所述轻链基因区段，和
(c)人IGKJ4J元件或其功能片段，其5’近端连接有所述轻链基因区段。
本文报道的一个方面是转基因兔，其包含本文报道的转基因载体中存在的人源化免疫球蛋白轻链基因座。在一个实施方案中，转基因兔具有基本完整的内源调控和抗体生产机制。
在一个实施方案中，转基因兔还包含
(1)衍生自用8个人VH元件、人JH1-JH6元件、与人bcl2编码序列融合的人Cμ编码区和人Cγ编码区取代的、兔免疫球蛋白重链基因座的转基因；
(2)衍生自包含人Vκ元件IGKV1-39-01和人IgKJ4J元件的、兔免疫球蛋白轻链基因座的转基因；
(3)衍生自人CD79α和CD79β基因座的转基因；和
(4)兔Cμ和兔Cκ基因座内的功能丧失的突变。
本文报道的一个方面是如本文报道的来自转基因兔的B细胞，其包含存在于本文报道的转基因载体中的人源化免疫球蛋白轻链基因座。
本文报道的一个方面是使用如本文报道的转基因兔产生人免疫球蛋白的方法。
在一个实施方案中，人免疫球蛋白是抗体。在一个实施方案中，人免疫球蛋白是多克隆抗体。在一个优选的实施方案中，人免疫球蛋白是单克隆抗体。
本发明的详细描述
定义
如本文所用的术语“共同轻链可变结构域”表示特异性抗体轻链可变结构域氨基酸序列，其可以与不同抗体重链可变结构域氨基酸序列配对以形成不同特异性的功能性抗原结合位点，即结合到相同抗原或不同抗原上的不同表位。在一个实施方案中，共同轻链可变结构域与SEQ ID NO：01具有至少80％，或至少90％，或至少95％，或在一个优选的实施方案中大于98％的氨基酸序列同一性。氨基酸残基差异通常对抗原结合仅具有很小甚至没有影响。因此，术语“共同轻链可变结构域”还包括抗体轻链可变结构域，其具有一些次要氨基酸序列差异，但当与抗体的相同重链配对时形成具有相同特异性和类似亲和力的结合位点。
能够鉴定一方面不相同但另一方面在功能上等同的多个共同轻链可变结构域。例如，这通过引入并测试保守氨基酸突变，当共同轻链与抗体重链可变结构域配对时共同轻链部分中不影响或仅略微影响结合位点的结合特异性的氨基酸残基的改变是可能的。
"有效连接的"是指两个或更多个组分的并列，其中如此描述的组分处于一种允许它们以其预期方式发挥功能的关系。例如，如果启动子和/或增强子顺式控制或调节所连接的编码序列的转录的话，则启动子和/或增强子有效连接到编码序列。通常但不必"有效连接"的DNA序列是邻接的，并在需要连接两个蛋白编码区域(例如分泌前导序列和多肽)时，是邻接的且在读码框内。然而，虽然有效连接的启动子通常位于编码序列的上游，它不必与编码序列邻接。增强子不必是邻接的。如果增强子增加了编码序列的转录，那么增强子有效连接到编码序列。有效连接的增强子可以位于编码序列的上游、之内或下游，并距启动子相当的距离。如果多聚腺苷酸化位点位于编码序列的下游使得转录进行通过编码序列到聚腺苷酸化序列，那么多聚腺苷酸化位点有效连接到编码序列。如果翻译终止密码子位于编码序列的下游末端(3'末端)使得翻译进行通过编码序列到终止密码子并在那里终止，那么翻译终止密码子有效连接到外显子核酸序列。连接是通过本领域中已知的重组方法，例如，使用PCR方法和/或通过在方便的限制性位点连接而完成的。如果不存在方便的限制性位点，那么根据常规实践使用合成的寡核苷酸衔接头或接头。
"分离的"抗体是已经与其天然环境的组分分离的抗体。在一些实施方案中，将抗体纯化至超过95％或99％纯度，如由例如电泳(例如，SDS-PAGE，等电聚焦(IEF)，毛细管电泳(或色谱(例如，离子交换或反相HPLC)测定的。对于用于评估抗体纯度的方法的综述，见例如，Flatman等人，J.Chromatogr.B848(2007)79-87。
“分离的”核酸分子是这样的核酸分子，其已经与其天然环境的组分分离。分离的核酸包括包含在通常含有核酸分子的细胞中的核酸分子，但是核酸分子存在于染色体外或存在于与其天然的染色体位置不同的染色体位置处。
术语“单克隆抗体”在用于本文时指由基本上同质的抗体群获得的抗体，即构成群体的各个抗体相同和/或结合相同表位，还有生产单克隆抗体的过程中可能产生的变体，这种变体通常以少量存在。与典型的包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，单克隆抗体制备物的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此修饰语“单克隆”指示由基本上同质的抗体群获得的抗体的特征，并不解释为需要通过任何特定方法来生产抗体。例如，依照本发明使用的单克隆抗体可以通过多种技术来制备，所述技术包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法和利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，本文描述了用于制备单克隆抗体的此类方法和其他示例性方法。
关于参照多肽序列的"氨基酸序列同一性百分数(％)"定义为对比序列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后，且不将任何保守替代视为序列同一性的一部分时，候选序列中与参照多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分率。可以本领域技术范围内的多种方式进行测定氨基酸序列同一性百分数目的的序列比对，例如使用公众可得到的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可决定用于比对序列的适宜参数，包括对所比较序列全长获得最大对比所需的任何算法。然而，为了本发明，氨基酸序列同一性％值是使用序列比较计算机程序ALIGN-2获得的。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech公司编写，源代码已经连同用户文档一起提交给美国版权局(US Copyright Office，Washington D.C.，20559)，并以美国版权注册号TXU510087注册。公众从Genentech公司(South San Francisco，California)可得到ALIGN-2程序或可从源代码编译。ALIGN2程序应当编译成在UNIX操作系统，包括数码UNIX V4.OD上使用。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设定且不变。
在采用ALIGN-2用于氨基酸序列比较的情况中，给定氨基酸序列A相对于、与、或针对给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(或者可表述为具有或包含相对于、与、或针对给定氨基酸序列B的某一％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A)如下计算：
分数X/Y乘100
其中X是由序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B对比中评分为相同匹配的氨基酸残基数，且其中Y是B中的氨基酸残基总数。可以领会，若氨基酸序列A的长度与氨基酸序列B的长度不相等，则A相对于B的％氨基酸序列同一性将不等于B相对于A的％氨基酸序列同一性。除非另外特别说明，否则所有本文使用的氨基酸序列同一性％值是使用ALIGN-2计算机程序如前面段落中所述获得的。
术语“药物制剂”是指这样一种制备物，其形式允许其中含有的活性成分的生物活性是有效的，并且其不含有对制剂将给予的受试者不可接受的毒性的额外组分。
哺乳动物中的抗体产生
抗体基因产生(参见Molecular Biology of the Cell.第四版，Alberts B，Johnson A，Lewis J等人，New York：Garland Science；2002；和Immunobiology：TheImmune System in Health and Disease.第5版，Janeway，CA Jr，Travers P，Walport M等人，New York：Garland Science；2001)：
λ轻链(染色体22)的遗传基因座具有约30个功能性Vλ基因区段和四对功能性Jλ基因区段和Cλ基因。κ基因座(染色体2)以相似的方式组织，具有约40个功能性Vκ基因片段，伴随有5个Jκ基因区段的簇，但具有单个Cκ基因。在大约50％的个体中，整个κV基因区段簇经历了重复增加。重链基因座(14号染色体)具有约65个功能性VH基因区段和位于这些VH基因区段和6个JH基因区段之间的约27个D区段的簇。重链基因座还含有大的CH基因簇。重链基因座的总长度超过2兆碱基(200万个碱基)，而一些D链段只有6个碱基长。
免疫球蛋白重链或轻链的V区或V结构域由多于一个基因区段编码。对于轻链，V结构域由两个独立的DNA区段编码。第一区段编码轻链的前95-101个氨基酸，并被称为V基因区段，因为它编码大部分V结构域。第二区段编码V结构域的其余部分(多达13个氨基酸)并被称为连接或J基因区段。因此，在免疫球蛋白的可变结构域中的三个高变环中，两个在V基因区段DNA内编码，而第三个(HV3或CDR3)在V基因区段和J基因区段之间的连接处，并且在重链中由D基因区段部分编码。在重链和轻链中，通过在基因区段之间形成连接的两个步骤添加和缺失核苷酸，CDR3的多样性显著增加。添加的核苷酸也称为P-核苷酸和N-核苷酸。
在B细胞发育期间，V和J基因区段(对于轻链)和V，D和J基因区段(对于重链)通过称为V(D)J连接的位点特异性重组过程连接在一起以形成功能性VL-或VH-区编码序列。保守的DNA序列位于每个基因区段的侧翼，且用作连接过程的识别位点，确保只有合适的基因区段发生重组。因此，例如，V区段将总是连接至J或D区段，但不连接到另一V区段。连接由称为V(D)J重组酶的酶复合物介导。该复合物含有两种对发育淋巴细胞特异的蛋白质，以及帮助修复本文所有细胞中受损DNA的酶。
例如，人κ轻链基因区段池中的任何40V区段都可以连接至5个J区段中的任何区段，从而至少200个(40x5)不同的κ链V区可以是由此池编码。类似地，人重链池中的51V区段的任一个可以连接至6个J区段中的任一个和27个D区段中的任一个以编码至少8262(51×6×27)个不同的重链V区。
由刚刚讨论的遗传性V，J和D基因区段的不同组合的组装产生的组合多样化是使抗体的抗原结合位点多样化的重要机制。仅通过这种机制，人可以产生287个不同的VL区(200种κ和116种λ)和8262个不同的VH区。
在大多数位点特异性重组的情况下，DNA连接是精确的。但是在连接抗体(和T细胞受体)基因区段期间，可变数量的核苷酸常常从重组基因区段的末端丢失，并且还可以插入一个或多个随机选择的核苷酸。这种在连接位点的核苷酸的随机丢失和获得被称为连接多样化，并且它极大地增加了通过重组产生的V区编码序列的多样性，特别是在第三高变区中的多样性。
如本文报道的共同轻链
这里报道了人源化轻链基因座。
本发明至少部分基于如下发现：包含多个V基因元件但仅包含与启动子组合的单个V基因元件的人源化轻链免疫球蛋白基因座可以用作转基因兔的共同轻链基因座。
如本文报道的人源化轻链基因座包含
(a)衍生自人轻链V区段IGKV1-39-01的V基因区段，
(b)启动子，其3’近端连接有所述轻链基因区段，和
(c)至少一个人IGKJ4J元件的片段，其5’近端连接有所述轻链基因区段。
完整的轻链V基因区段IGKV1-39-01具有以下核酸序列(参见例如GenBankX93627，智人种系免疫球蛋白κ轻链，可变区(DPK9)；287bp；SEQ ID NO：02)：
相应的氨基酸序列是(SEQ ID NO：03)：
全长人IgKJ4*01/02具有以下核酸(SEQ ID NO：04)和氨基酸(SEQ ID NO：05)序列：
核酸： ctcactttcggcggagggaccaaggtggagatcaaa
氨基酸： L T F G G G T K V E I K
使用共同轻链能够通过组合不同的重链可变结构域来产生多特异性抗体(例如双特异性全长抗体)，每个重链可变结构域与相同轻链可变结构域或其相同变体结合不同表位/抗原/靶标从而降低副产品的复杂性。
在一个实施方案中，人源化轻链基因座包含25至30个人Vκ元件和人Cκ编码区，其中
(a)3'近端Vκ元件是衍生自人轻链V区段IGKV1-39-01的V基因区段，
(b)启动子(3’近侧)有效连接至所述3’近端轻链基因区段，和
(c)人IGKJ4J元件的至少一个片段5’近端有效连接至所述轻链基因区段。
在一个实施方案中，启动子是人κ可变区启动子(亚组Vκ1)。
在一个实施方案中，V基因区段包含人κ免疫球蛋白轻链前导肽编码核酸。在一个实施方案中，前导肽具有SEQ ID NO：15的氨基酸序列。
在一个实施方案中，V基因区段包含人κ免疫球蛋白前导肽编码核酸和前导肽编码核酸序列与V基因区段之间的鸡衍生的间隔序列。在一个实施方案中，鸡衍生的间隔区序列是SEQ ID NO：16。
轻链免疫球蛋白基因座编码下列轻链V区段(SEQ ID NO：03，加下划线的HVR)：
和下列人J元件(SEQ ID NO：05，HVR-L3的一部分加下划线)：
LTFGG GTKVEIK。
因此，本文报道的一个方面是包含具有下述氨基酸序列或其变体的轻链可变结构域的抗体轻链
本文还涵盖由于B细胞成熟期间兔中的基因转变和超变而产生的该氨基酸序列的变体。
在一个实施方案中，(成熟的)轻链相对于由HVR外部的轻链免疫球蛋白基因座编码的轻链包含1至4个氨基酸突变。
在一个实施方案中，(成熟的)轻链相对于由轻链免疫球蛋白基因座编码的轻链包含1至15个氨基酸突变。
在一个实施方案中，(成熟的)轻链相对于由轻链免疫球蛋白基因座编码的轻链包含1至11个氨基酸突变。
在一个实施方案中，(成熟的)轻链相对于由轻链免疫球蛋白基因座编码的轻链包含1至15个氨基酸突变，其中至多11个在HVR中。
如本文报道的一个方面是包含两个不同重链和两个轻链的双特异性全长抗体，其中轻链相同且可变结构域具有本文报道的氨基酸序列。
转基因兔
如本文报道的轻链基因座可以用于产生生产人免疫球蛋白的转基因兔。
因此，本文报道的一个方面是具有如本文报道的人源化免疫球蛋白轻链基因座的轻链转基因兔。
使用例如基因转化的转基因兔具有人源化免疫球蛋白基因座，并且仍然具有野生型兔的抗体成熟过程，以产生抗体多样性。因此，野生型兔的重链和轻链基因座已经失活并且各自的人源化免疫球蛋白转基因基因座已被引入兔的基因组中，使兔能够产生人(源化的)/人样抗体。转基因兔的基因型可以描述如下：
转基因兔包含
(1)衍生自用8个人VH元件、人JH1-JH6元件、与人bcl2编码序列融合的人Cμ编码区和人Cγ编码区取代的、兔免疫球蛋白重链基因座的转基因；
(2)衍生自包含人Vκ元件IGKV1-39-01和人IgKJ4J元件的、兔免疫球蛋白轻链基因座的转基因；
(3)衍生自人CD79α和CD79β基因座的转基因；和
(4)兔Cμ和兔Cκ基因座内的功能丧失的突变。
本文报道了包含人源化免疫球蛋白重链基因座和人源化免疫球蛋白轻链基因座的转基因兔，其中
i)人源化重链免疫球蛋白基因座衍生自兔免疫球蛋白基因座或一部分的免疫球蛋白基因座，并且包含多个免疫球蛋白重链基因区段，其中
(a)所述重链基因区段中的至少一个基因区段是VH3家族的人重链V区段，作为3'近端V基因区段，侧翼为包含(介于20个和1000个连续核苷酸之间的来自)SEQ ID：06的兔间隔序列的核苷酸序列，
(b)所述基因区段以未重排、或部分重排或完全重排的构型并置，和(c)所述人源化免疫球蛋白基因座能够进行基因重排，根据需要，以及能够进行基因转变和/或超变，并且在所述兔中产生人源化免疫球蛋白的库，和
ii)人源化轻链免疫球蛋白基因座包含
(a)衍生自人轻链V区段IGKV1-39-01的V基因区段，
(b)启动子，其3’近端连接有所述轻链基因区段，和
(c)至少一个人IGKJ4J元件的片段，其5’近端连接有所述轻链基因区段。
在一个实施方案中，转基因兔对于人源化重链基因座和人源化轻链基因座是纯合的。
在一个实施方案中，转基因兔对于人源化重链基因座和人源化轻链基因座是杂合的。
在一个实施方案中，转基因兔对于内源性抗体重链表达和/或内源性抗体轻链表达失活。
如本文报道的一个方面是如本文报道的来自转基因兔的B细胞，其包含本文报道的人源化轻链免疫球蛋白基因座。
如本文报道的一个方面是包含本文报道的人源化轻链免疫球蛋白基因座的分离的B细胞。
在一个实施方案中，B细胞还包含衍生自兔免疫球蛋白基因座或一部分的免疫球蛋白基因座的人源化重链免疫球蛋白基因座，其包含多个免疫球蛋白重链基因区段，其中
(a)至少一个所述重链基因区段是VH3家族的人重链V区段，侧翼为包含(介于20个和1000个连续核苷酸之间的来自)SEQ ID：06的兔间隔序列的核苷酸序列，
(b)所述基因区段以未重排、部分重排或完全重排的构型并置，和
(c)所述人源化免疫球蛋白基因座能够进行基因重排，根据需要，以及能够进行基因转变和/或高变，并且在所述兔中产生人免疫球蛋白的库。
本文报道的一个方面也是使用本文报道的转基因兔产生人免疫球蛋白的方法。
在一个实施方案中，人免疫球蛋白获自兔的血液。
本文报道了具有包含重链免疫球蛋白基因座和轻链免疫球蛋白基因座的修饰的基因组的兔，其中所述修饰是内源性兔免疫球蛋白基因座的失活和人源化免疫球蛋白基因座的引入，产生转基因兔。因此，转基因兔的基因组包含编码不同人免疫球蛋白重链可变结构域和(单功能)人免疫球蛋白轻链可变结构域的外源核酸序列。
人源化免疫球蛋白基因座，即相应的核酸序列被整合到兔基因组中。免疫球蛋白基因座的修饰是插入一个或多个转基因人免疫球蛋白基因区段序列，伴随相应的一个或多个内源兔免疫球蛋白基因区段的失活。
术语“人源化免疫球蛋白基因座”表示包含一个或多个人元件，例如一个或多个V区和/或无和/或一个或多个J元件，的分离的免疫球蛋白基因座。这些与外源元件结合，即与自然界中未与其组合的遗传元件(例如来自非人生物体的启动子和/或调控元件)组合。
如本文报道的转基因兔可以用于产生人抗体。因此，本文报道的一个方面是来自如本文报道的转基因兔的(分离的)B细胞或(分离的)组织。
本文报道的又一个方面是如本文报道的转基因兔的用途，用于产生(i)包含人重链可变区和轻链可变区和兔恒定区的嵌合抗体，或(ii)完全人抗体。
本文报道的一个方面是用于产生特异性结合抗原的抗体的方法，其包括以下步骤：
(a)(用抗原)免疫本文报道的转基因兔，
(b)从免疫的转基因兔中分离产生特异性结合抗原的抗体的至少一个细胞，
(c)将步骤(b)的至少一个细胞作为单个保藏细胞培养以产生抗体。
在一个实施方案中，步骤b)中获得的至少一个细胞是脾细胞。在一个实施方案中，步骤b)中获得的至少一个细胞是B细胞。
本文报道的一个方面是用于产生特异性结合(目的)抗原的抗体的方法，其包括以下步骤：
(a)提供来自本文报道的转基因兔的一个或多个B细胞，其中所述转基因兔已经用(目的)抗原免疫，
(b)将步骤(a)的至少一个或多个B细胞作为单个保藏细胞培养以产生抗体。
本文报道的一个方面是用于产生特异性结合抗原的抗体的方法，包括以下步骤：
(a)培养包含编码特异性结合抗原的抗体的核酸的哺乳动物细胞，其中至少作为抗体的编码可变结构域的核酸已从本文报道的已用抗原免疫的转基因兔获得，
(b)从哺乳动物细胞或培养基中回收抗体。
在一个实施方案中，抗体是单克隆抗体。
在一个实施方案中，用抗原、用编码抗原的DNA、用抗原和编码抗原的DNA、或用表达抗原的细胞进行免疫。
在一个实施方案中，通过将本文所报道的抗原、编码抗原的DNA、抗原连同编码抗原的DNA、或表达抗原的细胞给予转基因兔来进行免疫。
提供以下实施例和序列以帮助理解本发明，其真实范围在所附权利要求中阐述。应该理解，可以在不背离本发明精神的情况下对所述程序进行修改。
实施例1
兔的免疫
用于免疫的转基因兔含有(1)衍生自用8个人VH元件、人JH1-JH6元件、与人bcl2编码序列融合的人Cμ编码区和人Cγ编码区取代的、兔免疫球蛋白重链基因座的转基因；(2)衍生自用25个人Vκ元件、近端Vκ元件融合至人Jκ4、和人Cκ编码区取代的、兔免疫球蛋白轻链基因座的转基因；(3)衍生自人CD79a和CD79b基因座的转基因；和(4)兔Cμ和兔Cκ基因座内的功能丧失的突变。
蛋白质免疫
在第0天用400μg重组可溶性抗原(用弗氏完全佐剂乳化)通过皮内施用以及在第7、14、42、70和84或98天用200μg各种抗原(用完全弗氏佐剂乳化)通过交替肌内和皮下施用免疫兔。在20-21、34-48、62-76和90-104天左右采集血液(估计总血量的10％)。制备血清，其用于通过ELISA测定滴度，并分离外周单个核细胞，其在B细胞克隆过程中用作抗原特异性B细胞的来源。因此获得人抗体。
DNA免疫
使用编码全长抗原的质粒表达载体，通过皮内施用400μg载体DNA，然后电穿孔(750V/cm的5个方形脉冲，持续时间10ms，间隔1s)对兔进行基因免疫。兔在第0、14、28、49、70、98和126天接受7次连续免疫。在第35、77、105和133天采集血液(估计总血量的10％)。制备血清，将其用于通过ELISA测定滴度，并分离外周单个核细胞，其在B细胞克隆过程中用作抗原特异性B细胞的来源。
实施例2
血清滴度的测定
将抗原以1.75-2μg/ml在PBS中100μl/孔固定在96孔NUNC Maxisorb板上，随后：用PBS溶液中的2％CroteinC 200μl/孔封闭板；以100μl/孔施用在PBS中的0.5％CroteinC中连续稀释的抗血清，一式两份；用(1)HRP缀合的驴抗兔IgG抗体(Jackson Immunoresearch)或(2)HRP缀合的兔抗人IgG抗体(Pierce/Thermo Scientific；1/5000)或(3)生物素化山羊抗人κ抗体(Southern Biotech/Biozol；1/5000)和链霉亲和素-HRP检测；其每种在PBS中的0.5％CroteinC中稀释，100μl/孔。对于所有步骤，将板在37℃孵育1h。在所有步骤之间，用PBS中的0.05％Tween 20洗涤板3次。通过加入100μL/孔的BM Blue POD Substrate溶液(Roche)使信号显色；并通过加入1M HCl，100μl/孔停止。在450nm处读取吸光度，相对于690nm作为参照。滴度定义为导致半数最大信号的抗血清的稀释。
实施例3
B细胞克隆和分选
兔外周血单个核细胞(PBMC)的分离
使用实施例1的转基因兔作为血源。根据制造商的说明书，在哺乳动物淋巴细胞分离液(lympholyte mammal)(Cedarlane Laboratories，Burlington，Ontario，Canada)上密度离心之前，用1x PBS将含EDTA的全血稀释2倍。在用抗体染色之前用1x PBS洗涤PBMC两次。
EL-4B5培养基
RPMI 1640(Pan Biotech，Aidenbach，Germany)补充有10％FCS(Hyclone，Logan，UT，USA)，2mM谷氨酰胺，1％青霉素/链霉素溶液(PAA，Pasching，Austria)，2mM丙酮酸钠，10mM HEPES(PAN Biotech，Aidenbach，Germany)和0.05mMβ-巯基乙醇(Gibco，Paisley，Scotland)。
巨噬细胞/单核细胞的消耗
使用无菌6孔板(细胞培养级)通过非特异性粘附来消耗巨噬细胞和单核细胞。每个孔最多装填4ml培养基和多达6x106个来自免疫兔的外周血单个核细胞，并使其在37℃和5％CO2的培养箱中结合1h。上清液中的细胞用于抗原淘选步骤。
板的包被
室温用2μg/ml抗原蛋白包被无菌细胞培养6孔板或用2μg/ml生物素化抗原包被无菌链霉抗生物素蛋白包被的6孔板(Microcoat，Bernried，德国)3小时，或者在4℃过夜。使用前将板在无菌PBS中洗涤三次。
B细胞在抗原蛋白上富集
用抗原蛋白包被的6孔组织培养板接种每4ml培养基高达6×106个细胞，并使其在37℃和5％CO2的培养箱中结合1h。在富集步骤后，通过用1x PBS小心洗涤孔1-2次去除抗原蛋白非粘附细胞的。剩余的粘附细胞用胰蛋白酶在37℃的培养箱中去粘附10分钟。用EL-4B5培养基终止胰蛋白酶消化。然后将细胞在培养基中洗涤两次。将细胞保持在冰上直至免疫荧光染色。
免疫荧光染色和流式细胞术
使用抗IgG FITC抗体(AbD Serotec，Düsseldorf,Germany)进行单细胞分选。对于表面染色，将来自消耗和富集步骤的细胞与PBS中的抗IgG FITC抗体孵育30-45分钟。在冷的房间里，在4℃的黑暗中滚动。离心后，通过抽吸取出上清液。将PBMC进行2轮离心并用冰冷的PBS洗涤。最后将PBMC重悬于冰冷的PBS中并立即进行FACS分析。在FACS分析之前加入浓度为5μg/ml的碘化丙啶(BD Pharmingen，San Diego，CA，USA)以区分死细胞和活细胞。
装配有计算机和FACSDiva软件(BD Biosciences，USA)的Becton DickinsonFACSAria用于单细胞分选。
B细胞培养
通过Seeber，S等人，PLoS One 9(2014)e86184所述的方法进行兔B细胞的培养。简言之，将单个分选的兔B细胞在含有Pansorbin细胞(1：100000)(Calbiochem(Merck)，Darmstadt，Deutschland)的200μl/孔EL-4B5培养基，5％兔胸腺细胞上清液MicroCoat，Bernried，Germany)和γ辐照的鼠EL-4B5胸腺瘤细胞(2.5×10e4个细胞/孔)中在37℃培养箱中孵育7天。移出B细胞培养物的上清液用于筛选，并立即收获剩余的细胞，并在100μlRLT缓冲液(Qiagen，Hilden，Germany)中于-80℃冷冻。
实施例4
B细胞PCR
根据制造商的方案使用NucleoSpin 8/96RNA试剂盒(Macherey&Nagel)从B细胞裂解物(重悬于RLT缓冲液)中制备总RNA。RNA用60μl无RNA酶的水洗脱。根据制造商的说明，使用6μl的RNA通过使用Superscript III First-Strand Synthesis SuperMix(Invitrogen)和寡dT-引物的逆转录酶反应来产生cDNA。所有步骤均在Hamilton ML Star系统上进行。使用4μl的cDNA用AccuPrime SuperMix(Invitrogen)以终体积50μl使用用于重链的引物rbHC.up和rbHC.do和用于轻链的引物BcPCR_FHLC_leader.fw和BcPCR_huCkappa.rev来扩增免疫球蛋白重链可变区和轻链可变区(VH和VL)。所有正向引物对(分别为VH和VL的)信号肽都是特异性的，而反向引物对(分别为VH和VL的)恒定区是特异性的。RbVH+RbVL的PCR条件如下：94℃热启动5分钟；94℃20秒，70℃20秒，68℃45秒，35个循环，最后在68℃延伸7分钟。HuVL的PCR条件如下：94℃热启动5分钟；94℃20秒，52℃20秒，68℃45秒，40个循环。最后在68℃延伸7分钟。
引物序列：
将8μl的50μl PCR溶液加载到48E-Gel 2％(Invitrogen G8008-02)上。使用NucleoSpin Extract II试剂盒(Macherey&Nagel；740609250)根据制造商的方案清洁阳性PCR反应物，并在50μl洗脱缓冲液中洗脱。所有清洁步骤均在Hamilton ML Starlet系统上进行。
使用的抗原是TPBG(滋养层糖蛋白，SEQ ID NO：11)的胞外结构域。
产生的TPBG胞外结构域的抗体具有以下轻链可变结构域：
实施例5
TPBG特异性Fab片段与TPBG的结合
为了评估重组TPBG的结合，用浓度为100ng/ml的25μl/孔生物素化的人TPBG-AviHis包被Nunc Maxisorb链霉亲和素包被的板(MicroCoat#11974998001)。将板在4℃孵育过夜。洗涤后(用PBST缓冲液3×90μl/孔)从2μg/ml开始以1：2稀释系列添加抗TPBG样品并在室温孵育1h。洗涤后(用PBST缓冲液3×90μl/孔)分别以1:7000或1：4000稀释加入25μl/孔山羊抗c-myc HRP(Bethyl，#A190-104P)或山羊抗huκHRP(Millipore，#AP502P)，并在室温在振荡器上孵育1h。洗涤后(用PBST缓冲液3×90μl/孔)加入25μl/孔TMB底物(Calbiochem，#CL07)并孵育2分钟。在Safire2读数器(Tecan)上于370/492nm处测量。
为了评估人TPBG的细胞结合，将内源表达TPBG的人乳腺癌肿瘤细胞系MFC7以21000个细胞/孔的浓度接种于384孔包被有聚-D-赖氨酸的板(Greiner，#781940)中。使细胞在37℃贴壁过夜。除去上清后，以从5μg/ml开始的1:2稀释系列加入25μl/孔含有抗TPBG抗体的上清液并在4℃孵育1h。洗涤(2×50μl/孔PBST)后，通过加入50μl/孔在1xPBS缓冲液中稀释的0.05％戊二醛(Sigma，25％)固定细胞，并在室温孵育10分钟。洗涤(3次；90μl/孔PBS-T)后，加入25μl/孔第二抗体用于检测：山羊抗c-myc HRP(1:5000，Bethyl)，然后在室温在振荡器上孵育1小时。洗涤(3次；90μl/孔PBS-T)后，加入25μl/孔的TMB底物溶液(Calbiochem)。在室温10分钟后，在Safire2读数器(Tecan)上于370/492nm处测量。
表：抗TPBG Fab片段与人TPBG的结合
发现051、091和097的Fab片段结合人TPBG或重组来源或在人乳腺癌细胞系的细胞上表达物。

Claims (13)

1.包含具有SEQ ID NO：01的氨基酸序列的可变结构域或其变体的共同抗体轻链用于产生双特异性抗体的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述用途是通过将两个共同抗体轻链与第一抗体重链和第二抗体重链组合，其中所述第一抗体重链与共同抗体轻链一起形成第一抗原结合位点并且第二抗体重链与共同抗体轻链一起形成第二抗原结合位点。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述共同轻链在SEQ ID NO：01的氨基酸序列内包含1至11个氨基酸突变。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的用途，其中所述共同轻链在SEQ ID NO：01的氨基酸序列内包含1至13个氨基酸突变，其中至多11个突变位于HVR中。
5.一种双特异性全长抗体，包含两条重链和两条共同轻链，每条轻链包含具有SEQ IDNO：01的氨基酸序列或者包含其变体的可变结构域。
6.一种包含人源化轻链基因座的转基因载体，其中所述人源化轻链基因座包含
(a)作为V基因区段的人轻链V区段IGKV1-39-01，
(b)启动子，其3’近端连接有所述轻链基因区段，和
(c)人IGKJ4J元件或其功能片段，其5’近端连接有所述轻链基因区段。
7.一种转基因兔，包含存在于权利要求5的转基因载体中的人源化免疫球蛋白基因座。
8.根据权利要求7所述的转基因兔，其中所述转基因兔进一步包含
(1)衍生自用8个人VH元件、人JH1-JH6元件、与人bcl2编码序列融合的人Cμ编码区和人Cγ编码区取代的、兔免疫球蛋白重链基因座的转基因；
(2)衍生自包含人Vκ元件IGKV1-39-01和人IgKJ4J元件的、兔免疫球蛋白轻链基因座的转基因；
(3)衍生自人CD79α和CD79β基因座的转基因；和
(4)兔Cμ和兔Cκ基因座内的功能丧失的突变。
9.来自权利要求7或8所述的转基因兔的B细胞，包含存在于根据权利要求6所述的转基因载体中的人源化免疫球蛋白基因座。
10.使用权利要求7或8的转基因兔制备人免疫球蛋白的方法。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于所述人免疫球蛋白是抗体。
12.根据权利要求10或11所述的方法，其特征在于所述人免疫球蛋白是多克隆抗体。
13.根据权利要求10或11所述的方法，其特征在于所述人免疫球蛋白是单克隆抗体。
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